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CN114958883B - 一种表达glp-1类似物的重组工程菌及其构建方法 - Google Patents

一种表达glp-1类似物的重组工程菌及其构建方法 Download PDF

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CN114958883B CN202210693488.5A CN202210693488A CN114958883B CN 114958883 B CN114958883 B CN 114958883B CN 202210693488 A CN202210693488 A CN 202210693488A CN 114958883 B CN114958883 B CN 114958883B
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Abstract

本发明涉及一种酰化的长效GLP‑1衍生物，所述GLP‑1(7‑37)类似物经脂肪酸酰化修饰得到长效GLP‑1衍生物，本发明还涉及表达所述GLP‑1(7‑37)类似物的重组工程菌、构建方法，所述衍生物具有与GLP‑1受体的良好的结合亲和力和显著延长的作用时间，能够用于包括糖尿病、糖耐量受损、肥胖、高血压、代谢综合征、血脂异常等疾病的治疗。

Description

一种表达GLP-1类似物的重组工程菌及其构建方法
本申请是申请日为2022年04月12日、申请号为202210381817.2，发明名称为“一种酰化的长效GLP-1衍生物”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及多肽技术及其衍生物领域，尤其涉及一种表达GLP-1类似物的重组工程菌及其构建方法。
背景技术
糖尿病是一种因胰岛素绝对或相对分泌不足和/或胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪等代谢紊乱性疾病，以高血糖为主要标志，可由遗传和环境等多种因素引起。糖尿病是人类三大致死疾病之一，它的死亡率仅次于心脑血管疾病和癌症。
糖尿病主要分为1型糖尿病和2型糖尿病，其中大多数患者为2型糖尿病患者(据统计，约占90％)。2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)，旧称非胰岛素依赖型糖尿病(noninsulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM)或成人发病型糖尿病(adult-onset diabetes)，患者特征为高血糖、相对缺乏胰岛素、胰岛素抵抗等。目前，临床上使用的治疗2型糖尿病的药物主要有双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类、DPP-4受体抑制剂、SGLT-2受体抑制剂和GLP-1衍生物。而其中，GLP-1衍生物由于具有与胰岛素类似的降糖效果，且同时几乎无低血糖风险、兼具减重效果和心血管保护功能，正逐渐成为2型糖尿病的主要治疗药物和研究热点。
GLP-1(胰高血糖素样肽1)是一种经食物刺激后由肠道细胞分泌入血、能够刺激胰岛素分泌的促胰素，其引起的胰岛素分泌能力约占全部胰岛素分泌量的50-70％，且刺激胰岛素分泌的作用具有葡萄糖浓度依赖的特点，具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的释放、刺激胰岛β细胞增殖、诱导胰岛β细胞再生、阻止胰岛β细胞凋亡、改善胰岛素敏感性和增加葡萄糖的利用等作用。GLP-1衍生物是一类肠促胰素类药物，属于GLP-1受体激动剂；GLP-1类似物和胰高血糖素的氨基酸序列有近一半相同，同样具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素分泌及抑制胃排空等多种功能(付刚，龚珉，徐为人.胰高血糖素样肽1及其受体激动剂研究进展[J].天津医药，2012，40(2):181-184.)；因此，GLP-1及其类似物和衍生物在治疗1和2型糖尿病的发生、发展中起着重要作用。
Nauck M.等对10例血糖控制不佳的2型糖尿病患者进行了研究，在空腹状态下分别给予患者GLP-1或安慰剂，研究结果显示，患者在输注GLP-1后，其胰岛素和C肽水平显著增加，胰高血糖素水平显著降低，空腹血糖水平在4小时后变为正常；在血糖水平正常后，虽然仍持续输注GLP-1，患者的胰岛素水平却不会再升高，血糖水平也维持稳定，不再进一步下降，这说明GLP-1是在营养物质(特别是碳水化合物)的刺激下才释放入血的，其促胰岛素分泌作用呈葡萄糖浓度依赖性，能够在血糖升高时发挥降糖作用，抑制胰高血糖素分泌，增加饱腹感，减少饥饿感，从而达到降低血糖作用(Normalization of fastinghyperglycaemia by exogenous glucagon-like peptide 1(7-36amide)in type 2(non-insulin-dependent)diabetic patients([J].Diabetologia,Nauck M.，1993,36))。