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CN114644711B - 重组抗人pvrig抗体及应用 - Google Patents

重组抗人pvrig抗体及应用 Download PDF

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CN114644711B CN202210215492.0A CN202210215492A CN114644711B CN 114644711 B CN114644711 B CN 114644711B CN 202210215492 A CN202210215492 A CN 202210215492A CN 114644711 B CN114644711 B CN 114644711B
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Abstract

本发明公开了一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，所述VH包括抗原决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VL包括抗原决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。人源化抗人PVRIG抗体能够特异性结合PVRIG，展现出良好的临床抗肿瘤应用前景。

Description

重组抗人PVRIG抗体及应用
技术领域
本发明涉及生物药物领域。具体而言，本发明涉及一种新型的经人工设计的PVRIG抗体。本发明还涉及这些结合PVRIG的抗体的治疗和诊断用途，特别是在治疗、预防和/或诊断PVRIG相关疾病，例如肿瘤中的用途。
背景概述
目前，癌症抗体治疗已逐渐建立起来，成为了治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤最成功及最重要的策略之一。这种疗法可通过改变抗原或受体的功能(例如采用激动剂或拮抗剂)或将特异性药物偶联到靶向特定抗原的抗体上来发挥功能。
一种含有脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的蛋白(poliovirusreceptor-associated immunoglobulin domain-containing protein，PVRIG)，通过与CD112配体结合来独立地介导抑制信号，同时也与CD226竞争配体而阻断其传递的刺激信号，从而实现对T细胞功能的负调控，但不与CD155结合。PVRIG与肿瘤细胞表面的配体CD112具有高亲和力，结合后可以抑制淋巴细胞的细胞作用，阻止其与在肿瘤细胞上过度表达的CD112受体的相互作用，从而驱动NK细胞和T细胞的激活并发挥免疫效用。实验证明PVRIG和TIGIT是CD8+T细胞上有效抑制受体，靶向这两个靶点干预可以有效的强体外抗肿瘤反应
但是现有抗体治疗存在临床上有效率偏低的问题，对于绝大多数癌种来说，如果不加选择地使用，有效率平均只有10％-20％。由此，抗肿瘤领域更加有效的抗体类药物分子有待研究。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中，肿瘤治疗的问题，具体来说，解决肿瘤靶向抗体分子疗效低的技术问题。为此，本发明的一个目的在于提供一种特异性结合PVRIG的抗体或抗原结合片段。
PVRIG与肿瘤细胞表面的配体CD112具有高亲和力，结合后可以抑制淋巴细胞的细胞作用，阻止其与在肿瘤细胞上过度表达的CD112受体的相互作用，从而驱动NK细胞和T细胞的激活并发挥免疫效用。
因而，根据本发明实施例的一个方面，提供了一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，所述VH包括抗原决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VH CDR1包含与SEQ ID NO：11氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述VH CDR2包含与SEQ ID NO：12氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述VH CDR3包含与SEQ ID NO：13氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；所述VL包括抗原决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL CDR1包含与SEQ ID NO：14氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述VL CDR2包含与SEQID NO：15氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述VL CDR3包含与SEQ ID NO：16氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
根据本发明实施例的PVRIG抗体或抗原结合片段，可以与人PVRIG结合，且结合人PVRIG活性，和抑制hPVRL2结合人PVRIG的活性，均优于对照抗体，并且亲和力强，对人PVRIG的特异性高，展现出良好的临床抗肿瘤应用前景。
另外，根据本发明上述实施例的抗体或抗原结合片段，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述VH包括与SEQ ID NO：3具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：4具有至少80％同一性氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：8具有至少80％同一性氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括与SEQ ID NO：7具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：10具有至少80％同一性氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括与SEQ ID NO：9具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：8具有至少80％同一性氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括与SEQ ID NO：9具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：10具有至少80％同一性氨基酸序列。进一步说明的是，该抗体或抗原结合片段的VH和VL序列可以是在SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸的插入、删除、突变或修饰等得到的。
