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CN117903319A - 一种人乳铁蛋白肽三聚体融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人乳铁蛋白肽三聚体融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117903319A
CN117903319A CN202410054446.6A CN202410054446A CN117903319A CN 117903319 A CN117903319 A CN 117903319A CN 202410054446 A CN202410054446 A CN 202410054446A CN 117903319 A CN117903319 A CN 117903319A
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lactoferrin peptide
recombinant human
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trimer
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钱晨明
邱琳
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Changzhou University
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Abstract

本发明公开了一种人乳铁蛋白肽三聚体融合蛋白及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明设计了一种能自发形成三聚体的融合蛋白，包含功能区和聚体区两段区域，功能区为人乳铁蛋白肽，聚体区为T4 foldon和人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分。本发明的方法通过毕赤酵母表达系统于胞外高效分泌表达人乳铁蛋白肽三聚体，经发酵纯化可获得高纯度的三聚体蛋白，可规模化生产。该三聚体稳定性好，不易降解，同时具有较好的抗菌活性，同时在特定浓度下，对细胞增殖有较好的促进作用。

Description

一种人乳铁蛋白肽三聚体融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种人乳铁蛋白肽三聚体融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
乳铁蛋白是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有广谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成；促进细胞的生长；调节机体免疫功能，增强机体抗病能力；抑制人体肿瘤细胞的作用；能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用。
自青霉素发现以来，抗生素开始在全球广泛应用，人类逐渐进入控制和治疗微生物感染性疾病的时代。然而各种抗生素的滥用导致致病菌快速进化，造成耐药菌的大量出现，但是抗生素的研发却跟不上耐药菌进化速度。具有多种生物学功能的抗菌肽被发现具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生抗药性、作用机理独特，热稳定性和水溶性好，对高等动物的正常细胞几乎无毒害作用。人乳铁蛋白肽是由人乳铁蛋白水解得到的多种具有不同生理功能的活性多肽，因其良好的生物学功能近年来备受关注。
目前乳铁蛋白肽的制备还存在着诸多问题。人乳铁蛋白肽的制备主要有乳汁中提取和基因重组两种方式。乳汁中提取产量低、工艺复杂、成本昂贵。而现有的基因重组方式是利用基因工程重组技术在微生物细胞分泌途径中表达重组人乳铁蛋白肽，产量和纯度均不高。同时，人乳铁蛋白肽单体抗菌活性和抗病毒活性较弱。
发明内容
为克服现有技术中关于重组人乳铁蛋白肽能否高效分泌表达、提高重组人乳铁蛋白肽的稳定性、现有重组人乳铁蛋白肽抗菌活性低、现有重组人乳铁蛋白肽未能规模化制备的生产的技术问题，本发明的目的在于提供一种人乳铁蛋白肽三聚体及其制备方法。具体包括人乳铁蛋白肽三聚体、编码该三聚体的多核苷酸、含有编码该三聚体的多核苷酸的重组载体、工程菌、制备该人乳铁蛋白肽三聚体的方法、该人乳铁蛋白肽三聚体的应用。
本发明一方面提供了一种含有重组人乳铁蛋白肽的融合蛋白，所述融合蛋白的结构用通式表示为L-C-T，其中L为重组人乳铁蛋白肽单体；C为人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分；T为T4 foldon蛋白，位于所述重组人乳铁蛋白肽单体的羧基末端。
