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CN117794955A - 与scFv等的接头结合的抗体 - Google Patents

与scFv等的接头结合的抗体 Download PDF

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CN117794955A
CN117794955A CN202280054169.8A CN202280054169A CN117794955A CN 117794955 A CN117794955 A CN 117794955A CN 202280054169 A CN202280054169 A CN 202280054169A CN 117794955 A CN117794955 A CN 117794955A
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CN
China
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region
antibody
amino acid
seq
acid sequence
Prior art date
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Pending
Application number
CN202280054169.8A
Other languages
English (en)
Inventor
玉田耕治
佐古田幸美
安达圭志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Neuer Immune Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Neuer Immune Biotechnology Co ltd
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Publication date
Application filed by Neuer Immune Biotechnology Co ltd filed Critical Neuer Immune Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供以新的结合方式与接头结合的抗体。更具体而言，本发明提供与scFv结构中的第1区域与接头的连接部结合的抗体以及与接头与第2区域的连接部结合的抗体。

Description

与scFv等的接头结合的抗体
技术领域
本发明涉及与scFv等的接头结合的抗体。本发明特别涉及与scFv的框架区与接头区的连接部结合且能够不依赖于scFv的CDR区的序列地识别各种scFv的抗体。
背景技术
融合蛋白中，蛋白质之间有时借助接头而连接。作为接头，使用包含G和S的GS接头等柔性接头，在部分用途中要求在蛋白质之间的连接中不附加结构上的制约。
作为抗体的片段，已知有scFv。scFv中，抗体的重链可变区与轻链可变区借助接头而连接。这样的融合蛋白可以通过蛋白L来检测。但是，蛋白L与其它免疫球蛋白也具有亲和性，对scFv的特异性不高，因此不适合于在体内应用、在混杂有其它免疫球蛋白的体系中应用(非专利文献1)。已开发出与这样的融合蛋白的接头结合的抗体。例如，专利文献1公开了与Whitlow接头结合的抗体。这些文献中，为了避免接头的免疫原性降低而在接头中插入脯氨酸(P)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)等氨基酸。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：US2019/0092818A
非专利文献
非专利文献1：Hu Y.and Huang J.,Front.Immunol.11:1770,2020.
发明内容
本发明提供与scFv等的接头结合的抗体。更具体而言，本发明提供与scFv中、抗体的重链可变区或轻链可变区与接头的连接部结合的抗体。
本发明人制作了与抗体的重链可变区或轻链可变区与接头的连接部结合的抗体。由此发现，能够得到不依赖于接头自身的免疫原性高低、与接头周边部结合的抗体。发现所得到的抗体不依赖于scFv的互补决定区(CDR)序列地与各种scFv结合。本发明基于这样的见解。
根据本发明，例如提供以下的发明。
[1]一种抗体，其为与含有第1区域、接头和第2区域的scFv结合的抗体，其中，
上述scFv中，从N末端侧向C末端侧依次配置有上述第1区域、上述接头和上述第2区域，
第1区域和第2区域分别为抗体的重链可变区和抗体的轻链可变区或者为抗体的轻链可变区和抗体的重链可变区，
上述抗体为满足以下(i)～(vi)中的至少一者的抗体：
{(i)与具有(i-a)作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和(i-b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(ii)与具有(ii-a)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和(ii-b)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(iii)与具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(iv)与具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(v)与(v-a)作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和/或(v-b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域(例如第1区域与接头的连接部)结合；以及
(vi)与(vi-a)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和/或(vi-b)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域(例如接头与第2区域的连接部)结合。
[2]根据上述[1]所述的抗体，其中，(i)与具有(i-a)作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和(i-b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度。
[3]根据上述[1]所述的抗体，其中，(ii)与具有(ii-a)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和(ii-b)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度。
[4]根据上述[1]所述的抗体，其中，(iii)与具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合。
[5]根据上述[1]所述的抗体，其中，(iv)与具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合。
[6]根据上述[1]所述的抗体，其中，(v)与(v-a)作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和/或(v-b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域(例如第1区域与接头的连接部)结合。
[7]根据上述[1]所述的抗体，其中，(vi)与(vi-a)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和/或(vi-b)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域(例如接头与第2区域的连接部)结合。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的抗体，其中，(vii)对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性。
[9]根据上述[1]～[7]中任一项所述的抗体，其中，(viii)对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv也显示显著的结合亲和性。
[10]根据上述[1]～[9]中任一项所述的抗体，其与含有上述scFv的嵌合抗原受体(CAR)结合。
[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的抗体，其与表达含有上述scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞结合。
[12]一种检测表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的方法，其包括使上述细胞与上述[11]所述的抗体接触的步骤。
[13]一种用于检测表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的试剂盒或检查试剂，其含有上述[11]所述的抗体。
[14]一种在对象中将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞靶标化的方法，其包括下述步骤：
将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞给药于对象；和
将上述[11]所述的抗体给药于对象。
[15]一种抗体制剂，其为用于在给药了表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的对象中将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞靶标化的抗体制剂，其含有上述[11]所述的抗体。
[16]一种获得(或选择或鉴定)与scFv结合的抗体的方法，其中，
scFv含有第1区域、接头和第2区域，上述scFv中，从N末端侧向C末端侧依次配置有上述第1区域、上述接头和上述第2区域，第1区域和第2区域分别为抗体的重链可变区和抗体的轻链可变区或者为抗体的轻链可变区和抗体的重链可变区，
所述方法包括从抗体组中选择或鉴定作为与scFv结合的抗体且满足以下(i)～(vi)中的至少一者的抗体的步骤：
{(i)与具有作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(ii)与具有作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(iii)与具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(iv)与具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(v)与作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域结合；以及
(vi)与作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域结合}。
[17]根据上述[16]所述的方法，其中，(vii)抗体对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性。
[18]根据上述[16]所述的方法，其中，(viii)抗体对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv也显示显著的结合亲和性。
[19]根据上述[16]～[18]中任一项所述的方法，其中，还包括使抗体产生细胞产生具有该筛选出的抗体的重链CDR1～3和轻链CDR1～3的氨基酸序列的抗体的步骤。
[20]根据上述[2]～[7]中任一项所述的抗体，其还满足上述(vii)。
[21]根据上述[2]～[7]中任一项所述的抗体，其还满足上述(viii)。
[22]根据上述[2]～[8]中任一项所述的抗体，其与不含第1区域或第2区域的部分肽且含有接头部分的氨基酸序列的肽不结合或仅以弱结合亲和性结合。
[23]根据上述[2]～[7]和[9]中任一项所述的抗体，其与不含第1区域或第2区域的部分肽且含有接头部分的氨基酸序列的肽也结合。
[24]根据上述[10]或[11]中任一项所述的抗体，其还满足上述(vii)。
[25]根据上述[10]或[11]中任一项所述的抗体，其还满足上述(viii)。
[26]根据上述[10]或[11]中任一项所述的抗体，其与不含第1区域或第2区域的部分肽且含有接头部分的氨基酸序列的肽不结合或仅以弱结合亲和性结合。
[27]根据上述[10]或[11]中任一项所述的抗体，其与不含第1区域或第2区域的部分肽且含有接头部分的氨基酸序列的肽也结合。
[28]根据上述[20]～[27]中任一项所述的抗体，其与含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)结合。
[29]一种组合物，其含有上述[20]～[28]中任一项所述的抗体。
[30]一种检测表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的方法，其包括使上述细胞与上述[28]所述的抗体接触的步骤。
[31]一种用于检测表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的试剂盒或检查试剂，其含有上述[28]所述的抗体。
[32]一种在对象中将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞靶标化的方法，其包括下述步骤：
将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞给药于对象；和
将上述[28]所述的抗体给药于对象。
[33]一种抗体制剂，其为用于在给药了表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的对象中将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞靶标化的抗体制剂，其含有上述[28]所述的抗体。
[34]根据上述[1]所述的抗体，其中，上述抗体组可以通过用上述[1]的(i)～(iv)中任一者规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到。
[35]根据上述[1]的(i)所述的抗体，其中，上述抗体组可以通过用上述[1]的(i)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到。
[36]根据上述[1]的(ii)所述的抗体，其中，上述抗体组可以通过用上述[1]的(ii)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到。
[37]根据上述[1]的(iii)所述的抗体，其中，上述抗体组可以通过用上述[1]的(iii)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到。
[38]根据上述[1]的(iv)所述的抗体，其中，上述抗体组可以通过用上述[1]的(iv)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到。
