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CN117946953A - 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用 - Google Patents

重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用 Download PDF

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CN117946953A
CN117946953A CN202410155654.5A CN202410155654A CN117946953A CN 117946953 A CN117946953 A CN 117946953A CN 202410155654 A CN202410155654 A CN 202410155654A CN 117946953 A CN117946953 A CN 117946953A
Authority
CN
China
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recombinant
lactococcus lactis
cegf
cecf
pnz8149
Prior art date
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Pending
Application number
CN202410155654.5A
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Inventor
邓干臻
巩英慧
袁永杰
张金鑫
冯文
贺宇成
余吉平
雷湘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
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Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Publication of CN117946953A publication Critical patent/CN117946953A/zh
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

本申请公开了一种重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用。该重组乳酸乳球菌为转入了无抗分泌表达cEGF的重组质粒的乳酸乳球菌NZ3900。该重组乳酸乳球菌不仅能够无抗表达cECF促进肠道发育和修复，还具有益生效果，以及具有增强机体的免疫能力和生长性能。该重组乳酸乳球菌对常见肠道致病菌具有明显的抑菌效果，可耐受胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，可在肠道定殖发挥益生作用。

Description

重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及 应用
技术领域
本申请涉及乳酸乳球菌技术领域，具体涉及重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用。
背景技术
乳酸乳球菌是发酵工业中常用的发酵剂之一，特别是在发酵乳制品中。另外，乳酸乳球菌是常用的诱导表达型宿主菌之一，具有重要的研究和应用价值。乳酸乳球菌归属于硬壁菌门(Firmicutes)、杆菌纲(Bacilli)、乳杆菌目(Lactobacillales)、链球菌科(Streptococcaceae)、乳球菌属(Lactococcus)。一般认为乳酸乳球菌包括三个亚种，其中乳源的有乳酸乳球菌乳酸亚种(L.lactissubsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactissubsp.cremoris)，还有分离自叶蝉的乳酸乳球菌霍氏亚种(L.lactissubsp.hordniae)。
乳酸乳球菌NZ3900基因型为lacF-,pepN::nisRnisK，能够在M17培养基及添加5g/L葡萄糖中生长，培养条件为30℃、有氧，保存方式为20％甘油，-80℃。乳酸乳球菌NZ3900生长快速、代谢相对简单，分解与合成代谢分开；基因组小但包含足够的生物信息，胞内外蛋白易于分离、纯化，这些优势使乳酸乳球菌在代谢调控方面具有的重大研究价值。乳酸乳球菌NZ3900在乳制品中已经得到广泛的应用，它可作为发酵剂用于酸奶油、酸奶、大豆酸奶、乳饮料等乳制品的生产。它也是制备干酪常用的发酵剂，例如切达干酪、农家干酪等，乳酸乳球菌NZ3900对于干酪等发酵乳制品的风味有重要影响。
发明内容
本申请实施例通过对NZ3900进行改造，提供了一株能够无抗表达cECF的重组乳酸乳球菌。该重组乳酸乳球菌不仅能够无抗表达cECF，还可以促进肠道发育和修复，增强机体的免疫能力和生长性能。为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
本申请实施例提供了一株重组乳酸乳球菌，为转入了无抗分泌表达cEGF的重组质粒的乳酸乳球菌NZ3900。
本申请实施例提供了一种保护肠道健康的益生菌剂制剂，包含浓度不低于5×108的所述的重组乳酸乳球菌。
本申请实施例提供了一株重组乳酸乳球菌的构建方法，其中，所述重组乳酸乳球菌为转入了无抗分泌表达cEGF的重组质粒的乳酸乳球菌NZ3900，所述构建方法包括：
构建无抗分泌表达cEGF的重组质粒；以及
将所述重组质粒转入乳酸乳球菌NZ3900。
本申请实施例提供了一种无抗表达cECF的方法，其包括：
构建上述的重组乳酸乳球菌的步骤；
将所述重组乳酸乳球菌接种于M17液体培养基于30℃培养24h；以及
