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CN117957254A - 抗pvrig抗体及其应用 - Google Patents

抗pvrig抗体及其应用 Download PDF

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CN117957254A
CN117957254A CN202380010496.8A CN202380010496A CN117957254A CN 117957254 A CN117957254 A CN 117957254A CN 202380010496 A CN202380010496 A CN 202380010496A CN 117957254 A CN117957254 A CN 117957254A
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China
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seq
amino acid
acid sequence
cancer
variable region
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CN202380010496.8A
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丁焕弟
惠希武
姚兵
淡墨
王瑞欢
冯静
刘洁茹
王明晓
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Jushi Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Jushi Biopharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种抗人PVRIG的抗体或其抗原结合片段，以及其在制备用于治疗PVRIG异常表达相关的疾病例如癌症的药物中的应用。

Description

抗PVRIG抗体及其应用 技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段及其用途。
背景技术
人PVRIG(poliovirus receptor-related immunoglobin domain-containing protein，脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域包含蛋白)又称CD112受体(CD112R)，是脊髓灰质炎病毒受体样蛋白(poliovirus receptor-like protein，PVR)家族中一种约34kda的蛋白。该基因编码一个跨膜蛋白，由一个胞外IgV结构域、一个跨膜结构域和一个长的胞内结构域组成。PVRIG(CD112R)主要表达在T细胞及NK细胞上，对免疫功能起调节作用，当PVRIG与其在抗原呈递细胞上的配体PVRL2(CD112，Nectin-2)结合时会抑制免疫激活。另外，PVRIG还可以通过与CD226竞争性结合其配体而阻断其传递的刺激信号，来发挥免疫抑制的效果。这与其同一家族成员TIGIT发挥免疫抑制的作用机制类似，并且两者可能在免疫抑制上产生协同作用。临床中发现，PVRL2在包括乳腺癌和卵巢癌在内的多种肿瘤类型中存在过度表达，表明其与PVRIG的相互作用可能是这些疾病免疫抑制的一种主要机制。因此，靶向PVRIG的治疗策略有潜力作为单药、双抗或联合疗法应用于临床。目前进度最快的是Compugen的COM-701和Surface Oncology的SRF813处于临床研究阶段，尚无上市产品。
为了给患者提供更多元化的治疗方案，本发明获得了具有更高亲和力的识别细胞表面上PVRIG的抗体，并且相对于SRF813(专利US20210253699A1)，本发明的抗体可更大程度上的阻断细胞水平的PVRIG与CD112的结合。此外，动物体内实验数据证实本发明获得的抗体能有效的抑制肿瘤细胞的过度增殖。
发明内容
一方面，本发明涉及一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括:
(1)包含如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HCDR3；和/或包含如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的LCDR3；
(2)包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:18或 SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的HCDR3；和/或包含如SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的LCDR3；或
(3)包含如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的HCDR3；和/或包含如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LCDR3。
在本发明的一个具体实施方案中，提供一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括:
(1)包含如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HCDR3；和包含如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的LCDR3；
(2)包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的HCDR3；和包含如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的LCDR3；
(3)包含如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的HCDR3；和包含如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LCDR3。
在本发明的一个实施方案中，提供一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区，其中：