[39]根据上述[16]～[18]中任一项所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(i)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择上述[16]的(i)所记载的抗体的步骤。
[40]根据上述[16]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(ii)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择上述[16]的(ii)所记载的抗体的步骤。
[41]根据上述[16]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(iii)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择上述[16]的(iii)所记载的抗体的步骤。
[42]根据上述[16]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(iv)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择上述[16]的(iv)所记载的抗体的步骤。
[43]根据上述[17]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(i)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择作为上述[16]的(i)所记载的抗体且对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性的抗体的步骤。
[44]根据上述[17]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(ii)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择作为上述[16]的(ii)所记载的抗体且对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性的抗体的步骤。
[45]根据上述[17]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(iii)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择作为上述[16]的(iii)所记载的抗体且对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性的抗体的步骤。
[46]根据上述[17]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(iv)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择作为上述[16]的(iv)所记载的抗体且对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性的抗体的步骤。
[47]根据上述[18]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(i)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择作为上述[16]的(i)所记载的抗体且对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv也显示显著的结合亲和性的抗体的步骤。
[48]根据上述[18]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(ii)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择作为上述[16]的(ii)所记载的抗体且对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv也显示显著的结合亲和性的抗体的步骤。
[49]根据上述[18]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(iii)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择作为上述[16]的(iii)所记载的抗体且对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv也显示显著的结合亲和性的抗体的步骤。
[50]根据上述[18]所述的方法，其中，上述抗体组可以通过用上述[16]的(iv)规定的单离短链肽免疫非人哺乳动物而得到，并且所述方法包括选择作为上述[16]的(iv)所记载的抗体且对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv也显示显著的结合亲和性的抗体的步骤。
[51]一种与scFv结合的抗体，其包含含有具有序列号92所记载的氨基酸序列的重链CDR1、具有序列号93所记载的氨基酸序列的重链CDR2和具有序列号94所记载的氨基酸序列的重链CDR3的重链可变区和含有具有序列号96所记载的氨基酸序列的轻链CDR1、具有序列号97所记载的氨基酸序列的轻链CDR2和具有序列号98所记载的氨基酸序列的轻链CDR3的轻链可变区。
[52]一种与scFv结合的抗体，其包含含有具有序列号100所记载的氨基酸序列的重链CDR1、具有序列号101所记载的氨基酸序列的重链CDR2和具有序列号102所记载的氨基酸序列的重链CDR3的重链可变区和含有具有序列号104所记载的氨基酸序列的轻链CDR1、具有序列号105所记载的氨基酸序列的轻链CDR2和具有序列号106所记载的氨基酸序列的轻链CDR3的轻链可变区。
[53]根据上述[51]所述的抗体，其含有具有序列号91所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号95所记载的氨基酸序列的轻链可变区。
[54]根据上述[52]所述的抗体，其含有具有序列号99所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号103所记载的氨基酸序列的轻链可变区。
[55]一种获得(或者选择或鉴定)与scFv结合的抗体的方法，其中，
scFv含有第1区域、接头和第2区域，上述scFv中，从N末端侧向C末端侧依次配置有上述第1区域、上述接头和上述第2区域，第1区域和第2区域分别为抗体的重链可变区和抗体的轻链可变区或者为抗体的轻链可变区和抗体的重链可变区，
方法包括从抗体组中选择或鉴定与scFv结合的抗体的步骤，抗体组为与上述[53]所述的抗体竞争与scFv的结合的抗体组。
[56]一种获得(或者选择或鉴定)与scFv结合的抗体的方法，其中，
scFv含有第1区域、接头和第2区域，上述scFv中，从N末端侧向C末端侧依次配置有上述第1区域、上述接头和上述第2区域，第1区域和第2区域分别为抗体的重链可变区和抗体的轻链可变区或者为抗体的轻链可变区和抗体的重链可变区，
方法包括从抗体组中选择或鉴定与scFv结合的抗体的步骤，抗体组为与上述[54]所述的抗体竞争与scFv的结合的抗体组。
[57]根据上述任一项所述的抗体，其实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合。
[58]根据上述任一项所述的抗体，其实质上不与VH-L1-VL型scFv结合，与VL-L1-VH型scFv结合。
[59]根据上述任一项所述的抗体，其实质上不与VL-L1-VH型scFv结合，与VH-L1-VL型scFv结合。
[60]根据上述任一项所述的抗体，其实质上不与VH-L2-VL型scFv结合，与VL-L2-VH型scFv结合。
[61]根据上述任一项所述的抗体，其实质上不与VL-L2-VH型scFv结合，与VH-L2-VL型scFv结合。
[62]根据上述[58]所述的抗体，其实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合。
[63]根据上述[59]所述的抗体，其实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合。
[64]根据上述[60]所述的抗体，其实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合。
[65]根据上述[61]所述的抗体，其实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合。
[66]根据上述任一项所述的抗体，其为人嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[67]根据上述任一项所述的抗体，其为非人动物抗体。
[68]一种组合物，其含有上述任一项所述的抗体。
[69]一种组合物，其含有上述[57]所述的抗体。
[70]一种上述[68]所述的组合物，其用于检测scFv。
[71]一种上述[68]所述的组合物，其用于在人体内检测scFv。
[72]一种上述[68]所述的组合物，其用于在人体内使scFv靶标化。
[73]一种上述[68]所述的组合物，其用于在体内检测scFv。
[74]一种上述[69]所述的组合物，其用于检测scFv。
[75]一种上述[69]所述的组合物，其用于在人体内检测scFv。
[76]一种上述[69]所述的组合物，其用于在人体内使scFv靶标化。
[77]一种上述[69]所述的组合物，其用于在体内检测scFv。
[78]一种组合物，其含有上述[62]～[65]中任一项所述的抗体。
[79]一种上述[78]所述的组合物，其用于检测scFv。
[80]一种上述[78]所述的组合物，其用于在人体内检测scFv。
[81]一种上述[78]所述的组合物，其用于在人体内使scFv靶标化。
[82]一种上述[78]所述的组合物，其用于在体内检测scFv。
附图说明
图1示出通常的scFv结构和作为本发明的抗体的例子的抗体1和2。图1中，抗体1示出结合于第1区域与接头的连接部的情况，抗体2示出结合于接头与第2区域的连接部的情况。
图2示出本发明的例示性抗体与作为含有scFv的抗原结合性化合物的一例的、各种表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的结合亲和性。图2中，从若干杂交瘤克隆的培养上清中回收针对VH-L1-VL型scFv的抗体并确认与CAR-T细胞的结合性。图2中，结合亲和性越强则PE的强度越强。作为CAR-T细胞，使用S#031、#673和#530。这些CAR-T细胞的详细情况如表5所记载。
图3示出本发明的例示性抗体与作为含有scFv的抗原结合性化合物的一例的、各种表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的结合亲和性。图3中，从若干杂交瘤克隆的培养上清中回收针对VH-L1-VL型scFv的抗体并确认与CAR-T细胞的结合性。图3中，结合亲和性越强则PE的强度越强。作为CAR-T细胞，使用S#067、S#075和#231。这些CAR-T细胞的详细情况如表5所记载。
图4示出本发明的例示性抗体与作为含有scFv的抗原结合性化合物的一例的、各种表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的结合亲和性。图4中，从若干杂交瘤克隆的培养上清中回收针对VH-L1-VL型scFv的抗体并确认与CAR-T细胞的结合性。图4中，结合亲和性越强则PE的强度越强。作为CAR-T细胞，使用#673和S#017。这些CAR-T细胞的详细情况如表5所记载。
图5示出本发明的例示性抗体与作为含有scFv的抗原结合性化合物的一例的、各种表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的结合亲和性。图4中，从若干杂交瘤克隆的培养上清中回收针对VL-L1-VH型scFv的抗体并确认与CAR-T细胞的结合性。图5中，结合亲和性越强则PE的强度越强。作为CAR-T细胞，使用S#067、S#075、#231和S#031。这些CAR-T细胞的详细情况如表5所记载。
具体实施方式
＜定义＞
本说明书中，“包含”(comprise)以包括“由……构成”(consist of)的含义来使用。“包含”表示可以包括所含构成要素以外的构成要素，“由……构成”表示实质上不含所含构成要素以外的构成要素。“仅由……构成”表示不含所含构成要素以外的构成要素。
本说明书中，“对象”为哺乳动物，可以为例如啮齿类(例如小鼠和大鼠)、狗、猫、牛、马、猪、灵长类(例如猴、大猩猩、红毛猩猩、倭黑猩猩、黑猩猩和人)，例如可以为人。
本说明书中，“处置”以包括治疗(治疗性处置)和预防(预防性处置)的含义来使用。本说明书中，“治疗”是指疾病或障碍的治疗、治愈、防止或缓解性改善、或者疾病或障碍的进展速度降低。本说明书中，“预防”是指降低疾病或病情的发生可能性、或者延迟疾病或病情的发生。
本说明书中，“疾病”是指治疗可获益的症状。本说明书中，“癌症”是指恶性肿瘤。
本说明书中，“治疗上的有效量”是指对处置(预防或治疗)疾病、状态而言有效的药剂量。治疗上的有效量的药剂能够降低疾病或状态的症状恶化速度、阻止上述症状的恶化、改善上述症状、治愈上述症状、或抑制上述症状的发生或发展。
本说明书中，“抗体”是指免疫球蛋白。抗体通常采取经一对二硫键稳定化的2条重链(H链)和2条轻链(L链)缔合而成的结构。重链由重链可变区VH、重链恒定区CH1、CH2、CH3和位于CH1与CH2之间的铰链区构成，轻链由轻链可变区VL和轻链恒定区CL构成。其中，由VH和VL构成的可变区片段(Fv)是直接参与抗原结合、对抗体赋予多样性的区域。另外，将由VL、CL、VH、CH1构成的抗原结合区域称为Fab区，将由铰链区、CH2、CH3构成的区域称为Fc区。可变区中，直接与抗原接触的区域的变化尤其大，称为互补决定区(complementarity-determining region：CDR)。将CDR以外的突变相对少的部分称为框架(framework region：FR)。轻链和重链的可变区中分别存在3个CDR，从N末端侧起分别依次称为重链CDR1～3和轻链CDR1～3。抗体可以为各种同种型抗体，例如可以为IgG。抗体可以为人嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。人嵌合抗体可通过将非人抗体的恒定区置换为人抗体的恒定区来制作。人源化抗体可通过将非人抗体的6个CDR以外的区域用人抗体的相应区域置换来制作。人抗体可以使用将免疫球蛋白的至少重链可变区用人基因座的相应区域置换的动物(例如小鼠)来制作。恒定区为非人时，可以通过将恒定区置换为人抗体的氨基酸序列而得到人抗体。抗体通常可与其抗原选择性或特异性地结合。
本说明书中，“CDR”为存在于抗体的重链可变区和轻链可变区的互补决定区。重链和轻链可变区中分别存在3个，从N末端起称为CDR1、CDR2和CDR3。存在于重链可变区的CDR称为重链CDR1～3(HCDR1～3)。存在于轻链可变区的CDR称为轻链CDR1～3(LCDR1～3)。CDR例如可以基于Kabat等人的编号(Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th ed.，1991，Bethesda：USDept.of Health and HumanServices，PHS，NIH.)、Chothia、AbM、contact、IMGT、Aho、Martin(Enhanced Chothia)等来确定。由此，重链CDR1～3和轻链CDR1～3可分别基于重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列按照常规方法来推断。