再将培养物以1:25比例接种于M17液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期，加入乳链杆菌肽10～80ng/mL诱导5～30h后终止培养，4℃12000r/min离心5min分别收集上清液，所述上清液包含cECF。
本申请实施例提供了第一方面所述的重组乳酸乳球菌在制备改善肠道腹泻制剂中的应用。
本申请实施例提供了第一方面所述的重组乳酸乳球菌在制备抑制肠道炎症、修复肠道损伤相关制剂中的应用
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
(1)该重组菌株使用乳酸乳球菌表达系统，为具有食品级筛选标记的食品级乳酸乳球菌为宿主菌，实现无抗分泌表达。
(2)菌株分泌表达的cEGF可以促进肠道发育和修复，增强机体的免疫能力和生长性能。
(3)体内实验证明，该重组菌株将cEGF的肠道修复功能和乳酸乳球菌的益生功能结合起来，调节机体炎症水平，治疗肠道损伤。
(4)该重组乳酸乳球菌对常见肠道致病菌具有明显的抑菌效果，可耐受胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，可在肠道定殖发挥益生作用。
(5)本申请实施例提供的发酵条件及干燥工艺方法也极大程度地保留了该重组菌株的活菌数，对cEGF的分泌表达影响甚微。
附图说明
图1为本申请实施例提供的重组质粒pTOPO-Blunt-Simple-cEGF的结构示意图。
图2为本申请实施例提供的cEGF基因的目的序列PCR扩增检测结果；M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：阳性对照(hEGF)；泳道2：cEGF的目的序列。
图3为本申请实施例提供的cEGF与pNZ8149连接产物电转化结果。
图4为本申请实施例提供的cEGF与pNZ8149连接产物重组菌株的PCR扩增鉴定结果；M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：阴性对照；泳道2：cEGF-pNZ8149(重组菌株)。
图5为本申请实施例提供的重组质粒cEGF-pNZ8149的双酶切PCR扩增鉴定结果；M:DL 5000DNA分子量标准；泳道1：重组质粒cEGF-pNZ8149。
图6为本申请实施例提供的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149培养上清、菌体WesternBlot结果图；泳道1：阴性对照；泳道2：cEGF-pNZ8149培养上清；泳道3：cEGF-pNZ8149培养菌体。
图7为本申请实施例提供的不同浓度Nisin诱导的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149培养上清Western Blot结果图；泳道1：阴性对照；泳道2：0ng/mL；泳道3：1ng/mL泳道4：2ng/mL；泳道5：5ng/mL；泳道6：10ng/mL；泳道7：20ng/mL；泳道8：40ng/mL。
图8为本申请实施例提供的诱导不同时间的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149培养上清Western Blot结果图；泳道1：阴性对照；泳道2：5h；泳道3：10h；泳道4：15h；泳道5：20h；泳道6：25h；泳道7：30h。
图9为本申请实施例提供的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149培养上清纯化Tricine-SDS-PAGE结果图；M:蛋白maker；泳道1：cEGF-pNZ8149上清。
图10为本申请实施例提供的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149上清与空载菌上清对CMT-1211细胞数量的影响图。
图11为本申请实施例提供的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149体内验证试验的小鼠7d的十二指肠病理切片图；A.空白对照组；B.模型对照组；C.空载pNZ8149组；D.重组cEGF-pNZ8149组。
图12为本申请实施例提供的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149体内验证试验的小鼠14d的十二指肠病理切片图；A.空白对照组；B.模型对照组；C.空载pNZ8149组D.重组cEGF-pNZ8149组。
图13为本申请实施例提供的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149体内验证试验的小鼠7d结肠病理切片图；A.空白对照组；B.模型对照组；C.空载pNZ8149组；D.重组cEGF-pNZ8149组。
图14为本申请实施例提供的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149体内验证试验的小鼠14d结肠病理切片图；A.空白对照组；B.模型对照组；C.空载pNZ8149组；D.重组cEGF-pNZ8149组。
图15为本申请实施例提供的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149体内验证试验的小鼠细胞因子变化结果图；A.TNF-α；B.IL-6；C.IL-1β；D.IL-10。
图16为本申请实施例提供的动物实验中空白对照组、腹泻模型组、空载pNZ8149对照组和重组cEGF-pNZ8149组的比格犬肠道组织中的p-EGFR、EGFR、p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2的WB实验结果。
图17为本申请实施例提供的动物实验中空白对照组、腹泻模型组、空载pNZ8149对照组和重组cEGF-pNZ8149组的比格犬粪便中乳酸菌含量结果。