(1)重链可变区包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(2)重链可变区包含选自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的氨基酸序列；或
(3)重链可变区包含选自SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，提供一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区，其中：
(1)重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；
(2)重链可变区包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；或
(3)重链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，提供一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区，其中：
(1)重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，和轻链可变区包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；
(2)重链可变区包含如SEQ ID NO:32所示氨基酸序列，和轻链可变区包含如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列；或
(3)重链可变区包含如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列，和轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，提供一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区，其中：
(1)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；
(2)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；或
(3)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列。
在本发明的一个实施方案中，提供一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区，其中：
(1)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:47所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区序列包含选自与SEQ ID NO:50所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；
(2)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:32所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:35所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；或
(3)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列。
在本发明的一个实施方案中，提供一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区，其中：
(1)重链可变区序列包含选自与SEQ ID NO:47所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和轻链可变区序列包含选自与SEQ ID NO:50所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；
(2)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:32所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:35所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；或
(3)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列。
在本发明的一个实施方案中，所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段优选是单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段是人源化或人抗体或其部分。
在本发明的一个实施方案中，所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段还包括Fc区。
在本发明的一个实施方案中，所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段为IgG1或IgG4抗体或其部分。
在本发明的一个实施方案中，所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段还包括Fc区变体。
在本发明的一个实施方案中，所述Fc变体与天然Fc区序列相比，包含由于具有至 少一个氨基酸突变，而与“天然”或“野生型”Fc区序列不同的氨基酸序列。优选地，与天然Fc区序列或与亲本多肽的Fc区序列相比，Fc变体具有至少一个氨基酸取代，例如在天然Fc区序列中或在亲本多肽的Fc区序列中从约一个至约十个氨基酸取代，且优选从约一个至约五个氨基酸取代。本文的Fc区变体将优选与天然Fc区序列和/或与亲本多肽的Fc区序列具有至少约80％同源性，且最优选与之具有至少约90％同源性，更优选与之具有至少约95％同源性。
在本发明的一个实施方案中，所述Fc区变体是IgG1Fc变体序列。
在本发明的一个实施方案中，所述IgG1Fc变体中突变发生在239位丝氨酸、330位丙氨酸或332位异亮氨酸。
在本发明的一个实施方案中，所述IgG1Fc变体中突变发生在239位丝氨酸、330位丙氨酸和332位异亮氨酸。
在本发明的一个实施方案中，所述IgG1Fc变体中突变包括S239D、A330L和I332E三个点突变。