本说明书中，“scFv”为具有重链可变区或其抗原结合区域和轻链可变区或其抗原结合区域的抗体的抗原结合性片段。scFv中，重链可变区或其抗原结合区域与轻链可变区或其抗原结合区域借助接头而连接。本说明书中，如图1所示，scFv从N末端侧向C末端侧依次具有第1区域、接头和第2区域。第1区域可以为重链可变区或其抗原结合区域，第2区域可以为轻链可变区或其抗原结合区域。或者，第1区域可以为轻链可变区或其抗原结合区域，第2区域可以为重链可变区或其抗原结合区域。作为接头，通常优选使用柔性接头。scFv中，重链可变区或其抗原结合区域和轻链可变区或其抗原结合区域可含有来自经免疫的动物的抗体的序列。scFv中，重链可变区或其抗原结合区域和轻链可变区或其抗原结合区域可以进行人源化。scFv中，重链可变区或其抗原结合区域和轻链可变区或其抗原结合区域可以为人抗体的重链可变区或其抗原结合区域和轻链可变区或其抗原结合区域。scFv有时会整合于抗原结合性化合物而作为其一部分，scFv可在该抗原结合性化合物中作为抗原结合部位起作用。
本说明书中，“与第1区域与接头的连接部结合的抗体”可包括仅与第1区域结合的抗体、仅与接头结合的抗体和与第1区域和接头这两者结合的抗体(例如，不与仅接头的构建物结合且不与仅第1区域的构建物结合的抗体)。本说明书中，“与第2区域与接头的连接部结合的抗体”可包括仅与第2区域结合的抗体、仅与接头结合的抗体和与第2区域和接头这两者结合的抗体(例如，不与仅接头的构建物结合且不与仅第2区域的构建物结合的抗体)。本说明书中，“第1区域与接头的连接部”和“第2区域与接头的连接部”以及类似表述中的“连接部”含有抗体的抗原结合性片段(例如scFv)的框架区和接头。与仅框架的构建物结合的抗体有可能也与天然的免疫球蛋白结合。例如，在要求给药于体内的抗体实质上不与天然的免疫球蛋白结合时，该抗体优选实质上不与天然的免疫球蛋白结合，例如优选实质上不与仅框架区的构建物结合。另外，给药于个体的抗体特别优选为与第2区域与接头的连接部结合、但是不与仅接头的构建物结合且不与仅第1区域的区域或仅第2区域的构建物结合的抗体。抗体的结合特性可以通过测试包含各区域的肽与抗体的结合来确认。另外，给药于个体的抗体优选抗体片段的CDR以外的序列被置换为被给药的个体的序列。从该观点出发，给药于人的抗体优选为人嵌合抗体、更优选为人源化抗体、进一步优选为人抗体。体外使用的抗体无此种特别限制，可以将与连接部结合的抗体(例如非人动物抗体、非人哺乳动物抗体、人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体)优选用在体内。
本说明书中，“单离”是指与体系内存在的至少1种以上其它成分分离。
本说明书中，“嵌合抗原受体”(CAR)为具有抗体的抗原结合性片段(特别是scFv)和免疫细胞的活化结构域的嵌合分子。CAR通常为scFv、胞外铰链结构域、跨膜结构域(例如CD8α或CD28)和活化信号转导结构域(例如CD3ζ)连接而成的分子。CAR可以导入细胞而在细胞表面表达。表达CAR的细胞可以靶向特定的抗原。例如可将CAR导入T细胞或NK细胞等免疫细胞，使T细胞或NK细胞等免疫细胞靶向癌。第1代CAR中连接有scFv、胞外铰链结构域、跨膜结构域(例如CD8α或CD28)和活化信号转导结构域(例如CD3ζ)，第2代CAR中，为了活化导入了CAR的免疫细胞，还含有共刺激分子信号转导结构域。作为共刺激分子信号转导结构域，使用CD28、4-1BB、OX40、CD27和ICOS等共刺激因子。第3代CAR中整合有多个共刺激因子。由此，CAR中增加了用于使导入了CAR的免疫细胞在生物体内持续增殖的改良。scFv部分以外的任一结构域均优选来自人蛋白。
＜本发明的能够检测scFv的抗体＞
根据本发明，提供与scFv结合的抗体。本发明的抗体为了与针对各种抗原的scFv结合而设计成与接头附近(特别是第1区域与接头的连接部或接头与第2区域的连接部)结合。
所有方式中，scFv可优选具有人重链可变区和人轻链可变区的框架区。优选方式中，scFv可具有来自人抗体的重链可变区和轻链可变区。
＜1＞与第1区域与接头的连接部结合的抗体
本发明人发现，可使用具有作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的单离短链肽(例如，具有10～20个氨基酸长度、例如13～20个氨基酸)作为抗原获得的抗体与针对各种抗原的scFv结合。接头为柔性接头时，存在不易获得与接头结合的抗体的情况，但是根据本发明，即使使用柔性接头作为接头时，也由于第1区域或第2区域的免疫原性而能够良好地获得与接头附近结合的抗体。
即，本发明提供一种抗体，其与含有作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域的单离短链肽结合。短链肽可优选为scFv的部分肽。
比重链CDR3(HCDR3)靠近C末端侧的重链可变区的氨基酸序列例如可选自由WGQGTLVTVSS(序列号1)、WGQGTLVTVSS(序列号2)、WGQGTLVTVSS(序列号3)、WGQGTTLTVS(序列号4)、WGQGTTVTVSSGILGS(序列号5)、GQGTLVTVSS(序列号109)、GAGTTVTVSS(序列号110)、GQGTLVTVSA(序列号111)、GQGTLVTVSS(序列号117)、GQGTTVTVSSGILGS(序列号118)和GQGTLVTVSS(序列号119)组成的组。因此，短链肽可设计成含有这些序列的C末端侧起1～10个氨基酸、优选1～5个氨基酸、例如3～5个氨基酸(例如VSS、TVSS、VTVSS(序列号6)、或VTVSA(序列号120)；TVS、LTVS、或TLTVS(序列号79)；或者，LGS、ILGS、或GILGS(序列号80))。并且，抗体可与含有第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域、优选第1区域的C末端起1～5个氨基酸(例如1个氨基酸、1～2个氨基酸、1～3个氨基酸、1～4个氨基酸、或1～5个氨基酸)的区域结合。
比轻链CDR3(LCDR3)靠近C末端侧的轻链可变区的氨基酸序列例如可选自由FGGGTKLEIK(序列号7)、FGAGTKLELKR(序列号8)、FGGGTQLTVLS(序列号9)、FGGGTKVEIK(序列号81)、FGGGTKVEIK(序列号107)、FGGGTKLEIK(序列号108)、FGGGTKVEIK(序列号112)、FGGGTKLEIK(序列号113)、FGGGTKLEIK(序列号114)、FGGGTKLEIK(序列号115)和FGGGTKVEIK(序列号116)组成的组。因此，短链肽可设计成含有这些序列的C末端侧起1～10个氨基酸、优选1～5个氨基酸、例如3～5个氨基酸(例如EIK、LEIK、或KLEIK(序列号10)；LKR、ELKR、或LELKR(序列号11)；VLS、TVLS、或LTVLS(序列号12)；或者，EIK、VEIK、或KVEIK(序列号82))。并且，抗体可与含有第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域、优选第1区域的C末端起1～5个氨基酸(例如1个氨基酸、1～2个氨基酸、1～3个氨基酸、1～4个氨基酸、或1～5个氨基酸)的区域结合。
本发明的一个优选方式中，可以使用具有(a)从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和(b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的肽作为免疫原来获得抗体。通过这样进行，可得到针对第1区域与接头的连接部的抗体。该方式中，上述单离短链肽可设计成含有(a)从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域、优选1～5个氨基酸、例如3～5个氨基酸(例如VTV、TVS、VSS、VTVS、TVSS、VTVSS(序列号6)、或VTVSA(序列号120)；TVS、LTVS、或TLTVS(序列号79)；或者，LGS、ILGS、或GILGS(序列号80))。该方式中，上述单离短链肽可设计成含有(b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域、优选1～8个氨基酸、例如3～8个氨基酸(例如1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、或8个氨基酸)。该方式中，上述单离短链肽可设计成含有(b)从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域、优选1～8个氨基酸、例如3～8个氨基酸(例如GGG、GGGG、GGGGS(序列号13)或GGGGSG(序列号14)；或者，SSA、SAD、SSAD、SADD、SSADD(序列号15)、SSADDA(序列号16)、SSADDAK(序列号17)、或SSADDAKK(序列号18)等3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、或8个氨基酸)。一个方式中，上述单离短链肽可含有第1区域的C末端起1～5个氨基酸和接头的N末端侧起3～8个氨基酸。优选方式中，上述单离短链肽可列举含有第1区域的C末端起至少3～5个氨基酸(例如VTV、TVS、VSS、VTVS、TVSS、或VTVSS(序列号6))和接头的N末端侧起至少3～8个氨基酸(例如GGG、GGGG、GGGGS(序列号13)或GGGGSG(序列号14)、SSA、SAD、SSAD、SADD、或SSADD(序列号15)、SSADDA(序列号16)、SSADDAK(序列号17)、或SSADDAKK(序列号18)的肽。
一个优选方式中，单离短链肽可含有以下的表1的1～16中的任一者。
[表1]
表1：短链肽至少可具有的优选区域
一个优选方式中，单离短链肽可含有序列号19：VTVSSSSADDAKK的氨基酸序列。该方式中，短链肽含有重链可变区的C末端侧和接头的N末端侧连接而成的区域。一个优选方式中，本说明书所公开的单离短链肽可在N末端和C末端分别添加1～3个氨基酸(例如分别2个氨基酸和1个氨基酸、例如分别为GG和C)。
一个优选方式中，单离短链肽可含有序列号20：VTVSSGGGGSG的氨基酸序列。该方式中，短链肽含有重链可变区的C末端侧和接头的N末端侧连接而成的区域。
一个优选方式中，单离短链肽可以为序列号21：GGVTVSSSSADDAKKC的氨基酸序列、或序列号22：GGVTVSSGGGGSGC所记载的氨基酸序列。
一个优选方式中，单离短链肽可含有序列号23：LEIKSSADDAKK的氨基酸序列。该方式中，短链肽含有轻链可变区的C末端侧和接头的N末端侧连接而成的区域。
一个优选方式中，单离短链肽可含有序列号24：LEIKGGGGSG的氨基酸序列。该方式中，短链肽含有轻链可变区的C末端侧和接头的N末端侧连接而成的区域。
一个优选方式中，单离短链肽可以为序列号70：GGLEIKSSADDAKKC的氨基酸序列、或序列号71：GGLEIKGGGGSGC的氨基酸序列。
一个优选方式中，本发明的抗体可以与上述的单离短链肽结合且可以与scFv结合。一个方式中，scFv可以为整合于其它抗原结合性化合物(例如CAR分子)的形态。作为抗原结合性化合物，可列举含有scFv作为抗原结合性部分的所有蛋白质分子，没有特别限定，可列举例如CAR、IgG-scFv(在IgG分子的Fc区连接有scFv的分子)、scFv-Fc(抗体的可变区被置换为scFv的分子)、scFv2-Fc(抗体的可变区被置换为scFv且在Fc区连接有scFv的分子)、scFv-HSA-scFv(在人血清白蛋白的N末端和C末端分别连接有scFv的分子)、Fab-scFv-Fc(抗体的可变区分别被置换为Fab和scFv且在Fc区连接有Fab和scFv的分子)、Fab-scFv(在Fab连接有scFv的分子)和BiTE(2个scFv连接而成的分子)。
一个方式中，scFv中的接头可以为10～40个氨基酸长度、例如15～25个氨基酸长度。
一个方式中，scFv中的接头可以为柔性接头。作为柔性接头，可列举GGGGSGGGGS(序列号25)、GGGGSGGGGSGGGGS(序列号26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(序列号27)和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(序列号28)等含有G和S的接头以及SSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDG(序列号29)。
一个方式中，本发明的抗体可以与上述的单离短链肽结合且可以与scFv结合。进而，本发明的抗体可识别上述单离短链肽中的第1区域与接头的连接部。
一个方式中，本发明的抗体与仅含第1区域的肽和仅含接头的肽以弱于对上述单离短链肽的结合亲和性的结合亲和性(例如50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、或1％以下、1/1000以下、或1/10000以下)结合或不具有显著的结合亲和性。或者，本发明的抗体对重链可变区和轻链可变区的顺序(即，第1区域和第2区域)调换后的scFv，以弱于对第1区域、接头和第2区域依次连接而成的scFv的结合亲和性(例如50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、或1％以下、1/1000以下、或1/10000以下)结合或不具有显著的结合亲和性。或者，结合亲和性弱例如可以是指，结合解离常数KD具有作为比较对象的结合的KD值的超过1倍、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、100倍以上、或1000倍以上的KD值。
＜2＞与接头与第2区域的连接部结合的抗体
上述描述了与第1区域与接头的连接部结合的抗体，但是与接头与第2区域的连接部结合的抗体可能也同样是有益的。
本发明的一个方式中，可提供一种抗体，其与具有作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的短链肽结合。
本发明的一个方式中，可提供一种抗体，其与具有(c)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和(d)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的短链肽(例如，具有10～20个氨基酸长度、例如13～20个氨基酸)结合。
比重链CDR1(HCDR1)靠近N末端侧的重链可变区的氨基酸序列例如可包括QVTLKESGPA(序列号30)、QVQLVQSGAE(序列号31)、EVQLVQSGAE(序列号32)、SQVQLKESGP(序列号33)和QVQLQQSGPG(序列号34)。因此，短链肽可设计成含有这些序列的C末端侧起1～10氨基酸、优选1～5个氨基酸、例如3～5个氨基酸(例如VTVSS(序列号6))。并且，抗体可与含有第1区域的C末端起1～10氨基酸的区域、优选第1区域的C末端起1～5个氨基酸(例如1个氨基酸、1～2个氨基酸、1～3个氨基酸、1～4个氨基酸、或1～5个氨基酸)的区域结合。
比轻链CDR1靠近N末端侧的重链可变区的氨基酸序列例如可包括DIVMTQSPLS(序列号35)、DIVMTQSPDS(序列号36)、DIQLTQSPSS(序列号37)、DIQMTQSPKF(序列号38)和QPVLTQSSSL(序列号39)。因此，短链肽可设计成含有这些序列的N末端侧起1～10个氨基酸、优选1～5个氨基酸、例如3～5个氨基酸(例如VTVSS(序列号6))。并且，抗体可与含有第2区域的N末端起1～10氨基酸的区域、优选第2区域的N末端起1～5个氨基酸(例如1个氨基酸、1～2个氨基酸、1～3个氨基酸、1～4个氨基酸、或1～5个氨基酸)的区域结合。
