CN106854244B - 一种针对her3的纳米抗体及其临床应用 - Google Patents
一种针对her3的纳米抗体及其临床应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106854244B CN106854244B CN201510902884.4A CN201510902884A CN106854244B CN 106854244 B CN106854244 B CN 106854244B CN 201510902884 A CN201510902884 A CN 201510902884A CN 106854244 B CN106854244 B CN 106854244B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- her3
- nano antibody
- antibody
- discloses
- nanobody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 8
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract 1
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxidanylidene-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000007584 Prealbumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010002022 amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种HER3的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明还公开了一种HER3纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明所述的HER3的纳米抗体的VHH链或本发明所述的HER3纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达HER3的纳米抗体，还公开了该HER3纳米抗体用于检测HER3的用途。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于HER3检测试剂及生物制药的研发。
Description
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及针对于HER3的纳米抗体及其编码序列。
背景技术
1993年比利时科学家Hamers.R在骆驼体内发现，与传统抗体相比，在骆驼血液中的抗体，有一半没有轻链，只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体直径为2.5nm，长4nm，分子量只有15KD，因此也被称为纳米抗体（Nanobody，Nb）。与常规抗体相比，基于骆驼重链抗体的VHH单域抗体具有诸多优势：1）分子量小，可穿透血脑屏障，较易作用于病灶区；2）在原核或者真核系统中可高表达；3）特异性强、亲和力高；4）高耐热性和化学稳定性；5）对人的免疫原性弱。其在肿瘤、感染性疾病、肠炎、淀粉样变疾病、血栓以及动脉粥样硬化病变的诊断和治疗方面具有良好的应用效果，同时可以显著降低成本。
在中国，癌症的健康负担逐年增长，每年超过160万人诊断为癌症，120万人因癌症而死亡。与其他大多数国家一样，乳腺癌也成为了中国女性最常见的癌症，发病率占全身各种恶性肿瘤的7~10%；每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2%和9.6%，在乳腺癌患者中约有1/4是HER3过表达。目前常规检测是对患者的活检组织进行定性、半定量方法免疫组化（IHC），但此法耗时较长且操作繁琐。因此为了及时对乳腺癌HER3表达的特异性检测过表达患者进行个体化、靶向性有效的治疗，制备乳腺癌过表达表皮生长因子受体3（HER3）的纳米抗体来进行疾病检测及治疗具有广阔的前景。
目前，也没有针对乳腺癌过表达表皮生长因子受体3（HER3）为靶标的特异性纳米抗体的研究报道。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种 针对HER3的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。
技术方案：本发明的技术方案为：
本发明的第一方面，提供了一种针对HER3重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4。
所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。
优选地，所述的HER3纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
本发明第二方面，一种针对HER3重链抗体VHH，此抗体特异性识别HER3抗原，包括一条具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的VHH链。
本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的HER3重链抗体VHH。
优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：9。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将血液中提取的HER3免疫新疆单峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于HER3的纳米抗体基因库，试验中将HER3偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对HER3特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
附图说明
图1是HER3纳米抗体的基因电泳图；其中泳道1是DNA分子标准，泳道2是PCR扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，PCR产物条带约为700bp。
图2是HER3纳米抗体的DNA琼脂糖凝胶电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为1000bp的分子标记，其余孔道为PCR扩增重链抗体可变区片段产物，PCR产物条带约为500bp；
图3是是构建的单域抗体文库的插入率检测结果，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为DNA分子标记，其余孔道为检测插入片段的PCR产物，经检测，该文库的插入率达到90％以上。
图4是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将HER3蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液。
图5是表达的HER3纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，其余泳道是 250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱下来的纳米抗体，结果显示HER3纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95%以上。
图6是HER3纳米抗体检测特异性分析的结果图。
具体实施方式
本发明首先将HER3的可溶性蛋白作为抗原免疫一只新疆单峰驼，经过5次免疫之后提取该单峰驼外周血淋巴细胞并构建了HER3特异的单域重链抗体文库。将HER3偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得HER3的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选HER3免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
针对于HER3的纳米抗体文库的构建：