图18为本申请实施例提供的动物实验中空白对照组、腹泻模型组、空载pNZ8149对照组和重组cEGF-pNZ8149组的比格犬十二指肠病理切片的HE染色图。
图19为本申请实施例提供的动物实验中空白对照组、腹泻模型组、空载pNZ8149对照组和重组cEGF-pNZ8149组的比格犬结肠病理切片的HE染色图。
图20为本申请实施例提供的动物实验中空白对照组、腹泻模型组、空载pNZ8149对照组和重组cEGF-pNZ8149组的比格犬空肠病理切片的HE染色图。
图21为本申请实施例提供的动物实验中空白对照组、腹泻模型组、空载pNZ8149对照组和重组cEGF-pNZ8149组的比格犬回肠病理切片的HE染色图。
图22为本申请实施例提供的动物实验中空白对照组、腹泻模型组、空载pNZ8149对照组和重组cEGF-pNZ8149组的比格犬血炎症细胞因子的含量结果图。A为TNF，B为IL-6，C为IL-1β，D为IL-10。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本申请实施例提供了一株重组乳酸乳球菌，为转入了无抗分泌表达cEGF的重组质粒的乳酸乳球菌NZ3900。该菌株利用食品级乳酸乳球菌、LacF缺失株NZ3900和LacF为筛选标记的食品级表达载体pNZ8149为表达系统，构建重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149，使用Nisin诱导剂对重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149进行诱导表达，且将重组菌液进行不同组分处理，鉴定为重组菌构建成功，上清液中cEGF表达量最高，即cEGF在nisin诱导剂的作用下进行无抗分泌表达。
本申请实施例提供的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149诱导表达的最适宜条件研究表明，cEGF的表达量与Nisin诱导剂的浓度、诱导时间有关，且在Nisin浓度为5ng/mL、诱导20h时表达量最高。
本申请实施例通过细胞增殖CCK8试验，对重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149分泌表达的cEGF蛋白进行生物活性体外验证，研究表明该菌分泌表达的cEGF蛋白对细胞有促增殖作用，且具有生物活性。本申请实施例动物实验结果表明，该重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149在发挥cEGF蛋白的修复增殖效果、修复肠道损伤的同时也发挥了益生作用。
该重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149的抑菌能力及抗逆性研究表明，该重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149对大肠杆菌K88、k99、O157、O189、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均具有较强的抑菌能力，耐胆盐、耐胃酸能力较强，对高温环境较为敏感。
本申请实施例选择喷雾干燥、冻干干燥两种方法分别制成益生菌制剂，比较这两种方法的优缺点，最终选择活菌数高、操作方便、安全稳定、适口性好的脱脂奶粉冻干干燥方法。
本申请实施例将最终制成的益生菌制剂进行动物实验。动物试验结果表明，实施例提供的益生菌制剂的制备方法极大程度地保留了cEGF的肠道修复功能，也十分有利于其在体内定殖发挥益生作用。为此，本申请实施例提供了一种保护肠道健康的益生菌剂制剂，包含浓度不低于5×108的如上所述的重组乳酸乳球菌。
在一些实施方式中，本申请实施例提供了一株重组乳酸乳球菌的构建方法，其中，所述重组乳酸乳球菌为转入了无抗分泌表达cEGF的重组质粒的乳酸乳球菌NZ3900。所述构建方法包括：构建无抗分泌表达cEGF的重组质粒；以及将所述重组质粒转入乳酸乳球菌NZ3900。具体的，乳酸乳球菌NZ3900来自MO BI Tec，产编号为#VS-ELS03900-01。
在一些实施例中，所述重组质粒的构建步骤包括：
获得cECF的目的片段；以及
将酶切的所述目的片段与酶切的载体质粒利用T4连接酶进行连接反应，连接产物包含所述重组质粒；
其中，所述连接反应体系以20μl计，包含1.5μl酶切目的片段、4.0μl酶切载体质粒、0.5μl T4连接酶、10×Buffer和余量的水，所述T4连接酶的活性为1000U。
在一些实施例中，所述cECF的目的片段的获得步骤包括：
获得cECF的蛋白序列；
对所述蛋白序列进行乳酸乳球菌密码子偏好性进行密码子优化后得到一条长度为156bp的DNA序列；
合成得到长度为156bp的DNA序列、SPusp45信号肽序列、6×His标签及NcoI和SacI限制性内切酶酶切序列的连接序列；
将所述连接序列与质粒pTOPO-Blunt-Simple连接后，以得到包含所述cECF的目的片段的重组质粒；以及
对包含所述cECF的目的片段的重组质粒进行PCR扩增，即可得到所述cECF的目的片段。
在一些实施例中，对包含所述cECF的目的片段的重组质粒进行PCR扩增的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
另外，本申请实施例还提供了一种无抗表达cECF的方法，其包括：
构建上述重组乳酸乳球菌的步骤将所述重组乳酸乳球菌接种于M17液体培养基，30℃培养24h；
再将培养物以1:25比例接种于M17液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期，加入乳链杆菌肽10～80ng/mL诱导5～30h后终止培养，4℃12000r/min离心5min分别收集上清液，所述上清液包含cECF。