本发明的一个优选方式中，可以使用具有(c)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和(d)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的肽作为免疫原来获得抗体。通过这样进行，可得到针对第2区域与接头的连接部的抗体。该方式中，上述单离短链肽可设计成含有(c)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域、优选1～8个氨基酸、例如3～8个氨基酸(例如GGS、GGGS、GGGGS(序列号13)、或SGGGGS(序列号40)、或KDG、KKDG、AKKDG(序列号41)、DAKKDG(序列号42)、DDAKKDG(序列号43)、或KDDAKKDG(序列号44)等3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、或8个氨基酸)。该方式中，上述单离短链肽可设计成含有(d)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域、优选1～5个氨基酸、例如3～5个氨基酸(例如DX1X2X3T{在此，X1为I或P，X2为V或Q，X3为M或L}(序列号45)、例如DIVMT(序列号46)、DIQLT(序列号47)、DIQMT(序列号48)、或QPVLT(序列号49))。该方式中，上述单离短链肽可含有接头的C末端侧起3～8个氨基酸和第2区域的N末端起1～5个氨基酸。优选方式中，上述单离短链肽可列举例如含有接头的C末端侧起3～8个氨基酸(例如GGS、GGGS、GGGGS(序列号13)、或SGGGGS(序列号40)、或KDG、KKDG、AKKDG(序列号41)、DAKKDG(序列号42)、DDAKKDG(序列号43)、或KDDAKKDG(序列号44))和第2区域的N末端起3～5个氨基酸的肽。
一个优选方式中，单离短链肽可含有以下的表2的1～27中任一者。
[表2]
表2：短链肽至少可具有的优选区域
一个优选方式中，单离短链肽可含有
序列号50：KDDAKKDGQVTLK的氨基酸序列、
序列号51：KDDAKKDGQVQLV的氨基酸序列、
序列号52：KDDAKKDGEVQLV的氨基酸序列、
序列号53：KDDAKKDGSQVQL的氨基酸序列、或
序列号54：KDDAKKDGQVQLQ的氨基酸序列。该方式中，短链肽含有接头的C末端侧和重链可变区的N末端侧连接而成的区域。
一个优选方式中，单离短链肽可含有
序列号55：SGGGGSQVTLK的氨基酸序列、
序列号56：SGGGGSQVQLV的氨基酸序列、
序列号57：SGGGGSEVQLV的氨基酸序列、
序列号58：SGGGGSSQVQL的氨基酸序列、或
序列号59：SGGGGSQVQLQ的氨基酸序列。该方式中，短链肽含有接头的C末端侧和轻链可变区的N末端侧连接而成的区域。
一个优选方式中，单离短链肽可含有
序列号83：KDDAKKDGDIVMT的氨基酸序列、
序列号84：KDDAKKDGDIQLT的氨基酸序列、
序列号85：KDDAKKDGDIQMT的氨基酸序列、或
序列号86：KDDAKKDGQPVLT的氨基酸序列。该方式中，短链肽含有接头的C末端侧和轻链可变区的N末端侧连接而成的区域。
一个优选方式中，单离短链肽可含有
序列号87：SGGGGSDIVMT的氨基酸序列、
序列号88：SGGGGSDIQLT的氨基酸序列、
序列号89：SGGGGSDIQMT的氨基酸序列、或
序列号90：SGGGGSQPVLT的氨基酸序列。该方式中，短链肽含有接头的C末端侧和轻链可变区的N末端侧连接而成的区域。
一个优选方式中，单离短链肽可以为
序列号60：GGKDDAKKDGQVTLKC的氨基酸序列、
序列号61：GGKDDAKKDGQVQLVC的氨基酸序列、
序列号62：GGKDDAKKDGEVQLVC的氨基酸序列、
序列号63：GGKDDAKKDGSQVQLC的氨基酸序列、或
序列号64：GGKDDAKKDGQVQLQC的氨基酸序列。
一个优选方式中，单离短链肽可以为
序列号65：GGSGGGGSQVTLKC的氨基酸序列、
序列号66：GGSGGGGSQVQLVC的氨基酸序列、
序列号67：GGSGGGGSEVQLVC的氨基酸序列、
序列号68：GGSGGGGSSQVQLC的氨基酸序列、或
序列号69：GGSGGGGSQVQLQC的氨基酸序列。
由此，通过使用具有接头与重链或轻链可变区的连接部分的氨基酸序列的肽免疫动物而获得抗体，可以得到与该连接部结合的抗体。并且，从而即使在接头自身的免疫原性低的情况下，也可得到与接头附近结合的抗体。
一个方式中，本发明的抗体与上述单离短链肽结合，但是与仅具有第2区域的肽和仅具有接头序列的肽以弱于上述的结合亲和性(例如50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、或1％以下、1/1000以下、或1/10000以下)结合或不显著结合。或者，结合亲和性弱例如可以是指，结合解离常数KD具有作为比较对象的结合的KD值的超过1倍、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、100倍以上、或1000倍以上的KD值。
一个方式中，本发明的抗体与上述单离短链肽结合，与仅具有第2区域的肽和仅具有接头序列的肽中的任一者以显著的结合亲和性结合。
＜3＞主要与接头结合的抗体
一个方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽结合且可与scFv结合。一个方式中，本发明的抗体主要可与第1区域和接头中的任一者结合。一个方式中，本发明的抗体可以为与上述单离短链肽结合且主要与scFv的接头结合的抗体。主要与scFv的接头结合的抗体是指：在与某一scFv结合时，也与将第1和第2区域调换后的scFv结合的抗体，在实际的结合中，不需要仅与接头结合，可以也与第1或第2区域的接头所邻接的第1区域或第2区域的氨基酸结合。一个方式中，主要与scFv的接头结合的抗体可与由接头的氨基酸序列构成的肽结合。
一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号13～18和26～29的氨基酸序列的肽中的任一者结合且可与scFv结合。一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号13或14的氨基酸序列的肽结合且与scFv结合。一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号15～18的氨基酸序列的肽中的任一者结合且与scFv结合。一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号26～28的氨基酸序列的肽中的任一者结合且与scFv结合。一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号29的氨基酸序列的肽结合且与scv结合。
如实施例所示，通过使用具有接头与重链或轻链可变区的连接部分的氨基酸序列的肽免疫动物而获得抗体，即使在接头自身的免疫原性低的情况下，结果也能够得到主要与接头结合的抗体。
主要与接头结合的抗体也与将第1和第2区域调换后的scFv结合，另外，主要与接头结合的抗体也与第1和第2区域的序列不同的scFv结合，因此通用性高。
＜4＞与更具体的肽序列结合的抗体
一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号19所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号20所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号21所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号22所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号23所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号24所记载的氨基酸序列的肽。更优选的方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽中的任意一种以上和在部分结构中含有scFv的抗体片段结合。作为在部分结构中含有scFv的抗体片段，可列举含有上述scFv作为抗原结合性部分的所有蛋白质分子。具体而言，可列举作为在部分结构中含有scFv的抗体片段，没有特别限定，可列举例如CAR、IgG-scFv(在IgG分子的Fc区连接有scFv的分子)、scFv-Fc(抗体的可变区被置换为scFv的分子)、scFv2-Fc(抗体的可变区被置换为scFv且在Fc区连接有scFv的分子)、scFv-HSA-scFv(在人血清白蛋白的N末端和C末端分别连接有scFv的分子)、Fab-scFv-Fc(抗体的可变区分别被置换为Fab和scFv且在Fc区连接有Fab和scFv的分子)、Fab-scFv(在Fab连接有scFv的分子)和BiTE(2个scFv连接而成的分子)。
一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号50所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号51所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号52所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号53所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为序列号54。更优选的方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽中的任意一种以上和在部分结构中含有scFv的抗体片段结合。作为在部分结构中含有scFv的抗体片段，可列举含有上述scFv作为抗原结合性部分的所有蛋白质分子。
一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号55所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号56所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号57所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号58所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号59所记载的氨基酸序列的肽。更优选的方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽中的任意一种以上和在部分结构中含有scFv的抗体片段结合。作为在部分结构中含有scFv的抗体片段，可列举含有上述scFv作为抗原结合性部分的所有蛋白质分子。
一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号60所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号61所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号62所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号63所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号64所记载的氨基酸序列的肽。更优选的方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽中的任意一种以上和在部分结构中含有scFv的抗体片段结合。作为在部分结构中含有scFv的抗体片段，可列举含有上述scFv作为抗原结合性部分的所有蛋白质分子。
一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号65所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号66所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号67所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号68所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号69所记载的氨基酸序列的肽。更优选的方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽中的任意一种以上和在部分结构中含有scFv的抗体片段结合。作为在部分结构中含有scFv的抗体片段，可列举含有上述scFv作为抗原结合性部分的所有蛋白质分子。
一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号70所记载的氨基酸序列的肽。一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号71所记载的氨基酸序列的肽。更优选的方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽中的任意一种以上和在部分结构中含有scFv的抗体片段结合。作为在部分结构中含有scFv的抗体片段，可列举含有上述scFv作为抗原结合性部分的所有蛋白质分子。
一个优选方式中，单离短链肽可以为具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的肽。
一个优选方式中，本发明的抗体可与scFv结合。更优选的方式中，本发明的抗体可与在部分结构中含有scFv的抗体片段结合。在进一步优选的方式中，本发明的抗体可与CAR结合。
特别优选的方式中，本发明的抗体与scFv的第1区域的C末端侧的1～10个氨基酸的区域结合。特别优选的方式中，本发明的抗体与scFv的第2区域的N末端侧的1～10个氨基酸的区域。因此，特别优选的方式中，本发明的抗体不与含有接头序列(例如其全长)且不含scFv的第1区域的C末端侧的氨基酸的肽以及含有接头序列(例如其全长)且不含scFv的第2区域的N末端侧的氨基酸序列的肽结合或仅以弱结合亲和性结合。特别优选的方式中，本发明的抗体与scFv的第1区域的C末端侧的1～10个氨基酸的区域与接头的连接部结合，但是不与接头部分(例如其全长)结合或仅以弱结合亲和性结合。特别优选的方式中，本发明的抗体与接头与scFv的第2区域的连接部结合，但是不与接头部分(例如其全长)结合或仅以弱结合亲和性结合。弱结合亲和性可以是指：相对于对含有scFv的第1区域的C末端侧的1～10个氨基酸的区域和接头连接而成的氨基酸区域的肽的结合亲和性(KD值)，具有超过1倍、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、100倍以上、或1000倍以上的KD值。
