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CN117820471B - Gfap特异性抗体及其在检测gfap试剂盒中的应用 - Google Patents

Gfap特异性抗体及其在检测gfap试剂盒中的应用 Download PDF

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CN117820471B CN202410247761.0A CN202410247761A CN117820471B CN 117820471 B CN117820471 B CN 117820471B CN 202410247761 A CN202410247761 A CN 202410247761A CN 117820471 B CN117820471 B CN 117820471B
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Abstract

本申请公开了一种GFAP特异性抗体及其在检测GFAP试剂盒中的应用，属于生物医药技术领域。本申请提供一种特异性结合GFAP的抗体或其抗原结合片段，本申请还提供编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述载体的宿主细胞、抗体或抗原结合片段的制备方法和检测GFAP蛋白的试剂盒。本申请提供的检测试剂盒可以用于与GFAP相关疾病的辅助诊断。

Description

GFAP特异性抗体及其在检测GFAP试剂盒中的应用
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，涉及一种靶向GFAP的抗体、制备方法和检测GFAP的试剂盒。
背景技术
GFAP富含谷氨酸和天冬氨酸，在软骨细胞、成纤维细胞、肌上皮细胞、淋巴细胞、肝星形细胞少有分布，但主要存在于中枢神经系统的AST内，为AST内的主要骨架蛋白。GFAP在AST内特异性表达，为其标志性蛋白，被认为是AST成熟活化的特异性标志。它在细胞核和细胞膜之间形成连接，参与细胞骨架重组、细胞黏附、维持脑内髓鞘形成和神经元的结构以及作为细胞信号参与转导通路等，还参与细胞运动迁移和细胞增殖。具有维护 AST 形态稳定、参与血脑屏障和髓鞘形成、调节突触功能等多种生物学功能。
多个研究表明，GFAP表达水平异常与多种遗传病和精神病相关，GFAP水平与脑卒中有关，脑卒中后胶质瘢痕的增生伴随着GFAP表达增加。GFAP水平可反映脑梗死病灶大小，血浆中GFAP水平越高，梗死病灶越大，且两者呈正相关。此外，GFAP水平还与神经功能损伤程度有关，血浆中GFAP水平越高，神经功能损伤程度越严重。
目前临床上GFAP最常用的检测方法为酶联免疫吸附法（ELISA）和化学发光法(CLIA)，电化学发光法和液相色谱法。其检测方法中使用的GFAP特异性抗体的性能直接决定检测的灵敏度和特异性。
因此，发现一种结合特异性较高的针对GFAP蛋白的单克隆抗体对检测GFAP表达水平具有重要的意义。
发明内容
本申请提供一种识别胶质纤维酸性蛋白的单克隆抗体及其在化学发光免疫检测试剂盒中的应用，为与胶质纤维酸性蛋白（即GFAP）相关的疾病的辅助诊断提供工具。
一方面，本申请提供一种特异性结合GFAP的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下述的CDR： (a)包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-H1；(b)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列的具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-H2；(c)包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-H3；(d)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L1；(e)包含与RAS的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L2；和(f)包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的VH CDR序列： (a)包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-H1；(b)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-H2；和(c)包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-H3。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的VL CDR序列： (a)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L1；(b)包含与RAS的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L2；和(c)包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L3。在一些实施方案中, 该抗体或抗原结合片段包含(a)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L1；(b)包含与RAS的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L2；和(c)包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含(a)包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的VH CDR序列的VH域： (i)包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-H1；(ii)包含与SEQID NO：2的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-H2；(iii)包含与SEQ ID NO：3的具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的CDR-H3；和(b)包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的VL CDR序列的VL域：(i)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L1；(ii)包含与RAS的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L2；和(iii)包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含RAS的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域(VH)序列。在一些实施方案中, 具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗GFAP抗体保留结合GFAP的能力。在一个实施方案中，该VH包含一种、两种或三种选自下述的CDR： (a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗GFAP抗体保留结合GFAP的能力。在一些实施方案中，该VL包含一种、两种或三种选自下述的CDR： (a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含RAS的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含如任何上文提供的实施方案中的VH，和如任何上文提供的实施方案中的VL。在一些实施方案中，该抗体包含分别如序列SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
一方面，本申请提供一种多核苷酸，其编码本申请的抗体或抗原结合片段。
一方面，本申请提供一种载体，其包含本申请的多核苷酸。
在一些实施方案中，提供一种编码本文所描述的抗GFAP抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在一些实施方案中，提供一或多种包含此类核酸的载体(例如表达载体)。
一方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含本申请的多核苷酸或载体。
在一些实施方案中，宿主细胞包含：(1)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体；或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，宿主细胞是293细胞。在一些实施方案中，提供一种制造抗GFAP抗体的方法，其中所述方法包括在适合于表达抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
一方面，本申请提供一种检测GFAP的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含本申请的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述试剂盒以非诊断目的免疫检测GFAP。在一些实施方案中，所述试剂盒为化学发光法、电化学发光法、ELISA。在一些实施方案中，所述试剂盒是双抗夹心原理的化学发光免疫检测试剂盒，其包括：靶向GFAP的第一抗体包被的磁珠；经化学发光剂标记的靶向GFAP的第二抗体。在一些实施方案中，所述化学发光剂选自吖啶酯、碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶(HRP)中的至少一种。
在一些实施方案中，所述靶向GFAP的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的一个抗体选自如上所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述靶向GFAP的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：20所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为DAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。在一些实施方案中，所述靶向GFAP的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区VL。
在一些实施方案中，所述第二抗体为本申请所述的抗体或抗原结合片段，所述第一抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：20所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为DAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。在一些实施方案中，所述第二抗体为本申请所述的抗体或抗原结合片段，所述第一抗体包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区VL。
一方面，本申请提供了如上述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测GFAP的试剂或试剂盒中的应用。一方面，本申请提供了如上述的抗体或抗原结合片段在制备辅助诊断GFAP相关疾病的试剂盒中的应用。
一方面，本申请提供了如上述的抗体或抗原结合片段的制备方法，具体采用单B细胞抗体克隆技术制备，包括以下步骤：
(1)使用GFAP为免疫原免疫兔，免疫结束后收集脾脏并分离脾细胞；
(2)筛选特异性B淋巴细胞，并提取其总RNA，合成cDNA，再利用PCR获得抗体可变区及恒定区序列；
(3)将扩增的抗体基因插入重组表达载体中，转染293细胞；
(4)收集培养上清并纯化，即得单克隆抗体。
进一步地，步骤1)所述GFAP的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
进一步地，步骤2)所述PCR所用的引物序列如SEQ ID NO：9-11所示。
抗体重链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(SEQ ID NO：9)。
抗体重链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcatttacccggagagcg(SEQ ID NO：10)。
抗体轻链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(SEQ ID NO：9)。