本发明的Fc变体按照组成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如，P329G是相对于亲本Fc多肽在329位用甘氨酸取代脯氨酸的Fc变体，其中编号按照EU索引。野生型氨基酸的身份可以不指定，在这种情况下，前述变体称为P329G。对于本发明中讨论的Fc区所有位置，编号按照EU索引。EU索引或Kabat中的EU索引或EU编号方案指，EU抗体的编号(Edelman等,Proc Natl Acad Sci USA 63(1969)78-85，在此整体引入作为参考)。
在本发明的一个实施方案中，所述抗人PVRIG抗体的抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv、dAb或CDR。
除非另外指出，否则本文中可变区氨基酸编号是根据Kabat编号规则确定。
本发明另一方面提供了一种编码前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。
本发明第三方面提供了包含前述的核酸分子的表达载体。
本发明第四方面提供了包含前述的表达载体的宿主细胞。
本发明第五方面提供了制备前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养前述的宿主细胞，从而使该核酸分子被表达。
在本发明的一个实施方案中，所述制备前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段的方法，还包括从宿主细胞培养物中回收抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段的步骤。
本发明第六方面提供了一种抗体-药物偶联物，其包含与治疗剂相连的前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段。
本发明第七方面提供了一种双特异性分子，其包含与靶向另一抗原表位或另一抗原的肽相连的前述的抗PVRIG抗体或其抗原结合片段。
本发明的第八方面提供了一种组合物，其包括前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子。任选地，所述组合物包含药学可接受的载体。
本发明第九方面提供了前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物在制备用于调控受试者中免疫应答的药物中的用途。
本发明第十方面提供了调控受试者中免疫应答的方法，包括向受试者施用治疗有效量的前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物。
本发明第十一方面提供了前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物，其用于调控受试者中免疫应答。
本发明第十二方面提供了前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物在制备用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的药物中的用途。
本发明第十三方面提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用治疗有效量的前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物。
本发明第十四方面提供了前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物，其用于抑制受试者中肿瘤细胞生长。
在本发明的一个具体实施方案中，所述肿瘤细胞是过度表达PVRIG或PVRL2的肿瘤细胞。在本发明的一个具体实施方案中，所述肿瘤细胞是选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞 状细胞癌、T细胞淋巴瘤、和所述癌症的任何组合的癌症的肿瘤细胞。
本发明第十五方面提供了前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物在制备用于治疗过度增殖性疾病的药物中的用途。
本发明第十六方面提供了治疗过度增殖性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物。
本发明第十七方面提供了治疗有效量的前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物，其用于治疗过度增殖性疾病。
在本发明的一个具体实施方案中，所述过度增殖性疾病为癌症，优选为过度表达PVRL2的癌症。
在本发明的一个具体实施方案中，所述癌症是选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、和所述癌症的任何组合的癌症。
本发明第十八方面提供了前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物在制备用于阻断PVRIG蛋白与CD112蛋白结合的药物中的用途。
本发明第十八方面提供了阻断PVRIG蛋白与CD112蛋白结合的方法，包括向受试者施用治疗有效量的前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物。
本发明第二十方面提供了前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或前述的抗体-药物偶联物，或前述的双特异性分子，或前述的组合物，其用于阻断PVRIG蛋白与CD112蛋白结合。
定义
本文所用的术语“抗体”指由四条多肽链即由二硫键互联的两条重链(H)和两条轻链(L)组成的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含CH1、CH2和CH3三个结构域。每条轻链包含轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着较保守的被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基酸末端到羧基末端按下列次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。互补决定区的氨基酸残基通常为例如轻链可变区的残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)和重链可变区的残基31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，或例如轻链可变区的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)和重链可变区的残基26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk，分子生物学杂志196：901-917(1987)。本申请中氨基酸的编号规则采用Kabat编号规则。