根据本发明的实施例，所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段与猴PVRIG具有交叉反应，与鼠PVRIG则无结合活性。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。例如，本发明实施例的抗体仅特异性结合PVRIG。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或人源化抗体。人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，经改造后与人的靶点结合，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体，例如，本发明实施例的抗体或抗原结合片段经人源化后，可以与人的PVRIG特异性结合。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是特异性结合人PVRIG的抗体片段，且选自Fv、Fab、Fab'、scFv和F(ab')2。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸。根据本发明的实施例，所述分离的多核苷酸编码前述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述分离的多核苷酸编码前项所述的PVRIG抗体或抗原结合片段。由此，由该多核苷酸编码的多肽可以与PVRIG特异性结合。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸。根据本发明的实施例，所述分离的多核苷酸编码前述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述分离的多核苷酸编码前项所述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区，或轻链或重链。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前述一种或多种多核苷酸。
根据本发明的实施例，所述载体包含前述两种多核苷酸，且所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PVRIG。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种载体对。根据本发明的实施例，所述每个载体对包含前述多核苷酸中的一种，其中所述载体对共同编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PVRIG。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种宿主细胞。根据本发明的实施例，所述宿主细胞包含有前述的载体、或前述的载体对。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包含前述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段、前述多核苷酸、前述载体、前述载体对，或前述宿主细胞；以及可选的药学上可接受的辅料。由此，该组合物可以与PVRIG特异性结合，并且抑瘤效果好，药效佳。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备抗人PVRIG抗体或其结合片段的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：在合适的条件下，培养前述的宿主细胞；分离回收抗人PVRIG抗体或其结合片段。本发明采用体外细胞培养后分离纯化目的蛋白的方法，得到特异性结合PVRIG的抗体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用途。根据本发明的实施例，所述用途包括：前述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段、前述多核苷酸、前述载体、前述载体对、前述宿主细胞或前述组合物在制备癌症诊断试剂中的用途。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用途。根据本发明的实施例，所述用途包括：前述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段、前述多核苷酸、前述载体、前述载体对、前述宿主细胞或前述组合物在制备治疗癌症药物中的用途。
根据本发明的实施例，所述癌症包乳腺癌、结直肠癌、女性生殖系统癌症、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(HCC)、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状细胞癌和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种预防或治疗患有受试者的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括向所述受试者施用有效量的前述抗PVRIG的抗体或其抗原结合片段或前述的药物组合物。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前述的抗PVRIG的抗体或其抗原结合片段。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于药物试剂盒中，可以以本领域已知的任何方式制备药物试剂盒。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测样品中PVRIG的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(a)将样品与前述的抗体或其抗原结合片段接触；以及
(b)检测抗体或其抗原结合片段与PVRIG间的复合物的形成；
任选地，所述抗体是被可检测地标记的。
