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CN117820463B - 一种稳定性和可溶性提高的胶原蛋白 - Google Patents

一种稳定性和可溶性提高的胶原蛋白 Download PDF

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CN117820463B CN202311872473.6A CN202311872473A CN117820463B CN 117820463 B CN117820463 B CN 117820463B CN 202311872473 A CN202311872473 A CN 202311872473A CN 117820463 B CN117820463 B CN 117820463B
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Abstract

本发明公开了一种稳定性和可溶性提高的胶原蛋白，属于基因工程技术领域。本发明将重复序列(GPP)10中部分脯氨酸改造为天冬氨酸和赖氨酸。本发明构建得到的胶原蛋白纯度达到90％以上，较未改造、由重复序列(GPP)10组成的胶原蛋白(V‑P10BP10)产量提高10.67％、耐热性提高2℃，同时保留较好的耐盐性。本发明提高了生产胶原蛋白的产量，在生物材料领域有着广阔的应用前景。

Description

一种稳定性和可溶性提高的胶原蛋白
技术领域
本发明涉及一种稳定性和可溶性提高的胶原蛋白，属于基因工程技术领域。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％，某些生物体甚至高达80％以上。畜禽源动物组织是人们获取天然胶原蛋白及其胶原肽的主要途径，但由于相关畜类疾病和某些宗教信仰限制了人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的使用，现今正在逐步转向海洋生物中开发。欧洲食品安全局(EFSA)已证实了即使是动物骨骼来源的胶原蛋白也不存在感染疯牛病和其它相关疾病的可能。
由于氨基酸组成和交联度等方面的差异，使得水产动物尤其是其加工废弃物——皮、骨、鳞中所含有的丰富的胶原蛋白具有很多牲畜胶原蛋白所没有的优点，另外来源于海洋动物的胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物的胶原蛋白，比如具有低抗原性、低过敏性等特性。因此水产胶原蛋白可能逐步替代陆生动物胶原蛋白。胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。
胶原蛋白的氨基酸序列由重复的肽三联体(Gly-Xaa-Yaa)构成，其中Xaa和Yaa通常是脯氨酸和羟脯氨酸。其基本结构由三条α链交错排列形成，形成聚脯氨酸Ⅱ型的左手螺旋构象，也即三螺旋结构。正确的三螺旋结构对于胶原蛋白在细胞外基质中实现细胞与细胞之间的相互作用至关重要。对胶原蛋白序列的研究发现，链的紧密包装、链之间形成的氢键、广泛的水合网络以及高含量的脯氨酸和羟脯氨酸是影响胶原蛋白三螺旋结构稳定的重要因素。
由于胶原蛋白具备卓越的生物学特性，其在多个领域中都得到了广泛应用，包括组织工程、临床医学、食品工业、包装材料、化妆品、医学美容、生物材料以及医疗器械等。其多功能性使其成为许多行业中不可或缺的重要组分。专利CN111333715B公开了一种类I型胶原蛋白纤维的制备方法，以N和C端(GPP)10序列为基础，在中间插入连续的Gly-Xaa-Yaa三联体的胶原蛋白序列，形成具有周期性明暗相间条纹的带状纤维，但是该方法存在蛋白存在表达量低、稳定性差等问题。
因此，研究开发可以提高重组胶原蛋白表达量，且稳定性高、能够促进重组胶原蛋白正确折叠形成三螺旋结构的方法具有极高的经济价值与实用价值。
发明内容
为解决上述问题，本发明在重复序列(GPP)10的基础上，将序列中的部分脯氨酸改造为天冬氨酸和赖氨酸。本发明的重复序列构建得到的胶原蛋白由较(GPP)10构建得到的胶原蛋白产量提高、胶原蛋白的耐热性提高、耐盐性稳定。
本发明的第一个目的是提供一种胶原蛋白单链，所述单链结构为第一重复序列-胶原域-第二重复序列；其中，第一重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示(命名为KD2)，第二重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(命名为P10)。
在一种实施方式中，胶原域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述第一重复序列的N端还含有折叠域，结构如图1所示。
在一种实施方式中，折叠域与第一重复序列间通过酶切位点连接；可选地，所述酶切位点为LVPRGSP。
在一种实施方式中，所述折叠域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述胶原蛋白单链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二个目的是提供编码任一上述胶原蛋白单链的基因。
本发明还提供携带上述基因的质粒或细胞。
在一种实施方式中，质粒为pColdIII。
在一种实施方式中，宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
本发明的第三个目的是提供一种提高胶原蛋白稳定性的方法，在胶原域的N端连接第一重复序列，C端连接第二重复序列，构建结构为第一重复序列-胶原域-第二重复序列的胶原蛋白单链(结构如图2所示)；第一重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，第二重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供一种提高胶原蛋白可溶性的方法，在胶原域的N端连接第一重复序列，C端连接第二重复序列，构建结构为第一重复序列-胶原域-第二重复序列的胶原蛋白单链；其中第一重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，第二重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述胶原蛋白单链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供一种提高胶原蛋白产量的方法，在胶原域的N端连接第一重复序列，C端连接第二重复序列，构建结构为第一重复序列-胶原域-第二重复序列的胶原蛋白单链，并通过宿主细胞表达；其中第一重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，第二重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述胶原蛋白单链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第四个目的是提供一种胶原蛋白，由三条结构为第一重复序列-胶原域-第二重复序列的胶原蛋白单链组成；其中，第一重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，第二重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述胶原蛋白单链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成三螺旋结构。
在一种实施方式中，所述胶原蛋白是将氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的胶原蛋白单链在宿主中进行表达后，酶切去除折叠域而得到的。
本发明还提供由上述胶原蛋白高聚自组装形成的胶原蛋白纤维。
本发明还提供上述胶原单链或胶原蛋白或胶原蛋白纤维在制备胶原蛋白产品中的应用。
本发明还提供一种胶原蛋白产品，所述产品含有任一上述胶原单链或胶原蛋白或胶原蛋白纤维。
在一种实施方式中，胶原蛋白产品还含有维生素、矿物质、透明质酸、天然多糖、精油、多酚类物质、天然植物提取物等。
本发明还提供上述胶原单链或胶原蛋白或胶原蛋白纤维在制备胶原蛋白产品中的应用。
在一种实施方式中，所述胶原蛋白产品是化妆品、食品或药物。
在一种实施方式中，所述胶原蛋白产品可以是药物载体、医疗用品或美容产品。
有益效果：
本发明通过对胶原蛋白的重复序列进行改进，在(GPP)10的基础上将序列中的部分脯氨酸改造为天冬氨酸和赖氨酸，有效地提高了胶原蛋白的稳定性和可溶性，同时还促进了胶原蛋白表达时产量的提高。本发明的重复序列和方法适用于多种胶原域。本发明构建得到的胶原蛋白纯度达到90％以上，较未改造、由(GPP)10组成的胶原蛋白(V-P10BP10)相比，产量提高10.67％、耐热温度提高2℃、可溶性提高，同时还保持了较好的耐盐性。
附图说明
图1为胶原蛋白结构示意图。
图2为切除折叠域后的胶原蛋白结构示意图。
图3为细胞破碎后离心收集的上清液的SDS-PAGE图；图中1～2分别对应序列V-P10BP10、V-KD2BP10箭头代表目的条带；M：protein marker。