（1）首先合成抗原HER3，用于免疫所用的HER3的浓度为500μg/mL，每次免疫将0.5mgHER3与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐剂（购自sigma），剩余几次全部使用弗式不全佐剂（购自sigma），免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。（2）5次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。（3）按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：
第一轮PCR：
上游引物GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC
下游:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，54℃退火，25个循环；结果如图1显示该片段的大小约为700bp，即从左到右的DNA条带分别是：第一为DNA的分子Marker，第二单域抗体基因电泳带约为700bp。
第二轮PCR：
以第一轮PCR产物作模板，
上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段（长片段和短片段），60℃退火，17个循环，回收目的片段，结果如图2显示，该片段的大小约为500bp，即从左到右的DNA条带分别是：第一为DNA分子Marker，第二纳米抗体基因电泳带约为500bp。（4）使用限制性的内切酶（购自NEB）PstI及NotI酶切20μg pComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μg VHH并用T4 DNA连接酶（购自TaKaRa公司）连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（北京神州红叶科技有限公司）中，构建HER3的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为3.1×108。与此同时，通过菌落PCR检测引物使用第二轮PCR引物，Tm55℃。文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机选取单颗克隆做菌落PCR。结果如图3显示插入率已达到90%以上。
实施例2
针对HER3的纳米抗体筛选过程：
（1）将溶解在PBS中的100μg/mL的HER3包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。（2）第二天两个孔中分别加入200μL1%牛奶，室温封闭2小时。（3）2小时后，加入100μL噬菌体（8×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库），在室温下作用1小时。(4）用PBST（PBS中含有0.05%吐温20）洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。(5）用三乙基胺（100mM）将与HER3特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复2轮。结果如图4显示：在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中HER3特异抗体的目的。
实施例3
用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆：
该实验的原理模式图如图4所示，具体检测如下：
（1）从3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3g磷酸二氢钾，12.52g磷酸氢二钾，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1mmol的IPTG，28℃培养过夜。（2）利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。（6）当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。（7）将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL的LB液体中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终得到氨基酸序列SEQID NO：8所示的纳米抗体。
实施例4
纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：
（1）将前面测序分析所获得两种纳米抗体亚克隆至表达性的载体PET32a中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3中，其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37℃过夜。（2）挑选单个菌落接种在15mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。（3）接种1mL的过夜菌种至330mLLB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜。（4）第二天，离心收菌。（5）将菌体破碎以获得抗体粗提液。（6）经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液（50mmol）用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液（250mmol，500mmol）最终可制备纯度达90%以上的蛋白。图5所示从左到右的条带分别是：第一为标准蛋白分子，第二第三250mmol咪唑的洗脱液洗脱的蛋白样品；结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到95%以上。
实施例5
生物素化纳米抗体及其纯化方法：
（1）将针对HER3的纳米抗体基因片段亚克隆至pBAD载体上，随后构建好的质粒pBAD与质粒BirA共转至大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37℃培养过夜；（2）挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；（3）接种1mL的过夜菌种至330mL含氨苄青霉素和氯霉素的TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.4-0.5时，加入330μl50mM的D-生物素（D-biotion）溶液，37℃慢摇1h；（4）加入终浓度为1mMIPTG，28℃摇床培养过夜；（4）离心，收菌；（5）利用渗透法，获得抗体粗提液；（6）使用链霉亲和素磁珠纯化偶联生物素的纳米抗体。
实施例6
HER3纳米抗体检测特异性分析：
（1）将HER3包被在酶标板上，同时做空白孔对照，各包被两个孔，将HER3蛋白纳米抗体及对照抗体前白蛋白纳米抗体分别转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（2）用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody（抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（3）用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate（山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（4）用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。结果如图6显示HER3纳米抗体能特异性的识别HER3蛋白。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种HER3纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2.一种DNA分子，其特征在于，编码权利要求1所述的HER3纳米抗体。
3.权利要求2所述的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
4.权利要求1所述的HER3纳米抗体在制备检测HER3的试剂中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510902884.4A CN106854244B (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | 一种针对her3的纳米抗体及其临床应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510902884.4A CN106854244B (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | 一种针对her3的纳米抗体及其临床应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106854244A CN106854244A (zh) | 2017-06-16 |