抗体轻链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcaacagtcacccctattg(SEQ ID NO：11)。
进一步地，步骤4)所述纯化具体为：上清过proteinA亲和层析柱进行纯化。
一方面，本申请提供了一种特异性结合GFAP的抗体或抗原结合片段的配对筛选方法，具体采用固定重链可变区如SEQ ID NO：16所示和轻链可变区如SEQ ID NO：17所示的抗体Rabbit anti-GFAP mAb，通过夹心ELISA实验配对筛选抗体或抗原结合片段。
本申请的有益效果
本申请提供了一种新的靶向GFAP的重组抗体及包含上述重组抗体的试剂盒，本申请的重组抗体亲和力高、灵敏度高、生产周期明显缩短，更适合作为核心原料应用于体外诊断试剂领域。
附图说明
图1为本申请抗GFAP单克隆抗体制备过程中抗原特异性单B细胞流式分选结果图。
图2为本申请抗GFAP单克隆抗体用于化学发光检测定值梯度临床样本，检测结果与临床值的相关曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本公开进行详细的说明，但本公开的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本公开的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本公开的保护范围。
除非另外定义，本文所使用的所有术语具有与本公开所属领域技术人员通常理解的相同的含义。整个公开所引用的所有专利、专利申请和出版物其整体通过引用并入本文。如果本文的术语存在多个定义，以本节中的那些定义为准。
下面结合实施例对本公开提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本公开保护范围的限定。
实施例1：抗胶质纤维酸性蛋白 (Glial fibrillary acidic protein, GFAP) 单克隆抗体制备
1.抗原制备
GFAP，本实施例选择哺乳动物细胞293F细胞表达系统，C端带His标签。免疫原、分选原相同，均为GFAP-His重组蛋白。
GFAP，序列为：
MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVSEGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVMGGGGSHHHHHH（SEQID NO：8）。
为获得GFAP兔单克隆抗体，以自主研发的GFAP-His蛋白为免疫原，免疫新西兰大白兔，每只免疫500ug。首次免疫，免疫原与等量的弗氏佐剂混合制成乳化剂，皮下多点注射，间隔3周取250ug免疫原与等量的弗氏佐剂混合制成乳化剂，皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集PBMC样本，GFAP--His蛋白作为分选原包板，ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，250ug免疫原于皮下多点注射加强免疫一次后取兔子脾脏。
2.单B细胞悬液制备
兔脾脏样本淋巴细胞的分离与制备，是通过物理研磨兔脾脏，经多孔滤网过滤制备单细胞悬液。单细胞悬液用于细胞染色和流式分选工作。
3.抗原特异性单B细胞分选
抗原特异性单B细胞分选，是基于流式抗体特异性识别淋巴B细胞表面特征性标志物，应用流式细胞分选术完成淋巴细胞悬液中特异性单个B细胞的获取。
本实施例中，分选原偶联FITC染料。
抗兔IgG二抗，是自研类抗体。偶联PE染料。
细胞标记时，加入DAPI染料，以区分死/活细胞（Dead/Live细胞）。
细胞标记方案，淋巴B细胞分选方案：Dead/Live-/IgG+/Antigen+。
细胞标记操作：兔淋巴细胞悬液，300g离心5min，加入5mL buffer液，上下颠倒混匀，300g离心5min。弃上清，重复1次，取30uL细胞悬液进行细胞计数，取40uL细胞悬液，用于空白对照管和待标记的单染管。剩余细胞液作为样本管，300g离心5min，加少量PBS液重悬。空白管不做处理。单染管，补充PBS液至100uL，分别加入2uL PE、2uL FITC、2uL DAPI染料。样本管按照PE染料1.5uL/106细胞，FITC染料2ug/106细胞，计算实际加入量，避光加入相应的抗体，4℃放置30min。抗体孵育结束后，加入2mL buffer液，轻混匀，300g离心5min，重复洗3次。1mL buffer液重悬，细胞过滤后，等待上机分选。
完成荧光补偿调节后，基于活细胞群，圈定PE和FITC双阳性信号细胞群（图1），抗原特异性B细胞分选入96孔板中，每孔仅有1个细胞，分选后孔板需立即低温保存，本实施例实验中备有干冰盒，可短暂放置。孔中装有细胞裂解液，分选的96孔PCR板直接进行单细胞抗体基因的扩增。
4.兔单B细胞cDNA制备
单B细胞cDNA文库制备，是基于SMART 5’RACE技术，所用试剂皆为南京诺唯赞生物科技股份有限公司（VAZYME）N711#试剂盒，可于市场购得。实施例中实验所涉及的扩增体系，均可参考N711试剂盒说明书。
单B细胞RNA逆转录：完成分选的96孔板，解冻后置于PCR仪中运行程序，程序结束后冰上静置2min。
单B细胞cDNA单链合成：逆转录反应程序结束后，可加入单链合成体系。待体系加入后，孔板轻混匀，置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置2min。
单B细胞DNA双链合成：cDNA单链产物的合成反应结束后，可加入双链合成体系。待体系加入后，孔板轻混匀，离心后置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置。
5.兔单B细胞PCR技术扩增抗体编码基因
单个B细胞cDNA文库，可调取天然配对的抗体重链和轻链编码基因。
编码基因扩增所用试剂，皆为南京诺唯赞生物科技股份有限公司（VAZYME）P515#试剂盒，可于市场购得。实施例中实验所涉及的扩增体系，均可参考P515试剂盒说明书。
上游引物包含与启动子CMV基因序列 3’端互搭的同源臂，因此抗体编码基因调取后，可直接用于线性表达框的构建。
抗体重链编码基因调取的下游引物位于恒定区位置，包含与BGH-polyA基因序列互搭的同源臂。
轻链编码基因调取的下游引物位于恒定区位置，包含与BGH-polyA基因序列互补的同源臂，因此抗体编码基因调取后，可直接用于线性表达框的构建。
抗体重链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc（SEQ ID NO：9）。