根据本发明上述实施例，发明人发现，本发明实施例的抗体可以结合并激活PVRIG，具有小于3.97E-10的亲和力，解决现有技术中抗人PVRIG抗体亲和力和特异性不足和不良反应的缺陷，具有良好的抗肿瘤应用前景，稳定性高，亲和力强，具有更高的生物学活性，展现出良好的临床抗肿瘤应用前景。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体结合human PVRIG ELISA活性；
图2显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体抑制hPVRL2结合human PVRIGELISA活性；
图3显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体报告基因生物学活性；
图4显示了根据本发明一个实施例的人源化抗体抑制hPVRL2结合human PVRIGELISA活性；
图5显示了根据本发明一个实施例的抗PVRIG人源化抗体提高CEFT活化PBMC分泌IFN-γ的活性。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合抗原的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链Fv(scFv)片段和单结构域片段。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24:316)。
如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和CH3结构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
术语“结合亲和力”在本文中用作为两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间非共价相互作用强度的度量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。经由单价相互作用的两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间的结合亲和力，可通过测定解离常数(KD)来定量测定。继而，可通过对复合物形成和解离动力学的测量，例如通过SPR方法，来测定KD。对应于单价复合物缔合和解离的速率常数，被分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过等式KD＝kd/ka与ka和kd相联系。根据以上定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对于给定的抗原的结合亲和力的比较，可通过比较各个抗体/抗原复合物的KD值进行比较。类似地，可通过测定，并比较感兴趣的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与不感兴趣的相互作用的KD值，来评价相互作用的特异性。通过众所周知的方法可直接测定该解离常数的值，例如，通过评价配体(例如抗体)对靶的结合能力的标准测定是本领域已知的，并包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准测定，例如SPR，还可评价抗体的结合动力学和结合亲和力。可进行竞争性结合测定，其中，将抗体与靶的结合，和该靶的另外的配体(例如另外的抗体)与该靶结合，进行比较。
抗人PVRIG抗体和其抗原结合片段
本发明提供了特异性结合PVRIG的抗体及其抗原结合片段。根据本发明实施例的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段能异性结合人PVRIG或鼠PVRIG蛋白，并且可以促进PVRIG-CD112信号传导途径，阻止其与在肿瘤细胞上过度表达的CD112受体的相互作用，从而驱动NK细胞和T细胞的激活并发挥免疫效用。
本发明实施例提供了抗PVRIG抗体，包括小鼠抗体1718-525，及其人源化抗体和嵌合抗体。这些嵌合抗体具有来自小鼠抗体的VH和VL。然而，这些嵌合抗体的恒定结构域来自人抗体(例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3、或人IgG4)，嵌合抗体被标记为1718-525HL。此外，本发明实施例还提供了人源化的抗体1718-525H1L0和1718-525H1L1。
一些公开的抗体的CDR序列(Kabat定义)、重轻链可变区、重轻链恒定区的序列在下表1中所示。
表1
本发明实施例还提供了人源化抗体的重链可变区和轻可变区的氨基酸序列。由于存在使小鼠抗体人源化的不同方式(例如，可以用不同的氨基酸取代来修饰序列)，抗体的重链和轻链可以具有一个以上形式的人源化序列。人源化1718-525抗体的重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:5、7和9所示。人源化1718-525抗体的轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、8和10所示。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:5、7和9)中的任一种均可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:6、8和10)中的任一种进行配对。
在一些实施方案中，抗体可以具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含互补决定区CDR1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成；所述VL包含CDR 1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成。
氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％、85％、90％、95％或99％或更高。所述变体可以包含保守性改变。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有重、轻链可变区，所述重、轻链可变区含有选自以下的CDR中的一个、两个或三个：在选定的CDR的一个、两个、或三个上具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO:11-16.
本发明实施例还提供了结合PVRIG的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3。在一些实施方案中，基于本领域已知的各种CDR定义，例如Kabat定义、Chothia定义、或IMGT定义来确定VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列。VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列由表1所示。
核酸、载体和细胞
本发明实施例还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如在表1所示的CDR，或具有如表1所示的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，所述配对的多肽结合PVRIG(例如，人PVRIG)。
本发明实施例还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的载体、引入了重组载体的宿主细胞(即，使得所述宿主细胞含有多核苷酸和/或含多核苷酸的载体)、以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。
如本文所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时能够将一个或多个目标多核苷酸递送至所述宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个目标多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。
可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如用重组病毒)将载体引入到宿主细胞中。因此，载体的非限制性实施例包括病毒载体(可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。
本发明实施例提供了用上文描述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的原核宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。优选地，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS细胞。优选的真菌细胞是酿酒酵母。
制备抗PVRIG抗体的方法
可以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，将人PVRIG的分离片段用作免疫原以产生抗体。可以通过多次注射(例如皮下或腹腔注射)抗原肽或蛋白质而在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，可以将抗原肽或蛋白质与待免疫物种中具有免疫原性的药剂缀合。可以多次向动物注射抗原肽或蛋白质。
免疫原通常用于通过免疫合适的受试者(例如表达至少一个人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的多肽或化学合成的多肽(例如人PVRIG的片段)。制剂可以进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。
药物组合物和用途及治疗方法
本发明实施例还提供了含有本发明实施例所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)的药物组合物。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。
药物组合物还可以含有药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或效力。
本发明提供了一种或多种抗体或其抗原结合片段可以用于多种治疗目的。在一个方面，本公开提供了用于治疗受试者癌症的方法、降低受试者肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低受试者发生另外转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致受试者癌症的一个或多个症状的数量、严重程度和/或持续时间减少。
在一个方面，本公开的特征在于如下方法，所述方法包括向有需要的受试者(例如，患有、或鉴定为患有或诊断为患有癌症的受试者)施用治疗有效剂量的本文公开的抗体或其抗原结合片段，所述癌症是例如乳腺癌、结直肠癌、女性生殖系统癌症、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(HCC)、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状细胞癌和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤。
在一个方面，本发明提供了前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。根据本发明的实施例，所述癌症包括乳腺癌、结直肠癌、女性生殖系统癌症、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(HCC)、子宫内膜癌、胰腺癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状细胞癌和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有癌症风险的患者。可以用本领域已知的多种方法来鉴定患有癌症的患者。
试剂盒
本发明实施例还提供了含有本发明实施例所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)的试剂盒。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于试剂盒中。可以以本领域已知的任何方式制备药物试剂盒。
试剂盒还可以含有：(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂)；(2)酶标记的抗原或抗体(结合物)；(3)酶的底物；(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考标准品和控制血清(定量测定中)；(5)结合物及标本的稀释液；(6)洗涤液，在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05％吐温20磷酸缓冲盐水；(7)酶反应终止液，常用的HRP反应终止液为硫酸。
本发明提供了前述的抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段试剂盒在检测试剂中的用途。根据本发明的实施例，所述检测包括RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real time RTPCR、芯片分析、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等检测实验。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1：鼠抗筛选