图4为400mM的咪唑浓度洗脱下的目标蛋白的SDS-PAGE图，图中1～2分别对应序列V-P10BP10、V-KD2BP10箭头代表目的条带；M：protein marker。
图5为胶原蛋白的产量图。
图6为带有V-domain的胶原蛋白经过胰蛋白酶酶切后的SDS-PAGE图，图中1～2分别对应序列P10BP10、KD2BP10，箭头代表目的条带；M：protein marker。
图7为通过MALDI-TOF验证是否为目标蛋白KD2BP10的分子量。
图8为所设计I型胶原蛋白的全波长图谱、热变曲线和热变曲线的一阶导数图。
图9为所设计I型胶原蛋白KD2BP10在0mM、10mM和100mM的全波长图谱、热变曲线和热变曲线的一阶导数图。
图10为配制样品浓度为2mmol/L，用10mM磷酸钠缓冲液溶解，于4℃放置1天后拍照记录。
具体实施方式
培养基：
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取粉5，NaCl 10，pH 7.0；
TB培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，甘油4mL，KH2PO4 2.31，K2HPO4 12.54
培养方法(摇瓶发酵)：
从保存有目的基因的甘油管中吸取菌液50μL至5mL的LB(Amp抗性)中，37℃200r/min过夜培养。转接1％至100mL的TB发酵液(Amp抗性)中，37℃200r/min培养24h后，添加IPTG至终浓度为1mmol/L，25℃200r/min发酵培养10h，再转入15℃发酵14h。
蛋白纯化方法：
发酵后收集菌液，4℃、10000rpm离心5min，弃去上清液，收集菌体沉淀，破碎后以4℃、10000rpm离心20min，经0.45μm水系滤膜过滤。然后用His TrapTM HP 5mL亲和纯化，先用5倍柱体积结合缓冲液A(20mmol/L Na2HPO4、20mmol/L NaH2PO4、500mmol/L NaCl、10mmol/LIminazole、pH 7.4)平衡，再以2.5mL/min的流速上样。上样结束后，用洗脱缓冲液B(20mmol/L Na2HPO4、20mmol/L NaH2PO4、500mmol/L NaCl、500mmol/L Iminazole、pH 7.4)进行梯度洗脱获得目的蛋白，并利用SDS-PAGE分析纯化情况。
胰蛋白酶切：
将纯化后的胶原蛋白用水溶成浓度为2mg/mL，按照摩尔比10：1加入浓度为2.5g/L的胰蛋白酶，25℃摇床酶切20h，经SDS-PAGE分析验证纯度。
除盐冻干处理方法：
用HiTrap Desalting对酶切后的反应物做脱盐处理，以超纯水为流动相，流速为5mL/min，收集峰样，经SDS-PAGE验证后于-50℃真空冷冻干燥。
样品三螺旋结构和稳定性鉴定：
采用圆二色谱鉴定，具体步骤为：将冻干后的样品用10mmol/L、pH 7.4的磷酸钠缓冲液缓冲液溶解成1mg/mL的溶液，4℃平衡24h后进行圆二色谱鉴定。全波长是在4℃下以1nm为间隔测定190-260nm的CD光谱，平均扫描时间为5s。热变曲线是通过监测225nm处的CD信号，以10℃/h的升温速率从10℃升高到80℃获得的，每个温度下平衡8s，熔融温度(Tm)通过取拟合热变曲线在10℃和80℃所对应的吸光值取中值求得，该数据表示样品的稳定性。
蛋白纯度测定：
采用ImageJ对SDS-PAGE电泳图进行分析，计算目的条带的灰度值与目标条带所在泳道的灰度值的比例，计算得到蛋白纯度。
MALDI-TOF-MS(ultrafleXtreme)质谱仪分子量测定方法：
将冻干后的样品分别用水溶解成1mg/mL的溶液使用MALDI-TOF-MS(ultrafleXtreme)质谱仪进行分子量的测定。采用的基质为DHAP(2-乙酰基间苯二酚，结合乙醇与柠檬酸氢二铵使用)，使用线性模式进行操作。
实施例1：胶原蛋白序列的设计
设计如图1所示的胶原蛋白氨基酸序列。其中，第一重复序列的氨基酸序列如SEQID NO.4所示(命名为KD2)，第二重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(命名为P10)。