另外，本申请实施例还提供了所述的重组乳酸乳球菌在制备改善肠道腹泻制剂中的应用，以及所述的重组乳酸乳球菌在制备抑制肠道炎症、修复肠道损伤相关制剂中的应用。
下方将以更加具体的实施例阐述本申请，但不构成对本申请实施方式的限制。
实施例1：重组质粒的构建
(1)获得cECF的目的片段
根据NCBI公布的犬表皮生长因子基因序列，得到cEGF的蛋白序列，命名为cEGF，之后按乳酸乳球菌密码子偏好性进行密码子优化后得到一条长度为156bp的DNA序列(如SEQID NO.5所示)，将此序列与SPusp45信号肽序列进行连接，并在其末尾加上1个6×His标签，两端分别加上NcoI、SacI限制性内切酶酶切位点，得到一个长度为270bp的目的序列(序列如SEQ ID NO.6所示)。之后，将此基因提交至武汉天一辉远生物科技有限公司进行合成，合成后的基因与质粒pTOPO-Blunt-Simple连接后得到的重组质粒命名为pTOPO-Blunt-Simple-cEGF(如图1所示，其序列如SEQ ID NO.7所示)。
以pTOPO-Blunt-Simple-cEGF为模板，设计cEGF-F和cEGF-R，进行PCR扩展，以得到所述的cECF的目的片段。其中，cEGF-F和cEGF-R的核苷酸序列如下，由武汉擎科生物科技有限公司合成cEGF-F:5’-ccatggatgaaaaaaaagattatctcagct-3’，如SEQ ID NO.1所示。cEGF-R:5’-gagctcctagtggtggtggtg-3’，如SEQ ID NO.2所示。
其扩增的PCR反应体系如表1所示。PCR反应程序包括：98℃2min，98℃10s，55℃5s，72℃5s，72℃5min，4℃∞，35个循环。PCR产物4℃保存，在120V电压下，取10μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳30min，用紫外成像系统检测记录，结果显示条带大约270bp，和预期相符，扩增结果见图2，PCR产物进行纯化回收。
表1获得cECF的目的片段的PCR反应体系
成分 用量(μL)
cEGF-F 2
cEGF-R 2
ptopO-Blunt-Simple-cEGF 1
PremixPrimeSTARMax 25
双蒸水 20
总体积 50
(2)目的基因和质粒的酶切连接
表2cECF的目的片段及质粒pNZ8149的NcoⅠ/SacⅠ双酶切体系
成分 用量
质粒pNZ8149/PCR产物 3μl/12μl
NocⅠ 1.5μl
SacⅠ 1.5μl
10×Buffer 2μl
双蒸水 Upto40μl
将cECF的目的片段及质粒pNZ8149按照如表2所示的酶切体系于37℃处理1h，将酶切产物于1％的琼脂糖凝胶电泳后对目的片段进行纯化回收。
将酶切的所述目的片段与酶切的载体质粒利用T4连接酶进行连接反应，连接产物包含所述重组质粒；其中，22℃水浴1h，65℃10min进行连接，连接反应体系如表3所示。
表3cECF目的片段与质粒pNZ8149的连接反应体系
成分 用量
cECF目的片段 1.5μl
质粒pNZ8149 4μl
T4连接酶 0.5μl
10×Buffer 2μl
双蒸水 Upto20μl
实施例2：重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149的构建
制备乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞，置于冰上解冻。解冻后与实施例1得到的重组质粒(即表3中得到的连接产物)混匀后，转入的预冷2mm电转化杯中进行电击转化。电击后加入预冷的恢复培养基G-SGM17，冰上静置5min，将菌液转移至离心管中，30℃静置培养2h。离心弃上清，加100μl M17恢复培养基重悬菌体，取重悬后的菌液涂布于溴甲酚紫筛选培养基进行筛选，30℃静置培养18-24h，电转化结果见图3。
挑取黄色单菌落，接种至5mL M17培养液中过夜培养，以pNZ8149-F：5’-gatttcgttcgaaggaactac-3’，如SEQ ID NO.3所示；pNZ8149-R：5’-atcaatcaaagcaacacgtgc-3’，如SEQ ID NO.4所示为引物，进行菌液PCR，菌液PCR体系如表4所示。PCR反应程序包括：98℃2min，98℃10s，55℃5s，72℃5s，72℃5min，4℃∞，35个循环，PCR产物4℃保存。
表4菌液PCR反应体系
成分 用量(μL)
pNZ8149-F 2
pNZ8149-R 2
菌液 1
PremixPrimeSTARMax 25
双蒸水 20
总体积 50
在120V电压下，取10μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳30min，用紫外成像系统检测记录，结果显示条带大约270bp，和预期相符，扩增结果见图4。提取菌液PCR验证为阳性菌株的重组质粒，用NcoⅠ、SacⅠ内切酶进行双酶切，通过琼脂糖凝胶核酸电泳检测双酶切产物，结果见图5，有两个条带，分别约为2500bp和270bp，与预期结果相符，说明目的基因已插入在pNZ8149表达载体上。鉴定为阳性的重组菌株交武汉擎科创新生物技术有限公司进行序列鉴定，测序结果与本研究中设计的cEGF序列在NCBI的blast软件进行比对，重组质粒的插入片段的测序结果与目的基因序列一致，这表明表达cEGF蛋白的重组乳酸乳球菌构建成功，并将其命名为重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149。
实施例3重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149表达cEGF蛋白的诱导表达及鉴定
(1)cEGF蛋白的诱导表达