而Lancet等的研究表明GLP-1通过多种途径产生降低体重的作用，包括抑制胃肠道蠕动和胃液分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空等。此外，GLP-1还可作用于中枢神经系统(特别是下丘脑)抑制食欲，减少进食量，从而使人体产生饱胀感和食欲下降，减少卡路里的摄入量，进而达到减轻体重的目的(Effect of 6-week course of glucagon-like peptide1 on glycaemic control,insulin sensitivity,andβ-cell function in type 2diabetes:a parallel-group study.([J].Lancet,Zander,Mette,Madsbad,et al.，2002))。
由于GLP-1在体内迅速被二肽基肽酶4(DPP-4)降解，极大的限制了其作用时间，使其难以直接作为药物使用。因此，目前以GLP-1为主改善血糖控制的方法主要以外源性模拟GLP-1作用及延长内源性GLP-1活性的GLP-1衍生物为主。目前，已上市的GLP-1衍生物主要有艾塞那肽、利拉鲁肽、度拉糖肽、利司那肽、艾塞那肽微球制剂、阿必鲁肽、聚乙二醇洛塞那肽和索马鲁肽(又名司美格鲁肽)。其中，索马鲁肽为GLP-1衍生物药物中的代表。
索马鲁肽(Semaglutide)是由诺和诺德公司研发的长效GLP-1衍生物，该药物只需要进行每周一次的皮下注射给药，目前已在多国获批上市。而且，诺和诺德通过制剂技术，开发了索马鲁肽的口服制剂。从结构上看，索马鲁肽是将GLP-1(7-37)链上第26位Lys接上AEEA、谷氨酸和十八烷脂肪二酸侧链，并将其中第8位氨基酸采用非天然氨基酸氨基异丁酸(Aib)取代原Ala所得。与利拉鲁肽相比，索马鲁肽的脂肪链更长，疏水性增加，但是索马鲁肽经过短链的AEEA修饰，亲水性大大增强。AEEA修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，延长生物半衰期，达到长循环的效果。索马鲁肽在多个临床试验研究已经证明联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖，并能够使患者减轻体重、减少收缩压及改善胰岛β细胞功能。
由于糖尿病和肥胖患者人数众多，市场巨大，对相关GLP-1衍生物的市场需求仍非常巨大。因此，目前仍需要提供新的具有优异降糖和减重潜力的GLP-1衍生物。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种GLP-1(7-37)多肽类似物及其长效衍生物。本发明提供的长效GLP-1(7-37)衍生物具有优异的减重和降糖能力，其减重效果、降糖效果显著优于索马鲁肽，具备更为优异和广阔的临床和市场应用前景。
本发明中术语GLP-1(7-37)类似物是指对人天然GLP-1(7-37)氨基酸进行修饰获得的多肽，所述修饰包括去除和/或取代(置换)和/或添加(延长)一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸，也可以是人工合成的氨基酸。本发明用一种简单的命名来描述所述类似物：例如[Val8]GLP-1(7-37)是指其中在位置8上天然存在的组氨酸已经由缬氨酸Val取代的GLP-1(7-37)类似物。
本发明中，有关肽(例如GLP-1或胰岛素)的术语“衍生物”表示经化学修饰(如共价修饰等)的肽或其类似物。典型的修饰是酰胺、糖类、烷基、酰基、酯等。GLP-1(7-37)衍生物的实例是N-ε26-((4S)-4-(十六烷酰基氨基)-羧基-丁酰基)[Arg34Lys26]GLP-1-(7-37)。
本发明中，术语“脂肪族二酸”包括直链或支链脂族二羧酸。脂肪族二酸的非限定实例为琥珀酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸和二十烷二酸。
本发明中，术语“药学上可接受的盐”是指保留母体的生物活性的多肽或蛋白的盐。
术语“载体”是指可以将编码蛋白质或多肽的核苷酸片段可操作地插入其中以引起所述蛋白质或多肽表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒、人工染色体、噬菌体、病毒颗粒等。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。
本发明中术语“重组表达载体”是编码基因的核酸分子，其在宿主细胞中表达且含有控制所述基因的表达的必需元件。通常，表达载体包含转录启动子、目的基因和转录终止子。
本发明中宿主细胞是指可将包含编码目的蛋白质或多肽的核苷酸序列片段的载体引入到其中进行克隆或基因表达的细胞。适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。
因此，一方面，本发明提供了一种GLP-1(7-37)类似物，所述GLP-1(7-37)类似物由下式所示的氨基酸序列的多肽组成：
YX8EGTFTSDVSSYLEX22QAAX26EFIX30WLVX34X35X36X37；
其中：
X8选自Aib、V、I、T、L、G或S；
X22选自G或E；
X26选自K或R；
X30选自A、K、E或R；
