CN117820149B

CN117820149B - 可电离脂质化合物

Info

Publication number: CN117820149B
Application number: CN202311848564.6A
Authority: CN
Inventors: 张�林; 李蕾; 刘少利; 刘安东; 雷佳霓; 张新禹; 石峰
Original assignee: Hangzhou Yetai Pharmaceutical Technology Co ltd; Beijing Yitai Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Yetai Pharmaceutical Technology Co ltd; Beijing Yitai Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2023-12-29
Publication date: 2025-01-07
Anticipated expiration: 2043-12-29
Also published as: CN117820149A

Abstract

本发明提供了一类新型可电离脂质化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体，其药物组合物，及其在制备预防性或治疗性核酸疫苗中的应用。

Description

可电离脂质化合物

技术领域

本发明涉及一类可电离的阳离子脂质化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体及其制备方法和应用。

背景技术

核酸疫苗是将编码特定抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入到宿主细胞内，在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答以达到预防和治疗疾病的目的。

Moderna和BioNTech开发的核酸疫苗采用脂质纳米颗粒(LNP)作为递送系统，LNP主要成分包括阳离子脂质分子(Cationic Lipid)、胆固醇、中性脂质和聚乙二醇缀合脂质。其中，阳离子脂质分子是LNP递送系统的核心，其分子结构对整个脂质体纳米颗粒递送效率、靶向性、制剂稳定性等方面起着决定性的作用。

由于实现不同种类核酸物质递送以及不同靶点的特异性递送对于递送体系有不同要求，为了满足基因治疗的不同需求，需要进一步开发新的脂质分子。

发明内容

BioNTech的核酸疫苗使用的阳离子脂质分子ALC0315是目前公认具有最佳核酸递送效果的阳离子脂质化合物之一，能使机体产生高效免疫应答。本发明人研发了一类含有偕二甲基的阳离子脂质化合物(参见CN115850104A)，当通过静脉给药方式注射到体内时具有高效的核酸递送效率，主要递送到肝。但是核酸疫苗可通过肌肉注射使机体淋巴器官产生免疫应答，由于应用不同，本发明脂质化合物是否产生良好的机体免疫反应是本发明的研究重点问题。预料不到地是，本发明化合物用于制备核酸疫苗，机体免疫应答效果比ALC0315更佳。

具体而言，本发明的一方面，提供一种式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体：

其中，

R₁和R₂独立地选自C_4-20烷基、C_4-20烯基和C_4-20炔基，所述C_4-20烷基、C_4-20烯基或C_4-20炔基任选地被一个或多个R取代，所述C_4-20烷基、C_4-20烯基或C_4-20炔基中的一个或多个亚甲基单元任选且独立地被-NR”-替换；

R独立地选自H、C_1-14烷基、-L_a-OR_a和-L_a-NR_aR’_a；

R”独立地选自H和C_1-20烷基；

R₃和R₄独立地选自H、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、3至10元环烷基和3至10元杂环基，所述C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、3至10元环烷基或3至10元杂环基任选地被1、2、3、4或5个R*取代；

或者R₃、R₄与它们相连接的N原子共同形成3至10元杂环基，所述3至10元杂环基任选地被1、2、3、4或5个R*取代；

a独立地选自0、1、2、3、4和5；

b和d独立地选自3、4、5、6、7、8和9；

c和e独立地选自0、1、2、3和4；

b+c＝3、4、5、6、7、8或9，d+e＝3、4、5、6、7、8或9；

中的亚甲基任选且独立地被1、2、3、4或5个C_1-6烷基取代；

R₅、R₆、R₇和R₈独立地选自C_1-6烷基，所述C_1-6烷基任选地被1、2、3、4或5个R*取代；

R*每次出现时独立地选自H、卤素、氰基、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、-L_b-OR_b或-L_b-NR_bR’_b；

L_a独立地选自化学键和C_1-6亚烷基；

L_b独立地选自化学键和C_1-6亚烷基；

R_a和R’_a独立地选自H、C_1-6烷基、3至10元环烷基和3至10元杂环基；

R_b和R’_b独立地选自H、C_1-6烷基、3至10元环烷基和3至10元杂环基。

本发明的化合物为可电离脂质化合物。

在一实施方式中，a选自2、3和4，更优选为2或3，更优选为2。

在一实施方式中，b和d独立地为4或5。

在一实施方式中，c和e独立地为0或1。

在一实施方式中，b+c＝4、5或6。

在一实施方式中，d+e＝4、5或6。

在一实施方式中，b+c＝5，d+e＝5。

在一实施方式中，R₁或R₂独立地选自总长度为6、7、8、9或10个碳原子的直链烷基，所述直链烷基中的1、2或3个亚甲基任选且各自独立地被C_1-8烷基取代。

在一实施方式中，R₁和R₂各自独立地为总长度为9个碳原子的直链烷基，且R₁或R₂之一被C_4-6烷基取代。

在一实施方式中，R₁和R₂各自独立地为总长度为9个碳原子的直链烷基，且R₁或R₂之一被正丁基、正戊基或正己基取代。

在一实施方式中，R₃和R₄独立地选自C_1-6烷基，所述C_1-6烷基任选地被1、2或3个R*取代。

在一实施方式中，R*独立地选自H、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基和-OR_a；其中，R_a独立地选自H和C_1-6烷基。

在一实施方式中，R₃和R₄独立地选自甲基。

在一实施方式中，R₅、R₆、R₇和R₈独立地选自C_1-6烷基；优选为甲基或乙基，更优选为甲基。

本发明的另一方面，提供以下化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体：

在一实施方式中，上述化合物用于制备核酸疫苗，优选用于制备RNA疫苗，更优选用于制备mRNA疫苗。

本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有上述化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体，和任选地药学上可接受的辅料，例如载体、佐剂或媒介物。

在一实施方式中，所述药物组合物为包含本发明化合物的纳米颗粒组合物。

在一实施方式中，所述纳米颗粒组合物包含脂质组分，以及任选地包含活性成分。

在一实施方式中，所述活性成分为核酸。

在一实施方式中，所述脂质组分中包含如下摩尔百分比的组分：

可电离阳离子脂质20mol％-85mol％；

结构性脂质10mol％-75mol％；

中性脂质1.0mol％-30mol％；

聚合物脂质0.25mol％-10mol％。

其中所述可电离阳离子脂质为上述化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体。

在一实施方式中，可电离阳离子脂质的摩尔百分比含量为42.5mol％-50mol％、32.5mol％-50mol％、25mol％-65mol％、30mol％-60mol％、30mol％-50mol％、30mol％-55mol％或40mol％-52.5mol％。

在一实施方式中，结构性脂质的摩尔百分比含量为30.6mol％-61mol％、30.6mol％-51mol％、25mol％-70mol％、27.5mol％-66mol％、30.5mol％-66mol％、28mol％-64mol％或28mol％-54mol％。

在一实施方式中，中性脂质的摩尔百分比含量为1mol％-25mol％、1.5mol％-20mol％、1.5mol％-20mol％、5mol％-20mol％或5mol％-20mol％。

在一实施方式中，聚合物脂质的摩尔百分比含量为1mol％-5mol％、1mol％-2mol％、0.5mol％-8mol％、1mol％-5mol％、1mol％-3mol％或1mol％-3mol％。

在一实施方式中，可电离阳离子脂质中的N原子与荷载分子中的P原子的N：P摩尔比为1-15:1，例如可以为3-12:1、3-7:1、1-10:1、3-6:1或3-5:1。