(1)动物免疫
采用CHO-K1表达，C末端融合了6个组氨酸标签的Human PVRIG(NP_076975.2)(Met1-Leu150)蛋白。按照常规弗氏佐剂免疫程序免疫4只BALB/c小鼠，分两批进行免疫，每批2只，两批之间间隔两周。每批动物进行4次免疫，采用Human PVRIG his进行ELISA检测，如果动物血清效价>1:100000,则进行动物终免，3-4天之后收集脾脏。
(2)B细胞淘选及培养
在进行正式实验前2天，将饲养细胞使用培养基铺到4个10cm培养皿(corning,cat.430167)中，在正式实验前1天将饲养细胞按照10000个/孔铺96孔板40块(corning,cat.3599)，100μL/孔。同时，使用包被的抗原Human PVRIG his对收集的免疫后小鼠B细胞进行淘选，将淘选获得B细胞铺到上述已经铺有饲养细胞的96孔板中。37℃、5％CO2培养10～14天，取B细胞培养上清进行ELISA和cell-based assay筛选。
(3)鼠抗上清筛选
鼠抗结合Human PVRIG his ELISA筛选：将上述的免疫原Human PVRIG his采用包被缓冲液稀释到1μg/mL，50μL/孔，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次，再用封闭液室温孵育1h，PBST再洗涤3次，将已经形成明显克隆的B细胞孔内上清加入到ELISA板中；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗鼠二抗(1：10000)，50μL/孔；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入TMB 50μL/孔，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值。以阴性对照OD值10倍以上作为阳性判定标准，挑取阳性克隆进行B细胞测序。
实施例2：B细胞测序
按照PureLinkTMRNA Mini Kit说明书提取B细胞克隆mRNA，并分装保存于-80℃；以提取的mRNA作为模板采用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit方案逆转录成cDNA，并分装保存于-80℃。
采用表2和表3所示的重链VH钓取引物和轻链VL钓取引物，以上述cDNA为模板，采用Ex Taq酶扩增VH和VL，然后连接到pMD18T载体进行测序。
表2重链VH钓取引物
表3轻链VL钓取引物
抗体的命名以包含的轻重链(HL)所来自的细胞克隆编号表示，本实验采用1718-525细胞进行克隆，得到鼠源抗体1718-525，其重链可变区和轻链可变区分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
实施例3：嵌合抗体的重组表达及筛选
(1)嵌合抗体重组表达
将实施例2扩增的来自相同克隆的轻重链搭配转染CHO-K1细胞，转染24h后加入10μg/mL MSX加压筛选，待细胞密度和活力恢复后接种进行Feed-batch表达，将表达完成后的上清离心并经protein A纯化，采用BCA法定量抗体浓度后用于定量筛选，所得嵌合抗体命名为“1718-525HL”。
(2)嵌合抗体结合human PVRIG活性筛选
采用COM701作为对照抗体，COM701来源于专利CN110088132B，其中COM701重链见该专利SEQ ID NO：9，轻链见该专利SEQ ID NO：14。Human PVRIG his用包被缓冲液稀释到1μg/mL，按照50μL/孔加入96孔板内，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次；再用封闭液室温孵育1h，PBST再洗涤3次。嵌合抗体从1000ng/mL起始3倍稀释，共稀释8个浓度，按照50μL/孔加入该96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗人二抗(1:10000)，按照50μL/孔加入96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，按照50μL/孔加TMB到96孔板内，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值，结果见表4和图1。由表4可知所获得嵌合抗体1718-525HL结合human PVRIG活性优于对照抗体COM701。
表4嵌合抗体结合human PVRIG活性以及相较于COM701的相对活性
抗体 EC50(ng/mL) 相对活性(％)
1718-525HL 90.14 110.71
COM701 99.79 -
(3)嵌合抗体抑制hPVRL2结合human PVRIG活性筛选
将human PVRIG his蛋白使用包被液稀释到1μg/mL，按照50μL/孔包到96孔板中，4℃冰箱孵育过夜；PBST洗涤三次，按照100μL/孔加入封闭液，室温孵育1h；PBST洗涤三次。使用稀释液将biotin-hPVRL2his稀释到浓度400μg/mL，使用稀释液将嵌合抗体稀释到起始浓度200μg/ml，然后3倍稀释，共8个浓度，将稀释好的biotin-hPVRL2his与稀释好的嵌合抗体1:1混合，按照50μL/孔加入到96孔板中，室温孵育1h；PBST洗涤三次，加入HRP标记的链霉亲和素(1:10000)，50μL/孔，室温孵育1h；PBST洗涤三次，TMB按照50μL/孔加到96孔板中，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值，结果见表5和图2。由表5可知所获得嵌合抗体1718-525HL抑制hPVRL2结合human PVRIG的活性优于COM701。
表5嵌合抗体抑制hPVRL2结合human PVRIG活性以及相较于COM701的相对活性
抗体 IC50(ng/mL) 相对活性(％)
1718-525HL 78.82 440.72
COM701 319.20 -
(4)嵌合抗体报告基因生物学活性筛选
取对数生长的CD112/TCR Activator/CHO细胞，胰酶消化重悬于新鲜的含10％FBS的F12K培养基中，将重悬的细胞密度调整为4*105/mL。将重悬的细胞接种到白壁透明底的96孔细胞培养板中，100μL/孔细胞悬液，37度培养箱培养过夜。第二天将接种CD112/TCRActivator/CHO细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)的96孔板内F12K培养基吸干，另用10％血清RPMI1640培养基对样品进行梯度，加入梯度稀释的2*浓度样品(50μL/孔)到接种好细胞的96孔板中，样品从最高浓度40μg/mL(2*浓度)开始，3倍稀释11个浓度梯度，并另外设置空白培养基对照孔。取对数期生长的PVRIG(CD112R)Effector Reporter细胞离心弃上清，重悬于新鲜的10％FBS的RPMI1640培养基中将重悬的细胞密度调整为4*105/mL,然后将细胞加入步骤3的96孔板中，每孔50μL，放置37度培养箱中继续培养5-6小时。将96孔板从培养箱中取出，加入100μL/孔Bright-GloTM萤光素酶检测试剂(购自promega)放置3到5分钟，放入酶标仪中读取数值。根据每个梯度浓度孔对应的读值，利用Prism Graphpad软件拟合样品对细胞激活的梯度曲线，并且计算样品的EC50，结果见表6和图3。由表6可知所获得嵌合抗体1718-525HL的报告基因生物学活性与COM701相当。
表6嵌合抗体报告基因生物学活性以及相较于COM701的相对活性
抗体 EC50(ng/mL) 相对活性(％)
1718-525HL 171.30 75.25
COM701 228.90 -
(5)嵌合抗体体对小鼠和猴子PVRIG交叉结合活性
mouse PVRIG his和cyno PVRIG his用包被缓冲液稀释到1μg/mL，按照50μL/孔加入96孔板内，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次；再用封闭液室温孵育1h，PBST再洗涤3次。嵌合抗体从2000ng/mL起始3倍稀释，共8个浓度，按照50μL/孔加入该96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗人二抗(1:10000)，按照50μL/孔加入96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，按照50μL/孔加TMB到96孔板内，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值，结果见表7。由表7可知所获得嵌合抗体均与猴子PVRIG交叉结合，而不与小鼠PVRIG交叉结合。
表7嵌合抗体体对小鼠和猴子PVRIG交叉结合活性
实施例4：1718-525HL抗体人源化
选择嵌合抗体1718-525HL抗体进行人源化设计，具体方法如下：
将嵌合抗体1718-525HL的重链和轻链可变区序列与人种系序列进行比较，该比较是对IMGT数据库进行的blast搜索。从该组人种系基因中去除冗余基因以及那些具有未配对半胱氨酸的基因。在框架和CDR区两者中选择其余最接近匹配人种系基因作为受体人框架。基于IGHJ/IGJK种系基因的序列相似性选择FR-4，以IGHV1-69*08作为人源化的重链可变区模板，以IGKV2-30*02作为轻链可变区模板，进行抗体可变区的人源化设计。表8显示了嵌合抗体1718-525HL的人源化序列形式，其中HZ0版本代表仅CDR移植，HZ1版本引入了回复突变。人源化后的具体序列见表8，其中以下划线示出了相应的CDR(根据增强Chothia/AbMCDR的定义)。
表8嵌合抗体1718-525HL重轻链可变区的人源化序列形式
实施例5：人源化抗体重组表达及筛选
(1)人源化抗体重组表达
以SEQ ID NO.1所示重链恒定区和SEQ ID NO.2所示轻链恒定区，构建源自于相同嵌合的人源化轻重链，进行搭配并转染CHO-K1细胞，转染24h后加入10μg/mL MSX进行加压筛选，待细胞密度和活力恢复后接种进行Feed-batch表达，将表达完成后的离心上清经protein A纯化，采用BCA法定量抗体浓度后用于定量筛选。
人源化抗体重轻链可变区的搭配方式见表9，其中后缀“ix”表示该抗体为相应的嵌合抗体。
表9 1718-525人源化抗体的轻重链可变区序列搭配
1718-525L 1718-525L-HZ0 1718-525L-HZ1
1718-525H 1718-525ix - -
1718-525H-HZ0 - 1718-525H0L0 1718-525H0L1
1718-525H-HZ1 - 1718-525H1L0 1718-525H1L1
(2)人源化抗体亲和力测定
实验均在25℃条件下，1×HBS-EP+缓冲液中操作。上述1718-525ix、1718-525H1L0和1718-525H1L1，各人源化抗体浓度5μg/ml，捕捉于Protein A芯片表面，捕捉时间60s。human PVRIG his注射溶液，浓度起始5nM，两倍梯度稀释6个点，监测缔合180s，监测解离600s，通过注射pH1.5的甘氨酸溶液获得传感器表面的再生。动力学数据使用1：1结合模型分析。根据拟合情况去掉了最高浓度点。具体结果可见表10。由表10可知人源化抗体1718-525H1L0与COM701的亲和力相当。
表10人源化抗体亲和力测定
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
1718-525ix 1.98E+06 0.001248 6.30E-10
1718-525H1L0 1.40E+06 5.55E-04 3.97E-10
1718-525H1L1 9.13E+05 1.62E-03 1.77E-09
COM701 1.36E+06 4.70E-04 3.46E-10
(3)人源化抗体抑制hPVRL2结合human PVRIG活性筛选
将human PVRIG his蛋白使用包被液稀释到1μg/mL，按照50μL/孔包到96孔板中，4℃冰箱孵育过夜；PBST洗涤三次，按照100μL/孔加入封闭液，室温孵育1h；PBST洗涤三次。使用稀释液将biotin-hPVRL2his稀释到浓度400μg/mL，使用稀释液将人源化抗体稀释到起始浓度200μg/ml，然后3倍稀释，共8个浓度，将稀释好的biotin-hPVRL2his与稀释好的人源化抗体1:1混合，按照50μL/孔加入到96孔板中，室温孵育1h；PBST洗涤三次，加入HRP标记的链霉亲和素(1:10000)，50μL/孔，室温孵育1h；PBST洗涤三次，TMB按照50μL/孔加到96孔板中，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值，结果见表11和图4。由表11可知所获得人源化抗体1718-525H1L0抑制hPVRL2结合human PVRIG活性明显优于COM701。
表11人源化抗体抑制hPVRL2结合human PVRIG活性以及相较于COM701的相对活性
抗体 IC50(ng/mL) 相对活性(％)
1718-525H1L0 258.30 189.54
1718-525H1L1 101.90 480.47