X34选自R或G；
X35选自R或G；
X36选自R或G；
X37选自R或G；
且X26和X30中仅有一个为K。
优选地，所述X8选自V，X22选自E，X26选自R，X30选自K，X34选自R，X35选自G。
更优选地，(1)所述X36选自R，X37选自G；或者，(2)X36选自G，X37选自R。
当所述GLP-1(7-37)类似物为[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)时，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
当所述GLP-1(7-37)类似物为[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34Gly36Arg37]-GLP-1(7-37)时，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
另一方面，本发明提供一种酰化的长效GLP-1(7-37)衍生物，所述衍生物包含与所述GLP-1(7-37)类似物K残基连接的脂肪酸侧链，优选通过K残基上的ε氨基与侧链连接。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明所述长效GLP-1(7-37)衍生物中使用的脂肪酸侧链结构为HOOC(CH2)nCO-，其中n为选自10-24的整数，更优选为16-20的整数。具体地，所述脂肪酸侧链可以选自HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)15CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)17CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)19CO-、HOOC(CH2)20CO-、HOOC(CH2)21CO-或HOOC(CH2)22CO-，优选地，所述脂肪酸侧链结构为HOOC(CH2)16CO-。
作为本发明的一种优选技术方案，所述脂肪酸侧链通过接头与氨基酸残基连接，优选接头与氨基酸K的ε氨基连接。
作为本发明的一种优选技术方案，所述脂肪酸侧链通过接头与所述GLP-1(7-37)类似物上的位置30的氨基酸K的ε氨基连接。
作为本发明的一种优选技术方案，所述接头选自：
Figure GDA0003914750120000061
Figure GDA0003914750120000071
其中，m为0-6的整数，例如0、1、2、3、4、5、6等，n为1-3的整数，例如1、2、3等，s为0-3的整数，例如0、1、2、3等，t为0-4的整数，例如0、1、2、3、4等，p为1-23的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23等。
作为本发明的一种具体实施方式，所述接头为：
Figure GDA0003914750120000072
其中，s为1，n为1或2，优选n为1。
对于上述优选的接头部分(当n为1时)，按照IUPAC命名法，可表示为γ-Glu-OEG-OEG；其中，OEG即“2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基”的简写。当选择HOOC(CH2)16CO-作为侧链时，上述侧链和接头的组合(酰基基团)，按照IUPAC命名法，可以被称为“[2-(2-[2-(2-[2-(2-)4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基]”。
作为本发明的一种具体实施方式，本发明所述衍生物包含与所述GLP-1(7-37)类似物的第30位的赖氨酸的ε氨基连接的脂肪酸侧链，优选所述脂肪酸侧链为HOOC(CH2)16CO-，所述脂肪酸侧链通过-γ-Glu-OEG-OEG-与上述第30位的赖氨酸的ε氨基连接。
因此，优选地，本发明所述长效GLP-1衍生物选自如下化合物：
N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)(简称为HS-Y1)，[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；或
N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34Gly36Arg37]-GLP-1(7-37)(简称为HS-Y2)，[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34Gly36Arg37]-GLP-1(7-37)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
通常，人们认为GLP-1(7-37)的氨基酸序列中，第7位的组氨酸H对保持其GLP-1活性是至关重要的，也因此在众多的基于GLP-1(7-37)的研究中，不会有针对该位点的变化。但本申请发明人在研究中意外发现，将该位置位点突变为酪氨酸Tyr，不仅保留了GLP-1的活性，而且不管在减重还是降糖方面，其活性都得到了加强。或许在其他位置氨基酸序列的变化影响下，该位置的变化反而协同加强了其GLP-1活性。因此，基于该发现，本发明得到了一组有望成为更具降糖和减重效力的药物。