在一实施方式中，所述颗粒的粒径为65-200nm，例如可以65-180nm、70-170nm、70-130nm、70-180nm、80-180nm、90-180nm或100-135nm。

在一实施方式中，所述中性脂质选自DSPC、DMPC、DOPC、DPPC、POPC、DOPE、DMPE、POPE或DPPE中的一种或多种。

在一实施方式中，所述结构性脂质选自胆固醇、谷甾醇、粪甾醇、岩皂甾醇、菜籽甾醇、麦角固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、豆甾醇、燕麦甾醇、麦角骨化醇或菜油甾醇中的一种或多种。

在一实施方式中，所述聚合物脂质为聚乙二醇化脂质。

在一实施方式中，所述聚乙二醇化脂质选自PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油中的一种或多种。

在一实施方式中，所述聚乙二醇化脂质选自DMPE-PEG1000、DPPE-PEG1000、DSPE-PEG1000、DOPE-PEG1000、DMG-PEG2000、Ceramide-PEG2000、DMPE-PEG2000、DPPE-PEG2000、DSPE-PEG2000、Azido-PEG2000、DSPE-PEG2000-Mannose、Ceramide-PEG5000、DSPE-PEG5000中的一种或多种。

本发明的另一方面，提供了上述化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体，或上述药物组合物，其用于治疗、诊断和/或预防疾病。

本发明的另一方面，提供了上述化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体，或上述药物组合物在制备用于治疗、诊断或预防疾病的药物中的用途。

在一实施方式中，所述用于治疗、诊断或预防疾病的药物选自治疗性疫苗或预防性疫苗。

在一实施方式中，所述疫苗用于预防/治疗病毒感染引起的疾病。

在一实施方式中，所述疫苗用于预防/治疗由冠状病毒感染引起的疾病，优选为由SARS-CoV-2引起的疾病；

在一实施方式中，所述疫苗用于预防/治疗由流感病毒感染引起的疾病。

在一实施方式中，所述疫苗用于预防/治疗由带状疱疹病毒感染引起的疾病。

本发明的另一方面，提供了在受试者中治疗、诊断或预防疾病的方法，包括向所述受试者施用包含上述化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体的药物组合物。

在一实施方式中，上述药物组合物的施用量为有效量。

在一实施方式中，所述疾病为病毒感染引起的疾病。

在一实施方式中，所述疾病为由冠状病毒感染引起的疾病，优选为由SARS-CoV-2引起的疾病。

在一实施方式中，所述疾病为由流感病毒感染引起的疾病。

在一实施方式中，所述疾病为由带状疱疹病毒感染引起的疾病。

本发明的另一方面，提供了上述化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体，或上述药物组合物在制备递送荷载的药物中的用途，所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种。

本发明的另一方面，提供了在受试者中递送荷载的方法，包括向所述受试者施用包含上述化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体的药物组合物，所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种。

在一实施方式中，所述治疗剂、预防剂或诊断剂为核酸。

在一实施方式中，所述核酸选自反义寡核苷酸(ASO)。

在一实施方式中，所述核酸选自RNA或DNA中的一种或多种。

在一实施方式中，所述RNA选自小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA(aRNA)、信使RNA(mRNA)、修饰的信使RNA(mmRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、多聚编码核酸(MCNA)、聚合编码核酸(PCNA)、引导RNA(gRNA)、CRISPRRNA(crRNA)或核酶中的一种或多种。

在一实施方式中，所述RNA为mRNA，更优选为修饰的mRNA。

定义

化学定义

下面更详细地描述具体官能团和化学术语的定义。

术语“取代的”或“取代”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代。

术语“化学键”指单键、双键或叁键，优选单键。

当列出数值范围时，既定包括每个值和在所述范围内的子范围。例如“C_1-6烷基”包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C_1-6、C_1-5、C_1-4、C_1-3、C_1-2、C_2-6、C_2-5、C_2-4、C_2-3、C_3-6、C_3-5、C_3-4、C_4-6、C_4-5和C_5-6烷基。

“C_4-20烷基”是指具有4至20个碳原子的直链或支链饱和烃基团，进一步包括C_9-15烷基。C_1-6烷基的例子包括：甲基(C₁)、乙基(C₂)、正丙基(C₃)、异丙基(C₃)、正丁基(C₄)、叔丁基(C₄)、仲丁基(C₄)、异丁基(C₄)、正戊基(C₅)、3-戊基(C₅)、戊基(C₅)、新戊基(C₅)、3-甲基-2-丁基(C₅)、叔戊基(C₅)和正己基(C₆)，等等。术语“C_1-6烷基”还包括杂烷基，其中一或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子被杂原子(例如，氧、硫、氮、硼、硅、磷)替代。烷基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。常规烷基缩写包括：Me(-CH₃)、Et(-CH₂CH₃)、iPr(-CH(CH₃)₂)、nPr(-CH₂CH₂CH₃)、n-Bu(-CH₂CH₂CH₂CH₃)或i-Bu(-CH₂CH(CH₃)₂)。

“C_4-20烯基”是指具有4至20个碳原子和至少一个碳碳双键的直链或支链烃基团。C_2-6烯基的例子包括：乙烯基(C₂)、1-丙烯基(C₃)、2-丙烯基(C₃)、1-丁烯基(C₄)、2-丁烯基(C₄)、丁二烯基(C₄)、戊烯基(C₅)、戊二烯基(C₅)、己烯基(C₆)，等等。术语“C_2-6烯基”还包括杂烯基，其中一或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子被杂原子(例如，氧、硫、氮、硼、硅、磷)替代。烯基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。

“C_4-20炔基”是指具有4至20个碳原子、至少一个碳-碳叁键以及任选地一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃基团。术语“C_2-6炔基”还包括杂炔基，其中一或多个(例如，1、2、3或4个)碳原子被杂原子(例如，氧、硫、氮、硼、硅、磷)替代。炔基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。

术语“变量A和变量B的总长度为x个碳原子”，表示变量A所表示的基团中主链的碳原子数和变量B所表示的基团中主链的碳原子数之和为x。

“卤代”或“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。

因此，“C_1-6卤代烷基”是指上述“C_1-6烷基”，其被一个或多个卤素基团取代。卤代烷基基团可以在任何可用的连接点上被取代，例如，1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基。

“C_3-10环烷基”或“3至10元环烷基”是指具有3至10个环碳原子和零个杂原子的非芳香环烃基团，其中任选地含有1、2或3个双键或叁键。环烷基还包括其中上述环烷基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合的环体系，其中连接点在环烷基环上，且在这样的情况中，碳的数目继续表示环烷基体系中的碳的数目。环烷基还包括其中上述环烷基环，其中任意不相邻的碳原子上的取代基相连形成桥环，一起形成共用两个或两个以上碳原子的多环烷烃。环烷基还包括其中上述环烷基环，其中同一碳原子上的取代基相连成环，一起形成共用一个碳原子的多环烷烃。示例性的所述环烷基包括但不限于：环丙基(C₃)、环丙烯基(C₃)、环丁基(C₄)、环丁烯基(C₄)、环戊基(C₅)、环戊烯基(C₅)、环己基(C₆)、环己烯基(C₆)、环已二烯基(C₆)、环庚基(C₇)、环庚烯基(C₇)、环庚二烯基(C₇)、环庚三烯基(C₇)，等等。环烷基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。