胶原蛋白序列中的折叠域(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的引入能够辅助胶原蛋白折叠形成三股螺旋结构；胶原域(简称B，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)的引入是通过蛋白质计算分析和热稳定性预测对Ι型胶原蛋白的α1链进行分析，选取预测Tm值接近37℃、三股螺旋倾向性高的序列B；在折叠域与第一重复序列间加入酶切位点LVPRGSP序列，便于后续酶切去除折叠域。考虑序列末端为脯氨酸可能不利于蛋白的表达，因此在胶原蛋白氨基酸序列末端额外添加一个甘氨酸G。将第一重复序列和第二重复序列氨基酸序列均为SEQ ID NO.3，构建得到的胶原蛋白序列作为对比。
根据重复序列的名称以及组件的位置将胶原蛋白序列分别命名为V-KD2BP10(氨基酸序列如SEQ ID NO.6)和V-P10BP10(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)。
实施例2：重组质粒和重组菌的构建
(1)构建重组质粒
从实施例1设计得到重组胶原蛋白序列V-KD2BP10、V-P10BP10的核苷酸序列出发，在合成蛋白单链的核苷酸序列时，在5'侧翼端引入碱基GC，并在5'和3'端分别引入Nco I和Bam HI酶切位点，Nco I酶切位点核苷酸序列为CCATGG，Bam HI酶切位点核苷酸序列为GGATCC(构建得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示)。将合成的上述基因分别插入到pColdIII质粒(购自金唯智)的Nco I和Bam HI之间，得到表达不同重复氨基酸序列的重组胶原蛋白质粒，测序得到正确的重组质粒。
(2)构建重组菌株
将步骤(1)中测序正确的重组质粒分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在含有氨苄的LB平板上，培养筛选，并在甘油管保菌，获得含有重组胶原蛋白的重组菌，分别命名为E.coli BL21(DE3)-V-KD2BP10，E.coli BL21(DE3)-V-P10BP10。
实施例3：胶原蛋白序列的表达纯化及酶切
以实施例2得到的重组菌E.coli BL21(DE3)-V-KD2BP10，E.coli BL21(DE3)-V-P10BP10进行摇瓶发酵培养，收集菌体破碎离心后，上清液的SDS-PAGE结果如图3所示。取上清用His TrapTM HP 5mL进行亲和纯化，收集咪唑浓度为175mmol/L和400mmol/L下的样品，样品通过SDS-PAGE验证为目标蛋白，结果如图4所示。
将验证后的蛋白进行除盐冻干后称重得到其产量，结果如图5所示。重组胶原蛋白V-P10BP10、V-KD2BP10产量分别为55.02mg/L、60.89mg/L，改造后的胶原蛋白V-KD2BP10的产量较V-P10BP10提高了10.67％。
为了去除折叠域，设计序列时在重复序列和折叠域之间引入胰蛋白酶酶切位点LVPRGSP序列，将纯化后的胶原蛋白用水溶成浓度为2mg/mL，按照摩尔比10：1浓度为2.5g/L的胰蛋白酶(购自上海泰坦科技股份有限公司)进行消化处理，得到纯胶原域结构。
在胰蛋白酶的作用下，V-domain会被消化成多条含有2-20个氨基酸残基的短肽，若胶原结构域在V-domain的作用下正确折叠形成刚性的三股螺旋结构，则短时间内不会被胰蛋白酶消化，酶切后进行脱盐去除短肽，最终得到胶原蛋白P10BP10、KD2BP10。经SDS-PAGE验证，结果如图6所示，纯度大于90％。
实施例4：MALDI-TOF鉴定
取实施例3酶切脱盐后的胶原蛋白KD2BP10冻干，将冻干后的样品分别用水溶解成1mg/mL的溶液使用MALDI-TOF-MS(ultrafleXtreme)质谱仪进行分子量的测定。采用的基质为DHAP(2-乙酰基间苯二酚，结合乙醇与柠檬酸氢二铵使用)，使用线性模式进行操作，验证所得到的胶原蛋白分子量与理论值一样，结果如图7所示。
实施例5：圆二色谱表征胶原蛋白、序列结构
为了确认胶原域的二级结构，将实施例3的酶切脱盐后胶原蛋白P10BP10、KD2BP10、冻干样品用10mmol/L的磷酸钠缓冲液配置成1mg/mL的溶液，在4℃下平衡24h。待平衡结束后，利用圆二色谱进行全波长扫描。
结果如图8所示，P10BP10、KD2BP10均在225nm处出现特征性正吸收峰，表明2种胶原蛋白都在V-domain的辅助下正确折叠形成三股螺旋结构。利用圆二色谱监测225nm下从4℃到80℃的热变曲线，通过对热变曲线一阶求导得到胶原蛋白的Tm值，P10BP10的Tm值为35℃，KD2BP10 Tm值为37℃。
以上结果表明，本发明设计的胶原蛋白序列能正确折叠形成三股螺旋结构，较P10BP10蛋白序列的Tm值提高2℃，所设计的序列能提高蛋白热稳定性。
实施例6：胶原蛋白的耐盐性检测