另一方面，本发明提供一种高表达所述GLP-1(7-37)类似物的重组工程菌，所述重组工程菌优选为重组大肠杆菌工程菌，更优选为重组大肠杆菌BL21工程菌。
另一方面，本发明提供一种所述GLP-1(7-37)类似物的重组工程菌的构建方法，所述方法包括步骤：(1)将促包涵体序列、EK酶切序列和GLP-1(7-37)类似物编码基因序列依次串联融合，制备得到GLP-1(7-37)类似物的基因表达片段；(2)将所述基因表达片段插入原核表达质粒，得GLP-1(7-37)类似物的表达质粒；(3)将所述表达质粒转入大肠杆菌，制备得到表达所述GLP-1(7-37)类似物的重组工程菌。
优选地，所述原核表达质粒为pET-30a(+)，并通过NdeI和XhoI位点将基因表达片段插入上述质粒。
优选地，本发明的促包涵体序列的氨基酸序列为FKFEFKFE，所述EK酶切序列为DDDDK。
体外结合活性表明：
(1)本发明提供的酰化的长效GLP-1衍生物相比于索马鲁肽，具有优于其的GLP-1R结合亲和力。在糖尿病动物模型中的降糖实验也表明，本发明的酰化的长效GLP-1衍生物具有类似或显著优于索马鲁肽的降糖效果。说明本发明的突变位点的选择，能够为GLP-1带来显著有益的降糖活性。
(2)此外，GLP-1衍生物的另外一个重要作用即是其减重效果，可开发为减重适应症药物，而且索马鲁肽作为减重适应症药物已经获得美国FDA批准。本发明肥胖动物模型中的研究结果也表明，相比于索马鲁肽，本发明的GLP-1衍生物在糖尿病动物模型中，同样具有显著有益的减重效果，且不存在低血糖风险。因此，本发明的长效GLP-1衍生物相比于索马鲁肽具有更为广阔的商业开发价值。
此外，本发明提供了一种药物组合物，包括所述酰化的长效GLP-1衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。
另一方面，本发明提供了所述酰化的长效GLP-1衍生物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
另一方面，本发明提供了所述酰化的长效GLP-1衍生物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物在制备减重制剂中的应用。
本发明提供的长效GLP-1衍生物与现有技术相比具有如下优点：
(1)本发明提供的GLP-1衍生物，在糖尿病患者中具有相当或更优异的降糖能力，且第7位氨基酸修饰为Y，其具备更优的抗酶解能力，具备更优稳定性和半衰期潜力；
(2)相比于索马鲁肽，本发明提供的长效GLP-1衍生物，具有更加优异且显著的减重能力，具备更优的减重应用潜力。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为长效GLP-1衍生物对小鼠模型血糖变化影响柱状图；
图中每个时间点对应的每组数据，从左至右依次为空白对照组、模型对照组、索马鲁肽组、HS-Y1组、HS-Y2组；
图2为长效GLP-1衍生物对小鼠模型体重变化率影响的柱状图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1酰化的长效GLP-1衍生物的制备
本实施例提供了多种长效GLP-1(7-37)衍生物及其制备方法，尤其是构建一种能高效表达本发明衍生物的重组工程菌，制备方法如下(以HS-Y1为例)：
(1)构建编码[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)的表达质粒
通过前期大量研究和实验，本发明选择FKFEFKFE作为促包涵体序列，DDDDK作为EK酶切序列，并将促包涵体序列、EK酶切序列和GLP-1类似物编码基因序列依次串联融合，得到如SEQ ID NO.3所示编码基因片段；通过NdeI和XhoI位点，将上述片段插入原核表达质粒pET-30a(+)中并测序验证，得到表达质粒，称作pET-30a(+)-[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)。
(2)构建表达[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)的重组工程菌
将50μL的BL21感受态细胞(TransGenBiotech)置于冰浴上融化，加入步骤(1)构建的表达质粒并摇匀，冰浴中放置30min，42℃水浴热激30s，然后快速将离心管转移到冰浴中放置2min，该过程不要摇动离心管。
向离心管中加入500μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后置于37℃，180rpm培养1h，以使细菌复苏；然后吸取200μL已转化的感受态细胞加到含有卡那霉素抗性的LB琼脂培养基平板上，将细胞均匀涂开，将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃培养过夜，使用接种环挑取转化平皿中的单克隆菌落，并接种于15mL的含卡那霉素抗生素的无菌LB培养基，37℃过夜培养，将500μL过夜培养菌液加入到1.5mL无菌离心管中，再加入500μL的50％无菌甘油混匀，得到甘油冻存菌，-80℃保存。
(3)重组工程菌的发酵表达