本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”指抗体中保留了与抗原(如人PVRIG)特异性结合能力的一个或多个片段。业已证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的某些片段来实现。抗体的“抗原结合片段”这一术语所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL1和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即由铰链区的二硫键连接的两个Fab'片段组成的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989)Nature241：544-546)；以及(vi)CDR。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码的，但它们可通过重组方法，由一种合成的接头连接在一起而成为单独的相连的链，其中VL和VH区配对而形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参阅例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这样的单链抗体也涵盖在抗体的“抗原结合片段”的术语范围内。其它形式的单链抗体，如双特异抗体也涵盖在内(参阅如Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448)。
术语“人源化抗体”，其包括最小限度的源自非人类免疫球蛋白的序列。在很大程度上，人源化抗体是人类的免疫球蛋白(接受体抗体)，其中接受体的CDR区残基被具有所需特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人类灵长类等非人类物种的(供体抗体)CDR区残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应的非人类残基所取代。而且，人源化抗体可包括在接受体抗体或供体抗体中不存在的残基。这些修饰旨在进一步改善抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个(通常包括两个) 可变区的全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人类免疫球蛋白的相应部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。当人源化抗体中，VH和VL序列全部来自非人类物种时，该人源化抗体为嵌合抗体。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，自然，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
术语“人抗体”在用于本文时意图包括可变区中的框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，那么恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机的或位点特异的诱变或者通过体内体细胞突变导入的突变)。
“同源性”定义为在将序列排列对比并引入缺口(如果需要)而得到同源性的最大百分率之后，氨基酸序列变体中相同残基的百分率。用于排列的方法和计算机程序在本领域众所周知。
表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。典型地，基因表达被置于特定的调节元件(包括组成型和诱导型启动子、组织特异性调节元件，和增强子)的控制之下。这样的基因被称为“可操作地连接于”所述调节元件。
宿主细胞可以是任何含有表达载体的原核或真核细胞。该术语还包含已经过基因工程改造，从而在宿主细胞的染色体或基因组中，或者宿主细胞的细胞中含有经克隆的基因的那些原核或真核细胞，以及转基因动物。
抗体-药物偶联物，是指与治疗剂如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等偶联的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段。细胞毒素包括任何损害细胞的试剂。适宜于形成免疫偶联物的细胞毒素和化疗剂的实例是本领域内周知的。参阅如WO05/103081。
双特异性抗体是具有针对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。如双特异性抗体可以与人PVRIG蛋白的两种不同表位结合。其它这种抗体可将人PVRIG结合位点与针对其他抗原的结合位点组合。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗原结合片段(如F(ab’)2双特异性抗体)。
“治疗有效量”这一短语意为对受药对象能产生预期作用的量。确切的剂量将取决于治疗目的、治疗对象的年龄和体形大小、给药途径等，并可由本领域专业人员利用已知技术确定(例如参阅Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)。如果是治疗癌症，则药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；减少肿瘤的大小；抑制(即减慢至一定程度，优选终止)癌细胞浸润到外周器官中；抑 制(即减慢至一定程度，优选终止)肿瘤转移；在一定程度上，抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上，缓解与癌症相关的一或多种症状。
在用于本文时，术语“受试者”包括任何人类或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
附图说明
图1嵌合抗体与可溶性PVRIG的结合实验结果。
图2人源化抗体与可溶性人源PVRIG蛋白的结合实验结果。
图3人源化抗体与可溶性食蟹猴PVRIG的结合实验结果。
图4人源化抗体与过表达人PVRIG的细胞表面上PVRIG的结合实验结果。
图5人源化抗体与过表达食蟹猴PVRIG的细胞表面上PVRIG的结合实验结果。
图6人源化抗体阻断PVRIG蛋白与CD112蛋白结合的ELISA检测实验结果。
图7人源化抗体阻断PVRIG蛋白与CD112细胞结合流式检测实验结果。