“3-10元杂环基”或“3至10元杂环基”是指具有环碳原子和1至5个环杂原子的3至10元非芳香环系的饱和或不饱和基团，其中，每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷和硅，其中任选地含有1、2或3个双键或叁键。在包含一个或多个氮原子的杂环基中，只要化合价允许，连接点可为碳或氮原子。杂环基还包括其中上述杂环基环与一个或多个环烷基稠合的环体系，其中连接点在杂环基环上，或其中上述杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合的环体系，其中连接点在杂环基环上；且在这样的情况下，环成员的数目继续表示在杂环基环体系中环成员的数目。杂环基还包括其中上述杂环基环，其中任意不相邻的碳或氮原子上的取代基相连形成桥环，一起形成共用两个或两个以上碳或氮原子的多环杂烷烃。杂环基还包括其中上述杂环基环，其中同一碳原子上的取代基相连成环，一起形成共用一个碳原子的多环杂烷烃。示例性的包含一个杂原子的3元杂环基包括但不限于：氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基(thiorenyl)。示例性的含有一个杂原子的4元杂环基包括但不限于：氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。示例性的含有一个杂原子的5元杂环基包括但不限于：四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5-二酮。示例性的包含两个杂原子的5元杂环基包括但不限于：吡唑烷基、二氧杂环戊烷基、氧硫杂环戊烷基(oxasulfuranyl)、二硫杂环戊烷基(disulfuranyl)和噁唑烷-2-酮。示例性的包含三个杂原子的5元杂环基包括但不限于：三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。示例性的包含一个杂原子的6元杂环基包括但不限于：哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和硫杂环己烷基(thianyl)。示例性的包含两个杂原子的6元杂环基包括但不限于：哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基、二噁烷基。示例性的包含三个杂原子的6元杂环基包括但不限于：六氢三嗪基(triazinanyl)。示例性的含有一个杂原子的7元杂环基包括但不限于：氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。示例性的与C₆芳基环稠合的5元杂环基(在本文中也称作5,6-双环杂环基)包括但不限于：二氢吲哚基、异二氢吲哚基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、苯并噁唑啉酮基，等等。示例性的与C₆芳基环稠合的6元杂环基(本文还指的是6,6-双环杂环基)包括但不限于：四氢喹啉基、四氢异喹啉基，等等。杂环基还包括上述杂环基与一个环烷基、杂环基、芳基或杂芳基共享一个或两个原子，形成桥环或螺环，只要化合价允许，共享的原子可为碳或氮原子。杂环基还包括上述杂环基与杂环基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。

“C_6-10芳基”是指具有6-10个环碳原子和零个杂原子的单环或多环的(例如，双环)4n+2芳族环体系(例如，具有以环状排列共享的6或10个π电子)的基团。在一些实施方案中，芳基具有六个环碳原子(“C₆芳基”；例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有十个环碳原子(“C₁₀芳基”；例如，萘基，例如，1-萘基和2-萘基)。芳基还包括其中上述芳基环与一个或多个环烷基或杂环基稠合的环系统，而且连接点在所述芳基环上，在这种情况下，碳原子的数目继续表示所述芳基环系统中的碳原子数目。芳基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。

“5-14元杂芳基”或“5至14元杂芳基”是指具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-14元单环或双环的4n+2芳族环体系(例如，具有以环状排列共享的6、10或14个π电子)的基团，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，只要化合价允许，连接点可以是碳或氮原子。杂芳基双环系统在一个或两个环中可以包括一个或多个杂原子。杂芳基还包括其中上述杂芳基环与一个或多个环烷基或杂环基稠合的环系统，而且连接点在所述杂芳基环上，在这种情况下，碳原子的数目继续表示所述杂芳基环系统中的碳原子数目。在一些实施方案中，5-10元杂芳基是优选的，其为具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元单环或双环的4n+2芳族环体系。在另一些实施方案中，5-6元杂芳基是特别优选的，其为具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-6元单环或双环的4n+2芳族环体系。示例性的含有一个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：吡咯基、呋喃基和噻吩基。示例性的含有两个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。示例性的含有三个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：三唑基、噁二唑基(例如，1,2,4-噁二唑基)和噻二唑基。示例性的含有四个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：四唑基。示例性的含有一个杂原子的6元杂芳基包括但不限于：吡啶基或吡啶酮基。示例性的含有两个杂原子的6元杂芳基包括但不限于：哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。示例性的含有三个或四个杂原子的6元杂芳基分别包括但不限于：三嗪基和四嗪基。示例性的含有一个杂原子的7元杂芳基包括但不限于：氮杂环庚三烯基、氧杂环庚三烯基和硫杂环庚三烯基。示例性的5,6-双环杂芳基包括但不限于：吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、茚嗪基和嘌呤基。示例性的6,6-双环杂芳基包括但不限于：萘啶基、喋啶基、喹啉基、异喹啉基、噌琳基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。杂芳基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。

“任选地被···取代”是指可以被指定的取代基取代，也可以为非取代。

上文定义的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基等基团除去另一个氢而形成的二价基团统称为“亚基”。环烷基、杂环基、芳基和杂芳基等成环的基团统称为“环基”。

本文定义的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基等为任选取代的基团。

“核酸”是指单链或双链的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子及其杂合分子。核酸分子的实例包括但不限于信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、自扩增RNA(saRNA)和反义寡核苷酸(ASO)等。核酸可进一步被化学修饰，化学修饰选自假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基胞嘧啶之一或其组合。mRNA分子含有蛋白质编码区，还可进一步含表达调控序列，典型的表达调控序列包括但不限于5'帽子(5'cap)、5'非翻译区(5'UTR)、3'非翻译区(3'UTR)、多聚腺苷酸序列(PolyA)、miRNA结合位点。

“阳离子脂质”是指在生理pH条件下能够带正电的脂质分子。在一些实施方式中，阳离子脂质为氨基脂质。

“中性脂质”是指在特定pH条件下不带电荷的脂质分子，例如生理pH条件。中性脂质的实例包括但不限于1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1-棕榈酰基-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1-棕榈酰基-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。

“结构性脂质”是指通过填充脂质之间的间隙以增强纳米颗粒稳定性的脂质，常见的如类固醇类。类固醇为具有环戊烷骈多氢菲类碳骨架的化合物，在一个优选的实施方案中，所述类固醇选自胆固醇、谷甾醇、粪甾醇、岩皂甾醇、菜籽甾醇、麦角固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、豆甾醇、燕麦甾醇、麦角骨化醇或菜油甾醇。

“聚合物脂质”是指含有聚合物部分和脂质部分的分子。在一些实施方式中，聚合物脂质为聚乙二醇(PEG)脂质。其它能够减少聚集的脂质，如具有不带电荷、亲水性、空间阻隔部分的化合物与脂质偶联的产物亦可使用。

“脂质纳米颗粒”是指含有脂质成分、具有纳米级尺寸的颗粒。

“生物可降解基团”是指含有生物可降解键的官能团，例如酯、二硫键和酰胺等。生物降解作用可以影响从体内清除化合物的过程。本发明的生物可降解基团的方向为从可电离脂质分子中头部到尾部的方向。

其它定义

本文所用的术语“治疗”涉及逆转、减轻、抑制该术语适用的障碍或病症的进展或者预防之，或者这类障碍或病症的一种或多种症状。本文所用的名词“治疗”涉及动词治疗的动作，后者是如刚才所定义的。