向50mL的2YT培养基中加入50μL甘油冻存菌液，同时加入50μL卡那霉素，混匀后放恒温振荡器中，37℃、200rpm过夜培养，测OD600＞5.0时，得到一级种子培养液。
取过夜培养一级种子培养液40mL按照1:5的比例接入到200mL2YT培养基中，同时加入200μL卡那霉素，混匀后放恒温振荡器中，37℃、200rpm培养3h，OD600＞3.0，得二级种子培养液。
取二级种子液60mL，按1:10的比例接种于FDM培养基中(600mL)，在2L发酵罐内进行培养，检测培养菌液OD600值达到160左右的时候，开始接入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，使其终浓度为1mmol/L，30℃诱导培养24h结束培养，放罐离心。
收集的菌液以8000g离心30min获得菌体细胞浆，大约获得不低于290g菌/L发酵液，离心收获的菌体进行目的蛋白表达量测定，表达量均不低于10g/L。
(4)重组[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)的纯化
称取100g步骤(3)得到的细胞浆重悬于500mL的溶液(50mM Tris-HCl、50mM NaCl、pH8.0)中，超声波细胞粉碎机中超声30min，以使细胞破碎，所得匀浆在4℃下以13000g离心30min，离心完成后收集沉淀，使用8M尿素溶解后即为酶切前样品。
将酶切前样品经事先用平衡液3(10mM乙酸铵、20％乙腈)平衡过的UniPS30-300(购自苏州纳微科技有限公司)进行浓缩，平衡液3淋洗后，再按0-100％洗脱液(10mM乙酸铵，80％乙腈)梯度洗脱，经RP-HPLC分析，由上述纯化过程生成GLP-1中间产物纯度高于70％。
使用EK酶将标签序列切除：中间产物中加入pH7.4的20mM PB缓冲液使其稀释三倍，20℃条件下按照EK酶:中间产物＝1:15加入EK酶混匀后酶切过夜，经RP-HPLC分析酶切率近80％。
[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)的精纯：利用平衡液3(10mM乙酸铵，20％乙腈)平衡过的UniPS30-300(购自苏州纳微科技有限公司)进行浓缩，平衡液3淋洗后，再按0-100％洗脱液(10mM乙酸铵，80％乙腈)梯度洗脱，经RP-HPLC分析纯度约为90％。
洗脱样品中加入0.2M Na2HPO4使其终浓度为20mM，用1M柠檬酸调节pH至4.8-5.0，4℃酸沉过夜，RP-HPLC检测收率90％以上，4℃下以13000g离心30min，收取沉淀放于-20℃保存，得到[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)；测序验证，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
(5)制备长效GLP-1衍生物
脂肪酸修饰：步骤(4)得到的[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)中加水，配制成4～6mg/mL溶解液，加入1M氢氧化钠调整pH至11.0-11.5，摇匀使蛋白完全溶解，HPLC定量多肽浓度；按多肽与十八烷二酸单叔丁酯-谷氨酸(1-叔丁酯)-AEEA-AEEA-OSU-摩尔比1:4称取脂肪酸粉末溶于乙腈中，将多肽样品与脂肪酸溶液混合，将混合液于4℃静置一小时，然后样品加水稀释5倍，用1M柠檬酸(或10％乙酸)调pH至4.8终止反应，放于4℃静置酸沉10min，酸沉后以13000g，4℃离心30min，然后将沉淀放于-80℃保存。
脂肪酸脱保护与纯化：向得到的沉淀中加入TFA至多肽终浓度约10mg/mL，震荡使沉淀溶解，置于室温静置脱保护30min，然后滴入4M的NaOH调节pH至7.5-8.5终止反应。
用蛋白纯化层析系统(赛谱SDL100)将反应终止后的反应液按4mL/min流速，泵入事先用平衡液3(10mM乙酸铵，20％乙腈)平衡过的UniPS10-300(购自苏州纳微科技有限公司)进行浓缩，平衡液3淋洗后，再按0-100％洗脱液(10mM乙酸铵，80％乙腈)梯度洗脱，收集洗脱峰经RP-HPLC检测纯度约为90％。
洗脱峰用水稀释3倍，酸沉调整pH至4.80，4℃酸沉30min，离心后沉淀中加入PBST缓冲液(pH7.0)复溶，并在-80℃冻存，得到N-ε30-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷酰胺基)-4(S)-羧基丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基][Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34]-GLP-1(7-37)(简称HS-Y1)。
按照上述实施例中的步骤(1)，将促包涵体序列、EK酶切序列和GLP-1类似物编码基因序列依次串联融合，获得包含编码[Tyr7Val8Glu22Arg26Lys30Arg34Gly36Arg37]-GLP-1(7-37)的基因片段，其序列如SEQ ID NO.4；其余步骤与本实施例相同，制备HS-Y2。
实施例2：体外细胞亲和力活性检测
(1)配制不同长效GLP-1衍生物注射液