抗体重链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcatttacccggagagcg（SEQ ID NO：10）。
抗体轻链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc（SEQ ID NO：9）。
抗体轻链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcaacagtcacccctattg（SEQ ID NO：11）。
抗体轻链、重链编码基因调取：按照说明书加入PCR扩增体系，孔板轻混匀，置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置。
本实施例中，抗体轻链、重链编码基因在同一96孔板的扩增产物配对阳性率在80％以上，借助琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰，说明单B细胞流式分选和编码基因扩增实验均是有效的。扩增产物，用于重组表达质粒的构建。
6.抗体重链和轻链重组表达质粒的构建与表达
重组表达载体，选择pcDNA3.1（Invitrogen），在ThermoFisher SCIENTIFIC官网购买。重组构建前，选择HindⅢ限制酶单酶切实现表达载体线性化，限制酶在New EnglandBiolabs官网购买。
载体与编码基因的高效重组，选择无缝克隆试剂盒，在VAZYME官网购买C115#试剂盒。
重组表达质粒的构建：抗体重链和轻链的编码扩增产物与pcDNA3.1线性化载体应用无缝克隆技术实现环化连接，后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB固定培养基平板，平板倒置37℃过夜培养。
重组阳性克隆挑选：初筛抗体的重链和轻链，分别挑取8个单菌落，PCR菌检后确定菌落阳性率。
重组质粒的菌检PCR，位于载体的上游引物序列为：caagctggctagcgtttaaactt（SEQ ID NO：12）。
抗体重链菌检PCR下游引物序列为：ctcatttacccggagagcg（SEQ ID NO：13）。
抗体轻链菌检PCR下游引物序列为：acctcaacagtcacccctattg（SEQ ID NO：14）。
重组阳性克隆送测：抗体重链、轻链，分别挑取5个菌检PCR阳性克隆送上海生工生物公司测序。
兔抗体基因序列分析：应用IMGT数据库完成抗体序列V区基因确定，并对抗体重链及轻链CDR1/CDR2/CDR3区等完成抗体序列的分析，导出并确定菌检PCR阳性克隆的正确序列编号。
重组表达质粒的小量表达：正确序列的克隆，菌液中量小提获得抗体轻链、重链质粒。质粒混合后共转染于HEK293哺乳动物细胞。细胞转染10天后，离心收集细胞上清。上清进行抗原特异性评测，等ELISA初筛结果后安排细胞上清纯化。
本实施例中每轮转染100个质粒，即每轮转染可获得100株单克隆抗体。共进行5轮转染实验。
7.重组表达上清抗原特异性评测
抗原包被板制备，筛选原为GFAP-His蛋白、GST-His标签蛋白，均为293F细胞重组表达，C端带His标签。
GFAP蛋白单克隆抗体的筛选方案：与GFAP-His蛋白反应，且不与GST-His蛋白反应的抗体，即初步定为GFAP特异性单克隆抗体。
筛选原GST-His，序列为
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKGGGGSHHHHHH（SEQ ID NO：15）。
间接ELISA检测细胞上清，应用自产兔二抗Anti-Rabbit IgG mAb包被，羊抗兔多抗标记HRP检测，反应性OD>1，说明重组质粒在293细胞上正常表达。
间接ELISA检测细胞上清，分别对2种抗原包被板进行反应性评测，得到孔板上清的初筛检测结果（表1为例示性展示50株细胞上清的检测数据）。
表1：部分抗体的抗原-抗体的亲和力数据表
间接ELISA检测结果：GFAP-His抗体初筛共转染重组获得500株单克隆抗体，与GFAP-His蛋白反应，且不与GST-His蛋白反应的抗体，初步筛选出100株单克隆抗体。
初步筛选确定的细胞上清，经proteinA纯化后获得小量单克隆抗体，每株平均1-3mg。
8.重组抗体ELISA配对筛选
GFAP蛋白的配对抗体筛选，早期已完成GFAP高亲和力特异性抗体的开发，因此本实施例选择固定Rabbit anti-GFAP mAb，夹心ELISA实验配对检测初步筛选的100株单克隆抗体，筛选出可以与Rabbit anti-GFAP mAb配对检测的较优单克隆抗体。
Rabbit anti-GFAP mAb重链可变区序列为：
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDLTTYTMTWVRQAPGKGLEWIGIISGSGTTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDLYGSSDIYNIWGPGTLVTVST（SEQ ID NO：16）；
（CDRH1：GIDLTTYT（SEQ ID NO：18）；CDRH2：ISGSGTT（SEQ ID NO：19）；CDRH3：ARDLYGSSDIYNI（SEQ ID NO：20））
轻链可变区序列为：
DIVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASESIRNYLSWYQQKPGQPPKLLIFDASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQTYYGVSGFGNAFGGGTEVVVK（SEQ ID NO：17）；
（CDRL1：ESIRNY（SEQ ID NO：21）；CDRL2：DAS；CDRL3：QTYYGVSGFGNA（SEQ ID NO：22））
临床阳性样本ELISA平台同步检测数据显示，ELISA配对实验可以选择GFAP-His作为检测原。
初步筛选的100株单克隆抗体，经夹心ELISA实验检测GFAP-His，最终筛选出检测原高值和低值的配对检测信号值排序的前10株，上化学发光平台验证抗体的临床样本检出情况（表2为例示性展示20对配对抗体的检测结果）。
表2：GFAP-His配对抗体的检测数据（部分）
9.重组抗体化学发光平台筛选
将步骤8中筛选出的抗体在化学发光平台上进行反应性与特异性检测，具体操作如下：
磁珠包被：固定Rabbit anti-GFAP mAb为包被抗体（抗体可变区序列信息已在步骤8中展示），取2mg磁珠，活化buffer清洗2次，后加入一定量的EDC振荡混匀，磁吸弃上清。沉淀加入1000uL偶联buffer，加入抗体40ug，振荡混匀2h，后加入100uL封闭液，振荡混匀封闭3h。最后加入1000uL TBST清洗磁珠，再加入1000uL保存液。