一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号13～18和26～29的氨基酸序列的肽中的任一者结合且与scFv结合。一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号13或14的氨基酸序列的肽结合且与scFv结合。一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号15～18的氨基酸序列的肽中的任一者结合且与scFv结合。一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号26～28的氨基酸序列的肽中的任一者结合且与scFv结合。一个方式中，本发明的抗体可与具有序列号29的氨基酸序列的肽结合且与scFv结合。一个方式中，可以是指：相对于对由scFv的第1区域的C末端侧的1～10个氨基酸的区域或第2区域的N末端侧的1～10个氨基酸的区域构成的肽的结合亲和性(KD值)，对由接头构成的肽的结合亲和性(KD值)例如为小于1倍、1/10以下、1/100以下、1/1000以下、10-4倍以下、10-5倍以下、10-6倍以下、10-7倍以下、10-8倍以下、10-9倍以下、10-10倍以下、10-11倍以下、或10-12倍以下。
一个优选方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽和scFv结合。更优选的方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽和在部分结构中含有scFv的抗体片段(特别是其scFv部分)结合。作为在部分结构中含有scFv的抗体片段，可列举含有上述scFv作为抗原结合性部分的所有蛋白质分子。在进一步优选的方式中，本发明的抗体可与上述单离短链肽和CAR(特别是其scFv部分)结合。
一个方式中，本发明的抗体为与scFv结合的抗体，其可以为：
(i)包含分别含有具有序列号91所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号95所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(ii)包含含有具有序列号92所记载的氨基酸序列的重链CDR1、具有序列号93所记载的氨基酸序列的重链CDR2和具有序列号94所记载的氨基酸序列的重链CDR3的重链可变区和含有具有序列号96所记载的氨基酸序列的轻链CDR1、具有序列号97所记载的氨基酸序列的轻链CDR2和具有序列号98所记载的氨基酸序列的轻链CDR3的轻链可变区的抗体；
(iii)包含分别含有具有序列号99所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号100所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(iv)包含含有具有序列号100所记载的氨基酸序列的重链CDR1、具有序列号101所记载的氨基酸序列的重链CDR2和具有序列号102所记载的氨基酸序列的重链CDR3的重链可变区和含有具有序列号104所记载的氨基酸序列的轻链CDR1、具有序列号105所记载的氨基酸序列的轻链CDR2和具有序列号106所记载的氨基酸序列的轻链CDR3的轻链可变区的抗体；
(v)包含分别含有具有序列号121所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号122所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(vi)包含分别含有具有序列号153所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号154所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(vii)含有具有序列号91所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号95所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(viii)含有具有序列号99所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号103所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(ix)含有具有序列号121所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号122所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(x)含有具有序列号153所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号154所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(xi)与上述(vii)、(viii)、(ix)、或(x)所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体；或
(xii)作为上述任一抗体、实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合的抗体。
这些抗体可以为非人抗体，优选可以为人源化抗体或人抗体。例如，给药于人的抗体优选为(xii)所记载的抗体，且为人源化抗体或人抗体。体外检查中使用的抗体可以为非人抗体，另外可以不具有(xii)所记载的特性。与(ix)所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体可以为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合的抗体。另外，与(x)所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体可以为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合的抗体。与(ix)所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体可以为实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。与(ix)所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体可以为实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。与(ix)所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体可以为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合且实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。另外，与(x)所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体可以为实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。与(ix)所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体可以为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合且实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。
一个方式中，本发明的抗体提供作为与VL-L1-VH型scFv结合的抗体：
(xv)含有具有序列号123～125所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号126～128所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(xv-2)含有具有序列号129～131所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号132～134所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(xv-3)含有具有序列号135～137所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号138～140所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(xv-4)含有具有序列号141～143所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号144～146所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(xv-5)含有具有序列号147～149所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号150～152所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(xvi)含有具有序列号155～157所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号158～160所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(xvi-2)含有具有序列号161～163所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号164～166所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(xvi-3)含有具有序列号167～169所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号170～172所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(xvi-4)含有具有序列号173～175所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号176～178所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(xvi-5)含有具有序列号179～181所分别记载的重链CDR1～3的重链可变区和具有序列号182～184所分别记载的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；或
(xvii)作为上述任一抗体、实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合的抗体。
这些抗体可以为非人抗体，优选可以为人源化抗体或人抗体。例如，给药于人的抗体优选为(xvii)所记载的抗体，且为人源化抗体或人抗体。体外检查中使用的抗体可以为非人抗体，另外可以不具有(xvii)所记载的特别规定。这些抗体优选为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合的抗体。这些抗体另外优选为实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。这些抗体更优选可以为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合且实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。
一个方式中，本发明的抗体提供与VL-L1-VH型scFv结合并且含有下述的抗体：
含有具有作为序列号121所记载的氨基酸序列的6～10个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号185所记载的氨基酸序列(TSY)的序列的重链CDR1、
具有作为序列号121所记载的氨基酸序列的5～16个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号186所记载的氨基酸序列(WNDGD)的序列的重链CDR2、和
具有作为序列号121所记载的氨基酸序列的8～9个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号187所记载的氨基酸序列(MNGYKD)的序列的重链CDR3的重链可变区；以及
含有具有作为序列号122所记载的氨基酸序列的6～11个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号188所记载的氨基酸序列(KRY)的序列的轻链CDR1、
具有作为序列号122所记载的氨基酸序列的3～10个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号189所记载的氨基酸序列(EDS)的序列的轻链CDR2、和
具有作为序列号122所记载的氨基酸序列的10～11个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号190所记载的氨基酸序列(HSTYSDDKLR)的序列的轻链CDR3的轻链可变区。
这些抗体可以为非人抗体，优选可以为人源化抗体或人抗体。例如，给药于人的抗体优选为(xvii)所记载的抗体，且为人源化抗体或人抗体。体外检查中使用的抗体可以为非人抗体，另外可以不具有(xvii)所记载的特别规定。这些抗体优选为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合的抗体。这些抗体另外优选为实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。这些抗体更优选可以为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合且实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。
一个方式中，本发明的抗体提供与VL-L1-VH型scFv结合并且含有下述的抗体：
含有具有作为序列号153所记载的氨基酸序列的6～8个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号191所记载的氨基酸序列(TSY)的序列的重链CDR1、
具有作为序列号153所记载的氨基酸序列的5～16个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号192所记载的氨基酸序列(YYDGD)的序列的重链CDR2、和
具有作为序列号153所记载的氨基酸序列的7～9个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号193所记载的氨基酸序列(SIGAED)的序列的重链CDR3的重链可变区；以及
具有作为序列号154所记载的氨基酸序列的6～11个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号194所记载的氨基酸序列(KRY)的序列的轻链CDR1、
具有作为序列号154所记载的氨基酸序列的3～10个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号195所记载的氨基酸序列(EDS)的序列的轻链CDR2、和
具有作为序列号154所记载的氨基酸序列的10～11个氨基酸长度的部分序列、且含有序列号196所记载的氨基酸序列(HSTYSDDKLR)的序列的轻链CDR3的轻链可变区。