具体配方为：DMEM空白培养基，GLP-1衍生物：320nM、64nM、12.8nM、2.56nM、0.512nM、0.1024nM、0.02048nM、0.004096nM。其中阳性对照组(索马鲁肽)，实验组1(HS-Y1)，实验组2(HS-Y2)。
选取培养状态良好的HEK293/Luc/GLP1R细胞，弃去瓶中培养液，用PBS缓冲液洗1次，加入0.05％ Trypsin消化液消化3分钟，然后加入DMEM基础培养基终止消化，离心收集细胞。用DMEM空白培养基调整细胞密度为8.0×105个/mL，50μL/孔接种于96孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2条件下培养过夜。
用Fire-Lumi荧光素酶检测试剂盒检测GLP-1类似物的衍生物的体外活性：配制测定培养液，DMEM空白培养基分步稀释样品至320nM，单次稀释倍数不超过10倍，之后在96孔板中按照进行5倍系列稀释，共8个梯度，每个稀释度做2个复孔。
从培养箱中取出培养好的细胞培养板，将稀释好的测定培养液加入细胞板中，每孔50μL，置于37℃、5％CO2条件下孵育6h。从培养箱中取出样品板，放置至室温。加入100μLFire-Lumi检测液，反应5min，震荡10s，检测荧光强度。
试验数据采用四参数回归计算法进行处理，可以计算出待测样品的EC50值。结果如表1所示：
表1
样品 HS-Y1 HS-Y2 索马鲁肽
EC50(nM) 0.336 0.1746 0.6611
由表中结果可知，本发明HS-Y1、HS-Y2相比于索马鲁肽具有更低的EC50值，HS-Y1和HS-Y2分别是索马鲁肽的1/2和1/4左右，表明其分别具备约2倍和4倍的优于索马鲁肽的与人胰岛素受体的结合亲和力。
实施例3：小鼠中降糖效果的研究
(1)实验材料：
a.实验药物制剂：
分别配制不同GLP-1衍生物的注射液，具体配方为1.133mg/mL Na2HPO4，5.5mg/mL苯酚，14.0mg/mL丙二醇，以及GLP-1衍生物；
b.动物实验：
选取健康SPF级雄性6-8周龄的KM小鼠50只，体重18-20g，分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组(索马鲁肽组)、实施例1组、实施例2组，其中：
空白对照组：包含10只小鼠，纯水灌胃，腹部皮下注射空白溶剂；
模型对照组：包含10只小鼠，葡萄糖(4g/kg)灌胃，腹部皮下注射空白；
阳性对照组：包含10只小鼠，葡萄糖(4g/kg)灌胃，腹部皮下注射药物；
实施例1组：包含10只小鼠，葡萄糖(4g/kg)灌胃，腹部皮下注射药物；
实施例2组：包含10只小鼠，葡萄糖(4g/kg)灌胃，腹部皮下注射药物。
(2)实验方法：
a.给药方法：
对上述确定的各实验组小鼠，按照表2所示的具体给药计量进行给药：
表2
Figure GDA0003914750120000161
b.血糖值检测：
血糖检测前禁食16h，给药后、口服葡萄糖前测定0h血糖，口服葡萄糖后检测0.5h、1h、2h小鼠血糖，随后在23h口服葡萄糖，在口服葡萄糖后1h检测血糖，结果见表3和图1：
表3
组别 0h 0.5h 1h 2h 24h
空白对照组 4.51±0.55 7.01±1.24** 6.01±1.14** 4.73±0.69** 10.83±1.13*
模型对照组 4.49±0.54 18.76±3.44 15.98±3.15 9.21±1.12 12.26±1.84
阳性对照组 4.32±0.45 10.94±2.88** 6.21±1.39** 4.32±0.79** 8.95±1.94**
实施例1组 4.4±0.74 8.4±4.03** 4.91±1.5** 3.69±0.49** 8.42±1.43**
实施例2组 4.23±0.54 10.24±4.53** 5.66±1.67** 4.52±0.75** 9.07±2.46**
注：“*”指的是，相对于模型对照组，p＜0.05；“**”指的是，相对于模型对照组，p＜0.01。
图1为本实施例实验小鼠的血糖变化趋势图，在图中，每个时间点从左至右依次为空白对照组、模型对照组、阳性对照组(索马鲁肽)、实施例1组(HS-Y1)和实施例2组(HS-Y2)。由图1可知，本发明的HS-Y1和HS-Y2在整个实验中对小鼠血糖的控制优于索马鲁肽，具备更好的血糖控制能力。
实施例4：小鼠中减重效果的研究
(1)实验材料
a.实验制剂：
配制GLP-1衍生物注射液(HS-Y1和HS-Y2)，具体配方为1.133mg/mL Na2HPO4，5.5mg/mL苯酚，14.0mg/mL丙二醇，以及GLP-1衍生物0.045mg/mL。
b.动物实验：
选取健康SPF级雄性6-8周龄的KM小鼠，体重18-20g，分为正常饮食组(ND组)、高脂饲料组(HFD组)，其中ND组饲喂普通维持饲料，HFD组饲喂60％高脂饲料，饲喂周期为12-18周；
对HFD组检测体重，筛除未成模小鼠，剩下小鼠依据体重随机分组，每组5只，分为模型对照组(空白溶剂)、阳性对照组(索马鲁肽，0.45mg/kg)、实验组1(HS-Y1，0.45mg/kg)、实验组2(HS-Y1，0.75mg/kg)、实验组3(HS-Y2，0.45mg/kg)、实验组4(HS-Y2，0.75mg/kg)；
(2)实验方法