本文中，化合物使用标准的命名法命名。具有非对称中心的化合物，应该明白(除非另有说明)所有的光学异构体及其混合物均包含在内。此外，除非另有规定，本发明所包括的所有异构体化合物与碳碳双键可能以Z和E的形式出现。在不同的互变异构形式存在的化合物，一个所述化合物并不局限于任何特定的互变异构体，而是旨在涵盖所有的互变异构形式。

本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示本发明化合物的那些羧酸盐、氨基酸加成盐，它们在可靠的医学判断范围内适用于与患者组织接触，不会产生不恰当的毒性、刺激作用、变态反应等，与合理的益处/风险比相称，就它们的预期应用而言是有效的，包括(可能的话)本发明化合物的两性离子形式。

药学上可接受的碱加成盐是与金属或胺生成的，例如碱金属与碱土金属氢氧化物或有机胺。用作阳离子的金属的实例有钠、钾、镁、钙等。适合的胺的实例有N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。

酸性化合物的碱加成盐可以这样制备，按照常规方式使游离酸形式与足量所需的碱接触，生成盐。按照常规方式使盐形式与酸接触，再分离游离酸，可以使游离酸再生。游离酸形式在某些物理性质上多少不同于它们各自的盐形式，例如在极性溶剂中的溶解度，但是出于本发明的目的，盐还是等价于它们各自的游离酸。

盐可以是从无机酸制备的硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物，酸例如盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等。代表性盐包括：氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、月桂基磺酸盐和羟乙磺酸盐等。盐也可以是从有机酸制备的，例如脂肪族一元与二元羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、烷二酸、芳香族酸、脂肪族与芳香族磺酸等。代表性盐包括乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盆、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、萘甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。药学上可接受的盐可以包括基于碱金属与碱土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。还涵盖氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等(例如参见Berge S.M.et al.，"PharmaceuticalSalts,”J.Pharm.Sci.，1977；66:1-19，引入此作为参考)。

给药的“受试者”包括但不限于：人(即，任何年龄组的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成人受试者(例如，年轻的成人、中年的成人或年长的成人))和/或非人的动物，例如，哺乳动物，例如，灵长类(例如，食蟹猴、恒河猴)、牛、猪、马、绵羊、山羊、啮齿动物、猫和/或狗。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人动物。本文可互换使用术语“人”、“患者”和“受试者”。

“疾病”、“障碍”和“病症”在本文中可互换地使用。

除非另作说明，否则，本文使用的术语“治疗”包括受试者患有具体疾病、障碍或病症时所发生的作用，它降低疾病、障碍或病症的严重程度，或延迟或减缓疾病、障碍或病症的发展(“治疗性治疗”)，还包括在受试者开始患有具体疾病、障碍或病症之前发生的作用(“预防性治疗”)。

除非另作说明，否则，本文使用的药物组合物的“预防有效量”是足以预防疾病、障碍或病症的量，或足以预防与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状的量，或防止疾病、障碍或病症复发的量。药物组合物的预防有效量是指单独使用或与其它药剂联用时，治疗剂的量，它在预防疾病、障碍或病症的过程中提供预防益处。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防的量，或增强其它预防药剂的预防效果的量。

“组合”以及相关术语是指同时或依次给药本发明药物组合物和其它治疗剂。例如，本发明药物组合物可以与其它治疗剂以分开的单位剂型同时或依次给药，或与其它治疗剂一起在单一单位剂型中同时给药。

本文所用的术语“疫苗”是指可以提供针对特定疾病或病原体的主动获得性免疫和/或治疗效果(例如治疗)的组合物。疫苗通常含有一种或多种药剂，其可以在个体中诱导针对病原体或疾病(即靶病原体或疾病)的免疫应答。所述免疫原性制剂刺激机体的免疫系统将该药剂识别为靶病原体或疾病存在的威胁或指示，从而诱导免疫记忆，以便免疫系统在随后接触时更容易识别和消灭任何病原体。疫苗可以是预防性的(例如预防或改善任何自然或病原体未来感染的影响或预期在易感个体中发生癌症的影响)或治疗性的(例如治疗已被诊断患有癌症的个体的癌症))。疫苗的给药称为疫苗接种。在一些实例中，疫苗组合物可以为个体提供核酸，例如编码抗原性分子(例如肽)的mRNA。通过疫苗组合物递送到个体体内的核酸可以表达成抗原性分子并使得个体获得针对所述抗原性分子的免疫力。在针对感染性疾病的疫苗接种的情况下，所述疫苗组合物可以提供编码与特定病原体相关的抗原性分子的mRNA，所述抗原性分子例如是已知在病原体(例如致病细菌或病毒)中表达的一种或多种肽。在病毒疫苗的情况下，所述疫苗组合物可以提供编码某些病毒肽的mRNA，这些病毒肽是为其寻求免疫力的病毒的特征，例如基本上专有地或高度表达在病毒表面的肽(例如，衣壳蛋白)。个体在接种所述病毒疫苗组合物后，可具有针对所述病毒肽的免疫力，特异性杀死表达其的细胞。

本文所用的术语“核酸疫苗”也叫基因疫苗，是把决定致病原特定抗原的基因遗传物质(DNA或RNA)直接导入人体细胞中，让人体细胞自己来生产这些抗原，并刺激机体产生对该抗原的免疫应答，从而使接种者获得相应的免疫保护，其还包含佐剂(例如脂质纳米颗粒)。

本文所用的术语“递送系统”是指一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。

本文所用的术语“佐剂”是指在与抗原共同施用时或在将抗原施用于受试者之前、期间或之后施用时增强对抗原的免疫应答的药学上可接受的物质，包括但不限于：核酸佐剂(如核酸载体)、植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。

术语“病毒”根据其在生物学领域中的普通含义使用，指的是包括病毒基因组(例如DNA、RNA、单链、双链)、蛋白质保护衣壳(例如衣壳蛋白)和相关蛋白，并且在包膜病毒(例如疱疹病毒)的情况下，包膜包括脂质和任选的宿主细胞膜组分，和/或病毒蛋白。

术语“病毒感染”或“病毒性疾病”是指由病毒引起的疾病或病症，包括有症状和无症状感染。病毒感染的非限制性实例包括肝病毒疾病(例如，甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎)、疱疹病毒感染(例如，HSV-1、HSV-2、带状疱疹)、黄病毒感染、寨卡(Zika)病毒感染、巨细胞病毒感染、呼吸道病毒感染(例如腺病毒感染、流感、严重急性呼吸系统综合征、冠状病毒感染(例如SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、COVID-19、MERS))、胃肠道病毒感染(例如诺如病毒感染、轮状病毒感染、星状病毒感染)、发疹性病毒感染(例如麻疹、带状疱疹、天花、风疹)、病毒性出血性疾病(例如埃博拉病毒、拉沙热、登革热、黄热病)、神经系统病毒感染(例如，西尼罗河病毒感染、脊髓灰质炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、日本脑炎、狂犬病)和人乳头瘤病毒感染。

SARS-CoV-2属于β冠状病毒家族，其成员包括另外两种在新千年引起严重疾病暴发的人畜共患病毒：严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV))。术语“SARS-CoV”是指SARS冠状病毒。术语“SARS-CoV”包括任何冠状病毒，例如SARS-CoV-2、SARS-CoV-1和MERS-CoV。