| CN106854244B true CN106854244B (zh) | 2020-05-22 |
Family
ID=59132686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510902884.4A Active CN106854244B (zh) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | 一种针对her3的纳米抗体及其临床应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106854244B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110396127A (zh) * | 2019-03-21 | 2019-11-01 | 南京东极医药科技有限公司 | 抗cd20纳米抗体的制备 |
| CN112239504A (zh) * | 2020-09-10 | 2021-01-19 | 哈尔滨博易诚生物科技有限公司 | 一种针对pd-l1的纳米抗体及其应用 |
| CN112250765A (zh) * | 2020-09-10 | 2021-01-22 | 哈尔滨博易诚生物科技有限公司 | 一种针对her2的纳米抗体及其应用 |
| CN114409787A (zh) * | 2022-02-18 | 2022-04-29 | 南京英瀚斯生物科技有限公司 | 一种针对her3纳米抗体的分离纯化方法 |
| WO2025140438A1 (zh) * | 2023-12-27 | 2025-07-03 | 江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 | 靶向her3和trop2的多特异性抗体及其偶联物 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101321784A (zh) * | 2005-10-11 | 2008-12-10 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 针对egfr和igf－ir的纳米抗体tm和多肽 |
| CN101674846A (zh) * | 2007-02-16 | 2010-03-17 | 梅里麦克制药股份有限公司 | ErbB3抗体及其用途 |
-
2015
- 2015-12-09 CN CN201510902884.4A patent/CN106854244B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101321784A (zh) * | 2005-10-11 | 2008-12-10 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 针对egfr和igf－ir的纳米抗体tm和多肽 |
| CN101674846A (zh) * | 2007-02-16 | 2010-03-17 | 梅里麦克制药股份有限公司 | ErbB3抗体及其用途 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Frijters P.Breast cancer and HER3 * |
| Isolation of antigen specific llama VHH antibody fragments and their high level secretion by saccharomyces cerevisiae;Frenken L G等;《J biotechnol.》;20000228;第78卷(第1期);11-21 * |
| the possibilities of imaging with VHH probes.《Utrecht university faculty of medicine these》.2011, * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106854244A (zh) | 2017-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103396482B (zh) | 一种前白蛋白纳米抗体、其编码序列及应用 | |
| CN106854244B (zh) | 一种针对her3的纳米抗体及其临床应用 | |
| CN103864927B (zh) | 视黄醇结合蛋白(rbp)单域抗体编码序列及其应用 | |
| JP2023524719A (ja) | ナノボディ及びナノボディ親和性を同定するための組成物及び方法 | |
| CN105524173B (zh) | 一种针对人源抗体Fc片段的纳米抗体及其应用 | |
| CN110396128B (zh) | 抗cd19纳米抗体的制备 | |
| CN110423277B (zh) | Pd-1的纳米抗体及其临床应用 | |
| CN110372793B (zh) | Pd-l1的纳米抗体及其临床应用 | |
| CN103342750B (zh) | 一种载脂蛋白b纳米抗体、其编码序列及应用 | |
| CN112250765A (zh) | 一种针对her2的纳米抗体及其应用 | |
| CN104479015A (zh) | 针对ngal表位的纳米抗体及其应用 | |
| CN106854246B (zh) | 一种针对pi3k的纳米抗体及其临床应用 | |
| CN106928364A (zh) | 一种FAP纳米抗体Nb26 | |
| CN106928365A (zh) | 一种FAP纳米抗体Nb36 | |
| CN106928355B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb184 | |
| CN106928358B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb168 | |
| CN106928360B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb68 | |
| CN113461816A (zh) | 一种针对绿色荧光蛋白gfp的纳米抗体及其应用 | |
| CN112210009A (zh) | 一种针对pd1的单域抗体及其应用 | |
| CN119119278B (zh) | 一种抗pd-l1蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用 | |
| CN106928359B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb59 | |
| CN106928368A (zh) | 一种FAP纳米抗体Nb57 | |
| CN117820471B (zh) | Gfap特异性抗体及其在检测gfap试剂盒中的应用 | |
| CN119912574B (zh) | 靶向ERα36的鲨鱼单域抗体及其制备方法、应用 | |
| CN106928356B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb50 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20200313 Address after: 210000 Yanziji Street and 371 Yanlu Road, Qixia District, Nanjing City, Jiangsu Province Applicant after: Nanjing Yinghins Biotechnology Co., Ltd. Address before: Yanziji street in Qixia District of Nanjing City, Jiangsu province 210028 and Yan Road 371, East Building Science Park by C307 Applicant before: NANJING DO-GENE BIOTECH Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |