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CN116897166A - 抗GPRC5DxBCMAxCD3三特异性抗体及其用途 - Google Patents

抗GPRC5DxBCMAxCD3三特异性抗体及其用途 Download PDF

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CN116897166A
CN116897166A CN202280015788.6A CN202280015788A CN116897166A CN 116897166 A CN116897166 A CN 116897166A CN 202280015788 A CN202280015788 A CN 202280015788A CN 116897166 A CN116897166 A CN 116897166A
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antibody
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沈湾湾
李莉
王旋
朱陈娟
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Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
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Abstract

涉及三特异性抗原结合蛋白，更具体地，涉及包含特异性结合GPRC5D和BCMA两种肿瘤抗原和T细胞表面抗原CD3的三特异性抗体，以及包含其的药物组合物、制备方法和用途。

Description

抗GPRC5DxBCMAxCD3三特异性抗体及其用途 技术领域
本发明涉及三特异性抗原结合蛋白，更具体地，涉及包含特异性结合GPRC5D和BCMA两种肿瘤抗原和T细胞表面抗原CD3的三特异性抗体，以及包含其的药物组合物、制备方法和用途。
背景技术
T细胞双特异性抗体(BsAb)已经被用于肿瘤治疗。此类抗体可以在细胞毒性T淋巴细胞与肿瘤细胞之间形成突触，诱导肿瘤细胞破坏。BsAb通常涉及针对肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞表面抗原(也称作T细胞衔接抗原，TEA)的双重靶向。然而，基于BsAb的治疗策略典型地依赖于肿瘤相关抗原在待治疗的肿瘤细胞上的分布。这就导致治疗对于患者群体的选择性和治疗的局限性。此外，研究也显示，靶向单个TAA位点的治疗形式可能会因肿瘤的逃逸机制而引起疾病的复发，从而限制治疗的有效性。
已经提出了开发三特异性和/或四特异性抗体来有效募集免疫细胞到肿瘤部位和改善治疗的功效。为此，近年来，多种多价、多特异性抗体形式(format)被描述。然而，不同治疗产品在治疗功能性和治疗行为上的要求具有多样性，决定了并不存在可以适用于大多数不同期望分子组合的“最佳形式”。因此，在实现多特异性时，需要考虑多种因素，包括，例如不同靶抗原的空间分布或大小，以及肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原表达密度。在许多情况下，对于特定靶抗原组合有效的抗体形式，必须通过产生和比较不同的抗体形式的功能性来鉴定。
发明概述
由于GPRC5D和BCMA在肿瘤中的表达呈非相关性，本发明人提出，组合靶向GPRC5D和BCMA的多特异性抗体将既可以覆盖GPRC5D阳性肿瘤患者，也可以覆盖BCMA阳性肿瘤患者，同时可以避免由于单一抗原丢失带来的复发，从而达到提高患者覆盖率和改善治疗功效的目的。
为了实现这一目的，本发明人提出了靶向GPRC5D/BCMA/CD3的三特异性抗体，并对多种GPRC5DxBCMAxCD3format进行了深入研究。通过调节两种TAA抗原(GPRC5D及BCMA)和T细胞表面抗原(CD3)之间的组合方式和距离，调控T细胞衔接器(T cell engager)抗体在介导T细胞激活和杀伤效能中的作用，本发明人成功实现了多靶点组合，减少了多药联用的需求。在此基础，进一步地通过Fc段采用Knob-in-Hole技术，减少重链错配；并通过胞外氧化还原的手段，解决轻链错配的问题，本发明的抗体也具有良好的可制备性和良好的可成药性。
因此，在一方面，本发明提供了具有上述优势的三特异性Y型抗体分子，其包含特异性结合GPRC5D、BCMA和CD3的抗原结合位点，且包含：两个抗体臂、位于抗体臂C端的茎，以及缀合部件，其中所述缀合部件缀合在抗体臂和/或茎C端。
再一方面，本发明提供特异性结合GPRC5D的抗体分子，其包含选自如下的CDR序列组合：按照HCDR1,HCDR2,HCDR3,LCDR1,LCDR2,LCDR3的顺序，SEQ ID NO:1-6；7-12,13-18或19-24。本发明的抗体分子以高亲和力结合GPRC5D，并阻断细胞中由GPRC5D介导的信号传导。
再一方面，本发明也提供本发明抗体分子的编码核酸、载体和宿主细胞；以及本发明抗体分子的用途，尤其是治疗GPRC5D阳性和/或BCMA阳性肿瘤，例如多发性骨髓瘤的方法和用途。
附图简述
结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。
图1示意性显示：设计的Format_1,2,6和7的三特异性抗体分子的结构。
图2示意性显示，实施例中使用的对照双特异性抗体分子的结构。
图3显示，Jurkat-NFAT-Luc报告系统检测示例抗体Ts-F2-1和-2介导的T细胞激活。
图4显示，Jurkat-NFAT-Luc报告系统检测示例抗体Ts-F2-3以及Ts-F6介导的T细胞激活。
图5显示，Jurkat-NFAT-Luc报告系统检测示例抗体Ts-F2-4和5介导的T细胞激活(A-D)；和Jurkat-NFAT-Luc报告系统检测示例抗体Ts-F2-4、5和6介导的T细胞激活(E-F)。
图6显示，Jurkat-NFAT-Luc报告系统检测示例抗体Ts-F7-1和7-2介导的T细胞激活。
图7显示，Jurkat-NFAT-Luc报告系统检测示例抗体Ts-F7-3和7-4介导的T细胞激活。
图8显示，示例抗体介导的PBMC中CD4+T细胞的激活。
图9显示，示例抗体介导的PBMC中CD8+T细胞的激活(B)。
图10显示，示例抗体介导的PBMC对H929细胞的杀伤作用。
图11显示，示例抗体诱导的PBMC对NCl-H929细胞的杀伤过程伴随的细胞因子释放量。
图12显示，示例抗体在H929荷瘤人源化小鼠模型中的抑瘤作用。
图13显示，不同多发性骨髓瘤细胞表面的GPRC5D和BCMA表达水平。
发明详述
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。
术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指天然存在的包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域(为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。
术语“抗原结合片段”是比完整或完全抗体的氨基酸残基数要少的完整或完全抗体的一部分或一段，其能结合抗原或与完整抗体(即与抗原结合片段所来源的完整抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链Fv、双体抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb)。所述Fab片段是一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，例如，通过木瓜蛋白酶消化完全抗体能够获得Fab片段。此外，通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab')2，其为Fab’的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab')2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，由此将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的Fab片段(其它抗体片段的更详细的描述请参见：基础免疫学(Fundamental Immunology),W.E.Paul编辑,Raven Press,N.Y.(1993))。所述Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。另外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够使这两个结构域作为单条蛋白链产生的合成性连接肽连接，在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv。可以通过化学方法、重组DNA方法或蛋白酶消化法获得所述抗体片段。
如本文所用的术语“抗原结合位点”与“抗原结合结构域”可以互换使用，表示抗体分子中与抗原实际结合的区域。优选地，用于本发明抗体分子的抗原结合位点包括由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的VH/VL对，所述VH/VL对可以包含单一多肽链中或包含在分离的两条多肽链中。在优选的实施方案中，本发明的抗体分子包含至少一个特异结合GPRC5D的抗原结合位点、至少一个特异结合BCMA的抗原结合位点，以及至少一个特异结合CD3的抗原结合位点。在一个实施方案中，本发明抗体为三价三特异性抗体，或4价三特异性抗体，或6价三特异性抗体。
如本文所用，术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点中的每一个位点与相同抗原的相同表位结合。如本文所用，术语“多特异性”抗体指具有至少两个抗原结合位点的抗体，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。本文提供的抗体为针对GPRC5D、BCMA和CD3的三特异性抗体。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有一个重链可变区(VH)，也称作重链可变结构域，随后是三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条免疫球蛋白轻链具有一个轻链可变区(VL)，也称作轻链可变结构域，随后是一个轻链恒定结构域(CL)。免疫球蛋白的重链可以归属5个类别之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些类别可以进一步划分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。IgG免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和两个二聚化的Fc区组成。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区。在一些情况下，单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”，是抗体可变结构域中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR从N-端开始顺序编号，通常称作CDR1、CDR2和CDR3。位于抗体重链可变结构域内的CDR也称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构 域内的CDR则称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，可以采用本领域公知的多种方案确定其CDR序列，例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(国际免疫遗传学信息系统,万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义(North等，“A New Clustering of Antibody CDR Loop Con格式ions”，Journal of Molecular Biology，406，228-256(2011))。
例如，使用Kabat和Chothia编号的CDR区域的不同定义范围。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
CDR也可以基于与参考CDR序列具有相同的Kabat编号位置而确定。除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5 th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如，在天然抗体中，免疫球蛋白Fc 结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域)；或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。
术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，小鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始小鼠抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。
“人源化抗体”是一种保留非人类抗体(例如小鼠单克隆抗体)的抗原特异性反应性，同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人类抗原结合位点并且抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即，恒定区以及可变区中不参与结合的部分为人类抗体的相应部分)来实现。参见，例如Padlan,Anatomy of the antibody molecule，Mol.Immun.,1994，31:169-217。人类抗体工程化技术的其他例子包括但不限于US 5,766,886中公开的Xoma技术。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法测定。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(KD)代表，解离常数是解离速率常数和缔合速率常数(分别是kdis和kon)的比例。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。
氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％,85％,90％,95％,97％,98％或99％或更高。所述变体可以包含保守性修饰。
对于多肽序列，“保守性修饰”包括对多肽序列的置换、缺失或添加，它们导致某个氨基酸置换为化学上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。这类保守性修饰的变体相对于本发明的多态性变体、物种间同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它们。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨 酸(M)(参阅例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“个体”或“受试者”可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。
术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“抗肿瘤作用”或抑瘤作用指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“GPRC5D”指肿瘤相关抗原G蛋白偶联受体家族C组5成员D(例如，登录号UniProt Q9NZD1下的人GPRC5D蛋白)。在本文中，“针对GPRC5D的抗原结合特异性”是指特异性结合GPRC5D的抗体或抗体片段，例如scFv或Fab。在一个实施方案中，通过流式细胞术检测，本发明抗体分子中结合GPRC5D的抗原结合位点可以对表达GPRC5D的细胞具有高亲和力结合活性，例如，1-100nM,如20-60nM的EC50值。在一个实施方案中，所述抗原结合特异性对人和猴GPRC5D具有交叉反应性。
术语“BCMA”指肿瘤相关抗原B细胞成熟抗原，也称为BCMA，TR17_人,TNFRSF17(例如，登录号UniProt Q02223下的人BCMA蛋白)。在本文中，“针对BCMA的抗原结合特异性”是指特异性结合BCMA的抗体或抗体片段，例如scFv或Fab。在一个实施方案中，通过生物膜层光学干涉技术检测，本发明抗体分子中结合BCMA的抗原结合位点可以对BCMA具有高亲和力结合活性，例如，0.1-10nM,如0.1-5nM的KD值。在一个实施方案中，所述抗原结合特异性对人和猴BCMA具有交叉反应性。
术语“CD3”指T细胞衔接抗原T细胞表面糖蛋白CD3(例如，登录号UniProt P07766下的人CD3蛋白)。在本文中，“针对CD3的抗原结合特异性”是指特异性结合CD3的抗体或抗体片段，例如scFv或Fab。在一个实施方案中，通过生物膜层光学干涉技术检测，本发明抗体分子中结合CD3的抗原 结合位点可以对CD3epsilon链具有高亲和力结合活性，例如，1-50nM,如0.1-5nM的KD值。优选地，在本发明三特异性抗体分子中，使用高亲和力CD3抗原结合位点，例如具有小于50nM的KD值。在一个实施方案中，所述抗原结合特异性对人和猴CD3具有交叉反应性。
在描述本发明抗体结构时，术语“N端”指N端的最末氨基酸，术语“C端”指C端的最末氨基酸。
“knob-in-hole”突变或“结入扣”突变在本文中用于指，利用“结入扣”技术，在第一Fc多肽和第二Fc多肽中分别引入突变，以在第一Fc多肽的界面上与在第二Fc多肽的界面上形成凸起(“结(knob)”)和互补的空穴(“扣(hole)”)。本领域已知，“结入扣”技术可在抗体分子的不同链之间改造界面，以促进抗体分子的各链正确缔合。通常，该技术涉及在一条链的界面引入“凸起”，在欲与之配对的另一条链的界面引入相应的“空穴”，使得凸起可置于空穴中。一个优选的界面包含一条链的重链恒定结构域的CH3结构域和欲与之配对的另一条链的重链恒定结构域的CH3结构域。可通过将来自一条链的重链恒定结构域的CH3结构域的界面的小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)来构建凸起。通过将大氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)，在欲配对的另一条链的重链恒定结构域的CH3结构域的界面构建与凸起相同或相似大小的补偿性空穴。另一可选的界面是上文所述Fab片段的包含轻链的CL结构域和重链的CH1结构域，通过构建凸起-空穴相互作用促进Fab片段的两条链之间发生正确的异二聚化。
“单链可变片段”或“scFv”在本文中用于指，包含由接头连接的重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL的单链抗体片段，其中VH和VL配对形成抗原结合位点。“二硫键稳定的单链可变片段”或“dsscFv”在本文中用于指，经二硫键稳定化的单链可变片段，其中，通过人为地将半胱氨酸突变引入VH结构域和VL结构域中，所述scFv片段在VH和VL结构域之间形成二硫键连接。
“Fv片段”在本文中用于指，包含重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL的抗体片段。“二硫键稳定的可变片段”或“dsFv”在本文中用于指，通过在VH和VL结构域之间人为引入的二硫键来稳定的Fv片段。
“单域抗体”或“sdAb”在本文中用于指，由单个可变抗体结构域，例如由VH或VL组成的抗体片段，例如衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、衍生自鱼类IgNAR的VH样单结构域(v-NAR)。单域抗体的单个可变结构域不需要与另一可变结构域相互作用以识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括源自骆驼科(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的单结构域抗体。
“Fab片段”或“Fab”在本文中用于指，由两条多肽链组成的、包含免疫球蛋白重链可变结构域VH、重链恒定结构域CH1、轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL的免疫球蛋白片段，其中，一条多肽链从N端到C端包含VH和选自CH1和CL的一个恒定区，另一条多肽链从N端到C端包含VL和选自CL和CH1的另一恒定区，其中所述VH结构域和VL结构域配对形成抗原结合位点。在本文中，当Fab的一条多肽链包含与CL连接的VH且另一多肽链包含与CH1连接的VL时，该Fab也称作crossFab。
在本文中，“单链Fab”或“scFab”用于指，将Fab片段的两条链通过接头连接而形成的单链多肽。
在本发明的一些实施方案中，本发明抗体可以包含选自以下的Fab片段：(i)由包含VH-CH1的一条链与包含VL-CL的一条链组成的Fab；和(ii)由包含VH-CL的一条链和包含VL-CH1的一条链组成的crossFab。在本发明的另一些实施方案中，本发明抗体可以包含选自以下的单链Fab片段：(i)包含VH-CH1-接头-VL-CL的单链Fab；和(ii)包含VH-CL-接头-VL-CH1的单链Fab。
在本文中，免疫球蛋白恒定结构域可以根据抗体分子的预期功能进行选择。例如，恒定结构域 可以是IgA,IgD,IgE,IgG或IgM结构域，尤其是人IgG的免疫球蛋白恒定结构域，例如，人IgG1，IgG2,IgG3或IgG4的恒定结构域，优选人IgG1的恒定结构域。作为一个例子，抗体的Fab片段可以包含来自IgG1的CH和CL恒定结构域。作为再一例子，抗体的Fc区可以包含来自IgG1的CH2和CH3结构域。
在本文中，术语“柔性连接肽”或“连接肽”或“接头”是指由氨基酸组成的短氨基酸序列，例如单独或组合使用的甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)和/或苏氨酸残基(T)，或来自免疫球蛋白的铰链区。在一个实施方案中，连接肽具有5-50个氨基酸长度，例如，10,15,20,25,30个氨基酸长度。在一个实施方案中，连接肽包含氨基酸序列(G4S)n，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2,3,4,5,6或7的整数。在一个实施方案中，连接肽包含氨基酸序列TS(G4S)n,其中n是等于或大于1的整数，例如，n是2,3,4,5,6或7的整数。在再一实施方案中，连接肽为来自免疫球蛋白的铰链区，例如包含“CPPC”的铰链区氨基酸序列，例如，氨基酸序列“EPKSCDKTHTCPPCP”(SEQ ID NO:114)或“EPKSSDKTHTCPPCP”(SEQ ID NO:115)。可以用于本发明抗体分子连接各结构域的连接肽还可以是，例如但不限于，如下氨基酸序列：GGG(SEQ ID NO:116)；DGGGS(SEQ ID NO:117)；TGEKP(SEQ ID NO:118)；GGRR(SEQ ID NO:119)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:120)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:121)；GGRRGGGS(SEQ ID NO:122)；LRQRDGERP(SEQ ID NO:123)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO:124)；和GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:125)。或者，可以使用计算机程序模拟蛋白和肽的三维结构，或通过噬菌体展示方法，来合理地设计合适的柔性连接肽。
II.本发明的三特异性抗体分子
本发明的三特异性抗体分子为Y型抗体分子。在本文中，术语“Y型抗体分子”是指包含两条抗体臂与一个茎部的Y型结构抗体分子，其中两个抗体臂形成Y型结构的两个分支，并各自连接在由两个抗体Fc结构域配对形成的Y型结构的茎部上。一种典型的Y型抗体分子是免疫球蛋白IgG分子。免疫球蛋白IgG分子的Y型结构由三个区域组成：两个抗体臂(Fab)和一个茎部(Fc)，其中，富有弹性的铰链区(Hinge)将抗体的茎部(Fc)与抗体臂(Fab)相连。在IgG分子中，两条臂可用于抗原的特异性结合，而茎部决定了抗体的型别和功能特性。在本文中，Y型抗体分子也涵盖与IgG分子具有相同或类似的Y型结构的分子，例如在抗体的抗体臂和/或茎上带有缀合部件的Y型分子。优选地，本发明的抗体分子是带有缀合部件的三特异性抗体分子。
在本发明的Y型抗体分子中，抗体臂可以由Fab、scFv、sdAB等抗原结合结构域构成，且构成两个抗体臂的抗原结合结构域可以靶向相同或不同的抗原和/或表位，具有相同或不同的结合特异性。在本发明的Y型抗体分子中，抗体分子的茎可以由配对的两个免疫球蛋白Fc结构域组成，其中所述Fc结构域可以各自独立地含有或不含有突变。当抗体分子为非对称IgG样分子时，优选地，茎部的两个Fc结构域包含利于其配对和二聚化的突变，例如，互补的“结入扣”突变。此外，茎部的Fc结构域也可以包含其它突变，例如半胱氨酸突变(以利于在第一Fc和第二Fc间形成二硫键连接)，电荷配对突变；和/或降低或消除效应子功能的突变(例如，降低或消除ADCC活性的突变，例如L234A/L235A突变组合)。本发明的Y型抗体分子的两个抗体臂可以直接或通过连接肽分别共价连接在茎的各一个Fc结构域上，优选地，臂通过免疫球蛋白的铰链区连接在茎Fc结构域上。
除了臂和茎外，本发明的Y型抗体分子还优选地包含缀合在臂和/或茎上的缀合部件，所述缀合部件包含额外的抗原结合结构域，例如Fab、scFv、sdAB，优选scFv。缀合部件中的抗原结合结构域可以赋予不同于抗体臂的抗原结合特异性。例如，Y型分子的两个抗体臂可以包含分别提供第 一和第二抗原结合特异性的抗原结合结构域，而Y型分子的缀合部件包含提供第三抗原结合特异性的抗原结合结构域，且第一、第二和第三抗原结合特异性各不相同。或者，Y型分子的两个抗体臂可以包含提供第一抗原结合特异性的抗原结合结构域，而Y型分子的缀合部件包含提供第二和第三抗原结合特异性的抗原结合结构域，且第一、第二和第三抗原结合特异性各不相同。
在本发明的Y型抗体分子中，第一、第二和第三抗原结合特异性为分别针对选自CD3、BCMA和GPRC5D的不同抗原结合特异性。例如，第一和第二抗原结合特异性可以分别针对选自GPRC5D和BCMA的不同肿瘤相关抗原(TAA)；第三抗原结合特异性可以针对T细胞表面抗原(TEA)CD3。或者，第一(或第二)和第三抗原结合特异性可以分别针对选自GPRC5D和BCMA的不同肿瘤相关抗原(TAA)，而第二(或第一)抗原结合特异性可以针对T细胞表面抗原(TEA)。
根据臂、茎和缀合部件的结构，本发明的Y型抗体分子可以包含至少2条多肽链，例如2条或4条多肽链。在本文中，包含茎Fc结构域的多肽链称作重链，对应地不包含Fc结构域的多肽链称作轻链。因此，在一些实施方案中，本发明的Y型分子是包含第一重链多肽链与第二重链多肽链的二链分子，在另一些实施方案中，本发明的Y型分子是包含两条重链多肽链和两条轻链多肽链的四链分子。在包含缀合部件的本发明Y型分子中，缀合部件可以缀合在抗体分子的重链多肽链上(例如茎部Fc结构域的C末端)，或可以缀合在抗体分子的轻链多肽链上(例如，包含Fab抗原结合位点的抗体臂的Fab轻链的C末端)。因此，例如，本发明抗体可以包含两条重链多肽链和两条轻链多肽链，其中第一重链和第一轻链配对形成抗体的一个抗体臂，第二重链和第二轻链配对形成抗体的另一抗体臂，且第一重链的Fc结构域和第二重链的Fc结构域配对形成抗体的茎，其中第一重链或第二重链在C端还包含形成抗体缀合部件的单链抗体片段(如scFv)，或第一轻链和第二轻链在C端还包含形成抗体缀合部件的单链抗体片段(如scFv)。
在一个方面，因此，本发明提供三特异性Y型抗体分子。本发明的Y型抗体分子具有下式的结构：
(M1:M2-(X1)p)-Fc::Fc-(X2)q， (式I)
其中，
M1和M2分别表示包含抗原结合位点的Y型抗体分子的第一抗体臂和第二抗体臂，其中第一抗体臂与第二抗体臂的抗原结合位点可以相同或不同；
Fc::Fc表示位于第一和第二抗体臂C端的Y型抗体分子的茎，由配对并二聚化的第一Fc结构域和第二Fc结构域组成；
X1表示缀合在抗体臂C端上的缀合部件，X2表示缀合在茎C端上的缀合部件，其中所述缀合部件包含抗原结合位点，其中缀合部件直接或通过连接肽缀合在抗体分子上；且
其中p和q分别表示0，1或2的整数，且p和q不同时为0，
其中，所述抗体通过抗体臂和缀合部件特异性结合GPRC5D、BCMA和CD3，
优选地，当第一抗体臂和第二抗体臂结合不同抗原时，p和q之一为0，其中抗体臂M1和M2提供第一和第二抗原结合特异性，缀合部件提供第三抗原结合特异性；或者
优选地，当第一抗体臂和第二抗体臂结合相同抗原时，p和q均不为0，其中抗体臂M1和M2提供第一抗原结合特异性，缀合部件X1和X2分别提供第二和第三抗原结合特异性。
在一些实施方案中，抗体分子的抗体臂(M1和M2)包含选自Fab或scFab(优选Fab)的抗原结 合位点，且p和q之一为0，其中抗体臂M1和M2分别结合第一和第二抗原，缀合部件(X1或X2)结合第三抗原，其中第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3，
优选地，当p＝0时，q＝1，缀合部件X2缀合在抗体分子茎的两个Fc结构域之一上；或
优选地，当q＝0时，p＝2，缀合部件X1缀合在抗体分子抗体臂M1和M2两者的Fab轻链上。
在一些实施方案中，抗体分子的抗体臂(M1和M2)包含选自Fab或scFab(优选Fab)的抗原结合位点，且p和q均不为0；其中抗体臂M1和M2结合相同的第一抗原，缀合部件X1和X2分别结合第二抗原和第三抗原，其中第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3，
优选地，p＝2且q＝2，其中缀合部件X1缀合在抗体分子抗体臂M1和M2两者的Fab轻链上；且缀合部件X2缀合在抗体分子茎的两个Fc结构域上。
在再一些实施方案中，抗体分子的抗体臂(M1和M2)包含选自scFv(优选dsscFv)的抗原结合位点，且p＝0，q＝1或2，其中抗体臂M1和M2分别结合第一和第二抗原，缀合部件X2结合第三抗原，其中第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3，
优选地，当p＝0时，q＝1，缀合部件X2缀合在抗体分子茎的两个Fc结构域之一的C末端。
在上述任一实施方案中，优选地，缀合部件包含选自scFv、dsFv和dsAb的抗原结合位点，优选地scFv，更优选dsscFv。
在上述任一实施方案中，优选地，第一Fc结构域和第二Fc结构域包含具有“CPPC”氨基酸残基的铰链区，由此，本发明抗体分子在第一和第二Fc结构域之间形成链间二硫键，以促成本发明的抗体分子的多肽链的正确配对。优选地，在本发明的抗体分子中，抗体臂通过Fc区的铰链区融合在Fc区的N端。
在上述任一实施方案中，优选地，缀合部件通过柔性连接肽缀合在抗体分子的茎和/或臂上。优选地，所述连接肽长5-15个氨基酸长度，例如10，12,15个氨基酸长度。优选地，所述链接肽包含氨基酸序列TS(G4S)n或(G4S)n，其中n＝1,2或3，优选地n＝2。
因此，在一些优选实施方案中，当式I的p和q之一为0时，本发明提供具有下式结构的IgG样抗体分子：
(M1:M2-(X1)p)-Fc::Fc-(X2)q， (式I)
其中，
M1和M2分别包含结合第一和第二抗原的Fab或scFab，优选Fab，
其中，当p＝0时，X2包含结合第三抗原的scFv，或者
当q＝0时，X1包含结合第三抗原的scFv,
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在再一些优选实施方案中，当式I的p＝0时，本发明提供具有下式结构的IgG样抗体分子：
(M1:M2)-Fc::Fc-(X2)q， (Format_2)
其中，
q＝1，
M1和M2分别包含结合第一和第二抗原的Fab或scFab，优选Fab，且
X2包含结合第三抗原的scFv，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在再一些优选实施方案中，当式I的q＝0时，本发明提供具有下式结构的IgG样抗体分子：
(M1:M2-(X1)p)-Fc::Fc， (Format_7)
其中，
p＝2，
M1和M2分别包含结合第一和第二抗原的Fab，且
X2包含结合第三抗原的scFv，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在再一些实施方案中，当式I的p＝2且q＝2时，本发明提供具有下式结构的IgG样抗体分子：
(M1:M2-(X1)p)-Fc::Fc-(X2)q， (Format_6)
其中，
M1和M2包含结合相同的第一抗原的Fab或scFab，优选Fab，且
X1和X2分别包含结合第二抗原和第三抗原的scFv，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在再一些实施方案中，当式I的p＝0且q＝1时，本发明提供具有下式结构的IgG样抗体分子：
(M1:M2)-Fc::Fc-X2， (Format_1)
其中，
M1和M2和X2分别包含结合第一、第二、和第三抗原的scFv，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
以下分别对构成本发明三特异性抗体分子的抗体臂、缀合部件和茎作出进一步详细描述。本领域技术人员明了，这些描述将适用于上述的本发明任何三特异性抗体分子，例如式I的分子、以及具有Format_1,2，6和7的结构的分子。
本发明抗体分子的抗体臂和缀合部件
本发明的抗体分子通过抗体臂和缀合部件的抗原结合位点，提供特异性地与第一、第二和第三抗原结合的抗原结合位点，其中第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：肿瘤相关抗原GRPC5D和肿瘤相关抗原BCMA以及T细胞衔接抗原CD3。
在一个实施方案中，本发明提供式I的抗体分子，其中，当p＝0或q＝0时，抗体的第一抗体臂和第二抗体臂分别提供第一和第二抗原结合位点，缀合部件提供第三抗原结合位点。
在另一实施方案中，本发明提供式I的抗体分子，其中，当p和q均不为0时，抗体的第一抗体臂和第二抗体臂提供第一抗原结合位点，且缀合在抗体臂C端上的缀合部件提供第二抗原结合位点、缀合在抗体茎上的缀合部件提供第三抗原结合位点。
可以用于本发明三特异性抗体分子的抗原结合位点(包括特异地结合GPRC5D,BCMA和CD3的 抗原结合位点)可以是包含能够结合目的抗原的任何抗体或抗体片段。例如，在本发明的式I抗体分子中，抗体臂和缀合部件中的抗原结合位点可以独立地是scFv,dsFv,Fab,scFab,或sdAb。优选地，在一些实施方案中，抗体臂的抗原结合位点选自：Fab和scFab，优选Fab。优选地，在另一些实施方案中，缀合部件的抗原结合位点选自：scFv,dsFv和dsAb,优选scFv，更优选二硫键稳定的scFv(即，dsscFv)。在更优选的一些实施方案中，抗体臂的抗原结构位点为Fab,且缀合部件的抗原结构位点为scFv，尤其是dsscFv。
在本文中，Fab_GPRC5D,Fab_BCMA和Fab_CD3分别用于表示结合GPRC5D、BCMA和CD3的Fab形式的抗原结合位点。在本文中，ScFv_GPRC5D,ScFv_BCMA和ScFv_CD3分别用于表示结合GPRC5D、BCMA和CD3的scFv形式的抗原结合位点。
在一些实施方案中，包含在本发明抗体分子中的Fab抗原结合位点由包含免疫球蛋白VH、CH1、VL和CL结构域的两条多肽链组成，其中所述VH和VL配对且所述CH1和CL配对以形成抗原结合位点。在一些实施方案中，在Fab中，一条链从N端到C端包含VH和CH1(即，VH-CH1)，另一条链从N端到C端包含VL和CL(即，VL-CL)。在另一些实施方案中，在Fab中，一条链从N端到C端包含VH和CL(即，VH-CL)，另一条链从N端到C端包含VL和CH1(即，VL-CH1)。在一些实施方案中，Fab构成本发明抗体分子的抗体臂的抗原结合位点。在所述实施方案中，所述Fab可以通过包含VH的链C端融合在抗体茎的Fc结构域的N端；或其中所述Fab通过包含VL的链的C端融合在抗体茎的Fc结构域的N端。优选地，所述Fab包含VH-CH1链和VL-CL链，并通过VH-CH1链的C末端与抗体茎Fc区结合。优选地，当本发明抗体分子包含缀合在抗体臂上的缀合部件时，所述缀合部件缀合在未与抗体茎连接的Fab链的C末端。在本文中，未与抗体茎连接的Fab链也称作Fab的轻链。因此，在一些实施方案中，本发明抗体分子具有缀合在抗体臂的Fab轻链的缀合部件。
在另一些实施方案中，包含在本发明抗体分子中的scFab抗原结合位点由包含免疫球蛋白VH、CH1、VL和CL结构域的一条多肽链组成，其中所述VH和VL配对且所述CH1和CL配对以形成抗原结合位点。在一些实施方案中，所述scFab从N端到C端包含：VH-CH1、接头、和VL-CL。在另一些实施方案中，所述scFab从N端到C端包含：VL-CL、接头、和VH-CH1。在再一些实施方案中，所述scFab从N端到C端包含：VH-CL、接头、和VL-CH1。在另一些实施方案中，所述scFab从N端到C端包含：VL-CH1、接头、和VH-CL。在一些实施方案中，scFab构成本发明抗体分子的抗体臂的抗原结合位点。在一些实施方案中，所述scFab通过其多肽链的C端融合在抗体茎的Fc结构域的N端。优选地，所述scFab从N端到C端包含：VL-CL、接头、和VH-CH1，并通过CH1结构域的C末端与抗体茎Fc区结合。优选地，当本发明抗体分子包含scFab抗体臂时，抗体分子的缀合部件仅缀合在抗体茎Fc结构域的C末端上。
在一些实施方案中，包含在本发明抗体分子中的Fab或scFab包含来自IgG免疫球蛋白的CH1结构域，例如，IgG1的CH1结构域，优选人IgG1的CH1结构域。在一些优选实施方案中，所述CH1结构域包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列、或与其具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含在本发明抗体分子中的Fab或scFab包含来自IgG 免疫球蛋白的kappa轻链恒定结构域，例如IgG1的CLκ结构域，优选人IgG1的的CLκ结构域。例如，所述Fab或scFab包含具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列，或与其至少90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的kappa轻链恒定结构域。在另一些实施方案中，包含在本发明抗体分子中的Fab或scFab包含来自IgG免疫球蛋白的lamda轻链恒定区，例如IgG1的CL λ结构域，优选人IgG1的CL λ结构域。例如，所述Fab包含具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列，或与其至少90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的lamda轻链恒定结构域。在一些实施方案中，当本发明的抗体分子的抗体臂M1和M2包含结合不同抗原的Fab或scFab(优选地Fab)时，抗体臂M1和抗体臂M2的Fab或scFab的轻链恒定结构域互不相同。例如，在一些实施方案中，抗体臂M1的Fab包含kappa轻链恒定结构域，抗体臂M2的Fab包含lamda轻链可变结构域；或抗体臂M1的Fab包含lamda轻链恒定结构域，抗体臂M2的Fab包含kappa轻链可变结构域。
在一些实施方案中，包含在本发明抗体分子中的scFv抗原结合位点由包含免疫球蛋白VH和VL结构域的一条多肽链组成，其中所述VH和VL通过接头连接以配对形成抗原结合位点。在一些实施方案中，所述scFv为反式构型，从N端到C端包含：VH、接头、和VL(VH-接头-VL)。在另一些实施方案中，所述scFv为顺式构型，从N端到C端包含：VL、接头、和VH(VH-接头-VL)。在一些实施方案中，接头为由氨基酸残基组成的肽接头。适宜的肽接头是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，接头为10-50个氨基酸长度，例如5-30个氨基酸长，例如15个氨基酸或20个氨基酸长度。在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列(G4S)n,其中n＝1,2,3,4或5，优选地，n＝3或4，更优选地，n＝4。
在一些实施方案中，scFv构成本发明抗体分子的抗体臂的抗原结合位点,并通过其多肽链的C端融合在抗体茎的Fc结构域的N端。
在另一些实施方案中，scFv构成本发明抗体分子的缀合部件的抗原结合位点。在一些实施方案中，所述scFv通过其多肽链的N端融合在抗体茎的C端和/或抗体臂的C端。优选地，本发明抗体分子中，抗体臂包含Fab，缀合部件包含scFv，其中，所述scFv通过其多肽链的N端融合在抗体茎Fc的C端和/或抗体臂Fab轻链的C端。
在一些优选的实施方案中，包含在本发明抗体分子中的scFv抗原结合位点为二硫键稳定的scFv，即，dsscFv。当抗原结合位点为dsscFv时，通过突变在scFv的VH和VL可变结构域之间引入的二硫键可以位于下列残基对之间(以下位置根据Kabat编号确定)：
VH的37位残基+VL的95位残基；VH的44位残基+VL的100位残基；VH的44位残基+VL的105位残基；VH的45位残基+VL的87位残基；VH的55位残基+VL的101位残基；VH的100位残基+VL的50位残基；VH的100b位残基+VL的49位残基；VH的98位残基+VL的46位残基；VH的105位残基+VL的43位残基；以及VH的106位残基+VL的57位残基。优选地，为形成dsscFv，半胱氨酸取代可以被引入VH的44位和VL的100位残基，从而在所述VH和VL配对时在两残基之间形成二硫键连接。
结合GPRC5D的抗原结合位点
可以用于本发明抗体分子的GPRC5D抗原结合位点可以是能够结合GPRC5D的任何抗体或抗体片段。例如，在本发明的抗体分子中，包含在抗体臂或缀合部件中的GPRC5D抗原结合位点可以独立地是scFv,dsFv,Fab,scFab,或sdAb，且优选是具有上面描述的scFv或Fab结构的抗原结合位 点。优选地，抗体臂的GPRC5D抗原结合位点选自：Fab和scFab，优选Fab。优选地，缀合部件的GPRC5D抗原结合位点选自：scFv,dsFv和dsAb,优选scFv，更优选二硫键稳定的scFv(即，dsscFv)。在一个更优选的实施方案中，抗体包含结合GPRC5D的抗体臂，且抗体臂的GPRC5D抗原结构位点为Fab；在另一更优选的实施方案中，抗体包含结合GPRC5D的缀合部件，且缀合部件的GPRC5D抗原结构位点为scFv，尤其是dsscFv。
在一些优选的实施方案中，结合GPRC5D的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的GPRC5D抗原结合位点，包含：
(i)如SEQ ID NO:25所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:26所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(ii)如SEQ ID NO:27所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:28所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(iii)如SEQ ID NO:29所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:30所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(iv)如SEQ ID NO:31所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:32所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(v)如SEQ ID NO:98所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:99所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(vi)如SEQ ID NO:100所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:101所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列。
在优选的一些实施方案中，结合GPRC5D的抗原结合位点，例如，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的GPRC5D抗原结合位点，包含选自如下的CDR序列组合：
(i)分别如SEQ ID NO:1-6所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
(ii)分别如SEQ ID NO:7-12所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
(iii)分别如SEQ ID NO:13-18所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
(iv)分别如SEQ ID NO:19-24所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
(v)分别如SEQ ID NO:13，110和15-18所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列。
或者，结合GPRC5D的所述抗原结合位点，例如，scFv或Fab,包含所述CDR序列组合之一的变体，其中所述变体在1、2、3、4、5或优选地6个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)，优选地重链CDR3保持不变。
在优选的一些实施方案中，结合GPRC5D的抗原结合位点，例如，具有上面描述的scFv或Fab结构的GPRC5D抗原结合位点，包含选自如下的重链可变结构域VH：
(a)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％ 或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；
(b)包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；
(c)包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；
(d)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；
(e)包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；
(f)包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域。
在优选的一些实施方案中，结合GPRC5D的抗原结合位点，例如，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的GPRC5D抗原结合位点，包含选自如下的轻链可变结构域VL：
(a)包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(b)包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(c)包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(d)包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(e)包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(f)包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在优选的一些实施方案中，结合GPRC5D的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的GPRC5D抗原结合位点，包含选自如下的VH和VL氨基酸序列组合：
(a)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(b)包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(c)包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与 其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(d)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(e)包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(f)包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在优选的一些实施方案中，结合GPRC5D的抗原结合位点，例如，具有上面描述的scFv或Fab结构的GPRC5D抗原结合位点，包含选自如下的VH和VL序列组合：
(i)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的轻链可变结构域，或者
(ii)包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变结构域，或者
(iii)包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的轻链可变结构域，或者
(iv)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(v)包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(vi)包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些优选的实施方案中，当结合GPRC5D的抗原结合位点是二硫键稳定的scFv时，所述scFv还在VH结构域的44位包含半胱氨酸取代并在VL结构域的100位包含半胱氨酸取代。
结合BCMA的抗原结合位点
可以用于本发明抗体分子的BCMA抗原结合位点可以是能够结合BCMA的任何抗体或抗体片段。例如，在本发明的抗体分子中，包含在抗体臂或缀合部件中的BCMA抗原结合位点可以独立地是scFv,dsFv,Fab,scFab,或sdAb，且优选是具有上面描述的scFv或Fab结构的抗原结构位点。优选地，抗体臂的BCMA抗原结合位点选自：Fab和scFab，优选Fab。优选地，缀合部件的BCMA抗原结合位点选自：scFv,dsFv和dsAb,优选scFv，更优选二硫键稳定的scFv(即，dsscFv)。在一个更优选的实施方案中，抗体包含结合BCMA的抗体臂，且抗体臂的BCMA抗原结构位点为Fab； 在另一更优选的实施方案中，抗体包含结合BCMA的缀合部件，且缀合部件的BCMA抗原结构位点为scFv，尤其是dsscFv。
在一些优选的实施方案中，结合BCMA的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的BCMA抗原结合位点，包含：如SEQ ID NO:39所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:40所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列。
在优选的一些实施方案中，结合BCMA的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的BCMA抗原结合位点,包含如下CDR序列组合：
-包含或由SEQ ID NO:33所示氨基酸序列组成的HCDR1；
-包含或由SEQ ID NO:34所示氨基酸序列组成的HCDR2；
-包含或由SEQ ID NO:35所示氨基酸序列组成的HCDR3；
-包含或由SEQ ID NO:36所示氨基酸序列组成的LCDR1；
-包含或由SEQ ID NO:37所示氨基酸序列组成的LCDR2；
-包含或由SEQ ID NO:38所示氨基酸序列组成的LCDR3，
或者，结合BCMA的所述抗原结合位点包含所述CDR序列组合之一的变体，其中所述变体在1、2、3、4、5或优选地6个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)，优选地重链CDR3保持不变。
在优选的一些实施方案中，结合BCMA的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的BCMA抗原结合位点,包含具有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域VH。
在优选的一些实施方案中，结合BCMA的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的BCMA抗原结合位点,包含具有SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域VL。
在优选的一些实施方案中，结合BCMA的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的BCMA抗原结合位点,包含具有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域VH；且包含具有SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域VL。
优选地，结合BCMA的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的BCMA抗原结合位点,包含具有SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的VL结构域。在一些优选的实施方案中，当结合BCMA的抗原结合位点是二硫键稳定的scFv时，所述scFv还在VH结构域的44位包含半胱氨酸取代并在VL结构域的100位包含半胱氨酸取代。
结合CD3的抗原结合位点
可以用于本发明抗体分子的CD3抗原结合位点可以是能够结合CD3的任何抗体或抗体片段。例如，在本发明的抗体分子中，包含在抗体臂或缀合部件中的CD3抗原结合位点可以独立地是scFv, dsFv,Fab,scFab,或sdAb，且优选是具有上面描述的scFv或Fab结构的抗原结构位点。优选地，抗体臂的CD3抗原结合位点选自：Fab和scFab，优选Fab。优选地，缀合部件的CD3抗原结合位点选自：scFv,dsFv和dsAb,优选scFv，更优选二硫键稳定的scFv(即，dsscFv)。在一个更优选的实施方案中，抗体包含结合GPRC5D的抗体臂，且抗体臂的CD3抗原结构位点为Fab；在另一更优选的实施方案中，抗体包含结合GPRC5D的缀合部件，且缀合部件的CD3抗原结构位点为scFv，尤其是dsscFv。
在一些优选的实施方案中，结合CD3的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的CD3抗原结合位点，包含：如SEQ ID NO:48所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:49所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列。
在另一些优选的实施方案中，结合CD3的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的CD3抗原结合位点，包含：如SEQ ID NO:50所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:49所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列。
在优选的一些实施方案中，结合CD3的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的CD3抗原结合位点,包含如下CDR序列组合：
-包含或由SEQ ID NO:41所示氨基酸序列组成的HCDR1；
-包含或由SEQ ID NO:42或47所示氨基酸序列组成的HCDR2；
-包含或由SEQ ID NO:43所示氨基酸序列组成的HCDR3；
-包含或由SEQ ID NO:44所示氨基酸序列组成的LCDR1；
-包含或由SEQ ID NO:45所示氨基酸序列组成的LCDR2；
-包含或由SEQ ID NO:46所示氨基酸序列组成的LCDR3，
或者，结合CD3的所述抗原结合位点包含所述CDR序列组合之一的变体，其中所述变体在1、2、3、4、5或优选地6个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)，优选地重链CDR3保持不变。
在优选的一些实施方案中，结合CD3的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的CD3抗原结合位点,包含具有SEQ ID NO:48或50所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域VH。
在优选的一些实施方案中，结合CD3的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的CD3抗原结合位点,包含具有SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域VL。
在优选的一些实施方案中，结合CD3的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的CD3抗原结合位点,包含具有SEQ ID NO:48或50所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域VH；且包含具有SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域VL。
优选地，结合CD3的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构的CD3抗原结合位点,包含具有SEQ ID NO:48或50所示的氨基酸序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的VL结构域。更优选地，结合CD3的抗原结合位点，例如具有上面描述的scFv或Fab结构 的CD3抗原结合位点,包含具有SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的VL结构域。在一些优选的实施方案中，当结合CD3的抗原结合位点是二硫键稳定的scFv时，所述scFv还在VH结构域的44位包含半胱氨酸取代并在VL结构域的100位包含半胱氨酸取代。
本发明抗体分子的茎
本发明抗体分子包含位于抗体臂的C端、由第一Fc结构域和第二Fc结构域形成的茎。在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域相同。在另一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域不同，两者配对并异二聚化。
适用于本发明抗体分子的Fc结构域片段可以是任何抗体Fc结构域。例如，本发明抗体的Fc结构域可以包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。优选地，本发明抗体的Fc结构域从N端到C端包含:CH2-CH3，更优选地从N端到C端包含：铰链区-CH2-CH3。
在本发明的抗体分子中，Fc结构域可以包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域)；或者包含源自IgM和IgE类抗体的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。在一些实施方案中，抗体分子的Fc结构域为来自IgG的Fc结构域，例如，IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域，优选地来自人IgG1的Fc结构域。
如本领域技术人员理解的，根据本发明抗体分子的预期用途，本发明抗体分子可以在Fc结构域中包含改变效应子功能的修饰。在一个实施方案中，本发明Fc结构域的一种或多种效应子功能相对于相同同种型的野生型Fc结构域已经被降低或消除。可以通过选自以下的任何方法来降低或消除Fc结构域的效应子功能：改变Fc结构域的糖基化、使用天然具有降低或消除的效应子功能的Fc同种型、和修饰Fc结构域的氨基酸序列。
在一个实施方案中，通过降低Fc结构域的糖基化来降低或消除效应子功能。本领域已知多种可以用于降低Fc结构域的糖基化的方法，包括但不限于：在不允许野生型糖基化的环境中生产本发明的抗体分子；除去Fc结构域上已经存在的碳水化合物基团；和修饰Fc结构域使得不发生野生型糖基化。在一个实施方案中，通过修饰Fc结构域来降低Fc结构域的糖基化，如在Fc结构域的位置297引入突变，使得该位置的野生型天冬酰胺残基被另一个干扰该位置糖基化的氨基酸替代，例如N297A突变。
在另一个实施方案中，通过修饰至少一个Fc结构域的氨基酸序列，来降低或消除效应子功能。所述Fc结构域修饰可以选自：在以下位置之一或多个上，引入损害Fc结构域与一种或多种Fc受体结合的点突变：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438和439；或者在选自以下位置引入损害C1q结合的点突变：270、322、329和321。
如本领域技术人员理解的，根据本发明抗体分子的预期用途，本发明抗体分子也可以在Fc结构域中包含改变对一种或多种Fc受体的结合亲和力的修饰。在一个实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体，特别地是人Fcγ受体。在一个实施方案中，所述修饰减少本发明抗体分子的效应子功能。在 一个具体实施方案中，所述效应子功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，本发明抗体分子的Fc结构域在第234和235位置(EU编号)包含氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是L234A和L235A(LALA突变)。在另一个实施方案中，本发明抗体分子的Fc结构域在第329位置(EU编号)包含氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是P329G。
如本领域技术人员理解的，当本发明抗体分子为非对称抗体分子时(例如Format_2和Format_7的抗体分子)，为了促进正确的非对称抗体分子形成，本发明抗体分子可以在第一和第二Fc结构域中包含利于第一Fc结构域与第二Fc结构域异二聚化的突变。例如，可以基于Knob-in-Hole技术，在第一Fc结构域和第二Fc结构域中引入互补的Knob突变和Hole突变。
因此，在一些实施方案中，本发明提供三特异性抗体分子，所述抗体分子在第一Fc结构域和第二Fc结构域中分别包含促进第一和第二Fc结构域配对并异二聚化的第一和第二异二聚化突变。在一些优选实施方案中，第一Fc结构域上的第一异二聚化突变包含Knob突变，第二Fc结构域的第二异二聚化突变包含与所述knob突变互补的Hole突变；或者，第一Fc结构域上的第一异二聚化突变包含Hole突变，第二Fc结构域的第二异二聚化突变包含与所述hole突变互补的Knob突变。在一些优选实施方案中，所述Knob突变为T366W，且所述互补的hole突变是T366S/L368A/Y407V。
在一个实施方案中，本发明提供三特异性抗体分子，其包含:
i)任选具有突变L234A和L235A的、人IgG1亚类的同二聚Fc-区，或
ii)任选具有突变P329G、S228P和L235E的、人IgG4亚类的同二聚Fc-区，或
iii)异二聚Fc-区，其中
a)一个Fc-区多肽包含突变T366W，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或
b)一个Fc-区多肽包含突变T366W和Y349C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一个Fc-区多肽包含突变T366W和S354C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或
iv)人IgG1亚类的异二聚Fc-区，其中两个Fc-区多肽都包含突变L234A和L235A，且
a)一个Fc-区多肽包含突变T366W，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或
b)一个Fc-区多肽包含突变T366W和Y349C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一个Fc-区多肽包含突变T366W和S354C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或
v)人IgG4亚类的异二聚Fc-区，其中两个Fc-区多肽都包含突变P329G、S228P和L235E，且
a)一个Fc-区多肽包含突变T366W，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或
b)一个Fc-区多肽包含突变T366W和Y349C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一个Fc-区多肽包含突变T366W和S354C，而另一个Fc-区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C。
在一些实施方案中,本发明抗体分子的Fc结构域还可以包含其他利于异源多聚化抗体纯化的突变。例如，可以将H435R突变引入第一和第二Fc结构域之一中(例如，带Hole突变的Fc结构域)，以利于使用蛋白A纯化目的异源多聚体抗体。
在本发明抗体分子中，抗体茎在Fc结构域的N端与抗体臂连接。如本领域技术人员明了的，适用于本发明抗体分子中连接抗体臂和茎部Fc结构域片段的连接肽可以是本领域已知的任何柔性连接肽。在一些实施方案中，连接肽可以包含来自IgG1的铰链区氨基酸序列，或可以包含选自以下的氨基酸序列：(GS)n,(GSGGS)n,(GGGGS)n,和(GGGS)n，其中n是至少1的整数。优选地，抗体茎通过来自IgG的铰链区(尤其是来自人IgG1的铰链区)与抗体臂连接。在一些实施方案中，对于包含铰链区的本发明异源多聚体抗体，可以在铰链区中引入突变，例如C220S，以利于目的异源多聚体抗体的形成。
示例性三特异性抗体分子
Format_2
在一些实施方案中，当p＝0且q＝1时，本发明抗体分子具有结构：(M1:M2)-Fc::Fc-(X2)q。由此，在所述的抗体分子上，仅具有缀合在茎上的缀合部件X2。在所述抗体分子中，优选地，抗体臂M1和M2包含分别结合第一抗原和第二抗原的Fab抗原结合位点，且缀合部件X2包含结合第三抗原的scFv抗原结合位点，其中第一、第二、第三抗原各不相同，且彼此独立地选自：GPRC5D、BCMA和CD3。
因此，在一些优选实施方案中，本发明提供了三特异性Y型抗体分子，所述抗体分子具有结构：
(M1:M2)-Fc::Fc-(X2)q， (Format_2)
其中，q＝1，
M1和M2分别表示抗体分子的第一抗体臂和第二抗体臂，且M1和M2分别包含结合第一和第二抗原的Fab或scFab，优选Fab，
Fc::Fc表示抗体分子的茎，由配对并二聚化的第一Fc结构域和第二Fc结构域组成，其中第一和第二抗体臂分别直接或通过连接肽(优选地铰链区)连接在第一Fc结构域和第二Fc结构域的N端；
X2表示缀合在茎C端上的缀合部件，其中所述缀合部件包含结合第三抗原的scFv，其中X2直接或通过连接肽缀合在第一Fc结构域的C端，或者缀合在第二Fc结构域的C端，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在一些实施方案中，本发明提供Format_2结构的三特异性抗体分子，其中：
(a):所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别包含结合GPRC5D的Fab和结合CD3的Fab且缀合部件X2包含结合BCMA的scFv，所述分子具有结构：
(Fab_GPRC5D:Fab_CD3)-Fc::Fc-(scFv_BCMA)；(例如实施例的Ts-F2-1,3-6分子)或者
(b):所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别包含结合BCMA的Fab和结合CD3的Fab且缀合部件X2包含结合GPRC5D的scFv，所述分子具有结构
(Fab_BCMA:Fab_CD3)-Fc::Fc-(scFv_GPRC5D)；(例如实施例Ts-F2-2的分子)或者
(c):所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别包含结合GPRC5D的Fab和结合BCMA的Fab且缀合部件X2包含结合CD3的scFv，所述分子具有结构：
(Fab_GPRC5D:Fab_BCMA)-Fc::Fc-(scFv_CD3)。
在上述本发明Format_2抗体分子的任何实施方案中，结合GPRC5D的Fab或scFv可以是特异结合GPRC5D的任何适宜Fab或scFv，例如上文描述的scFv或Fab结构的本发明GPRC5D抗原结合位点，尤其是具有上文所述VH和VL氨基酸序列的scFv或Fab。
在上述本发明Format_2抗体分子的任何实施方案中，结合BCMA的Fab或scFv可以是特异结合BCMA的任何适宜Fab或scFv，例如上文描述的scFv或Fab结构的本发明BCMA抗原结合位点，尤其是具有上文所述VH和VL氨基酸序列的scFv或Fab。
在上述本发明Format_2抗体分子的任何实施方案中，结合CD3的抗原结合位点可以是特异性结合CD3的任何适宜scFv或Fab，例如上文描述的scFv或Fab结构的本发明CD3抗原结合位点，尤其是具有上文所述VH和VL氨基酸序列的scFv或Fab。
在上述本发明Format_2抗体分子的任何实施方案中，抗体分子可以包含上文描述的适用于Format_2的任何本发明抗体茎结构。例如，在本发明的Format_2非对称三特异性抗体分子中，优选地，为了促进抗体分子多肽链的正确配对，可以在茎的第一Fc结构域和第二Fc结构域中引入利于第一和第二Fc结构域异二聚化的突变，尤其是互补“结入扣”突变，例如第一Fc结构域引入knob突变且第二Fc结构域引入互补的hole突变；或反之亦然，由此所述抗体分子的两个Fc结构域可以配对形成“结入扣”的稳定缔合。根据预期的用途，本发明的Format_2抗体分子的第一和/或第二Fc结构域优选地还可以包含影响抗体效应子功能的突变，例如，降低ADCC活性的突变，如LALA突变。
在一些实施方案中，本发明的Format_2三特异性抗体分子包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链从N端到C端包含：重链可变结构域VH、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域；
第一轻链多肽链从N端到C端包含：轻链可变结构域VL、免疫球蛋白CL结构域；
第二重链多肽链从N端到C端包含：重链可变结构域VH、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域；
第二轻链多肽链从N端到C端包含：轻链可变结构域VL、免疫球蛋白CL结构域；
且其中第一重链多肽链或第二重链多肽链还包含直接或优选地通过连接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)缀合在其Fc结构域C端的scFv结构域；
其中，
第一重链多肽链的VH-CH1与第一轻链多肽链的VL-CL配对形成结合第一抗原的第一抗体臂 (M1)；
第二重链多肽链的VH-CH1与第二轻链多肽链的VL-CL配对形成结合第二抗原的第二抗体臂(M1)；
第一重链多肽链的Fc结构域与第二重链多肽链的Fc结构域配对并二聚化形成抗体茎(Fc::Fc)；且
缀合在第一重链多肽链或第二重链多肽链C末端的scFv结构域形成结合第三抗原的缀合部件(X2)，
其中第一、第二和第三抗原各不相同，并彼此独立地选自：GPRC5D，BCMA，和CD3。
在一个的实施方案中，抗体臂M1结合GPCR5D，第二抗体臂M2结合CD3，缀合部件X2结合BCMA，由此，
-第一重链多肽链和第一轻链多肽链分别在N端包含特异性结合GPRCR5D的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列,
-第二重链多肽链和第二轻链多肽链分别在N端包含特异性结合CD3的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列，
其中，当缀合部件X2缀合在第一重链多肽链上时，第一重链多肽链在C端还包含特异结合BCMA的scFv的氨基酸序列，或者优选地，当缀合部件X2缀合在第二重链多肽链上时，第二重链多肽链在C端还包含特异结合BCMA的scFv的氨基酸序列。
在另一实施方案中，抗体臂M1结合BCMA，第二抗体臂M2结合CD3，缀合部件X2结合GPCR5D，由此，
-第一重链多肽链和第一轻链多肽链分别在N端包含特异性结合BCMA的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列,
-第二重链多肽链和第二轻链多肽链分别在N端包含特异性结合CD3的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列，
其中，当缀合部件X2缀合在第一重链多肽链上时，第一重链多肽链在C端还包含特异结合GPRCR5D的scFv氨基酸序列，或者优选地，当缀合部件X2缀合在第二重链多肽链上时，第二重链多肽链在C端还包含特异结合GPRCR5D的scFv的氨基酸序列。
在再一实施方案中，抗体臂M1结合GPCR5D，第二抗体臂M2结合BCMA，缀合部件X2结合CD3，由此，
-第一重链多肽链和第一轻链多肽链分别在N端包含特异性结合GPRCR5D的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列,
-第二重链多肽链和第二轻链多肽链分别在N端包含特异性结合BCMA的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列，
其中，当缀合部件X2缀合在第一重链多肽链上时，第一重链多肽链在C端还包含特异结合CD3的scFv氨基酸序列，或者当缀合部件X2缀合在第二重链多肽链上时，第二重链多肽链在C端还包含特异结合CD3的scFv的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，特异结合GPRC5D的Fab或scFv包含选自下组的VH和VL：
(a)包含SEQ ID NOs:1-3的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:4-6的LCDR1-3序列的VL；
(b)包含SEQ ID NOs:7-8的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:10-12的LCDR1-3序列的VL；
(c)包含SEQ ID NOs:13-15的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:16-18的LCDR1-3序列的VL；或
(d)包含SEQ ID NOs:19-21的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:22-24的LCDR1-3序列的VL；
优选地，所述Fab和所述scFv包含选自下组的VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:25/26,SEQ ID NOs:27/28,SEQ ID NOs:29/30,和SEQ ID NOs:31/32，
且优选地，当scFv为dsscFv时，还包含引入所述VH和VL序列中的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换。