在疾病的上下文中，术语“预防”及其各种语法变化用词的“预防”是指使所述疾病的临床症状不在尚未经历或出现所述疾病症状的个体中发生。

“疾病”、“障碍”和“病症”在本文中可互换地使用。

术语“有效量”是指根据本发明的当施用于患者用于治疗状态、病症或病状时足以实现此类治疗或当施用于患者用于产生免疫应答时足以产生此类免疫应答的调配物的量。“有效量”将根据活性成分、待治疗的状态、病症或病状和其严重程度，以及待治疗的受试者的年龄、体重、身体状况和应答性而变化。

除非另作说明，否则，“预防有效量”是足以预防疾病、障碍或病症的量，或足以预防与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状的量，或防止疾病、障碍或病症复发的量。药物的预防有效量是指单独使用或与其它药剂联用时，治疗剂的量，它在预防疾病、障碍或病症的过程中提供预防益处。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防的量，或增强其它预防药剂的预防效果的量。

实施例

为使本发明的技术方案更清楚、明确，通过以下实施例对本发明进行进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明的具体实施方式，以使本领域的技术人员能够理解本发明，但不用于限制本发明的保护范围。本发明的具体实施方式中，未作特别说明的技术手段或方法等为本领域的常规技术手段或方法等。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

表1

实施例1：化合物1的合成

在2L的四口圆底烧瓶中室温加入THF(160mL)、化合物1-1(80g,688.7mmol)，体系降温至-40℃滴加LDA(344.4mL,688.7mmol)用时2h，于-40℃搅拌1h。随后于-40℃滴加二溴丁烷(206.70g,957.3mmol)用时30分钟，最后于-40℃滴加DMPU(12.7g,99.2mmol)用时2h，-40℃保温1h。自由回温搅拌15h。用TLC监控反应，原料消耗完。于0℃用饱和NH₄Cl(200mL)淬灭反应，再加水(160mL)和乙酸乙酯(160mL)稀释体系，萃取，分液。水相再用乙酸乙酯(200mL)反萃一次。有机相合并后用饱和NaCl(300mL)洗两次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤浓缩。粗品过硅胶柱纯化得到淡黄色油状化合物1-2(100g)。

在2L的四口圆底烧瓶中室温加入THF(1L)、化合物1-2(98g,391.91mmol)，体系降温至-10℃滴加LiAlH₄(313.5mL,313.5mmol)用时30分钟，体系于-10℃搅拌30min后TLC监控反应，原料转化完全。用Na₂SO₄.10H₂O(125g)于-4℃淬灭反应，加水(500mL)和乙酸乙酯(5L)稀释体系，萃取，分液。水相再用乙酸乙酯(300mL)反萃一次。有机相合并后用饱和NaCl(500mL)洗两次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。粗品过硅胶柱得到淡黄色油状物1-3(73g)。

在250mL的三口瓶中室温加入DMSO(40mL)、NaH(3.83g,95.7mmol)，于25℃氮气保护下分批加入TosMIC(4.67g,23.9mmol)，随后加入TBAI(883.5mg,2.39mmol)，体系于25℃搅拌15分钟。最后将化合物1-3(10g,47.8mmol)溶于DMSO(100mL)于25℃滴加入上述体系，体系于25℃额外搅拌1h。TLC监控反应，原料转化完全。用冰水(400mL)于20℃淬灭反应，体系用MTBE萃取(2x500mL)，有机相合并后用饱和NaCl(500mL)洗一次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。得到粗品(10g)直接投下一步。

在500mL的三口瓶中室温加入粗品化合物1-4(10g)、CH₃OH(100mL)和12N HCl(5.3mL)。体系于80℃反应3h。LCMS监控反应，原料转化完全。体系降温至室温，用饱和碳酸钠调节pH＝7，减压浓缩除去甲醇，体系用水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)溶解稀释，萃取，分液。水相用乙酸乙酯(100mL)反萃一次，有机相合并用饱和NaCl(100mL)洗一次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。粗品过硅胶柱得到化合物1-5(4.6g)。

在100mL三口瓶中室温加入化合物1-5(2.5g,8.73mmol)，正癸酸(1.50g,8.73mmol)，DMAP(53.3mg,0.431mmol)和DCM(25mL)。于0℃加入EDCI(1.67g,8.73mmol)，体系20℃反应18h。TLC和LCMS共同监控反应，有产品信号。反应体系被饱和NH₄Cl(25mL)淬灭，萃取，分液。水相用DCM(25mL)反萃一次，有机相合并后用饱和NaCl(50mL)洗一次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。粗品过硅胶柱得到淡黄色化合物1-6(1.71g)。

在8mL封管中室温加入化合物1-6(240mg,0.55mmol)，化合物1-7(145.2mg,0.60mmol)，EDCI(156.6mg,0.82mmol)，DMAP(13.3mg,0.11mmol)和DCM(3mL)。体系20℃反应18h。TLC监控反应，原料转化完全。反应体系被饱和NH₄Cl(10mL)淬灭，DCM(10mL)稀释，萃取，分液。水相用DCM(15mL)反萃一次，有机相合并后用饱和NaCl(20mL)洗一次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。粗品过硅胶柱纯化得到淡黄色油状化合物1-8(301.8mg)。

在25mL三口瓶中室温加入化合物1-8(301.8mg,0.45mmol)，甲醇(4mL)和THF(1mL)，0℃加入NaBH₄(17.2mg,0.45mmol)。于20℃反应1h，TLC监控反应，原料反应完全。反应体系被水(20mL)淬灭，乙酸乙酯(20mL)稀释，萃取，分液。水相用乙酸乙酯(20mL)反萃一次，有机相合并后用饱和NaCl(20mL)洗一次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。粗品(273.8mg)直接投下一步。

在8mL封管中室温加入化合物1-9(273.8mg,0.41mmol)，4-二甲氨基丁酸(137.6mg,0.82mmol)，EDCI(236.0mg,1.23mmol)，DMAP(50.1mg,0.41mmol)和DCM(3mL)。体系20℃反应2h。TLC监控反应，原料转化完全。反应体系被饱和NH₄Cl(10mL)淬灭，DCM(10mL)稀释，萃取，分液。水相用DCM(10mL)反萃一次，有机相合并后用饱和NaCl(25mL)洗一次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩。粗品过硅胶柱纯化得到淡黄色油状化合物1(239.6mg)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:4.85(p,J＝6.2Hz,1H),3.77(s,4H),2.31(ddd,J＝14.8,7.4,4.3Hz,12H),1.65-1.49(m,11H),1.36-1.20(m,52H),0.89(s,15H),0.88(t,J＝6.8Hz,7H)；ESI-MS m/z:780.65[M+H]⁺。

实施例2：化合物2的合成

在8mL的封管中加入原料化合物1-6(150mg,0.34mmol),化合物2-1(96.01mg,0.374mmol)，EDCI(97.87mg,0.51mmol)，DMAP(8.32mg,0.068mmol)和DCM(3mL)。室温搅拌18小时，TLC监控无原料。加入硅胶拌样，柱层析纯化得196mg浅黄色油状物2-2。

25mL三口瓶中加入原料化合物2-2(196mg,0.29mmol)，MeOH(4mL)和THF(1mL)。降温至0℃，加入NaBH₄(10.92mg,0.29mmol)。室温搅拌1小时，TLC监控无原料。加入饱和氯化铵水溶液(10mL),MTBE萃取(1x20mL)。有机相用饱和食盐水洗(1x20mL)，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩得140mg产品2-3直接用于下一步反应。