重组人乳铁蛋白肽单体包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同源性的序列。
本发明所述的重组人乳铁蛋白肽单体的蛋白融合体,命名为HLfcin-T，蛋白融合体共108个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：
GRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQACRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFCGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL；此融合蛋白为基础，在分泌表达过程中形成三聚体，得到的人乳铁蛋白肽三聚体命名为3HLfcin-T。3HLfcin-T共324个氨基酸，理论分子量为37.4KDa。
上述氨基酸序列SEQ ID NO.4中第49-81位为人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分，人Ⅲ型胶原蛋白前肽有使胶原蛋白形成三螺旋功能，选取的多肽含二硫键可促进三聚体的形成，并使重组人乳铁蛋白肽三聚体蛋白有促进细胞增殖功效。其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
上述氨基酸序列SEQ ID NO.4中第82-108位为T4 foldon结构域，T4 foldon蛋白是T4噬菌体纤维蛋白的结构域，具有使融合蛋白形成三聚体的功能，其氨基酸序列为SEQID NO.3所示。
本发明还提供了一种重组人乳铁蛋白肽三聚体蛋白，所述重组人乳铁蛋白肽三聚体蛋白是重组人乳铁蛋白肽的融合蛋白通过T4 foldon三聚化模块和人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分形成三聚体，该三聚体蛋白具有较好的稳定性和较高抗菌活性，同时在特定浓度下还能促进细胞增殖。
本发明还提供了一种编码所述重组人乳铁蛋白肽融合蛋白的基因。
进一步的，所述编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种含有编码上述人乳铁蛋白肽三聚体的多核苷酸的重组表达载体，所述载体包括pPIC9K。
含有上述重组载体的重组工程菌，宿主菌为毕赤酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、丝状真菌、芽孢杆菌等，优选的，宿主菌为毕赤酵母。
本发明还提供一种重组人乳铁蛋白肽三聚体的制备方法，所述方法包括：
（1）设计并优化所述重组人乳铁蛋白肽的编码DNA序列；
进一步的，所述重组人乳铁蛋白肽包含所述含有重组人乳铁蛋白肽单体的蛋白融合体；
所述蛋白融合体的结构用通式表示为L-C-T，其中L为重组人乳铁蛋白肽单体；C为人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分；T为T4 foldon，位于所述重组胶原蛋白单体的羧基端。
进一步的，所述重组人乳铁蛋白肽单体包括SEQ ID NO：1所示的序列，或与SEQ IDNO：1具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上同一性的序列。
进一步的，所述重组人乳铁蛋白肽会通过T4 foldon和人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分聚集区，形成特定三聚体，所述形成重组人乳铁蛋白肽的三聚体化的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
（2）构建表达载体：
将步骤（1）中所述的DNA序列克隆于表达载体上，得到重组表达载体。
进一步的，所述表达载体包括pPIC9K。
（3）工程菌的构建及筛选：
将构建好的表达载体转入毕赤酵母感受态细胞中制成工程菌，工程菌经过筛选后，接入BMGY培养基诱导表达筛选表达高的工程菌。所述筛选的表达量高的工程菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，命名为HLFcin3。
进一步的，构建的高拷贝、可高效表达外源基因的重组酵母工程菌种样本送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为：CGMCC NO.29181；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日。分类命名为：巴斯德毕赤酵母 Komagataella phaffii。
（4）高密度发酵及蛋白纯化：
采用5L发酵罐诱导表达120h，取发酵液，检测OD值、菌体湿重、上清液中蛋白含量。
本发明进一步的还提供了一种重组人乳铁蛋白肽三聚体的高密度发酵方法，包括如下步骤：
优选地，种子培养基YPG(含酵母粉10g/L、酵母蛋白胨20g/L、甘油10g/L)；发酵培养基BSM(85％H3PO4 26.7mL/L、CaSO4·2H2O 0.93g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4·7H2O 14.9g/L、KOH 4.13g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。Invitrogen公司推荐提供)；补料培养基(含50％W/V甘油，每升加12mL PTM1微量元素)；诱导培养基(含100％甲醇，每升加入12mL PTM1微量元素)；PTM1（CuSO4•5H2O 6.0g/L；NaI 0 .08g/L；MnSO4•H2O 3.0g/L；NaMoO4•2H2O0.2g/L；H3BO3 0.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl2 20.0g/L；FeSO4•7H2O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO4 5.0mL/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存）。
优选地，种子液制备：工程菌接入含100mL种子培养基YPG的1L摇瓶中，220rpm、30℃，培养18-35h，至OD600值。
5L罐装液量2L的BSM培养基，121℃高温灭菌20min。接种前调节发酵罐中转速300rpm，通气量4L/min（2vvm），温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH=5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为4的种子液按5%（V/V）接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70%，开始流加补料培养基至菌体OD值为220，停止补加补料培养基。甘油耗尽后开始流加诱导培养基，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20%，诱导培养120h测定OD值、湿重和发酵上清蛋白含量。
对发酵上清液进行纯化，优选地，所述纯化进行阳离子层析步骤。阳离子层析采用缓冲液A平衡，缓冲液B洗脱；优选地，缓冲液A包括：20mM KH2PO4，pH4.0；缓冲液B包括：20mMKH2PO4，0.25M NaCl,，pH4.0。
本发明还进一步的提供了一种重组人乳铁蛋白肽三聚体的纯化方法，包括如下步骤：
阳离子层析：配制缓冲液A包括：20mM KH2PO4，pH4.0缓冲液B包括：20mM KH2PO4，0.25M NaCl,，pH4.0；用缓冲液B冲洗层析柱两个柱体积，再用缓冲液A平衡层析柱冲洗五个柱体积，然后将发酵上清液用HCl调节pH至4.0，并上样200ml/次，用缓冲液A平衡层析柱冲洗五个柱体积，使用缓冲液B进行洗脱并收集洗脱液，将洗脱液超滤冻干，得到纯化后的蛋白冻干品。
本发明还提供一种高纯度重组人乳铁蛋白肽三聚体在化妆品或保健品中的用途。
具体地，当所述重组人乳铁蛋白肽三聚体应用于化妆品时重组人乳铁蛋白肽三聚体0.01%~1%；甘油1％～5％；丙二醇1％～5％；透明质酸钠0.01％～0.1％；卡波姆0.1％～1％；甜菜碱1％～5％；β-葡聚糖0.1％～1％；霍霍巴酯0.01％～0.1％；甘草酸二钾0.1％～0.5％；虾青素0.1％～1％；其余为纯化水。
当所述重组人乳铁蛋白肽三聚体应用于保健品时，所述保健品各组分的质量分数为：重组人乳铁蛋白肽三聚体1%~10%；水解乳清蛋白1%~10%；甘氨酸0.1%~5%；山梨糖醇0.1%~10%；维生素C0.1%~10%；其余为纯水。
本发明的有益效果：
（1）本发明提供了一种高稳定性人乳铁蛋白肽三聚体的构建方法，通过在乳铁蛋白肽羧基端添加人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分和T4 foldon使得蛋白在分泌过程中形成三聚体。T4 foldon可特定形成三聚体，而人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分含二硫桥能进一步促进三聚体形成。该蛋白可在毕赤酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、丝状真菌、芽孢杆菌等表达系统重表达。本发明中已经证实该人乳铁蛋白肽三聚体不但能够于毕赤酵母这种真核宿主细胞的高效分泌可溶性表达，具有较好的抗菌活性，并且可工业化生产。
（2）本发明涉及的重组蛋白稳定性提高，发酵和纯化过程中均不易发生降解，同时通过一步离子交换即可获得高纯度的产品，生产工艺简单，可规模化生产。
（3）本发明涉及的重组人乳铁蛋白肽三聚体冻干海绵经稳定性试验，有较高的稳定性。
（4）本发明对重组蛋白进行抑菌检测，重组人乳铁蛋白肽三聚体具有较好的抗菌活性。
（5）本发明对重组蛋白进行细胞增殖检测，重组人乳铁蛋白肽三聚体在特定浓度下有促进细胞增殖作用。
附图说明
图1为HLFcin3菌株摇瓶诱导表达48h后上清液经SDS-PAGE检测结果。
图2为诱导表达得到的蛋白切胶回收后送质谱检测的结果。
图3为高密度发酵上清和纯化后冻干海绵经SDS-PAGE检测结果，左图为诱导120h后发酵上清，右图为冻干海绵。
图4为不同浓度的重组人乳铁蛋白肽三聚体冻干海绵和对照品细胞增殖检测结果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规实验方法完成，实施例中所涉及过程没有多作说明的都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。
本发明选取一种乳铁蛋白肽结合人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分和T4 foldon形成融合蛋白以三聚体的形式表达，但理论而言其他任何乳铁蛋白多肽均可使用类似的方法和策略也可以实现类似的效果。
实施例1
氨基酸序列设计
人乳铁蛋白肽(记为Lfcin-H)的氨基酸序列参考Uniprot数据库P02788(https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02788/entry)序列中第20-67部分(PRO_0000422770)，为重组人乳铁蛋白肽单体，是目前研究最多的乳铁蛋白肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
GRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQA
在如SEQ ID NO：1所示单体的羧基端加上人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分，人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分的氨基酸序列参考Uniprot数据库P02461（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02461）序列中1262-1294部分，其序列如SEQ ID NO.2所示：
CRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFC
在人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分C端加上T4 foldon氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
形成有重组人乳铁蛋白肽单体的蛋白融合体,命名为HLfcin-T，蛋白融合体共108个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.4所示：
GRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQACRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFCGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
序列中的“CRDLKFCHPELKSGEYWVDPNQGCKLDAIKVFCGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL”作为三聚体的结构域，并以此融合蛋白为基础，在分泌表达过程中形成三聚体，得到的人乳铁蛋白肽三聚体命名为3HLfcin-T。3HLfcin-T共324个氨基酸，理论分子量为37.4KDa。
实施例2
重组表达载体的构建、菌种筛选
（1）重组表达载体的构建
经过优化设计后，编码HLfcin-T的DNA序列，如SEQ ID NO.5所示：
GGTAGAAGAAGATCTGTTCAATGGTGTGCTGTTTCTCAACCAGAAGCTACTAAGTGTTTTCAATGGCAAAGAAACATGAGAAAGGTTAGAGGTCCACCAGTTTCTTGTATTAAGAGAGATTCTCCAATTCAATGTATTCAAGCTTGTAGAGATTTGAAGTTTTGTCATCCAGAATTGAAGTCTGGTGAATACTGGGTTGATCCAAACCAAGGTTGTAAGTTGGATGCTATTAAGGTTTTTTGTGGTTACATTCCAGAAGCTCCAAGAGATGGTCAAGCTTACGTTAGAAAGGATGGTGAATGGGTTTTGTTGTCTACTTTTTTG
设计好的DNA序列SEQ ID NO.5委托南京金斯瑞科技有限公司合成，并重组至pPIC9K空载体(赛默飞世尔科技（中国）有限公司)上，克隆位点为1215bp（即α-factorsecretion signal/ cleavage site 1215，查找序列为TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT）与1248bp（TAA site 1246-1248）。获得表达HLfcin-T的重组表达载体质粒。将重组质粒转化进入感受态大肠杆菌DH5α(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)，在含有kana抗生素的LB抗性平板筛选阳性克隆，提取重组质粒进行测序鉴定(交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)，验证正确。
（2）菌种筛选
将上述得到的重组表达载体质粒10μg用限制性内切酶Sal I(购自大连Takara公司)37°C酶切消化，使其线性化，再使用PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)回收线性化质粒。取线性化的质粒10μL电转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，将电转后的菌液涂布至MD平板上，每100μL～200μL菌液涂布一块平板，于30℃培养箱中倒置培养2-3天，直至有阳性菌落出现。
向MD平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的阳性菌落，并转移到无菌离心管中。用无菌双蒸水稀释菌悬液，每105个细胞涂布于一块含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，于30℃培养箱中倒置培养2～4天至单菌落出现。
从YPD平板上挑取单菌落至装有200μL YPD培养基的96孔板中，混匀后于30℃培养箱中静置培养48h；混匀孔中菌液，取10μL转接至第二块96孔板中，于30℃培养24h后再以相同操作转接至第三块96孔板中，使得孔板中菌体密度保持相对一致，取第三块96孔板中的菌液1μL分别点板于含1.0、2.0、4.0mg/mL G418的YPD平板，置于30℃培养箱中培养2~4天。毕赤酵母转化子若能在含高浓度(4mg/mL)G418的平板上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因，即有多个重组片段进入了酵母体内并通过同源重组整合到酵母的染色体上。经过这一步筛选可得到的高拷贝、可高效表达的重组酵母工程菌种。
构建的高拷贝、可高效表达外源基因的重组酵母工程菌种样本送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为：CGMCC NO.29181；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日。分类命名为：巴斯德毕赤酵母 Komagataella phaffii。
实施例3
诱导表达与重组人乳铁蛋白肽三聚体的鉴定
分别取实施例2得到的表达3HLfcin-T的重组工程菌置于装有10mL BMGY培养基的100mL三角瓶中，于30℃、220rpm培养至OD600为2～8(16-18h)。室温下10000rpm离心2min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600为2左右，放置于30℃、220rpm的摇床上继续培养2天，每24h向培养基中添加100%甲醇至培养基中。48h后结束培养，收取菌液样品置于1.5mL EP管中，4℃下以10000g离心10min，收集表达上清，加入5×上样缓冲液（250mMTris-HCl、pH6 .8，10%SDS，0 .5%溴酚蓝，50%甘油，5%β-巯基乙醇）于金属浴100℃煮样10min，使用南京金斯瑞Bis-tris12%预制胶跑蛋白胶，然后用Image Lab软件(Bio-Rad GelDoc XR+成像仪)进行SDS-PAGE检测。电泳结果如图1所示。从胶图上可见诱导48h后3HLfcin-T高效分泌表达。使用Image Lab软件测算，表观分子量为37.4KDa。
将SDS-PAGE凝胶上的目的条带切下来，送交苏州普泰生物技术有限公司进行Nano-LC-ESI-MS/MS蛋白质谱检测，将检测到的肽段进行序列比对（Uniprot数据库），数据比对结果及鉴定肽段与天然序列比对覆盖图，如图2所示，图2可见，胶图上的目的条带酶解后检测到的肽段属于人乳铁蛋白肽Lactoferricin-H链上的序列。
实施例4
高密度发酵与纯化
（1）基因工程菌高密度发酵
表达3HLfcin-T的重组工程菌用5L发酵罐（保兴生物）高密度发酵，获取含重组人乳铁蛋白肽三聚体的上清液。
种子培养基YPG(含酵母粉10g/L、酵母蛋白胨20g/L、甘油10g/L)；发酵培养基BSM(85％H3PO4 26.7mL/L、CaSO4·2H2O 0.93g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4·7H2O 14.9g/L、KOH4.13g/L、甘油40.0g/L、PTM1 0.45mL/L。Invitrogen公司推荐提供)；补料培养基(含50％W/V甘油，每升加12mL PTM1微量元素)；诱导培养基(含100％甲醇，每升加入12mL PTM1微量元素)；PTM1（CuSO4•5H2O 6.0g/L；NaI 0 .08g/L；MnSO4•H2O 3.0g/L；NaMoO4•2H2O 0.2g/L；H3BO3 0.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl2 20.0g/L；FeSO4•7H2O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO45.0mL/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存）。
种子液制备：工程菌接入含100mL种子培养基YPG的1L摇瓶中，220rpm、30℃，培养18-35h，至OD600值为4。
5L罐装液量2L的BSM培养基，121℃高温灭菌20min。接种前调节发酵罐中转速300rpm，通气量4L/min（2vvm），温度30℃，用浓氨水调节pH，控制发酵pH=5.0。然后先接入0.9mL PTM1，然后再将制备好的OD值为4的种子液按5%（V/V）接入罐内。当碳源耗尽后，溶氧突然回升至70%，开始流加补料培养基至菌体OD值为220，停止补加补料培养基。甘油耗尽后开始流加诱导培养基，进入甲醇诱导培养阶段。调节转速和压缩空气通量使得溶氧大于20%，诱导培养120h后结束发酵测定OD值为276、湿重为330g/L和发酵上清蛋白含量为11.1g/L。
收集发酵上清进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3中左图所示，可见高密度发酵下重组人乳铁蛋白肽三聚体对毕赤酵母有杀伤作用，酵母死亡较多导致上清液中有较多毕赤酵母宿主蛋白，同时目的条带出现在28KDa位置上，无降解条带。这说明，在发酵阶段重组人乳铁蛋白肽三聚体蛋白能较高表达，同时能有较好的稳定性。
（2）对发酵上清液进行纯化，
缓冲液A包括：20mM KH2PO4，pH4.0缓冲液B包括：20mM KH2PO4，0.25M NaCl,，pH4.0。
收集发酵液，7000rpm、30min、4℃离心分离菌体和发酵上清，收集上清液。用缓冲液B冲洗阳离子层析介质两个柱体积，以缓冲液A平衡阳离子交换介质(层析填料为苏州纳微产UniGel-80sp装载于利穗科技产GCC-50-400层析柱，使用GE AKTA Pure蛋白质分离层析纯化系统)至A215吸光值和电导率值都保持不变后，设置40us/cm的流速上样，上样体积0.5L/次，检测紫外A280nm吸光值，当其上升时，开始接样。随后浓缩、冷冻干燥，收集冻干重组人乳铁蛋白肽三聚体冻干海绵。取纯化后冻干海绵溶于超纯水，进行SDS-PAGE电泳，如图3中右图所示。重组人乳铁蛋白肽三聚体发酵液经一步阳离子层析纯化步骤后去除了所有酵母的宿主蛋白，同时目的蛋白不发生降解情况，符合三聚体设计预期。
实施例5
重组人乳铁蛋白肽三聚体冻干海绵稳定性研究
（1）将实施例4中收集的重组人乳铁蛋白肽三聚体冻干海绵用稳定性试验（LHH-150SD，上海灯晟仪器制造有限公司）箱做常温贮存加速试验，采用的温度为40℃，湿度为75%RH。重组人乳铁蛋白肽三聚体海绵经10天加速试验，稳定性较好。
时间 第0天 第1天 第3天 第5天 第7天 第10天
纯度 91.52% 90.85% 91.81% 90.86% 91.78% 90.66%
（2）将实施例4中收集的重组人乳铁蛋白肽三聚体冻干海绵用稳定性试验（LHH-150SD，上海灯晟仪器制造有限公司）箱做冷冻贮存加速试验，采用的温度为25℃，湿度为60%RH。重组人乳铁蛋白肽三聚体海绵经10天加速试验，稳定性较好。
时间 第0天 第1天 第3天 第5天 第7天 第10天
纯度 91.52% 90.44% 91.40% 90.91% 92.30% 91.16%
实施例6
重组人乳铁蛋白肽三聚体抗菌活性检测：将重组人乳铁蛋白肽三聚体冻干海绵和重组人乳铁蛋白肽单体冻干品（样品由江苏创健医疗科技股份有限公司提供）按2mg/ml稀释成水溶液，按QB/T 2738-2012 《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》进行抑菌率检测试验（挪亚检测技术有限公司）。
由实施例6可知重组人乳铁蛋白肽三聚体对铜绿假单胞菌和黑曲霉有较强的抗菌活性，同时抗菌活性均高于重组人乳铁蛋白肽单体。
实施例7
细胞增殖检测试验：
（1）细胞铺板
取对数生长期且已覆盖培养皿底部面积 80~90%的 L-929 细胞，吸除原培养基，加入3mL预热的 DPBS 清洗1次，倒掉 PBS，加入1mL胰酶—EDTA 消化液，将消化液在皿底铺平后静置3min，待有肉眼可见的有细胞脱落，加入3mL预热的 DMEM完全培养基（或 200μlFBS）终止消化反应，并用 1mL枪头反复吹打将细胞混匀，将其转移至 15mL离心管中使用1000rpm 离心5min；弃上清，轻弹离心管底端的细胞沉淀使其散开，向其内加入2mLDMEM完全培养基，吹打混匀后细胞计数，计数后调整细胞悬液密度为 1×10 5 /mL 时，将细胞悬液以每孔10 4 cell/100μl 接种于96孔板中，96孔板边缘的孔内添加100μL DPBS，将96孔板放入细胞培养箱（37℃，5%CO2)中培养。
（2）加样
待孵育24小时后，Balb/3T3细胞贴壁生长至70-80%左右，弃去96孔板内原培养基，在96孔板相应孔内各加入100μl由无血清DMEM培养基溶解的样品试剂（终浓度为 2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL 和 0.25mg/mL），空白对照样品试剂，阴性对照样品试剂和阳性对照样品试剂。每个样品设置5个重复，置于37℃、5% CO2 培养箱中。连续培养 24 h、48 h、72 h、96h（每48h更换一次含重组人乳铁蛋白肽三聚体样品的培养液）。
（3）MTT 显色
至每个时间点，后取出96孔板，在显微镜下观察细胞形态，然后去除原液体，每孔加入100μl MTT溶液（用DPBS稀释为终浓度 1mg/mL），置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养2h。
（4）测吸光度（OD490nm）
2h后快速翻转96孔板 ，弃去上清液，每孔添加100μL DMSO，振荡10 min 溶解MTT结晶。用酶联检测仪检测各孔在490 nm 处的吸光值（OD490值），同时设置无细胞孔作为对照组进行调零，取3孔平均值。以培养时间与吸光值为坐标轴绘制细胞生长曲线。
结果如图4所示，0.5mg/mL的重组人乳铁蛋白肽三聚体冻干海绵对细胞增殖有较好的促进作用，超过0.5mg/mL随着浓度的增加促进作用下降。
实施例8
一种乳液化妆品具体成分为：重组人乳铁蛋白肽三聚体0.1%；甘油1％；丙二醇1％；透明质酸钠0.1％；卡波姆0.2％；甜菜碱1％；β-葡聚糖0.2％；霍霍巴酯0.1％；甘草酸二钾0.05％；虾青素0.1％；其余为纯化水。
实施例9
一种提高免疫力保健品各组分的质量分数为：重组人乳铁蛋白肽三聚体5%；水解乳清蛋白2%；甘氨酸0.1%；山梨糖醇1%；维生素C0.5%；其余为纯水。
以上所述仅是本发明的优选或示例性的实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进或润饰，这些改进或润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种含有重组人乳铁蛋白肽的三聚体化融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由重组人乳铁蛋白肽、人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分和T4 foldon蛋白组成，所述人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分位于重组人乳铁蛋白肽的羧基末端，T4 foldon蛋白位于人Ⅲ型胶原蛋白C端前肽部分的羧基末端。
2.根据权利要求1所述的含有重组人乳铁蛋白肽的三聚体化融合蛋白，其特征在于，所述重组人乳铁蛋白肽包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1具有80%以上同源性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的含有重组人乳铁蛋白肽的三聚体化融合蛋白，其特征在于，所述的含有重组人乳铁蛋白肽的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.编码权利要求1所述含有重组人乳铁蛋白肽的三聚体化融合蛋白的基因。
5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
6.重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求1所述的含有重组人乳铁蛋白肽的三聚体化融合蛋白或权利要求5所述的编码基因。
7.重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包含权利要求6所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌保藏编号为：CGMCCNO.29181；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2023年11月30日；分类命名为： Komagataella phaffii。
9.如权利要求1所述的含有重组人乳铁蛋白肽的三聚体化融合蛋白在制备化妆品或保健品中的应用。
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