在一个优选的实施方案中，所述特异结合CD3的Fab或scFv包含选自下组的VH和VL：
(a)包含SEQ ID NOs:41-43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序列的VL；或
(b)包含SEQ ID NOs:41,47,43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序列的VL；
优选地，所述Fab和scFv包含选自下组的VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:48/49,SEQ ID NOs:50/49,且更优选地SEQ ID NOs:48/49，
且优选地，当scFv为dsscFv时，还包含引入所述VH和VL序列中的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换。
在一个优选的实施方案中，所述特异结合BCMA的Fab或scFv包含如下VH和VL：
包含SEQ ID NOs:33-35的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs36-38的LCDR1-3序列的VL；
优选地，所述Fab和scFv包含VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:39/40，
且优选地，当scFv为dsscFv时，还包含引入所述VH和VL序列中的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换。
在一些优选实施方案中，第一轻链多肽链和第二轻链多肽链分别包含kappa轻链恒定结构域CLκ和lamda轻链恒定结构域CL λ。在一个具体的实施方案中，轻链恒定结构域CLκ包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；轻链恒定结构域CL λ包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些优选实施方案中，第一重链多肽链和第二重链多肽链包含来自人IgG1的重链恒定区CH1，优选地，包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些优选实施方案中，第一重链多肽链和第二重链多肽链分别包含含有knob或互补hole突 变的Fc结构域。在一个具体实施方案中，含有knob突变的Fc结构域包含T366W；含有互补hole突变的Fc结构域包含T366S,L368A,Y407V突变。在一个具体实施方案中，含有hole突变的Fc结构域包含选自SEQ ID NO:102和107的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；含有互补knob突变的Fc结构域包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_2结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:65的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_2结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:69的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_2结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:72的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_2结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:75的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:77或78的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_2结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:79的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
Format_7
在一些实施方案中，当q＝0且p＝2时，本发明抗体分子具有结构：(M1:M2-(X1)p)-Fc::Fc。由此，在所述的抗体分子上，仅具有缀合在抗体臂上的缀合部件X1。在所述抗体分子中，抗体臂M1和M2包含分别结合第一抗原和第二抗原的Fab抗原结合位点，且缀合部件X1包含结合第三抗原的scFv抗原结合位点，其中第一、第二、第三抗原各不相同，且彼此独立地选自：GPRC5D、BCMA和CD3。
因此，在一些优选实施方案中，本发明提供了三特异性Y型抗体分子，所述抗体分子具有结构：
(M1:M2-(X1)p)-Fc::Fc， (Format_7)
其中，p＝2，
M1和M2分别表示抗体分子的第一抗体臂和第二抗体臂，且M1和M2分别包含结合第一和第二抗原的Fab，
Fc::Fc表示抗体分子的茎，由配对并二聚化的第一Fc结构域和第二Fc结构域组成，其中第一和第二抗体臂分别直接或通过连接肽(优选地铰链区)连接在第一Fc结构域和第二Fc结构域的N端；
X1表示缀合在抗体臂C端上的缀合部件，其中所述缀合部件包含结合第三抗原的scFv，其中X1直接或通过连接肽缀合在第一和第二抗体臂的Fab轻链C端，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在一些实施方案中，本发明提供Format_7结构的三特异性抗体分子，其中：
(a):所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别包含结合GPRC5D的Fab和结合CD3的Fab且缀合部件X1包含结合BCMA的scFv，所述分子具有结构：
(Fab_GPRC5D:Fab_CD3-(scFv_BCMA) 2)-Fc::Fc；(例如，实施例Ts-F7-1,2,5的分子)或者
(b):所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别包含结合GPRC5D的Fab和结合BCMA的Fab且缀合部件X1包含结合CD3的scFv，所述分子具有结构：
(Fab_GPRC5D:Fab_BCMA-(scFv_CD3) 2)-Fc::Fc；(例如，实施例Ts-F7-3,4的分子)或者
(c)所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别包含结合BCMA的Fab和结合CD3的Fab且缀合部件X1包含结合GPRC5D的scFv，所述分子具有结构
(Fab_BCMA:Fab_CD3-(scFv_GPRC5D) 2)-Fc::Fc。
在上述本发明Format_7抗体分子的任何实施方案中，结合GPRC5D的Fab或scFv可以是特异结合GPRC5D的任何适宜Fab或scFv，例如上文描述的scFv或Fab结构的本发明GPRC5D抗原结合位点，尤其是具有上文所述VH和VL氨基酸序列的scFv或Fab。
在上述本发明Format_7抗体分子的任何实施方案中，结合BCMA的Fab或scFv可以是特异结合BCMA的任何适宜Fab或scFv，例如上文描述的scFv或Fab结构的本发明BCMA抗原结合位点，尤其是具有上文所述VH和VL氨基酸序列的scFv或Fab。
在上述本发明Format_7抗体分子的任何实施方案中，结合CD3的抗原结合位点可以是特异性结合CD3的任何适宜scFv或Fab，例如上文描述的scFv或Fab结构的本发明CD3抗原结合位点，尤其是具有上文所述VH和VL氨基酸序列的scFv或Fab。
在上述本发明Format_7抗体分子的任何实施方案中，抗体分子可以包含上文描述的适用于Format_7的任何本发明抗体茎结构。例如，在本发明的Format_7非对称三特异性抗体分子中，优选地，为了促进抗体分子多肽链的正确配对，可以在茎的第一Fc结构域和第二Fc结构域中引入利于第一和第二Fc结构域异二聚化的突变，尤其是互补“结入扣”突变，例如第一Fc结构域引入knob突变且第二Fc结构域引入互补的hole突变；或反之亦然，由此所述抗体分子的两个Fc结构域可以配对形成“结入扣”的稳定缔合。根据预期的用途，本发明的Format_7抗体分子的第一和/或第二Fc结构域优选地还可以包含影响抗体效应子功能的突变，例如，降低ADCC活性的突变，如LALA突变。
在一些实施方案中，本发明的Format_7三特异性抗体分子包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链从N端到C端包含：重链可变结构域VH、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域；
第一轻链多肽链从N端到C端包含：轻链可变结构域VL、免疫球蛋白CL结构域；
第二重链多肽链从N端到C端包含：重链可变结构域VH、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域；
第二轻链多肽链从N端到C端包含：轻链可变结构域VL、免疫球蛋白CL结构域；
且其中第一轻链多肽链和第二轻链多肽链还包含直接或优选地通过连接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)缀合在其CL结构域C端的scFv结构域；
其中，
第一重链多肽链的VH-CH1与第一轻链多肽链的VL-CL配对形成结合第一抗原的第一抗体臂(M1)；
第二重链多肽链的VH-CH1与第二轻链多肽链的VL-CL配对形成结合第二抗原的第二抗体臂(M1)；
第一重链多肽链的Fc结构域与第二重链多肽链的Fc结构域配对并二聚化形成抗体茎(Fc::Fc)；且
缀合在第一轻链多肽链和第二轻链多肽链C末端的scFv结构域形成结合第三抗原的缀合部件(X1)，
其中第一、第二和第三抗原各不相同，并彼此独立地选自：GPRC5D，BCMA，和CD3。
在一个的实施方案中，抗体臂M1结合GPCR5D，第二抗体臂M2结合CD3，缀合部件X1结合BCMA，由此，
-第一重链多肽链和第一轻链多肽链分别在N端包含特异性结合GPRCR5D的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列,
-第二重链多肽链和第二轻链多肽链分别在N端包含特异性结合CD3的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列，
且，第一轻链多肽链和第二轻链多肽链在C端还包含特异结合BCMA的scFv的氨基酸序列。
在一个的实施方案中，抗体臂M1结合BCMA，第二抗体臂M2结合CD3，缀合部件X1结合GPCR5D，由此，
-第一重链多肽链和第一轻链多肽链分别在N端包含特异性结合BCMA的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列,
-第二重链多肽链和第二轻链多肽链分别在N端包含特异性结合CD3的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列，
且，第一轻链多肽链和第二轻链多肽链在C端还包含特异结合GPRCR5D的scFv的氨基酸序列。
在一个的实施方案中，抗体臂M1结合GPCR5D，第二抗体臂M2结合BCMA，缀合部件X1结合CD3，由此，
-第一重链多肽链和第一轻链多肽链分别在N端包含特异性结合GPRCR5D的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列,
-第二重链多肽链和第二轻链多肽链分别在N端包含特异性结合BCMA的Fab抗原结合位点的VH和VL氨基酸序列，
且，第一轻链多肽链和第二轻链多肽链在C端还包含特异结合CD3的scFv的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，特异结合GPRC5D的Fab或scFv包含选自下组的VH和VL：
(a)包含SEQ ID NOs:1-3的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:4-6的LCDR1-3序列的VL；
(b)包含SEQ ID NOs:7-8的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:10-12的LCDR1-3序列的VL；
(c)包含SEQ ID NOs:13-15的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:16-18的LCDR1-3序列的VL；或
(d)包含SEQ ID NOs:19-21的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:22-24的LCDR1-3序列的VL；
优选地，所述Fab和所述scFv包含选自下组的VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:25/26,SEQ ID NOs:27/28,SEQ ID NOs:29/30,和SEQ ID NOs:31/32，
且优选地，当scFv为dsscFv时，还包含引入所述VH和VL序列中的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换。
在一个优选的实施方案中，所述特异结合CD3的Fab或scFv包含选自下组的VH和VL：
(a)包含SEQ ID NOs:41-43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序列的VL；或
(b)包含SEQ ID NOs:41,47,43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序列的VL；
优选地，所述Fab和scFv包含选自下组的VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:48/49,SEQ ID NOs:50/49,且更优选地SEQ ID NOs:48/49，
且优选地，当scFv为dsscFv时，还包含引入所述VH和VL序列中的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换。
在一个优选的实施方案中，所述特异结合BCMA的Fab或scFv包含如下VH和VL：
包含SEQ ID NOs:33-35的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs36-38的LCDR1-3序列的VL；
优选地，所述Fab和scFv包含VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:39/40，
且优选地，当scFv为dsscFv时，还包含引入所述VH和VL序列中的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换。