在8毫升封管中加入原料化合物2-3(140mg,0.21mmol)，4-二甲氨基丁酸(41.35mg,0.25mmol)，EDCI(59.10mg,0.31mmol)，DMAP(5.02mg,0.041mmol)和DCM(2mL)。室温反应5小时，TLC监控无原料。加入硅胶拌样，柱层析纯化得105.9mg化合物2。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:4.85(q,J＝6.3Hz,1H),3.77(s,4H),2.45-2.22(m,13H),1.84(p,J＝7.4Hz,2H),1.61(d,J＝7.2Hz,4H),1.52(d,J＝6.1Hz,5H),1.27(qd,J＝6.8,4.5,3.4Hz,46H),0.89(s,17H),0.88(d,J＝13.3Hz,3H)；ESI-MS m/z:794.70[M+H]⁺。

实施例3：化合物3的合成

在8mL的封管中，加入化合物1-6(150mg,0.34mmol)，化合物3-1(85.50mg,0.374mmol)，EDCI(97.87mg,0.510mmol)，DMAP(8.32mg,0.068mmol)和DCM(2mL)。室温搅拌18小时，TLC监控。直接拌样，柱层析纯化得165.6mg黄色油状物3-2。

在25mL三口瓶中加入化合物3-2(165.6mg,0.25mmol)，MeOH(4mL)和THF(1mL)。降温至0℃加入NaBH₄(9.62mg,0.25mmol)，随后室温搅拌1小时，TLC监控。待原料反应完，加入10mL饱和NH₄Cl水溶液，EA萃取(1x20mL)，有机相用饱和食盐水洗(1x10mL)。无水Na₂SO₄干燥，真空浓缩得166mg化合物3-3粗品直接用于下一步。

在8mL的封管中，加入化合物3-3(166mg,0.25mmol)，4-二甲氨基丁酸(51.13mg,0.31mmol)，EDCI(73.09mg,0.38mmol)，DMAP(6.21mg,0.051mmol)和DCM(2mL)。室温搅拌5小时，TLC监控。直接拌样，柱层析纯DCM/MeOH(50:1)得142.4mg浅黄色油状化合物3。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:4.87(q,J＝6.2Hz,1H),3.77(s,4H),2.39-2.26(m,12H),1.84(q,J＝7.4Hz,2H),1.68-1.54(m,5H),1.52(d,J＝6.2Hz,5H),1.34-1.19(m,47H),0.91-0.86(m,21H)；ESI-MS m/z:766.55[M+H]⁺。

实施例4：化合物4的合成

将化合物4-1(100g,979mmol)的四氢呋喃(800mL)溶液冷却至零下40℃，向溶液中缓慢滴加LDA(2M,490mL)，滴加完成后继续搅拌1小时，相同温度下向反应体系中滴加4-2(315g,1.37mol)的四氢呋喃(100mL)溶液，反应体系搅拌过夜。反应体系用饱和氯化铵水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干得粗品。粗品经硅胶柱分离纯化得化合物4-3(115g)。

化合物4-3(100g,398mmol)，TosMIC(38.9g,199mmol)和TBAI(14.7g,39.8mmol)的四氢呋喃(800mL)溶液冷却至0℃，分批次缓慢加入氢化钠(20.7g,517mmol)，常温过夜反应。反应体系用饱和氯化钠水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干得4-4粗品115g，无需分离纯化，直接用于下步反应。

化合物4-4(110g,205mmol)二氯甲烷(880mL)溶液中加入330mL浓盐酸，常温反应2小时，TLC监测底物反应完全。反应体系用饱和氯化铵水溶液淬灭，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干得粗品。经硅胶柱分离纯化得化合物4-5(30.0g,80.9mmol,产率39.4％)。

常温下将TMSOK(11.0g,86.4mmol)加入化合物4-5(8.0g,21.6mmol)的四氢呋喃(35.0mL)溶液中，反应体系加热至70℃进行搅拌，TLC监测反应原料消耗完全。反应液冷却至室温，旋蒸除去有机溶剂，粗品加入20mL水并且用二氯甲烷萃取，收集水相层，用1M盐酸调节溶液pH值小于5，用二氯甲烷进行萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤收集滤液，浓缩得化合物4-6(7.0g)。

将碳酸钾(1.55g,11.2mmol)加入化合物4-6(959mg,2.8mmol)和1-溴壬烷(638mg,3.08mmol)的DMF溶液中，然后反应升温至60℃反应4小时，冷却至室温，反应体系用饱和氯化钠水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩滤液至干得粗品，经硅胶柱纯化得化合物4-8(682mg)。

在20mL封管中加入化合物4-8(600mg,1.28mmol)、化合物4-9(329.3mg,1.54mmol)、EDCI(294.5mg,1.54mmol)、DMAP(156.4mg,1.28mmol)、DCM(5mL)。常温反应过夜。LCMS监控有产品信号。加水10mL淬灭，CH₂Cl₂萃取(1x10mL)，有机相饱和食盐水洗(1x10mL)，Na₂SO₄干燥，过滤旋干，过柱子纯化得到化合物4-10(543mg)。

氮气保护，向50mL三口瓶中加入化合物4-10(543mg,0.83mmol)、MeOH(10mL)，0℃分批加入NaBH₄(157.8mg,4.17mmol)，常温反应2h。0℃加滴加20mL水淬灭，EtOAc萃取(1x20mL)。有机相饱和食盐水洗(1x20mL)，Na₂SO₄干燥，过滤旋干，得到化合物4-11(480mg)。

在8mL封管中加入4-11(480mg,0.74mmol)、SM4(289.23mg,2.21mmol)、EDCI(422.68mg,2.21mmol)、DMAP(89.8mg,0.74mmol)、DCM(3mL)，常温反应过夜。LCMS监控有产品信号。加水10mL淬灭，DCM萃取(2x20mL).有机相盐水洗(1x20mL)，Na₂SO₄干燥，过滤旋干，Prep-TLC(DCM/MeOH 10:1)纯化得到4(118.3mg)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ:4.86(t,J＝6.2Hz,1H),4.06(td,J＝6.6,2.5Hz,4H),2.40(t,J＝7.0Hz,2H),2.00(s,2H),1.66-1.56(m,5H),1.50(s,9H),1.27(d,J＝12.8Hz,45H),1.17(s,13H),0.96-0.86(m,9H)；ESI-MS m/z:766.80[M+H]⁺。

实施例5：化合物5的合成

按照CN115850104A实施例70的合成方法制备化合物5。

药理实验

实验例1：纳米颗粒制备

用于脂质纳米颗粒组装的材料有：(1)可电离脂质化合物：如实施例化合物1-5或者ALC0315(购自AVT)；(2)结构性脂质：如胆固醇Cholesterol(购自Sigma-Aldrich)；(3)磷脂:如DSPC为1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱(Distearoylphosphatidylcholine,购自AVT)或DOPE为1,2二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Dioleoyl Phosphoethanolamine,购自AVT)；(4)聚乙二醇化脂质化合物:如DMG-PEG2000为二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000,购自AVT)或ALC0159(购自赛诺邦格)；(5)核酸片段有效成分:新型冠状病毒刺突蛋白mRNA(自制，编码序列与WO2021154763A1(Table 1)SARS-CoV-2S Protein Variant 1相同)或水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白E mRNA(自制，编码序列Uniprot:Q9J3M8)。脂质纳米颗粒组装材料名称及其结构式详见表2。