图8人源化抗体阻断PVRIG与CD112细胞结合的报告基因检测实验结果。
图9A嵌合抗体抑制A375荷瘤小鼠移植瘤的体积变化结果。
图9B嵌合抗体对A375荷瘤小鼠体重的影响结果。
图9C嵌合抗体抑制A375荷瘤小鼠移植瘤单个肿瘤体积的变化结果。
图10抗PVRIG单抗及联合抗PD-1单抗对人黑色素瘤A375混合PBMC皮下移植瘤体积的影响图。
图11食蟹猴单次静脉注射抗PVRIG单抗后的药时曲线。
具体实施方式
实施例1：抗人PVRIG单克隆抗体的获得
使用重组人PVRIG胞外结构域蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示)免疫健康的BALB/c小鼠，初次免疫后，每隔14天进行加强免疫，共免疫4次。通过流式细胞仪检测小鼠血清效价，选择血清抗体滴度高的小鼠进行细胞融合。融合前3天通过尾静脉注射PVRIG胞外结构域蛋白进行冲击免疫。融合当天对小鼠进行安乐死，无菌环境下取出小鼠脾脏制备成单细胞悬液，将SP2/0细胞与脾细胞按1:1的比例混合，采用电融合的方法进行融合。将融合后的细胞铺在96孔细胞培养板中，每孔含1-3个杂交瘤细胞。加入选择介质(HAT培养液)后在37液，CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况10天左右进行筛选。
重组人PVRIG胞外结构域蛋白序列：
选取高亲和力的抗体通过提取RNA、反转录及PCR扩增，获得鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区片段，进行测序。最终获得了1B10E8、21F10C10和43F7C9克隆的重链和轻链CDR区和可变区的氨基酸序列如下：
1B10E8
重链CDR1：SYWMH(SEQ ID NO:1)
重链CDR2:EINPSNGLTNYNEQFRN(SEQ ID NO:2)
重链CDR3:HHGSTYYALDS(SEQ ID NO:3)
重链可变区序列
1B10E8
轻链CDR1：KSSQSLLNSINQKNFLA(SEQ ID NO:4)
轻链CDR2：FASTRES(SEQ ID NO:5)
轻链CDR3：QQHYSTPPT(SEQ ID NO:6)
轻链可变区序列
21F10C10
重链CDR1：NNFIE(SEQ ID NO:17)
重链CDR2:VINPGSGDANYNEKFKG(SEQ ID NO:18)
重链CDR3:HWLAY(SEQ ID NO:21)
重链可变区序列
21F10C10
轻链CDR1：KSSQSLLSSGNQKNYLA(SEQ ID NO:22)
轻链CDR2：GASTRES(SEQ ID NO:24)
轻链CDR3：QNGHFYPYT(SEQ ID NO:26)
轻链可变区序列
43H7C9
重链CDR1：SDYAWN(SEQ ID NO:36)
重链CDR2:YIRYNGNTNYNPSLKS(SEQ ID NO:37)
重链CDR3:IYYDYDGFVY(SEQ ID NO:38)
重链可变区序列
43H7C9
轻链CDR1：RASQNVYENLH(SEQ ID NO:39)
轻链CDR2：FASDSIS(SEQ ID NO:40)
轻链CDR3：LQLYSTPYT(SEQ ID NO:41)
轻链可变区序列
注：上述抗体序列中，下划线为CDR序列(根据kabat编号系统确定并注释)。
实施例2：ELISA法检测嵌合抗体的亲和力
根据上述单克隆抗体编码基因的可变区序列信息，构建人鼠嵌合抗体表达载体。将VH和VL分别构建到含有hIgG1-kappa恒定区的真核表达载体上。将获得的真核表达载体，瞬转入HEK-293细胞中，培养6天。收获培养上清通过Protein A进行纯化，获得目标抗体，分别命名为21F10C10-hIgG1和43F7C9-hIgG1，采用ELISA法测定抗体与重组PVRIG蛋白的亲和力。将PVRIG胞外全长蛋白稀释至500ng/ml的浓度包被酶标板，PBST缓冲液洗板3次，然后加入200μl含2％BSA的PBS缓冲液，37液封闭2h，完成封闭后用PBST缓冲液洗板3次；加入3倍梯度稀释的待测抗体(0-33.3nM)，373孵 育2h，PBST缓冲液洗板3次。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体，37，孵育1h，PBST缓冲液洗板3次。加入TMB单组份显色液显色，加入终止液后读取吸光值。所得亲和力如图1及表1所示。
表1嵌合抗体亲和力的EC50值
21F10C10-hIgG1和43F7C9-hIgG1与PVRIG蛋白结合的EC50分别为0.1222nM及0.2901nM。
实施例3：抗体人源化
使用Discovery Studio和Antibody Modeling进行同源建模。通过结构模拟与理性设计，获得与鼠源抗体框架区最接近的人源框架区。
将轻链和重链的CDR分别移植到匹配的轻链和重链基因的框架序列上，即获得人源化抗体Hab1B10E8、Hab21F10C10及Hab43F7C9。然后通过Discovery Studio和Antibody Modeling构建3D模型，分析是否存在任何将小鼠氨基酸取代为人氨基酸的框架位置影响结合和/或CDR构象的位点，进行回复突变。序列见表2及表3(表2和表3中，CDR区编号规则均采用Kabat编号规则)。将获得的回复突变进行组合表达，表达的抗体组合见表4、5、6。
表2具有VH回复突变的序列(CDR编号为kabat)
表3具有VL回复突变的序列
表4 1B10E8人源化抗体组合示意图
表5 21F10C10人源化抗体组合示意图
表6 43F7C9人源化抗体组合示意图
实施例所使用的抗体恒定区序列如下：
IgG1恒定区
IgG4恒定区
IgG1恒定区，Fc包含S239D-A330L-I332E突变，简称DLE突变
实施例4：人源化抗PVRIG抗体亲和力检测
4.1 Fortebio检测人源化抗体与人PVRIG蛋白的亲和力
使用HIS1K生物传感器，将人的PVRIG-His蛋白固定在生物传感器上，至0.3nm的结合响应阈值。在120s基线步骤后，将传感器分别浸入用0.02％PBST缓冲液稀释的抗PVRIG抗体中，抗体起始浓度为25nM，2倍浓度梯度稀释，设置7个梯度。固化物与分析物结合和解离时间分别为120s和300s。根据结合曲线由分析软件，回归计算出抗原抗体的亲和力数据。在所有检测抗体中Hab1B10E8.6、Hab21F10C10.12及Hab43F7C9.12表现出最高的亲和力和较少的回复突变，结果如表7所示。
表7 Fortebio检测人源化抗体与人PVRIG蛋白的亲和力
4.2 ELISA检测人源化抗体与人PVRIG蛋白的亲和力