这些抗体可以为非人抗体，优选可以为人源化抗体或人抗体。例如，给药于人的抗体优选为(xvii)所记载的抗体，且为人源化抗体或人抗体。体外检查中使用的抗体可以为非人抗体，另外可以不具有(xvii)所记载的特别规定。这些抗体优选为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合的抗体。这些抗体另外优选为实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。这些抗体更优选可以为实质上不与天然(生物体内)的免疫球蛋白结合且实质上不与VH-L1-VL型scFv结合的抗体。
VL-L1-VH型scFv表示依次含有VL、接头和VH且接头具有序列号29的氨基酸序列的scFv。VH-L1-VL型scFv表示依次含有VH、接头和VL且接头具有序列号29的氨基酸序列的scFv。
上述(i)、(iii)、(v)和(vi)中，CDR的氨基酸序列如上所述可通过Kabat、Chothia、AbM、contact、IMGT、Aho、Martin(Enhanced Chothia)等的方法来确定。作为上述(ii)、(iv)、(xv-2)和(xvi-2)中的CDR的氨基酸序列的一例，为通过Kabat确定的CDR的氨基酸序列，可优选使用通过Kabat确定的CDR。
本发明的抗体或其抗原结合性片段可包括相对于上述抗体具有选自由1～数个氨基酸的插入、缺失、添加和置换组成的组中的突变的抗体或其抗原结合性片段。一个实施方式中，提供含有与本发明的抗体或其抗原结合性片段中的至少1个CDR、至少2个、至少3个或3个以上CDR实质上一致的、至少1个CDR、至少2个、至少3个或3个以上CDR的抗体或其抗原结合性片段。另一实施方式中，包括具有与本发明的抗体或其抗原结合性片段中的或来自本发明的抗体或其抗原结合性片段的至少2个、3个、4个、5个、或6个CDR实质上一致的、至少2个、3个、4个、5个、或6个CDR的抗体。一个实施方式中，含有与本发明的抗体或其抗原结合性片段中的至少1个、2个、或3个CDR为至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个CDR。一个实施方式中，至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个CDR在本发明的抗体或其抗原结合性片段中的或来自本发明的抗体或其抗原结合性片段的至少1个、2个、3个、4个、5个、或6个CDR中含有至少1个插入、缺失、添加或置换。本发明的抗体或其抗原结合性片段可包括具有80％以上、85％以上、90％以上、或95％以上的氨基酸序列的一致性且具有抗体的抗原特异性的抗体或其抗原结合性片段。本发明的抗体或其抗原结合性片段可包括在6个CDR以外的区域中与上述抗体或其抗原结合片段具有80％以上、85％以上、90％以上、或95％以上的氨基酸序列的一致性且具有抗体的抗原特异性的抗体或其抗原结合性片段。
＜本发明的短链肽＞
根据本发明，可提供上述单离短链肽。单离短链肽可具有10～20个氨基酸长度、例如13～20个氨基酸长度。单离短链肽例如可具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列。在此，“单离”是指从scFv的其它区域分离。另外，“短链”例如是指最多具有50个氨基酸、优选30个氨基酸以下、更优选20个氨基酸以下的长度。一个优选方式中，从发挥scFv部分的免疫原性的观点出发，在单离短链肽中，包含与接头部分相比长1倍以上、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2.0倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上、2.9倍以上、或3倍以上的scFv的氨基酸序列的长度。
＜抗体的获得方法＞
抗体可以使用周知的方法来制作。例如，可通过将上述单离肽免疫于动物(例如小鼠、大鼠、兔等)而得到。单离肽可通过与作为载体蛋白的钥孔血蓝蛋白(KHL)连接来提高免疫原性。可根据需要进行两次以上追加免疫。由脾脏和淋巴结等淋巴组织获得抗体产生细胞，可得到产生单克隆抗体的细胞。产生单克隆抗体的细胞可通过使得到的抗体产生细胞与骨髓瘤进行细胞融合而得到杂交瘤，对杂交瘤进行单细胞克隆而得到。另外，单克隆抗体可以以该杂交瘤的培养上清形式得到。得到的单克隆抗体可供于确认与抗原的反应性的试验(例如ELISA)。得到的单克隆抗体另外可供于确认与scFv或含有scFv作为抗原结合部位的抗原结合性化合物的反应性的试验(例如ELISA)。得到的单克隆抗体另外可供于确认与CAR-T细胞的反应性的试验(例如流式细胞术)。通过这样进行，可以从抗体组中选择或鉴定满足以下(i)～(vi)中的至少一者的抗体：
{(i)与具有作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(ii)与具有作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(iii)与具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(iv)与具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(v)与作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域结合；和
(vi)与作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域结合}。由此可以选择与scFv结合的抗体。一个方式中，抗体组可以为与scFv结合的抗体组。优选方式中，抗体组可以为与上述单离短链肽中的任一者结合的抗体组。更优选的方式中，可以为与上述单离短链肽中的任一者结合、不与接头部分(例如其全长)结合或仅以弱结合亲和性结合的抗体组。
另外，一个方式中，提供一种方法，其包括下述步骤：
从抗体组中选择或鉴定与下述抗体中任一者竞争与scFv的结合且与scFv结合的抗体：
(b-iii)含有具有序列号91所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号95所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(b-iv)含有具有序列号99所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号103所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(b-xi)含有具有序列号121所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号122所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；和
(b-xii)含有具有序列号153所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号154所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。
一个方式中，抗体组可以为例如与scFv结合的抗体的组。一个方式中，抗体组可以为满足选自下述中的1种以上的抗体组，也可以为还满足与scFv结合这一条件的抗体组：
(i)与具有作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(ii)与具有作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，上述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(iii)与具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(iv)与具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(v)与作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域结合；和
(vi)与作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域结合。
一个方式中，抗体组可以为(iii)与具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合或(iv)与具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合的抗体组。
一个方式中，上述抗体(vii)对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性。
一个方式中，上述抗体(viii)对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv也显示显著的结合亲和性。
抗体对肽或scFv的结合亲和性例如可以通过ELISA等周知的方法来确定。抗体(vii)对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性这一点可以通过实施针对该scFv的ELISA和针对未调换的原scFv的ELISA来确定。抗体不与接头部分(例如其全长)结合或仅以弱结合亲和性结合的抗体这一点可以通过实施针对该接头部分的肽的ELISA、并且与针对上述单离肽中的任一者的ELISA结果进行比较来确定。由此，本公开中，可以基于抗体的结合特性而组合合适的分析系统，可以通过合适的分析系统来选择抗体。
对于所选择或鉴定出的抗体，可以推断编码其重链和轻链的核酸的序列和其氨基酸序列。编码抗体的重链和轻链的核酸的序列例如可以如下来推断：由产生抗体的细胞获得编码抗体的重链和轻链的mRNA，合成cDNA，对其序列进行解读，由此来推断各核酸序列。另外，可以由推断出的核酸序列来推断抗体的重链和轻链的氨基酸序列。可以由推断出的重链和轻链的氨基酸序列来推断重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。可以由重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列来推断重链CDR1～3和轻链CDR1～3的氨基酸序列。抗体可以使用常规方法利用基因重组技术由抗体产生细胞(例如中华仓鼠卵巢细胞(CHO))来产生。因此，本发明的方法可以还包括下述步骤：由包含编码包含所鉴定出的抗体的含有重链CDR1～3的重链可变区和含有所鉴定出的抗体的轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体的基因的抗体产生细胞来得到包含上述含有重链CDR1～3的重链可变区和含有轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体。
＜细胞的靶标化或检测细胞的方法＞
根据本发明，提供检测细胞的方法。所检测的细胞可以为表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。一个方式中，检测可以使用本发明的抗体来进行。具体而言，本发明的方法可包括下述步骤：使本发明的抗体与表达或认为表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞接触，形成抗体与细胞的复合体。复合体可以使用针对抗体的标记等来进行检测。检测可以使用流式细胞术来进行。
根据本发明，表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞可以为免疫细胞。免疫细胞可优选为T细胞或NK细胞。一个优选方式中，表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞可以为CAR-T细胞。
根据本发明，可提供用于检测scFv的试剂盒或检查试剂。另外，一个方式中，根据本发明，可提供用于检测表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的试剂盒或检查试剂，其含有本发明的抗体。试剂盒或检查试剂可以包含含有抗体的溶液。试剂盒或检查试剂可以包含含有抗体的溶液和用于检测scFv的试剂(例如进行了标记的二抗、反应缓冲液、封闭液和清洗液等)。试剂盒或检查试剂可以包含含有抗体的溶液和用于检测scFv的说明书。
本发明中，scFv的抗原可以为癌细胞中表达的抗原(例如癌抗原)。作为scFv的抗原，可以为例如选自由CD16、CD19、CD20、CD22、CD123、CD171、上皮生长因子受体(EGFR)、尤其是EGFRvIII、3型EGFR、de2-7EGFR和HER2、癌胚抗原(CEA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、CS1、NKG2D、NKp30、B7H6、MUC-16(CA125)、受体酪氨酸激酶用孤儿受体1(ROR-1)、GD3、GM2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、间皮素、IL13R、c-KIT、c-MET、NY-ESO-1、WT1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A10、HPV的E6、HPV的E7、CMV、AFP、PRAME、SSX2、KRAS、HER2和PD-L1组成的组中的1种以上。scFv的抗原另外可以为例如蛋白质性的标签。scFv的抗原例如可以为异硫氰酸荧光素(FITC)等荧光蛋白。
本发明中，CAR表达细胞除了表达CAR以外，还可以表达细胞因子。CAR表达细胞例如可以表达白介素-7(IL-7)和CCL19。优选方式中，CAR表达细胞可以为CAR表达T细胞。本发明中，CAR表达细胞可以出于细胞除去等目的而含有编码胸苷激酶(例如单纯疱疹病毒的胸苷激酶)的基因。表达胸苷激酶的细胞摄入更昔洛韦时使更昔洛韦磷酸化，从而产生强毒性，杀伤表达胸苷激酶的细胞。因此，利用该机制，例如可以除去或控制CAR表达细胞。
根据本发明，提供在生物体外或生物体内使细胞、抗体靶标化的方法。所靶标化的细胞可以为表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。一个方式中，细胞的靶标化可以使用本发明的抗体来进行。具体而言，本发明的方法可在给药了表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的对象中实施。对象可以在体内具有表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。因此，通过将本发明的抗体给药于该对象，可以在对象的体内使上述细胞靶标化。本发明的抗体可控制被靶标化的细胞的功能。例如，本发明的抗体可通过抑制CAR-T细胞与靶抗原的结合而降低CAR-T细胞的功能。
被靶标化的抗体可以为上述单离单链肽中的任意一种以上以及在部分结构中含有scFv的抗体或其片段。一个方式中，抗体的靶标化可以使用本发明的抗体来进行。具体而言，本发明的方法可以在给药了经靶标化的抗体的对象中实施。通过将本发明的抗体给药于该对象，可以在对象的体内使上述单离单链肽中的任意一种以上以及在部分结构中含有scFv的抗体或其片段靶标化。本发明的抗体可控制被靶标化的抗体的功能。例如，本发明的抗体可通过抑制被靶标化的抗体与其抗原的结合来降低被靶标化的抗体的功能。
将本发明的抗体用于细胞、抗体的靶标化时，也可以在本发明的抗体上结合其它药物、试剂而将所述药物、试剂递送至被靶标化的细胞或抗体或其治疗靶点。结合在本发明的抗体上的药物、试剂没有特别限定，可列举使被靶标化的细胞、抗体自身的功能亢进或降低的化合物(例如细胞活化剂)、作用于被靶标化的细胞、抗体的治疗靶点的化合物、以可检测方式标记被靶标化的细胞或抗体或它们的治疗靶点的化合物等。
根据本发明，提供抗体制剂，其为用于在给药了表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的对象中将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞靶标化的抗体制剂，其含有本发明的抗体。
实施例
实施例1：与scFv的接头区结合的抗体的制作
本实施例中尝试制作与scFv的接头区结合的抗体。具体而言，如图1所示那样得到针对经单离的肽的抗体，所述经单离的肽位于依次含有第1区域、接头区和第2区域的scFv中的跨越第1区域和接头区的区域。第1区域和第2区域分别为抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)或者为轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。
scFv由同种型对照IgG的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)来设计第1区域和第2区域或者第2区域和第1区域。作为接头，使用具有序列号27(GGGGSGGGGSGGGGS)或序列号29(SSADDAKKDAAKKDDA KKDDAKKDG)所记载的氨基酸序列的接头。
以下实验中，VH-L1-VL表示依次含有VH、接头和VL且接头具有序列号29的氨基酸序列的scFv。VL-L1-VH表示依次含有VL、接头和VH且接头具有序列号29的氨基酸序列的scFv。另外，VH-L2-VL表示依次含有VH、接头和VL且接头具有序列号27的氨基酸序列的scFv。VL-L2-VH表示依次含有VL、接头和VH且接头具有序列号27的氨基酸序列的scFv。
针对接头的抗体不容易获得。例如，根据US2019/0092818A，对接头的氨基酸序列进行改造而变得容易获得抗体，得到了与具有该经改造的氨基酸序列的接头结合的抗体。本实施例的目的在于，直接使用现有的接头序列来得到通用性更高的抗体。因此，尝试用具有跨越第1区域和接头的部分的氨基酸序列的多肽进行免疫来获得抗体。具体而言，在第1区域的C末端侧的4或5个氨基酸的序列上连接接头序列而得到4种肽序列，并分别进行了合成。以下示出作为免疫原使用的单离肽的序列。
作为免疫原使用的肽的序列：
肽1(序列号22)：
肽2(序列号71)：
肽3(序列号21)：
肽4(序列号70)：
上述肽1和3中，下划线为重链可变区的C末端起5个氨基酸的区域的序列，肽2和4中，下划线为轻链可变区的C末端起4个氨基酸的区域。上述肽1和2中，斜体为序列号27的接头的N末端侧的6个氨基酸，上述肽3和4中，斜体为序列号29的接头的N末端侧的8个氨基酸。上述肽1～4的N末端添加有GG，C末端添加有C。这些氨基酸的N末端被乙酰基化。
化学合成了上述肽1～4，然后按照常规方法借助C末端所添加的C将作为载体蛋白的钥孔血蓝蛋白(KHL)与各肽缀合。将得到的肽缀合物免疫于大鼠的足垫，追加免疫是对尾根部进行免疫。从髂骨淋巴结单离淋巴细胞，供于与骨髓瘤的细胞融合。将得到的杂交瘤供于克隆。克隆利用甲基纤维素法，通过挑取单个集落而进行。将得到的杂交瘤播种于96孔板，在培养过程中边进行培养基交换边进行培养。对于得到的各克隆的培养上清，测试对scFv的结合。使用肽1进行免疫而得到的克隆的培养上清与瞬时表达scFv(VH-L2-VL)质粒(#530)的HEK293T细胞接触，使用肽2进行免疫而得到的克隆的培养上清与瞬时表达scFv(VL-L2-VL)质粒(#350)的HEK293T细胞接触，使用肽3进行免疫而得到的克隆的培养上清与瞬时表达scFv(VH-L1-VL)质粒(#602)的HEK293T细胞接触，使用肽4进行免疫而得到的克隆的培养上清与瞬时表达scFv(VL-L1-VH)质粒(#231)的HEK293T细胞接触，确认有无结合。作为阴性对照，使用未进行上述质粒转染的293T细胞。作为抗体的阳性对照，对于用肽1～3进行免疫而得到的克隆使用生物素化蛋白L，对于用肽4进行免疫而得到的克隆使用FITC-DEX。
从用肽4进行免疫而得到的杂交瘤所产生的抗体中选择对scFv的结合亲和性特别高的2D12、4B12和3A4。结合亲和性的测定结果如表3所示。表3中，数值越高则表示结合亲和性越强。
[表3]
表3：使用培养基上清的筛选结果
※VH-L1-VL为VH、接头和VL依次连接而成的scFv。
如此地进行，可以将设计在第1区域与接头的边界区域的单离肽作为免疫原来得到与scFv结合的抗体。这些抗体是当然与用作免疫原的单离肽(肽3)结合、而且与scFv也结合的抗体。
对选择的2D12、4B12和3A4进行单细胞克隆，再次确认对scFv的反应性。
[表4]
表4：单细胞克隆后的筛选结果
由2D12通过单细胞克隆获得D10、B3、B12、A10和D6。另外，由3A4通过单细胞克隆获得A10、H11、B11和D11。另外，由4B12获得了C5、C4和D4。这些克隆如表4所示均为产生与scFv结合的抗体的克隆。确认由这些克隆产生的抗体与含有scFv(VH-L1-VL型和VH-L2-VL)的CAR-T细胞的反应性。CAR分别使用与不同抗原结合的CAR。
使用的CAR如表5所记载。
[表5]
表5：用于确认与接头抗体的反应性的CAR-T细胞
编号 类型 CAR-T的结构
S#067 VL-L1-VH 人第2代(4-1BB)_hIL7_hCCL19_HSVtk
S#075 VL-L1-VH 人第2代(4-1BB)_hIL7_hCCL19_HSVtk
#231 VL-LI-VH 人第3代
S#031 VH-L1-VL 人第3代_hIL7_hCCL19_HSVtk
#673 VH-L1-VL 人第3代
S#017 VH-L2-VL 人第3代_hIL7_hCCL19_HSVtk
#530 VH-L2-VL 人第3代
在此，人第2代(4-1BB)为将scFv区域、CD8α的跨膜结构域、4-1BB结构域和CD3ζ结构域依次连接而成的分子，分别表示来自人的分子。人第3代为将scFv区域、CD8α的跨膜结构域、CD28结构域、4-1BB结构域和CD3ζ结构域依次连接而成的分子，分别表示来自人的分子。hIL7_hCCL19_HSVtk表示其为表达人IL-17和人CCL19且搭载有作为自杀基因的单纯疱疹病毒的胸苷激酶的细胞。上述自杀基因可以被更昔洛韦活化而杀伤CAR表达细胞。
表5的CAR-T所具有的scFv区域的第1区域的C末端(比CDR3靠近C末端侧)的序列如表6所记载。
[表6]
表6：CAR-T所具有的scFv区域的第1区域的C末端的氨基酸序列
编号 氨基酸序列 序列号
S#067 FGGGTKLEIK 72
S#075 FGGGTKVEIK 73
#231 FGGGTKLEIK 74
S#031 GQGTTVTVSS 75
#673 GQGTKVTVSA 76
S#017 WGQGTTLTVS 77
#530 GQGTLVTVSS 78
结果如图2所示。如图2所示，来自2D12的克隆B3、B12、A10和来自3A4的克隆A10对含有针对抗原D的VH-L1-VL型scFv的CAR-T细胞(S#031)显示反应性。这些克隆对针对含有抗原E的VH-L1-VL型scFv的CAR-T细胞(#673)也显示反应性。需要说明的是，任一抗体对于接头的氨基酸序列不同的VH-L2-VL型scFv(阴性对照、#530)均不显示显著的结合亲和性。由此认为，得到的抗体与接头或VH与接头的边界区域结合。
另外，确认了上述克隆所产生的抗体与含有各种VL-L1-VH型scFv的CAR-T细胞(S#067、S#075和#231)的反应性。结果如图3所示。如图3所示，任一克隆均与VL-L1-VH型的scFv和含有其的CAR-T细胞显示反应性。进而，对3A4-A10进一步进行单克隆，得到3个克隆，评价对表达scFv的CAR-T细胞的结合性。结果如图4所示。均良好地与VH-L1-VL型scFv结合，对含有VH-L2-VL型scFv的CAR-T细胞不显示显著的反应性。根据这些认为，得到的抗体主要与接头结合。
对于用肽4进行免疫而得到的抗体，确认与VL-L1-VH型scFv的结合性。从得到的杂交瘤所产生的抗体中选择对scFv的结合亲和性特别高的1H5、2C7、3E7和4B9。结合亲和性的测定结果如表7所示。表7中，数值越高则表示结合亲和性越强。
[表7]
表7：使用培养基上清的筛选结果
如此地进行，可以将设计在第1区域与接头的边界区域的单离肽作为免疫原而得到与scFv结合的抗体。这些抗体是当然与用作免疫原的单离肽(肽4)结合、而且与scFv也结合的抗体。
表8对3E7和4B9示出单细胞克隆后的对scFv的反应性。
[表8]
表8：单细胞克隆后的筛选结果
将代表性的结果示于图5。如图5所示，所研究的克隆对具有VL-L1-VH型scFv的CAR显示结合性，但另一方面，对具有VH-L1-VL型scFv的CAR仅微弱地显示结合性。由此认为，这些克隆跨越第1区域和接头而进行结合。
以下，在表9中示出各克隆对各CAR-T细胞上的CAR的反应性(％)。反应性通过用PE标记二抗检测结合于CAR的抗体来进行。反应性以相对于全部细胞的PE阳性细胞数形式求出。
[表9]
表9：抗体的反应性(％)
对于表9所示的CAR-T中在表6中未示出的CAR-T，将CAR-T所具有的scFv区域的第1区域的C末端(比CDR3靠近C末端侧)的序列示于表10。
[表10]
表10
编号 氨基酸序列 序列号
S#104 FGGGTKVEIK 107
S#085 FGGGTKLEIK 108
S#050 GQGTLVTVSS 109
S#027 GAGTTVTVSS 110
#264 GQGTLVTVSA 111
#371 FGGGTKVEIK 112
S#066 FGGGTKLEIK 113
S#084 FGGGTKLEIK 114
S#074 FGGGTKLEIK 115
S#097 FGGGTKVEIK 116
S#076 GQGTLVTVSS 117
#628 GQGTTVTVSSGILGS 118
#651 GQGTLVTVSS 119
如表9所示，(i)面向scFv的可变区的恒定区和接头而制作的单克隆抗体能够不依赖于scFv的CDR区的氨基酸序列地与scFv结合。因此，所制作的单克隆抗体可成为不依赖于CDR区的氨基酸序列地广泛检测具有相同序列的各种scFv的抗体。另外，如表9所示，(ii)3E7-C1、4B9-B11克隆与VL-L1-VH结合，但不与VH和VL的配置调换后的scFv结合。这表明，这些抗体跨越VH/VL和接头而进行结合。这样的抗体可成为不依赖于scFv的CDR区的氨基酸序列地广泛检测具有相同序列的各种scFv的抗体。与这些抗体进行竞争的抗体也在与这些抗体相同的位置进行结合，可成为不依赖于scFv的CDR区的氨基酸序列地广泛检测具有相同序列的各种scFv的抗体。另外，像这些抗体这样跨越VH/VL和接头而进行结合的抗体不会非特异性地检测体系中的免疫球蛋白，可以在可特异性地检测目标CAR表达方面有用。
与此相对地，2D12-B12、3A4-A10-7克隆也与VH和VL的配置调换后的scFv结合，但是对将接头置换为其它接头的scFv不显示结合。这表明，这些克隆为主要与接头结合的抗体。表明：虽然不容易得到与接头结合的抗体，但是本发明中，通过使用与VH/VL的部分肽的融合肽，能够改善接头部分的免疫原性，能够高效地获得主要与接头结合的抗体。这样的抗体不依赖于scFv的CDR区的氨基酸序列，且与VH和VL的顺序无关，均能够广泛地检测scFv。
因此表明，本发明的抗体在能够不依赖于scFv的CDR区的氨基酸序列(不依赖于抗原)地检测scFv和含有scFv的CAR表达细胞方面是有益的。
进而，根据表9，针对VH-L1-VL和VL-L1-VH型scFv的抗体对具有不同接头的VH-L2-VL和VL-L2-VH型scFv几乎不显示反应。与此相对地，面向VL-L1-VH型scFv而制作的抗体对表达具有VL-L1-VH型scFv的CAR的CAR-T细胞显示强的反应性。另外，面向VH-L1-VL型scFv而制作的抗体对表达具有VH-L1-VL型scFv的CAR的CAR-T细胞显示强的反应性。
针对VL-L1-VH型scFv的抗体对VH-L1-VL型scFv几乎不显示反应性，因此认为不是仅与接头或VL结合的抗体，而是与VL与接头的连接部结合的抗体(特别是跨越VL和接头而进行结合的抗体)。这样，通过以VH或VL与接头的连接部作为免疫原，可以得到针对该连接部的抗体(或者跨越VL和接头而进行结合的抗体)。这样的针对连接部的抗体对各种scFv显示显著的反应性。另外，与VH部分或VL部分结合的抗体或与接头结合的抗体也可能是有益的。
对于2D12-B12抗体，由编码重链可变区和轻链可变区的mRNA合成cDNA，推断重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。其结果是，推断重链可变区具有序列号91所记载的氨基酸序列，轻链可变区具有序列号95所记载的氨基酸序列。通过Kabat编号系统(Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，1991，Bethesda：USDept.of Health and Human Services，PHS，NIH.)来推断重链CDR1～3(HCDR1～3)和轻链CDR1～3(LCDR1～3)的氨基酸序列。其结果是，推断HCDR1～3分别具有序列号92～94所记载的氨基酸序列，推断LCDR1～3分别具有序列号96～98所记载的氨基酸序列。
另外，对于3A4-A10-7，由编码重链可变区和轻链可变区的mRNA合成cDNA，推断重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。其结果是，推断重链可变区具有序列号99所记载的氨基酸序列、轻链可变区具有序列号103所记载的氨基酸序列。同样基于Kabat编号系统来推断重链CDR1～3(HCDR1～3)和轻链CDR1～3(LCDR1～3)的氨基酸序列。其结果是，推断HCDR1～3分别具有序列号100～102所记载的氨基酸序列，推断LCDR1～3分别具有序列号104～106所记载的氨基酸序列。
另外，对于3E7-C1，由编码重链可变区和轻链可变区的mRNA合成cDNA，推断重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。其结果是，推断重链可变区具有序列号121所记载的氨基酸序列、轻链可变区具有序列号122所记载的氨基酸序列。推断重链CDR1～3(HCDR1～3)和轻链CDR1～3(LCDR1～3)的氨基酸序列时，IMGT的情况下推断为序列号123～125和序列号126～128、Kabat的情况下推断为序列号129～131和序列号132～134、Chothia的情况下推断为序列号135～137和序列号138～140、Contact的情况下推断为序列号141～143和序列号144～146、AbM的情况下推断为序列号147～149和序列号150～152。可以将推断出的任一HCDR1～3和LCDR1～3的组合推断为3E7-C1的CDR。本领域技术人员可以适当选择CDR并制作具有与3E7-C1同样的结合特性的抗体。例如，可以基于Kabat等的编号制作具有与3E7-C1同样的结合特性的抗体。
另外，对于4B9-B11，由编码重链可变区和轻链可变区的mRNA合成cDNA，推断重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。其结果是重链可变区具有序列号153所记载的氨基酸序列、轻链可变区具有序列号154所记载的氨基酸序列。推断重链CDR1～3(HCDR1～3)和轻链CDR1～3(LCDR1～3)的氨基酸序列时，IMGT的情况下推断为序列号155～157和序列号158～160、Kabat的情况下推断为序列号161～163和序列号164～166、Chothia的情况下推断为序列号167～169和序列号170～172、Contact的情况下推断为序列号173～175和序列号176～178、AbM的情况下推断为序列号179～181和序列号182～184。可以将推断出的任一HCDR1～3和LCDR1～3的组合推断为4B9-B11的CDR。本领域技术人员可以适当选择CDR制作具有与4B9-B11同样的结合特性的抗体。例如，可以基于Kabat等的编号制作具有与4B9-B11同样的结合特性的抗体。
[表11-1]
表11：序列表
[表11-2]
[表11-3]
[表11-3]
[表11-4]
[表11-5]

Claims (21)

1.一种抗体，其为与含有第1区域、接头和第2区域的scFv结合的抗体，其中，
所述scFv中，从N末端侧向C末端侧依次配置有所述第1区域、所述接头和所述第2区域，
第1区域和第2区域分别为抗体的重链可变区和抗体的轻链可变区或者为抗体的轻链可变区和抗体的重链可变区，
所述抗体为满足以下(i)～(vi)中的至少一者的抗体：
(i)与具有(i-a)作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和(i-b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，所述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(ii)与具有(ii-a)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和(ii-b)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，所述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(iii)与具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(iv)与具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(v)与(v-a)作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和/或(v-b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域结合；以及
(vi)与(vi-a)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和/或(vi-b)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域结合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，(i)与具有(i-a)作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和(i-b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，所述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中，(ii)与具有(ii-a)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和(ii-b)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，所述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中，(iii)与具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中，(iv)与具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合。
6.根据权利要求1所述的抗体，其中，(v)与(v-a)作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和/或(v-b)作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域结合。
7.根据权利要求1所述的抗体，其中，(vi)与(vi-a)作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和/或(vi-b)作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域结合。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的抗体，其中，(vii)对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性。
9.根据权利要求1～7中任一项所述的抗体，其中，(viii)对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv也显示显著的结合亲和性。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的抗体，其与含有所述scFv的嵌合抗原受体(CAR)结合。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的抗体，其与表达含有所述scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞结合。
12.一种检测表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的方法，其包括使所述细胞与权利要求11所述的抗体接触的步骤。
13.一种用于检测表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的试剂盒或检查试剂，其含有权利要求11所述的抗体。
14.一种在对象中将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞靶标化的方法，其包括下述步骤：
将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞给药于对象；和
将权利要求11所述的抗体给药于对象。
15.一种抗体制剂，其为用于在给药了表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞的对象中将表达含有scFv的嵌合抗原受体(CAR)的细胞靶标化的抗体制剂，其含有权利要求11所述的抗体。
16.一种获得与scFv结合的抗体的方法，其中，
scFv含有第1区域、接头和第2区域，所述scFv中，从N末端侧向C末端侧依次配置有所述第1区域、所述接头和所述第2区域，第1区域和第2区域分别为抗体的重链可变区和抗体的轻链可变区或者为抗体的轻链可变区和抗体的重链可变区，
所述方法包括从抗体组中选择或鉴定作为与scFv结合的抗体且满足以下(i)～(vi)中的至少一者的抗体的步骤：
(i)与具有作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，所述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(ii)与具有作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域的氨基酸序列的经单离的肽结合，在此，所述经单离的肽具有13～20个氨基酸长度；
(iii)与具有序列号19、20、23和24中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(iv)与具有序列号19～24和50～71中任一者所记载的氨基酸序列的经单离的肽结合；
(v)与作为第1区域内的区域的、从第1区域的C末端起1～10个氨基酸的区域和作为与该区域相连的接头的部分区域的、从接头的N末端侧起1～10个氨基酸的区域结合；以及
(vi)与作为与第2区域相连的接头的部分区域的、从接头的C末端侧起1～10个氨基酸的区域和作为第2区域内的区域的、从第2区域的N末端起1～10个氨基酸的区域结合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，(vii)抗体对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv不显示显著的结合亲和性。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，(viii)抗体对重链可变区和轻链可变区的顺序调换后的scFv也显示显著的结合亲和性。
19.根据权利要求16～18中任一项所述的方法，其中，还包括使抗体产生细胞产生具有该筛选出的抗体的重链CDR1～3和轻链CDR1～3的氨基酸序列的抗体的步骤。
20.一种与scFv结合的抗体，其为：
(i)包含分别含有具有序列号91所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号95所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(ii)包含含有具有序列号92所记载的氨基酸序列的重链CDR1、具有序列号93所记载的氨基酸序列的重链CDR2和具有序列号94所记载的氨基酸序列的重链CDR3的重链可变区以及含有具有序列号96所记载的氨基酸序列的轻链CDR1、具有序列号97所记载的氨基酸序列的轻链CDR2和具有序列号98所记载的氨基酸序列的轻链CDR3的轻链可变区的抗体；
(iii)包含分别含有具有序列号99所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号100所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(iv)包含含有具有序列号100所记载的氨基酸序列的重链CDR1、具有序列号101所记载的氨基酸序列的重链CDR2和具有序列号102所记载的氨基酸序列的重链CDR3的重链可变区以及含有具有序列号104所记载的氨基酸序列的轻链CDR1、具有序列号105所记载的氨基酸序列的轻链CDR2和具有序列号106所记载的氨基酸序列的轻链CDR3的轻链可变区的抗体；
(v)包含分别含有具有序列号121所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号122所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(vi)包含分别含有具有序列号153所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号154所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(vii)含有具有序列号91所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号95所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(viii)含有具有序列号99所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号103所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(ix)含有具有序列号121所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号122所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(x)含有具有序列号153所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号154所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(xi)与上述(vii)、(viii)、(ix)和(x)中任一者所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体；
(xii)作为上述任一者的抗体的、与天然(生物体内)的免疫球蛋白实质上不结合的抗体；或
(xiii)与上述任一者所记载的抗体的氨基酸序列具有90％以上的一致性的抗体。
21.一种获得与scFv结合的抗体的方法，其包括从抗体组中选择或鉴定满足以下任一者且与scFv结合的抗体的步骤：
(i)包含分别含有具有序列号91所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号95所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(ii)包含含有具有序列号92所记载的氨基酸序列的重链CDR1、具有序列号93所记载的氨基酸序列的重链CDR2和具有序列号94所记载的氨基酸序列的重链CDR3的重链可变区以及含有具有序列号96所记载的氨基酸序列的轻链CDR1、具有序列号97所记载的氨基酸序列的轻链CDR2和具有序列号98所记载的氨基酸序列的轻链CDR3的轻链可变区的抗体；
(iii)包含分别含有具有序列号99所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号100所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(iv)包含含有具有序列号100所记载的氨基酸序列的重链CDR1、具有序列号101所记载的氨基酸序列的重链CDR2和具有序列号102所记载的氨基酸序列的重链CDR3的重链可变区以及含有具有序列号104所记载的氨基酸序列的轻链CDR1、具有序列号105所记载的氨基酸序列的轻链CDR2和具有序列号106所记载的氨基酸序列的轻链CDR3的轻链可变区的抗体；
(v)包含分别含有具有序列号121所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号122所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(vi)包含分别含有具有序列号153所记载的氨基酸序列的重链可变区的重链CDR1～3作为重链CDR1～3的重链可变区和分别含有具有序列号154所记载的氨基酸序列的轻链可变区的轻链CDR1～3作为轻链CDR1～3的轻链可变区的抗体；
(vii)含有具有序列号91所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号95所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(viii)含有具有序列号99所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号103所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(ix)含有具有序列号121所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号122所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(x)含有具有序列号153所记载的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号154所记载的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
(xi)与上述(vii)、(viii)、(ix)和(x)中任一者所记载的抗体竞争与scFv的结合的抗体；
(xii)作为上述任一者的抗体的、与天然(生物体内)的免疫球蛋白实质上不结合的抗体；和
(xiii)与上述任一者的抗体的氨基酸序列具有90％以上的一致性的抗体。
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