COM701 489.60 -
(4)抗体的pH值敏感性结合
在低pH值下以降低亲和力结合于其靶标的治疗抗体可以具有增强的PK特性，此归因于抗体在溶酶体的低pH值下释放靶标，随后靶标降解和抗体再循环。抗体1718-525H1L0和COM701的pH值敏感性结合的生物传感器分析是在Biacore X100上进行。在10μL/min的流动速率下监测pH7.4下的结合速率以及pH5.5和7.4下的解离速率。动力学数据使用1：1结合模型分析。具体结果可见表12。由表12可知抗体1718-525H1L0在降低pH值下解离速率显著更快。
表12抗体在pH5.5与pH7.4 kd改变倍数
(5)抗PVRIG人源化抗体提高CEFT活化PBMC分泌IFN-γ的功能实验
本测试用于评价抗PVRIG人源化抗体单独用药或与抗PD-1抗体联合用药，对用抗原肽混合物CEFT(购自JPT Peptide Technologies公司，货号：PM-CEFT-4)刺激的PBMC产生IFN-γ的影响。采用PBMC(购自妙通(上海)生物科技有限公司)，用含100IU/ml IL-2和4μg/ml抗原肽混合物CEFT的RPMI 1640(购自thermo)+10％FBS(购自thermo)培养基重悬PBMC，调整细胞密度为1╳106个/ml，接种于96孔板U底板(购自corning)，100μl/孔；将20μg/ml的COM701、1718-525H1L0、同型IgG4对照抗体(hIgG4)与抗PD-1抗体pembrolizumab(南京诺艾新生物技术有限公司自制)的组合物，加入到96孔板中，100μl/孔，设双复孔；于37℃、5％CO2培养箱中培养6天后，取上清，使用IFN-γELISA试剂盒(购自R&D公司)测定IFN-γ上清浓度，结果如图5所示。
由图5可知，COM701、1718-525H1L0均能够显著促进IFN-γ分泌，且与PD-1抗体的联用效果也优于单药组。
本发明实施例所得1718-525HL抗体可以与人PVRIG结合，且结合human PVRIG活性，和抑制hPVRL2结合human PVRIG的活性，均优于对照抗体COM701。人源化抗体1718-525H1L0抑制hPVRL2结合human PVRIG活性明显优于COM701。本发明实施例所得抗体亲和力强，活性高，有良好的临床应用前景。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 南京诺艾新生物技术有限公司
<120> 重组抗人PVRIG抗体及应用
<160> 94
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Glu Leu Arg Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Glu Leu Arg Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Glu Leu Arg Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Gly Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Ser
1 5 10
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Leu Arg Phe Thr Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
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Gly
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Met Gln Gly Thr His Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Cys Ala Gly Gly Thr Arg Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ser
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gly Ala Lys Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys
1 5 10 15
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20
<210> 26
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
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1 5 10 15
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20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
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1 5 10 15
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
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20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
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1 5 10 15
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20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
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20
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Gly Ala Ala Gly Thr Gly Met Ala Met Thr Thr Lys Ser Trp Gly Gly
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
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20
<210> 49
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20
<210> 50
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
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20
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1 5 10 15
Thr Thr Gly Gly
20

Claims (20)

1.一种抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中，
所述VH包括抗原决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VH CDR1为SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，所述VH CDR2为SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，所述VH CDR3为SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列；
所述VL包括抗原决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VL CDR1为SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述VL CDR2为SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，所述VL CDR3为SEQ IDNO：16所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述VH包括与SEQID NO：3具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：4具有至少80％同一性氨基酸序列。
3.如权利要求1所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述VH包括与SEQID NO：7具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：8具有至少80％同一性氨基酸序列。
4.如权利要求1所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述VH包括与SEQID NO：7具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：10具有至少80％同一性氨基酸序列。
5.如权利要求1所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述VH包括与SEQID NO：9具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：8具有至少80％同一性氨基酸序列。
6.如权利要求1所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述VH包括与SEQID NO：9具有至少80％同一性氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：10具有至少80％同一性氨基酸序列。
7.如权利要求1所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段与猴PVRIG具有交叉反应，与鼠PVRIG则无结合活性。
8.如权利要求7所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。
9.如权利要求8所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或人源化抗体。
10.如权利要求9所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是特异性结合人PVRIG的抗体片段，且选自Fv、Fab、Fab'、scFv和F(ab')2。
11.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-10中任一项所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段。
12.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-10中任一项所述抗人PVRIG抗体。
13.一种载体，其包含权利要求11或12所述的一种或多种多核苷酸。
14.根据权利要求13所述的载体，其特征在于，所述载体包含权利要求11或12所述的两种多核苷酸，且所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PVRIG。
15.一种载体对，其特征在于，每个载体对包含如权利要求11或12所述的多核苷酸中的一种，其中所述载体对共同编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PVRIG。
16.一种宿主细胞，其包含权利要求11或12所述的多核苷酸、权利要求13或14所述的载体、或权利要求15所述的载体对，其中，所述宿主细胞是原核或真核细胞，且所示真核细胞为原生生物细胞、动物细胞或真菌细胞。
17.一种组合物，其包含：
1)权利要求1-10中任一项所述抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段、权利要求11或12所述多核苷酸、权利要求13或14所述载体、权利要求15所述的载体对，或权利要求16所述宿主细胞；以及
2)可选的药学上可接受的辅料。
18.一种制备抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
1)在合适的条件下，培养权利要求16所述的宿主细胞；
2)分离回收抗人PVRIG抗体或其抗原结合片段。
19.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至10中任一项的抗PVRIG的抗体或其抗原结合片段。
20.检测样品中PVRIG的方法，所述方法包括
(a)将样品与根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及
(b)检测抗体或其抗原结合片段与PVRIG间的复合物的形成；
任选地，所述抗体是被可检测地标记的。
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