在一些实施方案中，第一轻链多肽链和第二轻链多肽链包含kappa轻链恒定结构域CLκ。在一些实施方案中，第一轻链多肽链和第二轻链多肽链包含lamda轻链恒定结构域CL λ。在一个具体的实施方案中，轻链恒定结构域CLκ包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，轻链恒定结构域CL λ包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些优选实施方案中，第一重链多肽链和第二重链多肽链包含来自人IgG1的重链恒定区CH1，优选地，包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些优选实施方案中，第一重链多肽链和第二重链多肽链分别包含含有knob或互补hole突变的Fc结构域。在一个具体实施方案中，含有knob突变的Fc结构域包含T366W；含有互补hole突变的Fc结构域包含T366S,L368A,Y407V突变。在一个具体实施方案中，含有knob突变的Fc结构域包含选自SEQ ID NO:102和107的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；含有互补hole突变的Fc结构域包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_7结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:77或78的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_7结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:90的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_7结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:92的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:93或96的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:95或97的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
Format_1
在一些实施方案中，当p＝0且q＝1时，本发明抗体分子具有结构：(M1:M2)-Fc::Fc-(X2)q，其中抗体臂M1和M2和缀合部件X2分别包含结合第一抗原、第二抗原和第三抗原的scFv抗原结合位点，其中第一、第二、第三抗原各不相同，且彼此独立地选自：GPRC5D、BCMA和CD3。
因此，在一些优选实施方案中，本发明提供了三特异性Y型抗体分子，所述抗体分子具有结构：
(M1:M2)-Fc::Fc-(X2)q， (Format_1)
其中，q＝1，
M1和M2分别表示抗体分子的第一抗体臂和第二抗体臂，且M1和M2分别包含结合第一和第二抗原的scFv，
Fc::Fc表示抗体分子的茎，由配对并二聚化的第一Fc结构域和第二Fc结构域组成，其中第一和第二抗体臂分别直接或通过连接肽(优选地铰链区)连接在第一Fc结构域和第二Fc结构域的N端；
X2表示缀合在茎C端上的缀合部件，其中所述缀合部件包含结合第三抗原的scFv，其中X2直接或通过连接肽缀合在第一Fc结构域的C端，或者缀合在第二Fc结构域的C端，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在一些实施方案中，本发明提供Format_1结构的三特异性抗体分子，其中：
(a):所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别包含结合GPRC5D的scFv和结合CD3的scFv且缀合部件X2包含结合BCMA的scFv，所述分子具有结构：
(scFv_GPRC5D:scFv_CD3)-Fc::Fc-(scFv_BCMA)；(例如，实施例Ts-F1-1的分子)或者
(b):所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别包含结合BCMA的scFv和结合CD3的scFv且缀合部件X2包含结合GPRC5D的scFv，所述分子具有结构
(scFv_BCMA:scFv_CD3)-Fc::Fc-(scFv_GPRC5D)；(例如，实施例Ts-F1-2的分子)。
在一些实施方案中，本发明的Format_1三特异性抗体分子包含或由第一重链多肽链和第二重链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链从N端到C端包含：第一scFv和Fc结构域；
第二重链多肽链从N端到C端包含：第二scFv和Fc结构域；
且其中第一重链多肽链或第二重链多肽链还包含直接或优选地通过连接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)缀合在其Fc结构域C端的第三scFv结构域；
其中，
第一重链多肽链的第一scFv形成结合第一抗原的第一抗体臂(M1)；
第二重链多肽链的第二scFv形成结合第二抗原的第二抗体臂(M1)；
第一重链多肽链的Fc结构域与第二重链多肽链的Fc结构域配对并二聚化形成抗体茎(Fc::Fc)；且
缀合在第一重链多肽链或第二重链多肽链C末端的第三scFv结构域形成结合第三抗原的缀合部件(X2)，
其中第一、第二和第三抗原各不相同，并彼此独立地选自：GPRC5D，BCMA，和CD3。
在一些实施方案中，本发明提供Format_1结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链和第二重链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:61的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_1结构的三特异性抗体分子，其包含或由第一重链多肽链和第二重链多肽链组成，其中，
第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:63的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
第二重链多肽链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
Format_6
在一些实施方案中，当p＝2且q＝2时，本发明抗体分子具有结构：(M1:M2-(X2)p)-Fc::Fc-(X2)q，其中抗体臂M1和M2包含结合第一抗原的Fab抗原结合位点、且缀合部件X1和X2分别包含结合第二抗原和第三抗原的scFv抗原结合位点，其中第一、第二、第三抗原各不相同，且彼此独立地选自：GPRC5D、BCMA和CD3。
因此，在一些优选实施方案中，本发明提供了三特异性对称Y型抗体分子，所述抗体分子具有结构：
(M1:M2-(X2)p)-Fc::Fc-(X2)q， (Format_6)
其中，p＝2且q＝2，
M1和M2分别表示抗体分子的第一抗体臂和第二抗体臂，且M1和M2均包含结合第一抗原的Fab，
Fc::Fc表示抗体分子的茎，由配对并二聚化的第一Fc结构域和第二Fc结构域组成，其中第一和第二抗体臂分别直接或通过连接肽(优选地铰链区)连接在第一Fc结构域和第二Fc结构域的N端；
X1和X2分别表示缀合在抗体臂Fab轻链C端或茎Fc结构域C端上的缀合部件，其中所述缀合部件X1包含结合第二抗原的scFv，所述缀合部件X2包含结合第三抗原的scFv，其中X1和X2直接或通过连接肽缀合在臂或茎上，
其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRCR5D、BCMA和CD3。
在一些实施方案中，本发明提供Format_6结构的三特异性抗体分子，其中：
(a)所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2包含结合GPRC5D的Fab，缀合部件X1包含CD3的scFv且缀合部件X2包含结合BCMA的scFv，所述分子具有结构：(Fab_GPRC5D:
Fab_GPRC5D-(scFv_CD3) 2)-Fc::Fc-(scFv_BCMA) 2；(例如，实施例Ts-F6-1,2的分子)或者
(b):所述分子的抗体臂M1和抗体臂M2包含结合BCMA的Fab，缀合部件X1包含CD3的scFv 且缀合部件X2包含结合GPRC5D的scFv，所述分子具有结构：(Fab_BCMA:Fab_BCMA-(scFv_CD3) 2)-Fc::Fc-(scFv_GPRC5D) 2；(例如，实施例Ts-F6-3,4的分子)。
在一些实施方案中，本发明的Format_6三特异性抗体分子包含或由两条相同的重链多肽链和两条相同的轻链多肽链组成，其中，
所述重链多肽链从N端到C端包含：重链可变结构域VH、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域、和第一scFv结构域；
所述轻链多肽链从N端到C端包含：轻链可变结构域VL、免疫球蛋白CL结构域和第二scFv结构域；
其中所述重链多肽链和轻链多肽链的第一和第二scFv结构域直接或优选地通过连接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)分别缀合在其C端；
其中，
一条重链多肽链N端的VH-CH1结构域与一条轻链多肽链N端的VL-CH1结构域配对形成结合第一抗原的第一抗体臂(M1)；
另一条重链多肽链N端的VH-CH1结构域与一条轻链多肽链N端的VL-CH1结构域配对形成结合第一抗原的第二抗体臂(M2)；
两条重链多肽链的Fc结构域配对形成并二聚化形成抗体茎(Fc::Fc)；且
缀合在两条轻链多肽链C末端的scFv结构域形成结合第二抗原的缀合部件(X1)，
缀合在两条重链多肽链C末端的scFv结构域形成结合第三抗原的缀合部件(X2)；
其中第一、第二和第三抗原各不相同，并彼此独立地选自：GPRC5D，BCMA，和CD3。
在一些实施方案中，本发明提供Format_6结构的三特异性抗体分子，其包含或由两条相同的重链多肽链和两条相同的轻链多肽链组成，其中，
所述重链多肽链包含：SEQ ID NO:81的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
所述轻链多肽链包含SEQ ID NO:82或83的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供Format_6结构的三特异性抗体分子，其包含或由两条相同的重链多肽链和两条相同的轻链多肽链组成，其中，
所述重链多肽链包含：SEQ ID NO:84的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；
所述轻链多肽链包含SEQ ID NO:85或86的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
III.本发明的GPRC5D抗体分子
在一方面，本发明提供特异性结合GPRCR5D的抗体或其抗原结合片段。在一些优选的实施方案中，本发明GPRC5D抗体或其抗原结合片段包含：
(i)如SEQ ID NO:25所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:26 所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(ii)如SEQ ID NO:27所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:28所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(iii)如SEQ ID NO:29所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:30所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(iv)如SEQ ID NO:31所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:32所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(v)如SEQ ID NO:98所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:99所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列，或者
(vi)如SEQ ID NO:100所示的重链可变结构域的HCDR1、2和3序列，以及如SEQ ID NO:101所示的轻链可变结构域的LCDR1、2和3序列。
在另一些实施方案中，本发明的GPRC5D抗体或其抗原结合片段包含选自如下的CDR序列组合：
(i)分别如SEQ ID NO:1-6所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
(ii)分别如SEQ ID NO:7-12所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
(iii)分别如SEQ ID NO:13-18所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
(iv)分别如SEQ ID NO:19-24所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
(v)分别如SEQ ID NO:13，110和18所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列。
在再一些实施方案中，本发明的GPRC5D抗体分子或其抗原结合片段包含选自如下的VH和VL氨基酸序列组合：
(a)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(b)包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(c)包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
(d)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(e)包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(f)包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。
优选地，本发明的GPRC5D抗体分子或其抗原结合片段包含选自如下的VH和VL氨基酸序列组合：
(i)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的轻链可变结构域，或者
(ii)包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的轻链可变结构域，或者
(iii)包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的轻链可变结构域，或者
(iv)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(v)包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列的轻链可变结构域；