吖啶酯标记：将步骤8中筛选出的抗体作为标记抗体，取100-(100/CAb)uL偶联Buffer至0 .5mL的棕色EP管中，加入(100/CAb)uL Ab至0 .5mL的棕色EP管中，使抗体标记终浓度在1mg/mL，加入5mM的吖啶酯到0 .5mL的棕色EP管中，漩涡振荡器混合均匀，之后室温(20-25℃)条件下垂直混匀仪反应2h，纯化去除游离的吖啶酯。
筛选原选择GFAP-His蛋白、GST-His蛋白，筛选原具体序列信息已在之前展示，同时检测样本稀释液作为对照。
按上述方法分别完成包被抗体、标记抗体及筛选原的制备，使用全自动化学发光仪，按设定程序对各筛选原进行检测。检测结果与GFAP-His蛋白有反应，且不与GST-His蛋白有反应的抗体即为优选抗体。
经夹心ELISA实验筛选出的10株单克隆抗体，经化学发光平台检测，优选出1株GFAP特异性抗体。表3例示性展示4对配对抗体的检测结果。
表3：GFAP特异性抗体化学发光平台配对检测数据（部分）
将筛到的特异性抗体命名为Anti-GFAP-rRmab-1，重链可变区序列为：
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTSSGFSLSSYYIQWVRQAPGKGLEWIGIIYASGSTYYASWAKGRFTISKTSATVDLKITSPTQEDTATYFCARNDYDSNLIMSIWGPGTLVTVSS（SEQ ID NO：6）；
轻链可变区序列为：
AYDMTQTPASMEVAVGGTVTINCQASQNIGSSLAWYQQKPGQRPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGLQCDDAATYYCQQHFSIGAVQNVFGGGTEVVVR（SEQ ID NO：7）。
表4：抗GFAP抗体的氨基酸序列
实施例2：抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）单克隆抗体在化学发光检测临床样本中的应用
将优选出的GFAP特异性抗体Anti-GFAP-rRmab-1应用于化学发光检测实验，搭配能够与之配对的抗体，对定值梯度临床样本进行检测，比较检测结果与临床定值间的相关性。
梯度临床样本采用simoa单分子免疫法对样本中的GFAP浓度进行定值，具体浓度如表5：
表5：临床样本GFAP浓度表
将优选出的GFAP特异性抗体Anti-GFAP-rRmab-1和上述与之配对的抗体Rabbitanti-GFAP mAb组成抗体对，使用全自动化学发光仪对样本P1-P9，以及样本稀释液中GFAP的浓度进行检测（步骤同实施例1（9）），结果如表6：
表6：临床样本化学发光检测结果表
以simoa单分子免疫法检测的GFAP浓度为横轴，化学发光法检测的GFAP浓度为纵轴，绘制各样本GFAP浓度的散点图，并计算两种检测方法间GFAP浓度值的相关系数。
如图2所示，两种检测方法的相关系数R=0.9954，R2=0.9908，即使用优选出的GFAP特异性抗体Anti-GFAP-rRmab-1，搭配能够与之配对的抗体，应用于化学发光检测实验时，检测结果与simoa单分子免疫法具有较强的相关性，该优选抗体可用于下游试剂盒制备。
尽管已经示出和描述了本申请的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本申请的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种特异性结合GFAP的抗体或其抗原结合片段，其重链CDRH1-CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为RAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：如SEQ ID NO：6所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区VL。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
4.一种检测GFAP的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括靶向GFAP的第一抗体包被的磁珠，和经化学发光剂标记的靶向GFAP的第二抗体，其中，靶向GFAP的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的一个抗体为权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18-SEQ ID NO：20所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为DAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体包含：如SEQ ID NO：16所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区VL。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，所述第二抗体为权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述第一抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18-SEQ IDNO：20所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为DAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，所述第二抗体为权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述第一抗体包含如SEQ ID NO：16所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区VL。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，化学发光剂选自吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的至少一种。
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