将阳性菌重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149及空载体对照菌pNZ8149，以1：100比例接种于加入M17液体培养基，30℃静置培养24h。将培养物以1:25比例接种于M17液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期(OD＝0.4)，用10ng/mL乳链杆菌肽(Nisin)诱导15h后终止培养，4℃12000r/min离心5min分别收集上清和菌体，-80℃储存用以进行Westernblot检测重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149能否分泌表达cEGF蛋白，结果见图6，表明该重组菌成功分泌表达cEGF蛋白。
(2)cEGF蛋白表达的条件优化
分别用0ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，80ng/mL的Nisin诱导阳性重组菌液，诱导20h后终止培养，4℃、12000r/min离心5min分别收集上清和菌体，-80℃储存用以进行Westernblot检测，结果见图7，结果显示在不同浓度Nisin诱导剂诱导时，cEGF的分泌表达量也有所不同，在0ng/mL和1ng/mL低浓度诱导时，cEGF蛋白的分泌表达量几乎为零，而诱导剂浓度过高时cEGF蛋白的分泌表达量并不会随之升高，反而会有所下降，所以推断最佳诱导浓度为5ng/mL。
用5ng/mL的Nisin分别诱导5h，10h，15h，20h，25h，30h后终止培养，4℃、12000r/min离心5min分别收集上清和菌体，-80℃储存用以进行Westernblot检测，结果见图8，结果显示在诱导前期cEGF的分泌量递增，但在20h以后分泌量到达顶峰不再增加，因此推断最佳诱导时间为20h。
(3)cEGF蛋白的纯化
重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149用5ng/mL的Nisin诱导培养20h，收集上清液，经硫酸铵浓缩、透析袋透析、0.45μm滤器过滤除杂，使用镍离子层析柱纯化，进行Tricine-SDS-PAGE检测，结果见图9，目的蛋白cEGF的大小与预期基本相符。
实施例4、重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149蛋白功能活性的体外验证
平板划线复苏培养重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149及空载体对照菌pNZ8149，挑取单菌落接种于5mL M17液体培养基中，30℃静置培养12h后按照1:25体积比转接到M17液体培养基，30℃静置培养至0D600≈0.3(2h左右)，分别加入终浓度为5ng/mL的Nisin诱导剂培养20h，4℃、12000r/min离心5min收集上清，0.22μm无菌滤器过滤除菌后置于-80℃保存备用。
复苏培养犬乳腺癌细胞CMT-1211，调整传代培养细胞浓度转接至96孔细胞培养板中，培养至细胞达到60％汇合时吸掉培养液，用无菌PBS反复清洗细胞3次，加入不含血清的DMEM进行饥饿培养24h，再用无菌PBS清洗细胞1次，更换不含血清的DMEM，按照表1分组处理细胞，12h后分别加入10％的cck8预混液(10μL cck8+90μLDMEM)，37℃培养1h后观察细胞生长状态，检测OD450，该试验每个处理组6个重复，每个重复为一个孔，共进行3次重复试验，结果见图10。该结果表明重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149诱导表达的cEGF蛋白有促进细胞增殖的效果，说明分泌表达的cEGF蛋白具有生物活性。
表5重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149细胞增殖活性检测试验分组
分组 处理方式
空白对照 100μL高糖DMEM
空载对照菌pNZ8149 90μL高糖DMEM+10μLNisin诱导的空载上清液
重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149 90μL高糖DMEM+10μLNisin诱导的重组乳菌上清液
实施例5：重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149蛋白功能活性的体内验证
随机选取36只雌雄各半的四周龄昆明小鼠(北京维通利华，货号：43513)，适应3d后，随机分为4个组，分别设置空白对照组、腹泻模型组、空载pNZ8149组、重组cEGF-pNZ8149组，每组9只，保持温度、饲料等条件一致，采用连续饮水的方法，空白对照组饲喂自来水，其他组均饲喂5％的DSS溶液，饲喂3d后小鼠出现腹泻症状，腹泻模型建立成功，每个组随机选取3只小鼠，眼眶采血，4℃、2000r/min离心15min，分离血清，测定第0d的血清相关指标(肠道炎症细胞因子:IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10)。
正式试验的具体分组和试验方案见表6，分别于试验期第7d和第14d，小鼠禁食12h，自由饮水，每个组随机选取3只小鼠，眼眶采血，4℃、2000r/min离心15min，分离血清，测定血清相关指标。生长性能的测定：饲养期间每天定时称重，记录其体重，试验结束后计算小鼠的平均增重；病理切片制作：在小鼠相同部位取样(十二指肠、结肠)，取约1cm2大小的组织样品，置于通用组织固定液溶液中固定，送往公司制成切片，经修整、冲洗、脱水、透蜡、包埋、切片(厚度为4μm)等处理步骤，进行观察、取图和拍照，观察各组各期小鼠脏器组织病理学变化，分析绒毛长度、数量，隐窝深度，绒隐比等指标；验数据用Excel 2007软件进行初步处理后，再用SPSS18.0软件进行统计分析。利用ANOVA、LSD进行差异显著性检验和多重比较，(P<0.05)的统计值被认为是差异显著。试验结果以平均值±标准差(Mean±SD)形式表示。
表6动物试验分组
组别 7d 14d