脂质纳米颗粒的制备方法：(1)将可电离脂质化合物、胆固醇、磷脂和聚乙二醇化脂质分别按优选配方依次溶解混合于乙醇中，本发明实施例化合物1-5优化配方详见表3，ALC0315优选配方参见文献(mRNA-lipid nanoparticle COVID-19vaccines:Structureand stability，International Journal of Pharmaceutics，2021)，LNP配方详见表3；(2)将mRNA有效成分溶解于25mM醋酸钠溶液(pH＝4.5)；(3)使用自动化高通量微流控系统将溶解有脂质混合体的有机相和溶解有mRNA成分的水相按1:1到1:4范围的流速比例进行混合，混合速度处于10mL/min到18mL/min；(4)制备出的脂质纳米颗粒用磷酸缓冲盐溶液进行稀释，并用截留分子量为30kDa的超滤管(购自Millipore)对纳米颗粒溶液进行超滤至原制备体积；(5)所得纳米颗粒经过0.2μm无菌滤膜的过滤除菌后于密封玻璃瓶中低温保存。

脂质纳米颗粒的制备方式包括微流控混合系统，但不限于此方法，也包括T-型混合器和乙醇注入法等。

表2

表3

实验例2：脂质纳米颗粒物理性质表征

使用Zetasizer Pro(购自Malvern Instruments Ltd)以及DynaPro NanoStar(购自Wyatt)动态光散射仪对制备的脂质纳米颗粒的颗粒大小和粒径分散系数(PDI)进行测量。脂质纳米颗粒对于RNA的包载程度由包封率来表征(Encapsulation Efficiency％)，该系数反映出脂质纳米颗粒与RNA片段的结合程度。该系数由Quant-it^TMRiboGreen RNAAssay(购自Invitrogen)的方法来测量。脂质纳米颗粒样品于TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH＝7.5)稀释，取出部分样品溶液加入0.5％曲拉通(Triton X-100)于37℃静置30分钟。加入反应液后立即于Varioskan LUX多功能酶标仪(购自Thermofisher)在吸收光波段为485nm和发射光波段为528nm条件下读取荧光值从而得到包载率数值。

实验例3：小鼠肌肉免疫

评估包载编码病毒抗原蛋白mRNA的脂质纳米颗粒在小鼠体内产生的适应性免疫效果。试验小鼠为SPF级BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22g，购自北京斯贝福生物技术有限公司。所有动物在试验前进行7天以上的适应性饲养，试验期间自由进食饮水，光照12/12h明暗交替，室内温度为20-26℃，湿度为40-70％。将小鼠随机分为免疫组和阴性对照组(DPBS,pH＝7.4)，每组5只小鼠。将制备的包载编码病毒抗原蛋白mRNA的脂质纳米颗粒按表4的免疫剂量以肌肉给药的方式注射进入免疫组小鼠体内。进行初次免疫和加强免疫两次免疫，两次免疫间隔数天。

表4

序号	组别	剂量	免疫间隔
				1	新型冠状病毒刺突蛋白组	0.025mg/kg mRNA	14天
2	水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白E组	0.05mg/kg mRNA	28天

实验例4：体液免疫效果评估

每次免疫后第10天通过小鼠眼眶取血以获得足够量血清，评估包载编码病毒抗原蛋白mRNA的脂质纳米颗粒在小鼠体内产生的体液免疫反应。

1.新型冠状病毒特异性结合抗体检测

新型冠状病毒刺突蛋白(购自义翘神州)用碳酸盐缓冲液(50mM，pH 9.6，0.22μm滤膜过滤)稀释至2ng/μl形成蛋白包被液，加入96孔板密封、4℃过夜；包被过夜后，倾倒96孔板去除蛋白包被液，每孔加入洗涤液(含0.2％ Tween-20的1×TBS，购自索莱宝)进行洗板，重复6次洗板后每孔加入封闭液(含2％ BSA的1×TBS，购自索莱宝)，37℃温箱孵育进行封闭；封闭2h后重复洗板操作；将免疫小鼠血清用抗体稀释液(含0.5％ BSA的洗涤液)进行10倍梯度稀释得到10^-1至10^-6不同稀释度的血清并加入孔板进行37℃温箱孵育；孵育2h后重复洗板操作；将辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(购自碧云天)用抗体稀释液(含0.5％BSA的洗涤液)进行250倍稀释得到二抗稀释液加入孔板进行37℃温箱孵育；孵育1h后重复洗板操作；加入TMB底物，室温、避光、孵育20min进行显色；最后加入终止液(购自索莱宝)终止反应并在酶标仪上检测A450的OD值。

血清结合抗体IgG滴度判断：某一稀释血清OD/阴性对照OD≥2.1，下一稀释倍数OD/阴性对照OD＜2.1，该稀释倍数为该血清样品对应的抗体滴度(如果阴性对照OD＜0.05则按0.05计算)。包载有新型冠状病毒刺突蛋白mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠血清的新型冠状病毒刺突蛋白结合抗体效价详见表5。

2.新型冠状病毒特异性抗体中和作用评价

利用新型冠状病毒刺突蛋白假病毒，对小鼠血清的抗体中和作用进行评价。

用DMEM完全培养基(购自Gibco)对小鼠免疫血清进行连续3倍稀释，得到6个不同稀释度血清，然后与650TCID₅₀假病毒(购自云菱生物技术有限公司)37℃孵育。同时设无假病毒的细胞对照组和无血清样品的假病毒对照组。孵育一小时后，各加入2×10⁴个Huh 7细胞(肝癌细胞)，37℃，5％ CO₂下进行细胞培养。因假病毒进入细胞会表达萤火虫荧光素酶，24小时后，与发光底物反应并进行发光检测。通过与假病毒对照组发光值比较，计算假病毒被抑制的百分比。通过Reed-Muench方法计算出假病毒50％被抑制时血清的稀释倍数，即半数中和稀释度(NT₅₀)。NT₅₀说明血清抗体对假病毒中和活性的情况，包载有新型冠状病毒刺突蛋白mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠血清的中和活性NT₅₀详见表5。

通过表5的数据可以看出，本发明化合物制备的新型冠状病毒疫苗，其体液免疫效果在血清IgG效价和血清中和能力上均显著优于对照ALC0315。当本发明化合物可降解基团(对应通式基团M1和M2)为-OC(O)-时，与含有基团-C(O)O-的化合物相比，血清中和能力更优。

表5

3.水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白E特异性结合抗体检测

重组水痘-带状疱疹病毒(Oka株疫苗)包膜糖蛋白E(购自近岸蛋白，DRA224)用碳酸盐缓冲液(50mM，pH 9.6，0.22μm滤膜过滤)稀释至1ng/μl形成蛋白包被液，加入96孔板密封、4℃过夜；包被过夜后，倾倒96孔板去除蛋白包被液，每孔加入洗涤液(含0.2％ Tween-20的1×TBS，购自索莱宝)进行洗板，重复6次洗板后每孔加入封闭液(含2％ BSA的1×TBS，购自索莱宝)，37℃温箱孵育进行封闭；封闭2h后重复洗板操作；将免疫小鼠血清用抗体稀释液(含0.5％ BSA的洗涤液)进行10倍梯度稀释得到10^-1至10^-6不同稀释度的血清并加入孔板进行37℃温箱孵育；孵育2h后重复洗板操作；将辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(购自碧云天，A0216)用抗体稀释液(含0.5％ BSA的洗涤液)进行250倍稀释得到二抗稀释液加入孔板进行37℃温箱孵育；孵育1h后重复洗板操作；加入TMB底物(购自天根)，室温、避光、孵育20min进行显色；最后加入终止液(购自索莱宝)终止反应并在酶标仪上检测A450的OD值。血清结合抗体IgG滴度判断：某一稀释血清OD/阴性对照OD≥2.1，下一稀释倍数OD/阴性对照OD＜2.1，该稀释倍数为该血清样品对应的抗体滴度(如果阴性对照OD＜0.05则按0.05计算)。包载有水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白E mRNA的脂质纳米颗粒免疫小鼠血清的水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白E结合抗体效价详见表6。