采用ELISA方法测定人源化抗体与重组人PVRIG蛋白的亲和力，将PVRIG蛋白稀释至500ng/ml包被酶标板；封闭完成后加入3倍梯度稀释的抗体(0-66.7nM)，经过山羊抗人二抗孵育后显色读数，结果通过GraphPad拟合后所得亲和力如图2及表8所示。
表8 ELISA检测人源化抗体亲和力的EC50值
Hab1B10E8.6、Hab21F10C10.12和Hab43F7C9.12与人源PVRIG蛋白结合的EC50分别为0.0869nM、0.1646nM和0.1447nM。
4.3 ELISA检测人源化抗体与食蟹猴PVRIG蛋白的亲和力
采用ELISA方法测定人源化抗体与重组食蟹猴(Cyno)PVRIG蛋白的亲和力，将Cyno-PVRIG蛋白稀释至500ng/ml包被酶标板；封闭完成后加入3倍梯度稀释的抗体(0-33.3nM)，山羊抗人二抗孵育1h后洗板显色读数，结果通过GraphPad拟合后所得亲和力如图3及表9所示。
表9 ELISA检测人源化抗体与Cyno-PVRIG蛋白亲和力的EC50值
抗体Hab1B10E8.6、Hab21F10C10.12和Hab43F7C9.12与Cyno-PVRIG蛋白结合EC50值与抗体和人PVRIG蛋白亲和力EC50值相差不大。
实施例5：人源化抗体与过表达人PVRIG的细胞的结合
将Hab1B10E8.6、Hab21F10C10.12、Hab43F7C9.12及SRF813(CDR区序列来自US20210253699A1的克隆46，HV的氨基酸序列如该专利申请中SEQ ID NO:912所示，LV的氨基酸序列如该专利申请中SEQ ID NO:918所示)抗体表达后，使用过表达人PVRIG的细胞系Jurkat-hPVRIG评估人源化抗体与细胞表面PVRIG的结合能力。细胞以2×106/ml的密度，100μl/孔接种于96孔板中。加入4倍梯度稀释的抗体(0-66.7nM)，4℃孵育1h。加入山羊抗人二抗，4℃加避光标记45min，收集细胞清洗后通过流式细胞仪读取细胞的荧光强度。实验结果如图4及表10所示，结果表明：人源化抗体可以剂量依赖性结合细胞系上表达的PVRIG蛋白。同时，Hab43F7C9.12在识别细胞表面PVRIG的亲和力优于对照分子SRF813。
表10人源化抗体与Jurkat细胞表面PVRIG结合实验
实施例6：人源化抗PVRIG抗体与过表达食蟹猴PVRIG的细胞的结合
为了表征我们筛选的抗体对细胞膜上食蟹猴PVRIG分子的识别能力，我们构建了可以稳定表达猴源全长PVRIG的293T细胞。将细胞以2×106/ml的密度，100μl/孔接种于96孔板。用FACS缓冲液洗三次，弃上清。加入PBS缓冲液梯度稀释的抗体(0-2.5nM)，4℃孵育1h。用FACS缓冲液洗涤细胞3次，随后用AlexaFluor488标记的山羊抗人IgG抗体在4℃避光标记45min。用FACS缓冲液洗涤细胞3次，通过流式细胞仪读取细胞的荧光强度。实验结果如图5及表11所示，实验结果表明：人源化抗体可以剂 量依赖性结合细胞系上表达的猴PVRIG蛋白。
表11人源化抗体与293T-cynoPVRIG细胞表面PVRIG结合实验
实施例7：抗PVRIG抗体功能性验证
通过ELISA阻断实验、FACS阻断实验和报告基因实验来验证PVRIG抗体的生物学功能。
7.1抗体阻断人PVRIG蛋白与人CD112蛋白的结合
采用ELISA法测定人源化PVRIG抗体阻断人CD112蛋白与人PVRIG蛋白的结合。将CD112-His蛋白稀释至1μg/ml的浓度包被酶标板，将3倍梯度稀释的抗体(0-133nM)与PVRIG-hFc蛋白混合后加入包被好的酶标板中，37゜C孵育1h，洗板后加入HRP标记的山羊抗人Fc抗体在37゜C孵育1h。洗板后加入显色液，5min后加入终止液并读数。抗体所得阻断结果通过GraphPad拟合后如图6及表12所示。结果表明，人源化抗体可以较好的阻断CD112与PVRIG蛋白的结合,同时，Hab1B10E8.6、Hab21F10C10.12和Hab43F7C9.12ELISA阻断能力上优于对照分子SRF813。
表12人源化抗体阻断PVRIG与CD112蛋白结合实验
7.2抗体阻断PVRIG与293T-PVRL2细胞的结合
采用流式细胞仪测定人源化抗体阻断PVRIG蛋白与过表达CD112的293T细胞的结合。将处于对数期的293T-CD112细胞消化后稀释至1E6/ml，于流式板中每孔加入50μl，同时加入3倍梯度稀释的抗体样品25μl(0-300nM)以及1ug/ml的PVRIG-hFc蛋白25μl，4℃孵育1h。用FACS缓冲液洗涤细胞3次，随后加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗人IgG抗体在4℃避光标记50min。用FACS缓冲液洗涤细胞3次，通过流式细胞 仪读取细胞的荧光强度。阻断结果如图7及表13所示。结果表明人源化抗体呈剂量依赖性阻断PVRIG与293T-CD112细胞结合。
表13人源化抗体阻断PVRIG与CD112细胞结合实验
7.3报告基因方法检测人源化抗体阻断PVRIG与CD112的结合
取对数生长期的CD112/TCRActivator/CHO细胞，消化后离心，将细胞密度调整为4E5/ml,每孔100μl接种到白壁透明底96孔板中，37℃过夜培养。第二天移除培养上清，加入用RPMI1640培养基3倍梯度稀释的抗体样品50μl(0-66.7nM)，加入对数生长期的稳定表达PVRIG的效应细胞50μl，细胞密度为4E5/ml，置于37℃培养箱中培养6小时，通过Bright-GloTM萤光素酶检测系统检测。报告基因结果如图8及表14所示；结果表明：人源化抗体可以较好的阻断CD112细胞与PVRIG细胞的结合,同时，Hab1B10E8.6、Hab21F10C10.12和Hab43F7C9.12ELISA阻断能力明显上优于对照分子SRF813-IgG1。
表14人源化抗体阻断PVRIG与PVRL2细胞结合实验
实施例8：抗PVRIG嵌合抗体的动物体内生物学活性
在肿瘤异种移植模型中评估了21F10C10-hIgG1、43H7C9-hIgG1嵌合抗体的单一治疗功效。将4×106个A375黑素瘤细胞和5×105人PBMC混合后与基质胶1：1接种到NCG免疫缺陷小鼠中。在移植当天，通过腹膜内注射20mg/kg的21F10C10、43H7C9嵌合抗体以及PBS对照，并每周注射两次。在对照组中，平均肿瘤体积在治疗28天为2387.34±95.79mm3(平均值±标准误差)。与对照组相比，43H7C9组减小了肿瘤生长，造成43.93％的肿瘤抑制及1338.48±296.09mm3的肿瘤体积，21F10C10组减小了肿瘤生长，造成20.83％的肿瘤抑制及1890.09±568.21mm3的肿瘤体积(图9A)。各实验组的体重变化并不显著(图9B)，表明治疗得到了良好的耐受。单个肿瘤体积的结果显示在图9C(图9C多条线的含义代表多只小鼠)中。
实施例9：抗PVRIG人源化抗体的动物体内生物学活性