为了验证不同胶原蛋白序列能否在高浓度盐溶液中的稳定性，取实施例3制备得到的胶原蛋白KD2BP10冻干并将样品溶于10mmol/L的磷酸钠缓冲液，配置成1mg/mL的溶液。在此基础上于溶液中分别加入100mmol，200mmol的氯化钠，结果如图9所示，利用圆二色谱监测225nm下从4℃到80℃的热变曲线，通过对热变曲线一阶求导得到胶原蛋白的Tm值，结果显示，各序列在高盐环境下Tm值仍为37℃，由此可见，改造后胶原蛋白仍具有较好的耐盐性。
实施例7：重复序列提高胶原域蛋白溶解性
为了验证不同胶原蛋白序列的溶解性，取实施例3制备得到的胶原蛋白P10BP10、KD2BP10冻干样品溶于10mmol/L的磷酸钠缓冲液，配置成样品浓度为2mmol/L的溶液，将其于4℃静置1天，结果如图10所示，P10BP10有沉淀，KD2BP10蛋白无沉淀。由此表明，改造后的胶原蛋白在相同浓度下，较序列P10BP10浊度下降，分子可溶性提高。
本发明涉及的序列：
SEQ ID NO.1：V-domain的氨基酸序列
ADEQEEKAKVRTELIQELAQGLGGIEKKNFPTLGDEDLDHTYMTKLLTYLQEREQAENSWRKRLLKGIQDHALD
SEQ ID NO.2：胶原域B的氨基酸序列
GFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGA AGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPS
SEQ ID NO.3：(GPP)10的氨基酸序列
GPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP
SEQ ID NO.4：KD2的氨基酸序列
GPPGPPGPKGDPGPPGPPGPKGDPGPPGPP
SEQ ID NO.5：V-P10BP10的氨基酸序列
HHHHHHHHGGGGSADEQEEKAKVRTELIQELAQGLGGIEKKNFPTLGDEDLDHTYMTKLLTYLQEREQAENSWRKRLLKGIQDHALDLVPRGSPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPG
SEQ ID NO.6：V-KD2BP10的氨基酸序列
HHHHHHHHGGGGSADEQEEKAKVRTELIQELAQGLGGIEKKNFPTLGDEDLDHTYMTKLLTYLQEREQAENSWRKRLLKGIQDHALDLVPRGSPGPPGPPGPKGDPGPPGPPGPKGDPGPPGPPGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPG
SEQ ID NO.7：V-P10BP10的核苷酸序列
CATCATCATCATCATCATCATCATGGTGGTGGTGGTTCAGCAGATGAACAGGAAGAAAAGGCAAAAGTGCGTACAGAACTGATCCAGGAACTGGCACAGGGCCTGGGTGGTATCGAAAAGAAGAACTTTCCGACTCTGGGTGATGAAGATCTGGATCATACCTATATGACAAAACTGCTGACCTATCTGCAGGAACGTGAACAGGCAGAAAATAGTTGGCGTAAACGTCTGCTGAAAGGTATTCAGGATCATGCTCTGGATCTGGTGCCTCGTGGTTCACCGGGTCCTCCTGGTCCTCCTGGCCCTCCTGGCCCTCCGGGTCCTCCAGGTCCGCCTGGTCCTCCTGGCCCTCCAGGTCCGCCAGGTCCGCCGGGTTTTCCTGGTGAACGTGGTGTTCAGGGTCCTCCTGGTCCGGCAGGTCCTCGTGGTGCAAATGGTGCTCCTGGTAATGATGGTGCCAAAGGTGATGCCGGTGCACCGGGTGCACCTGGTAGTCAGGGTGCACCTGGCCTGCAGGGTATGCCTGGTGAACGCGGTGCTGCTGGTCTGCCTGGTCCTAAAGGCGATCGTGGTGATGCAGGTCCGAAAGGTGCAGATGGTAGTCCGGGTAAAGATGGTGTTCGTGGTCTGACCGGTCCGATTGGTCCGCCTGGCCCTGCAGGTGCACCTGGTGATAAAGGTGAAAGCGGTCCGAGCGGTCCGCCAGGCCCTCCTGGTCCACCTGGTCCTCCGGGTCCTCCGGGCCCTCCTGGCCCGCCTGGTCCTCCTGGTCCACCGGGTCCTCCTGGT