空白对照组 PBS PBS
腹泻模型组 PBS PBS
空载pNZ8149对照组 空载菌悬液 空载菌悬液
重组cEGF-pNZ8149组 重组菌悬液 重组菌悬液
根据统计学结果分析，各处理组对小鼠体重影响结果见表7所示，重组cEGF-pNZ8149组小鼠在整个试验期体重增长状态良好，与空白对照组无显著差异，与腹泻模型组的小鼠差异极显著，因此证明重组菌cEGF-pNZ8149分泌表达的cEGF蛋白具有良好的效果。空载pNZ8149对照组在7d～14d与腹泻模型组差异显著，说明该益生菌本身也具有良好的益生效果，但空载菌仍与重组菌差异显著，则说明单纯的益生菌起效较慢且改善效果不如重组菌。
表7各处理组小鼠体重分析
如图11、12、13、14所示，根据各组7d、14d的十二指肠和结肠的病理切片结果分析，7d、14d时模型对照组的十二指肠均有不同程度的炎症且伴有不同程度的组织溶解，空载组在7d时也有轻微腺体萎缩和炎症，而重组cEGF-pNZ8149组与空白组的十二指肠组织结构均完整，肠绒毛良好，无炎症发生。模型对照组7d时结肠杯状细胞减少和炎症，14d时有轻微炎症，空载组7d、14d有轻微炎症，而重组cEGF-pNZ8149组明显与空白组一致，无明显炎症损伤。
由图15细胞因子结果分析，在0d时，与空白对照组相比，其他组小鼠促炎因子IL-1β(P＜0.01)、TNF-α(P＜0.05)、IL-6(P＜0.05)的表达均上调，抑炎因子IL-10(P＜0.05)的表达显著下调，表明腹泻模型建立成功；在第7d试验期时重组cEGF-pNZ8149组与模型对照组相比，促炎因子TNF-α(P＜0.01)、IL-1β(P＜0.05)的表达显著下调，同时抑炎因子IL-10(P＜0.05)的表达显著上调，而空载组与模型对照组差异不显著；在14d试验期时，重组cEGF-pNZ8149组仍显著上调IL-6(P＜0.05)、IL-1β(P＜0.05)的表达，且与空载组也有显著差异，而空载组与模型对照组相比除IL-1β(P＜0.05)显著下调外，差异均不显著；且在7d、14d时重组cEGF-pNZ8149组与空白组差异均不显著。
因此根据动物试验结果可得，重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149能够成功到达小鼠肠道并分泌表达cEGF，在肠道内同时发挥表皮生长因子的修复作用和乳酸乳球菌的益生作用，较快较好地治疗肠道损伤，维持肠道内的菌群平衡。
实施例5：重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149的抑菌性能和抗逆特性测定
(1)抑菌性能试验
以Bacillus coli O157、Bacillus coli O139、Bacillus coli K88、Bacilluscoli K99、沙门氏菌Salmonella choleraesuis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus为指示菌，按1％比例将指示菌接种于5mL LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养6h，比浊法将指示菌培养液稀释到合适浓度后使用棉签均匀地涂在LB固体培养基上；将重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149接种于M17培养基，30℃静置培养24h制备重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149发酵液，将重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149发酵液离心，取上清过滤除菌，牛津杯中加入除菌过滤后的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149上清液，过夜4℃冰箱扩散后放入30℃恒温培养箱中培养12h后观察抑菌圈；测量重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149的抑菌圈，来判断重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149对指示菌的抑菌能力，连续3次重复。试验结果见表8。
表8重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149发酵上清液体外抑菌试验
指示菌 cEGF-pNZ8149重组菌抑菌圈直径(mm)
BacilluscoliO139 9.78±2.46
BacilluscoliO157 6.93±1.33
BacilluscoliK88 13.33±5.11
BacilluscoliK99 11.33±3.81
Salmonellacholeraesuis 16.31±5.73
Staphylococcusaureus 13.72±3.75
(2)高温耐受性试验
将重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149接种于M17培养基，30℃静置培养24h制备重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149发酵液，分别置于37、50、60℃水浴锅中热处理5min，取热处理后的菌液进行逐级倍比稀释，用倾注法测剩余活菌数，以等量的发酵液置于30℃为对照，每组试验3个重复。该菌株耐高温结果见表9，可知重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149在50℃、60℃处理5min后仅有11.62％、4.91％的生物活性，可知该菌对温度较为敏感，因此在后期进行商品化加工时要尽量避开高温环境，尽可能保存该菌的活菌率。
表9重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149对高温的耐受性
处理温度(℃) cEGF-pNZ8149活菌数 cEGF-pNZ8149存活率
30 (7.45±0.17)×107 100％
37 (3.72±0.33)×107 49.93±0.06％
50 (8.66±0.37)×106 11.62±0.07％
60 (3.66±0.29)×106 4.91±0.06％
(3)胆盐耐受性试验
将重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149接种于M17培养基，30℃静置培养24h制备重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149发酵液，取0.5mL菌液加入到4.5mL的0.30％模拟胆盐中，迅速在涡旋仪上充分混匀，置于30℃培养箱静置培养。在0h、24h的时候取出进行倍比稀释，用倾注法测绘菌数，等量菌液置于无菌生理盐水中作对照。该菌株重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149模拟胆盐耐受性结果见表10。由表10可知，重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149可以正常耐受模拟胆盐的环境，在模拟胆盐中处理24h后仍有近79.57％的存活率，因此，重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149能耐受肠道胆盐的环境。
表10重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149对胆盐的耐受性
处理时间 模拟胆盐组 对照组 存活率
0h (1.33±0.11)×105 (1.07±0.03)×105 100％
24h (7.79±0.09)×104 (9.79±0.07)×104 79.57±0.05％
(4)胃液耐受性试验
取0.5mL菌液加入到模拟胃液中，迅速在涡旋仪上充分混匀，置于30℃培养箱静置培养。在0h、2h、4h的时候取出进行倍比稀释，用倾注法测绘菌数，等量菌液置于无菌生理盐水中作对照。耐胃酸结果见表11。由表11可知，重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149在pH值约为2.0的模拟胃液中，存活率较高，2h、4h存活率分别高达85.59％，72.48％。综合以上数据，重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149具有较强的耐胃酸的能力，能够在胃中存活并保持良好的存活率，发挥益生作用。
表11重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149对胃酸的耐受性
处理时间 模拟胃液组 对照组 存活率
0h (1.18±0.17)×104 (1.33±0.25)×104 100％
2h (1.01±0.37)×104 (1.18±0.17)×104 85.59％
4h (0.79±0.10)×104 (1.09±0.05)×104 72.48％
实施例6：重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149发酵条件及方式选择
复苏重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149200mL，30℃静置培养24h，制成种子液，按照乳糖25％、蛋白胨10％、酵母膏10％、牛肉膏5％、硫酸镁0.08％、磷酸二氢钾0.1％、消泡剂0.1％比例配制发酵培养基。30L罐配料体积按20L，不加乳糖，初始定容18L，灭菌条件121℃，20min，乳糖500g溶解后定容至900ml，装入一只补料瓶中，灭菌并冷却后于接种前加入，消前pH值7.2左右；排气口采用12层纱布扎口；实消完成后正常通风降温。加入种子液，接种量200ml；搅拌转速50rpm，全程培养温度30℃，不通风。发酵6h加入诱导剂(取1mg/ml贮存液0.1ml，加入到100ml无菌水中)，发酵周期按22小时，放罐取样1管检测活菌数，活菌数为4.8×109。
分别使用淀粉喷雾干燥、玉米芯粉吸附干燥、脱脂奶粉冻干干燥三种方法将其制成益生菌制剂，并测定不同方法的活菌数。结果见表12，与发酵罐取样活菌数相比较选取活菌率最高的干燥方法，且使用淀粉和玉米芯粉工艺时间长、操作复杂，制剂出现了霉菌污染情况，因此选择脱脂奶粉冻干干燥的技术来加工重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149。
表12重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149不同干燥方法的存活率
干燥方法 活菌数 存活率
淀粉喷雾干燥 1.9×109 39.58％
玉米芯粉吸附干燥 5×108 10.4％
脱脂奶粉冻干干燥 3.3×109 68.75％
实施例7：重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149制剂的效果验证
随机选取健康比格犬(市售)12只，适应3d后，温度、犬粮等条件一致，分组方式见表13，将腹泻模型组、空载pNZ8149对照组、重组cEGF-pNZ8149组的饮用水换成番泻叶水，空白对照组正常饲喂自来水，处理三天，进行造模试验。后期空载pNZ8149对照组，重组cEGF-pNZ8149组，试验期间每天饲喂冻干菌粉一次。检测指标主要为：
(1)肠道发育：14d时在犬十二指肠、结肠部位取样，制成石蜡切片并HE染色，观察各组各期犬脏器组织病理学变化。
(2)免疫指标：0d、7d、14d分别静脉采血分离血清，ELISA测定肠道炎症细胞因子：IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10。
(3)乳酸菌量检测：14d时无菌采取各组犬只粪便，通过荧光定量法，对肠道内乳酸菌量进行检测。
(4)cEGF下游信号的检测：Western Blot检测肠道组织中cEGFR及下游信号ERK1/2、AKT的激活。
表13动物实验分组
组别 处理方式
空白对照组 基础犬粮+水
腹泻模型组 基础犬粮+水
空载pNZ8149对照组 基础犬粮+pNZ8149冻干粉
重组cEGF-pNZ8149组 基础犬粮+cEGF-pNZ8149制剂
如图16所示，与腹泻模型组和空载pNZ8149对照组相比，8重组cEGF-pNZ8149组p-EGFR、p-AKT、p-ERK1/2的水平显著升高，说明该益生制剂中重组菌分泌表达的cEGF激活了EGFR及其下游信号。
如图17所示，与空白对照组相比，腹泻模型组犬粪便中乳酸菌含量明显降低，重组cEGF-pNZ8149组犬粪便中的乳酸菌含量较腹泻模型组明显升高，其空载pNZ8149对照组也高。表明空载pNZ8149和重组cEGF-pNZ8149的冻干干燥的制剂都可以成功进入犬的胃肠道定殖并发挥益生作用。
如图18、19、20、21所示，根据各组十二指肠、结肠、空肠、回肠的病理切片结果分析，重组cEGF-pNZ8149组肠道损伤明显轻于腹泻模型组和空载pNZ8149对照组，说明该制剂很大程度保存了cEGF对肠道的修复作用。
由图22细胞因子结果分析，与腹泻模型组相比，重组cEGF-pNZ8149组显著上调了抑炎因子IL-10的表达，下调了促炎因子的表达，同时与空载组也有显著差异。表明该重组益生制剂可以有效地调节机体炎症水平，改善机体状态。
因此根据动物试验结果可得，通过对cEGF-pNZ8149制剂进行的犬体内效果验证，cEGF下游信号通路、乳酸菌含量、肠道发育、免疫指标的结果，表明实施例提供的cEGF-pNZ8149益生制剂有效地保留了乳酸乳球菌的活菌量，顺利到达犬的胃肠道内定殖并发挥作用；且分泌表达的cEGF也有良好的活性，能够治疗犬的肠道损伤和炎症，该益生制剂具有良好的效果。
综上，本申请实施例提供了一株分泌表达cEGF的重组乳酸乳球菌，既实现cEGF的无抗分泌表达同时又可以发挥乳酸乳球菌本身的益生作用，以保护肠道健康。本申请还通过体内、体外实验分别验证了构建的重组乳酸乳球菌cEGF-pNZ8149能够成功分泌表达具有活性的cEGF蛋白，且研究测定该菌具有良好的抑菌效果及耐胃酸耐胆盐能力。为此，本申请实施例还以选取最适宜的工艺将其制成益生菌制剂，以提供一种能够保护犬肠道健康的益生菌剂制剂，并且验证表明制备的益生制剂良好保留了cEGF-pNZ8149乳酸乳球菌的功能，能良好定殖并发挥作用。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株重组乳酸乳球菌，为转入了无抗分泌表达cEGF的重组质粒的乳酸乳球菌NZ3900。
2.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌能够被Nisin诱导于胞外表达cECF。
3.根据权利要求2所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于，在Nisin浓度为5ng/mL、诱导20h时，胞外表达cECF的表达量最高。
4.一种保护犬肠道健康的益生菌剂制剂，其特征在于，包含浓度不低于5×108的如权利要求1～3任一项所述的重组乳酸乳球菌。
5.一株重组乳酸乳球菌的构建方法，其中，所述重组乳酸乳球菌为转入了无抗分泌表达cEGF的重组质粒的乳酸乳球菌NZ3900，所述构建方法包括：
构建无抗分泌表达cEGF的重组质粒；以及
将所述重组质粒转入乳酸乳球菌NZ3900。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒的构建步骤包括：
获得cECF的目的片段；以及
将酶切的所述cECF目的片段与酶切的载体质粒利用T4连接酶进行连接反应，连接产物包含所述重组质粒；
其中，所述连接反应体系以20μl计，包含1.5μl酶切目的片段、4.0μl酶切载体质粒、0.5μl T4连接酶、10×Buffer和余量的水，所述T4连接酶的活性为1000U。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述cECF的目的片段的获得步骤包括：
获得cECF的蛋白序列；
对所述蛋白序列进行乳酸乳球菌密码子偏好性进行密码子优化后得到一条长度为156bp的DNA序列；
合成得到长度为156bp的DNA序列、SPusp45信号肽序列、6×His标签及NcoI和SacI限制性内切酶酶切序列的连接序列；
将所述连接序列与质粒pTOPO-Blunt-Simple连接后，以得到包含所述cECF的目的片段的重组质粒；以及
对包含所述cECF的目的片段的重组质粒进行PCR扩增，即可得到所述cECF的目的片段。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，对包含所述cECF的目的片段的重组质粒进行PCR扩增的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。
9.一种无抗表达cECF的方法，其包括：
采用如权利要求5～8任一所述的构建方法，得到如权利要求1～3任一所述的重组乳酸乳球菌；
将所述重组乳酸乳球菌接种于M17液体培养基，30℃培养24h；
再将培养物以1:25比例接种于M17液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期，加入乳链杆菌肽10～80ng/mL诱导5～30h后终止培养，4℃12000r/min离心5min分别收集上清液，所述上清液包含cECF。
10.权利要求1～3任一所述的重组乳酸乳球菌在制备改善犬肠道腹泻制剂、抑制肠道炎症、修复肠道损伤相关制剂中的应用。
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