表6数据表明，本发明化合物制备编码水痘-带状疱疹病毒核酸疫苗产生强烈的体液免疫反应。

表6

实验例5：细胞免疫效果评估

1.新型冠状病毒特异性细胞免疫

加强免疫后的第14天，对免疫小鼠和阴性对照组小鼠进行脾脏解剖，并分离脾细胞制备单细胞悬液。小鼠脾细胞加入新型冠状病毒刺突蛋白肽(购自金斯瑞，2μg/ml/肽)，在37℃，5％CO₂细胞培养条件下进行特异性刺激，刺激18h后利用酶联免疫斑点法(ELISpot)检测试剂盒(购自MABTECH)检测细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌情况。实验结束后自然晾干待显色斑点板，利用全自动AID iSpot ELISPOT读板仪对斑点计数，并记录斑点的各种参数。新型冠状病毒刺突蛋白特异性IFN-γ和IL-2分泌情况详见表7。

通过表7的数据可以看出，本发明化合物制备新型冠状病毒疫苗，其细胞免疫效果显著优于对照化合物ALC0315。

表7

2.水痘-带状疱疹病毒特异性细胞免疫

加强免疫后的第14天，对免疫小鼠和阴性对照组小鼠进行脾脏解剖，并分离脾细胞制备单细胞悬液。小鼠脾细胞加入水痘-带状疱疹病毒(Oka株疫苗)包膜糖蛋白E白混合重叠肽库(购自金斯瑞，2μg/ml/肽)在37℃，5％ CO2细胞培养条件下进行特异性刺激，刺激18h后利用酶联免疫斑点(ELISpot)方法检测细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌情况。ELISpot检测试剂盒购自MABTECH，具体实施方法参照试剂盒说明书，实验结束后待显色斑点板自然晾干后，利用全自动AID iSpot ELISPOT读板仪对斑点计数，并记录斑点的各种参数。水痘-带状疱疹病毒包膜糖蛋白E特异性IFN-γ和IL-2分泌情况详见表8。

表8数据表明，本发明化合物制备水痘-带状疱疹病毒核酸疫苗产生强烈的细胞免疫反应。

表8

实验例6：体外安全性评估

1.hERG测试

使用SyncroPatch 384i/384自动膜片钳系统评估可电离脂质化合物对人hERG通道的潜在抑制作用。采用稳定过表达hERG基因的CHO细胞进行评估，以西沙必利作阳性对照品。可电离脂质化合物设置30、10、3.33、1.11、0.37μM共5个浓度并计算50％抑制浓度(IC₅₀)。评估由康龙化成完成。测试结果详见表9。

2.鼠伤寒沙门氏菌和大肠埃希杆菌Mini-Ames测试

检测可电离脂质化合物诱导组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(TA98，TA100，TA1535和TA1537)和色氨酸营养缺陷型大肠埃希杆菌WP2 uvrA(pKM101)产生回复突变的能力，评价受试物潜在的致突变性。可电离脂质化合物的测试剂量为1.5、4、10、25、64、160、400和1000μg/孔。同时测试阴性/溶剂对照(甲醇)和阳性对照。测试由康龙化成完成。测试结果详见表9。

表9数据表明，本发明化合物基本没有钾离子通道抑制作用和毒性，安全性良好。

表9

虽然本发明已通过其实施方式进行了全面的描述，但是值得注意的是，各种变化和修改对于本领域技术人员都是显而易见的。这样的变化和修改都应该包括在本发明所附权利要求的范围内。

Claims

1.式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体：

(I)

其中，

R₁和R₂独立地选自C_4-20烷基，所述C_4-20烷基任选地被一个或多个R取代；

R独立地选自H和C_1-14烷基；

R₃和R₄独立地选自H和C_1-6烷基；

a选自2、3或4；

b和d独立地为4或5；

c和e独立地为1；

b+c=5或6，d+e=5或6；

中的亚甲基任选且独立地被1或2个C_1-6烷基取代；

R₅、R₆、R₇和R₈独立地选自甲基或乙基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中，a为2或3。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中，a为2。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，b和d独立地为4；b+c=5，d+e=5。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，R₁和R₂独立地选自总长度为6、7、8、9或10个碳原子的直链烷基，所述直链烷基中的1、2或3个亚甲基任选且各自独立地被C_1-8烷基取代。

6.根据权利要求5所述的化合物，其中，R₁或R₂各自独立地为总长度为9个碳原子的直链烷基，且R₁或R₂之一被C_4-6烷基取代。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，R₃和R₄为甲基。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，R₅、R₆、R₇和R₈为甲基。

9.以下化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体：

。

10.药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体，以及任选地药学上可接受的辅料。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为纳米颗粒组合物：其包括脂质组分以及任选地活性成分；

所述脂质组分包含：可电离阳离子脂质20 mol％-85 mol％、结构性脂质10 mol％-75mol％、中性脂质1.0 mol％-30 mol％、聚合物脂质0.25 mol％-10 mol％；

其中所述可电离阳离子脂质为式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述脂质组分包含：可电离阳离子脂质30 mol％-50 mol％、结构性脂质30 mol％-60 mol％、中性脂质10 mol％-30 mol％、聚合物脂质0.25 mol％-5 mol％。

13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述脂质组分包含：可电离阳离子脂质35 mol％-45 mol％、结构性脂质40 mol％-50 mol％、中性脂质10 mol％-20 mol％、聚合物脂质0.5 mol％-2 mol％。

14.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述中性脂质选自DSPC、DMPC、DOPC、DPPC、POPC、DOPE、DMPE、POPE或DPPE中的一种或多种。

15.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述结构性脂质选自胆固醇、谷甾醇、粪甾醇、岩皂甾醇、菜籽甾醇、麦角固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、豆甾醇、燕麦甾醇、麦角骨化醇或菜油甾醇中的一种或多种。

16.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，所述聚合物脂质为聚乙二醇化脂质，所述聚乙二醇化脂质选自PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油中的一种或多种。

17.权利要求1-9中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐、同位素变体、互变异构体或立体异构体，或权利要求10-16中任一项所述的药物组合物在制备递送荷载的药物中的用途，所述荷载选自治疗剂、预防剂或诊断剂中的一种或多种。

18.根据权利要求17所述的用途，其中，所述治疗剂、预防剂或诊断剂为核酸。

19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述核酸选自ASO。

20.根据权利要求18所述的用途，其中，所述核酸选自RNA或DNA中的一种或多种。

21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述RNA选自小干扰RNA、短发夹RNA、反义RNA、信使RNA、修饰的信使RNA、长非编码RNA、微RNA、小激活RNA、多聚编码核酸、聚合编码核酸、引导RNA、CRISPRRNA或核酶中的一种或多种。

22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述RNA为mRNA。

23.根据权利要求22所述的用途，其中，所述RNA为修饰的mRNA。