a.给药方式：
每两天给药一次，给药途径为腹腔注射，给药四次，具体给药剂量等内容见表4：
表4
Figure GDA0003914750120000171
b.检测指标：
体重：每次给药时对体重进行检测；
(3)实验结果
本实施例测试结果如表5所示，对应图2所示的柱状图：
表5
Figure GDA0003914750120000181
由表5和图2可知，本发明的HS-Y1和HS-Y2虽然将氨基酸序列中第7位的H变为了Y，但其出人意料的仍保持了良好的GLP-1活性，具备良好的减重能力，且其效果也是优于索马鲁肽的。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 北京惠之衡生物科技有限公司
吉林惠升生物制药有限公司
<120> 一种酰化的长效GLP-1衍生物
<130> KP2212392.2
<150> 2022103818172
<151> 2022-04-12
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Lys Trp Leu Val Arg Gly Gly Arg
20 25 30
<210> 3
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttcaaatttg aatttaaatt tgaagatgac gatgataaat atgtggaagg caccttcacg 60
agcgacgtga gtagctatct ggaggaacaa gcggcgcgcg aatttattaa atggttagtg 120
cgcggccgcg gc 132
<210> 4
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcaaatttg aatttaaatt tgaggacgat gacgataaat atgtggaagg cacctttacg 60
agcgatgtga gcagctatct ggaagaacaa gcggcgcgcg aatttattaa atggctggtg 120
cgcggcggcc gc 132

Claims (10)

1.一种编码包含GLP-1(7-37)类似物的融合多肽的基因片段，其序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的基因片段。
3.一种表达GLP-1(7-37)类似物的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包含权利要求2所述的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组表达载体为重组pET-30a(+)表达载体，所述重组工程菌为重组BL21大肠杆菌工程菌。
5.根据权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于，所述工程菌按照如下方法构建：
(1)合成权利要求1所述的基因片段；
(2)将步骤(1)合成的所述基因片段连接至表达载体pET-30a(+)中，构建得到重组表达载体；
(3)将步骤(2)构建的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组工程菌。
6.根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，所述方法的步骤(2)为：将步骤(1)中所述基因片段插入表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间，构建得到所述重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述方法的步骤(3)为：将所述重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，筛选得到所述重组工程菌。
8.一种权利要求3-7中的任一项所述重组工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
(1)合成权利要求1所述的基因片段；
(2)将步骤(1)合成的所述基因片段连接至表达载体pET-30a(+)中，构建得到重组表达载体；
(3)将步骤(2)构建的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组工程菌。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述方法的步骤(2)为：将步骤(1)中所述基因片段插入表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间，构建得到所述重组表达载体。
10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述方法的步骤(3)为：将所述重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，筛选得到所述重组工程菌。
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