在肿瘤异种移植模型中评估Hab21F10C10.12-DLE(Fc包含DLE突变，恒定区序列见SEQ ID NO:53)、43H7C9.12-DLE(Fc包含DLE突变，恒定区序列见SEQ ID NO:53)人源化抗体功效。NCG小鼠到达设施后，适应性饲养至少2天。体外将冻存的人PBMC复苏计数，与经丝裂霉素C(Mitomycin C)处理后的A375黑素瘤细胞共培养。共培养后收集PBMC，与指数生长期的新鲜A375黑素瘤细胞混合，PBS重悬至合适浓度接种于NCG小鼠皮下。在移植当天，按照小鼠体重随机分组，腹膜内给予上文所述抗PVRIG单抗，20mg/kg，并每隔一天注射一次，并量取肿瘤体积。在对照组中，平均肿瘤体积在治疗13天为201.9±53.6(平均值±标准误差)。与对照组相比，43H7C9.12-DLE组减小了肿瘤生长，造成27.3％的肿瘤抑制及146.8±45.0的肿瘤体积。43H7C9.12-DLE+SG-001(一种PD-1抗体，序列见下文)组造成61.5％的肿瘤抑制及77.8±52.6的肿瘤体积。21F10C10.12-DLE+SG-001组造成74.2％的肿瘤抑制及52.2±10.1的肿瘤体积(图10)。
SG-001重链
SG-001轻链
实施例10：抗PVRIG人源化抗体的药代动力学特征
食蟹猴单次静脉输注43H7C9.12-DLE人源化抗体后(20mg/kg)通过检测血清中的药物浓度，考察抗PVRIG单抗在食蟹猴体内药代动力学特征。2只雄性食蟹猴经静脉输 注20mg/kg的抗PVRIG单抗，在药前及药后采集全血样品并分离血清。采用ELISA方法检测血清样本中抗PVRIG单抗含量，并得到PK参数。在该剂量下半衰期约为227小时，结果如图11及表15所示，其中M1和M2代表2只食蟹猴。
表15食蟹猴单次静脉输注抗PVRIG单抗后PK参数

Claims (26)

  1. 抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括:
    (1)包含如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HCDR3；和/或包含如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的LCDR3；
    (2)包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的HCDR3；和/或包含如SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的LCDR3；或
    (3)包含如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的HCDR3；和/或包含如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LCDR3。
  2. 权利要求1所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括:
    (1)包含如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HCDR3；和包含如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的LCDR3；
    (2)包含如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的HCDR3；和包含如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的LCDR3；
    (3)包含如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的HCDR1，包含如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的HCDR2，和包含如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的HCDR3；和包含如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的LCDR1，包含如SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的LCDR2，和包含如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的LCDR3。
  3. 权利要求1-2任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中：
    (1)重链可变区包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
    (2)重链可变区包含选自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35的氨基酸序列；或
    (3)重链可变区包含选自SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的氨基酸序列。
  4. 权利要求3所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中：
    (1)重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；
    (2)重链可变区包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；或
    (3)重链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
  5. 权利要求4所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和轻链可变区序列，其中：
    (1)重链可变区包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，和轻链可变区包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；
    (2)重链可变区包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，和轻链可变区包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；或
    (3)重链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，和轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
  6. 抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中：
    (1)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；
    (2)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；或
    (3)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列。
  7. 权利要求6所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区和/或轻链可变区序列，其中：
    (1)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:47所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:50所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；
    (2)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:32所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:35所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列；或
    (3)重链可变区包含选自与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，和/或轻链可变区包含选自与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列。
  8. 权利要求1-7任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其是人源化或人抗体或其部分。
  9. 权利要求1-8任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其为IgG1或IgG4抗体或其部分。
  10. 权利要求1-9任一项所述的抗原结合片段，其选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv、dAb或CDR。
  11. 权利要求1-10任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗体的Fc区存在突变，优选地，所述Fc突变包括S239D、A330L和I332E中的至少一种突变；进一步优选地，所述Fc区突变同时包括S239D、A330L和I332E三点突变。
  12. 编码权利要求1-11任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。
  13. 包含权利要求10所述的核酸分子的表达载体。
  14. 包含权利要求13所述的表达载体的宿主细胞。
  15. 制备权利要求1-11任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养权利要求14所述的宿主细胞，从而使该核酸分子被表达。
  16. 如权利要求15所述的方法，还包括从宿主细胞培养物中回收抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段的步骤。
  17. 抗体-药物偶联物，其包含与治疗剂相连的权利要求1-11任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段。
  18. 双特异性分子，其包含与靶向另一抗原表位或另一抗原的肽相连的权利要求1-11任一项所述的抗PVRIG抗体或其抗原结合片段。
  19. 组合物，其包括权利要求1-11任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或权利要求17所述的抗体-药物偶联物，或权利要求18所述的双特异性分子。
  20. 权利要求1-11任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或权利要求17所述的抗体-药物偶联物，或权利要求18所述的双特异性分子，或权利要求19所述的组合物在制备用于调控受试者中免疫应答的药物中的用途。
  21. 权利要求1-11任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或权利要求17所述的抗体-药物偶联物，或权利要求18所述的双特异性分子，或权利要求19所述的组合物在制备用于阻断PVRIG蛋白与CD112蛋白结合的药物中的用途。
  22. 权利要求1-11任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或权利要求17所述的抗体-药物偶联物，或权利要求18所述的双特异性分子，或权利要求19所述的组合物在制备用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的药物中的用途。
  23. 权利要求22所述的用途，其中所述肿瘤细胞是选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤和所述癌症的任何组合的癌症的肿瘤细胞。
  24. 治疗有效量的权利要求1-11任一项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，或权利要求17所述的抗体-药物偶联物，或权利要求18所述的双特异性分子，或权利要求19所述的组合物在制备用于治疗过度增殖性疾病的药物中的用途。
  25. 权利要求24所述的用途，其中所述过度增殖性疾病为癌症；优选地，所述癌症是选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤和所述癌症的任何组合的癌症。
  26. 权利要求20-25的任一项所述的用途，其中所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段与抗PD-1抗体或其抗原结合片段组合。
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