SEQ ID NO.8：V-KD2BP10的核苷酸序列
CATCATCATCATCATCATCATCATGGTGGTGGTGGTTCAGCAGATGAACAGGAAGAAAAGGCAAAAGTGCGTACAGAACTGATCCAGGAACTGGCACAGGGCCTGGGTGGTATCGAAAAGAAGAACTTTCCGACTCTGGGTGATGAAGATCTGGATCATACCTATATGACAAAACTGCTGACCTATCTGCAGGAACGTGAACAGGCAGAAAATAGTTGGCGTAAACGTCTGCTGAAAGGTATTCAGGATCATGCTCTGGATCTGGTGCCTCGTGGTTCACCGGGTCCTCCTGGTCCTCCTGGCCCTAAAGGTGATCCGGGTCCTCCAGGTCCGCCTGGTCCTAAAGGTGATCCAGGTCCGCCAGGTCCGCCGGGTTTTCCTGGTGAACGTGGTGTTCAGGGTCCTCCTGGTCCGGCAGGTCCTCGTGGTGCAAATGGTGCTCCTGGTAATGATGGTGCCAAAGGTGATGCCGGTGCACCGGGTGCACCTGGTAGTCAGGGTGCACCTGGCCTGCAGGGTATGCCTGGTGAACGCGGTGCTGCTGGTCTGCCTGGTCCTAAAGGCGATCGTGGTGATGCAGGTCCGAAAGGTGCAGATGGTAGTCCGGGTAAAGATGGTGTTCGTGGTCTGACCGGTCCGATTGGTCCGCCTGGCCCTGCAGGTGCACCTGGTGATAAAGGTGAAAGCGGTCCGAGCGGTCCGCCAGGCCCTCCTGGTCCACCTGGTCCTCCGGGTCCTCCGGGCCCTCCTGGCCCGCCTGGTCCGCCTGGTCCACCGGGTCCTCCTGGT
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (14)

1. 一种胶原蛋白单链，其特征在于，所述单链结构为第一重复序列-胶原域-第二重复序列；其中，第一重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，第二重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2. 根据权利要求1所述胶原蛋白单链，其特征在于，胶原域的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述胶原蛋白单链，其特征在于，所述第一重复序列的N端还含有折叠域。
4. 根据权利要求3所述胶原蛋白单链，其特征在于，所述折叠域的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
5.根据权利要求3所述胶原蛋白单链，其特征在于，折叠域与第一重复序列间通过酶切位点连接。
6.根据权利要求5所述胶原蛋白单链，其特征在于，所述酶切位点为LVPRGSP。
7.编码权利要求1~6任一所述胶原蛋白单链的基因、携带编码权利要求1~6任一所述胶原蛋白单链的基因的质粒或者细胞。
8. 一种提高胶原蛋白稳定性或可溶性或产量的方法，其特征在于，在胶原域的N端连接第一重复序列，C端连接第二重复序列，构建结构为第一重复序列-胶原域-第二重复序列的胶原蛋白单链，并通过宿主细胞表达；其中，第一重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，第二重复序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.权利要求1~6任一所述胶原蛋白单链高聚自组装形成的胶原蛋白纤维。
10.权利要求1~6任一所述胶原蛋白单链或权利要求9所述胶原蛋白纤维在制备胶原蛋白产品中的应用。
11.一种胶原蛋白产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1~6任一所述胶原蛋白单链或权利要求9所述胶原蛋白纤维。
12.根据权利要求11所述胶原蛋白产品，其特征在于，所述胶原蛋白产品是化妆品、食品或药物。
13.根据权利要求11所述胶原蛋白产品，其特征在于，所述胶原蛋白产品是药物载体、医疗用品或美容产品。
14.根据权利要求11所述胶原蛋白产品，其特征在于，所述胶原蛋白产品还含有维生素、矿物质、天然多糖、精油、多酚类物质的一种或多种。
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