(vi)包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，本发明GPRC5D抗体为单特异性抗体、双特异性抗体或三特异性抗体。在一些优选的实施方案中，本发明GPRC5D抗体为双特异性抗体，还包含结合CD3的抗原结合位点，例如上文描述的本发明CD3抗原结合位点。在另一些优选实施方案中，本发明GPRC5D抗体为三特异性抗体，还包含结合BCMA的抗原结合位点(例如上文描述的本发明BCMA抗原结合位点)和结合CD3的抗原结合位点(例如，上文描述的本发明CD3抗原结合位点)。
在一些实施方案中，本发明GPRC5D抗体是结合GPRC5D和CD3的双特异性抗体，
优选地，其中，所述抗体包含结合CD3的选自下组的VH和VL氨基酸序列对：
(a)包含SEQ ID NOs:41-43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序列的VL；或
(b)包含SEQ ID NOs:47,42,43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序 列的VL；
优选地，包含选自下组的VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:48/49,和SEQ ID NOs:50/49,
任选地，所述VH和VL序列中包含引入的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换，由此在所述VH和VL之间形成二硫键。
因此，在一个优选实施方案中，本发明提供结合GPRC5D和CD3的双特异性抗体，其中：所述抗体包含选自下组的结合GPRC5D的VH和VL氨基酸序列对和结合CD3的VH和VL氨基酸序列对的组合，
组合 结合GPRC5D的VH和VL氨基酸序列对 结合CD3的VH和VL氨基酸序列对
1 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49
2 SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49
3 SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49
4 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49
5 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:49
6 SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:49
7 SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:49
8 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:49
本发明也提供上述双特异性抗体的变体，其中所述变体在所述结合GPRC5D的VH和VL氨基酸序列对，和/或在所述结合CD3的VH和VL氨基酸序列对中包含氨基酸改变，例如氨基酸置换、缺失和/或插入，其中所述氨基酸改变不影响双特异性抗体对GPRC5D和CD3的结合。在一些实施方案中，所述变体包含选自如下的氨基酸序列组合，
在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含在所述结合GPRC5D的VH和VL氨基酸序列对，和/或在所述结合CD3的VH和VL氨基酸序列对中引入了半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换，由此在所述VH和VL之间形成二硫键。
本发明也提供包含本发明GPRC5D抗体的融合蛋白和免疫缀合物(例如与毒素或化学小分子缀合)、以及药物组合物和药物联合。在药物组合物或药物联合中，本发明的抗体可以包含另一治疗剂， 例如，可以用于本发明抗体的预期用途的另一治疗剂，例如化疗剂、放疗剂、抑瘤分子。
IV..本发明的抗体分子的生产和纯化
再一方面，本发明提供用于生产本发明抗体分子的方法，所述方法包括：在适于表达所述抗体的多肽链的条件下培养包含编码所述多肽链的宿主细胞；和在适于所述多肽链装配为所述抗体分子的条件下使多肽链装配产生所述抗体。
当本发明抗体分子为非对称抗体分子时，例如包含第一重链多肽链和第一轻链多肽链以及第二重链多肽链和第二轻链多肽链的三特异性抗体分子，例如Format_2和Format_7的抗体分子，优选地，本发明的抗体分子生产方法包括步骤：(i)在适于表达所述抗体分子的第一重链多肽链和第一轻链多肽链的条件下，培养包含编码所述第一重链和第二轻链的宿主细胞，产生第一亲本蛋白，(ii)在适于表达所述抗体分子的第二重链多肽链和第二轻链多肽链的条件下，培养包含编码所述第二重链和第二轻链的宿主细胞，产生第二亲本蛋白，(iii)将第一亲本蛋白和第二亲本蛋白等摩尔比例混合，并置于体外适宜的氧化还原条件下，使其装配形成所述抗体。在一个具体实施方案中，步骤(iii)包括：向纯化的第一和第二亲和蛋白的混合溶液中加入谷胱甘肽(GSH)，其中，优选地，GHS/蛋白摩尔比例控制在500-700倍。在一个具体的实施方案中，步骤(iii)还包括：在去除GSH后，进行一段时间(例如2-3小时)的自然氧化。
本发明的抗体分子的多肽链可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。为了重组生产，将编码所述抗体分子的任意一条多肽链和/或多条多肽链的多核苷酸分离并插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。使用常规方法，可以轻易地分离所述多核苷酸并将其测序。在一个实施方案中，提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体，优选地表达载体。
可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。表达载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种多核苷酸的表达载体，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。
在一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”指可以工程化以产生本发明的抗体分子的任何种类的细胞系统。适于复制和支持本发明的抗体分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。根据需要，这类细胞可以用特定表达载体转染或转导，并且可以培育大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵器以获得足够量的本发明抗体分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。可以使用适于悬浮培养的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、CHO细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO、HEK293或NSO细胞。
如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。
可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的抗体分子的物理/化学特性和/或生物学活性。
V.药物组合物、药物联合和试剂盒
在一个方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，所述组合物包含与可药用载体配制在一起的本文所述的抗体分子。如本文所用，“可药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。本发明的药物组合物适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。在一些实施方案中，本发明抗体分子是药物组合物中的唯一活性成分。在另一些实施方案中，药物组合物可以包含本文所述的抗体分子与一种以上治疗剂。
在另一方面，本发明也提供包含本文所述的抗体分子与一种以上治疗剂的药物联合。
适用于本发明的药物组合物和药物联合中的治疗剂可以为选自以下类别(i)-(iii)任一类别的治疗剂：(i)增强抗原呈递(例如，肿瘤抗原呈递)的药物；(ii)增强效应细胞反应(例如，B细胞和/或T细胞活化和/或动员)的药物；(iii)减少免疫抑制的药物；(iv)具有抑制肿瘤作用的药物。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、分散体剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。常见的优选组合物处于可注射用溶液剂或可输注溶液剂形式。优选的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹腔(i.p.)、肌内)注射。在一个优选实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体分子。在另一个优选实施方案中，通过肌内、腹腔或皮下注射施用抗体分子。
如本文所用的短语“肠胃外施用“和“肠胃外方式施用”意指除了肠施用和局部施用之外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、皮内、腹腔、经气管、皮下注射和输注。
治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或冻干形式。可以通过将活性化合物(即抗体分子)以要求的量加入适宜的溶剂中，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。通常，通过将所述活性化合物并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和其他成分。可以使用包衣剂如卵磷脂等。在分散体的情况下，可以通过使用表面活性剂来维持溶液剂的适宜流动性。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶而引起可注射组合物的延长吸收。
在某些实施方案中，可以口服施用本发明的抗体分子，例如随惰性稀释剂或可食用载体一起经口施用。本发明的抗体分子也可以封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中、压缩成片剂或直接掺入受试者的膳食中。对于口服治疗施用，所述化合物可以随赋形剂一起掺入并且以可摄取的片剂、颊用片剂、锭剂(troche)、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。为了通过非肠胃外施用方法施用本发明的抗体分子，可能需要将所述抗体分子与防止其失活的材料包衣或随这种材料共施用。还可以用本领域已知的医疗装置施用治疗组合物。
本发明的药物组合物可以包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明所述抗体分子。“治疗有效 量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量等变动治疗有效量。治疗有效量是任何有毒或有害作用不及治疗有益作用的量。相对于未治疗的受试者，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约60％和仍更优选地至少约80％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价本发明的抗体分子抑制可度量参数(例如，肿瘤体积)的能力。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在受试者中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量小于治疗有效量。
包含本文所述抗体分子的试剂盒也处于本发明的范围内。试剂盒可以包含一个或多个其他要素，例如包括：使用说明书；其他试剂，例如标记物或用于偶联的试剂；可药用载体；和用于施用至受试者的装置或其他材料。
V.本发明分子的用途和方法
在一个方面，本发明提供了本发明抗体分子的体内、体外用途和应用方法。
在一些实施方案中，本发明的用途和方法涉及将本发明抗体分子在体内和/或体外应用于：
-以高亲和力，例如KD小于10nM，结合GPRC5D抗原，包括细胞表面表达GPRC5D抗原；
-使T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)靶向表面表达GPRC5D的细胞，尤其是GPRC5D阳性肿瘤细胞；
-使T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)靶向表面表达BCMA的细胞，尤其是BCMA阳性肿瘤细胞；
-激活T细胞的CD3下游信号通路；
-介导T细胞对GPRC5D阳性肿瘤细胞和/或BCMA阳性肿瘤细胞的杀伤作用；
-诱导T细胞释放细胞因子，例如TNF-α，IFN-γ,和IL-2；
-抑制或杀伤GPRC5D阳性和/或BCMA阳性肿瘤细胞，或
-治疗GPRC5D阳性和/或BCMA阳性多发性骨髓瘤，例如治疗BCMA阳性患者群、GPRC5D阳性患者群，在抗BCMA分子结合后BCMA丢失的GPRC5D阳性患者群；
-用于避免由BCMA逃逸介导的肿瘤复发，例如多发性骨髓瘤复发。
在一些实施方案中，本发明抗体分子或包含本发明抗体分子的药物组合物用作在个体中治疗和/或预防疾病的药物或用作疾病的诊断工具，优选地，所述个体是哺乳动物，更优选地是人。
在一些实施方案中，本发明提供应用本发明的抗体分子尤其是三特异性抗体分子治疗癌症的方法和用途，其中所述癌症可以例如选自多发性骨髓瘤、黑素瘤、B细胞淋巴瘤。优选地，所述癌症是多发性骨髓瘤。由于具有针对BCMA和GRPC5D的抗原结合特异性，本发明的三特异性抗体分子可以比靶向BCMA和CD3双特异性抗体和靶向GPRC5D和CD3的双特异性抗体具有更宽的治疗癌症患者群体。在一些实施方案中，本发明提供应用本发明的三特异性抗体分子治疗BCMA阴性癌症或BCMA低表达癌症的方法。在再一些实施方案中，本发明提供应用本发明的三特异性抗体分子治疗GPRC5D和CD3双阳性癌症。
在一个方面，本发明提供了体外或体内检测生物样品，例如血清、精液或尿或组织活检样品(例 如，来自过度增生性或癌性病灶)中存在相关抗原的诊断方法。该诊断方法包括：(i)在允许相互作用发生的条件下使样品(和任选地，对照样品)与如本文所述的抗体分子接触或向受试者施用所述抗体分子和(ii)检测所述抗体分子和样品(和任选地，对照样品)之间复合物的形成。复合物的形成表示存在相关抗原，并且可以显示本文所述治疗和/或预防的适用性或需求。
在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测相关抗原。可以使用的检测方法包括免疫组织化学、免疫细胞化学、FACS、ELISA测定、PCR技术(例如，RT-PCR)或体内成像技术。一般地，体内和体外检测方法中所用的抗体分子直接或间接地用可检测物质标记以促进检测结合的或未结合的结合物。合适的可检测物质包括多种生物学活性酶、辅基、荧光物质、发光物质、顺磁(例如，核磁共振活性)物质和放射性物质。
在一些实施方案中，体内确定相关抗原的水平和/或分布，例如，以非侵入方式确定(例如，通过使用合适的成像技术(例如，正电子发射断层摄影术(PET)扫描)检测可检测物标记的本发明抗体分子。在一个实施方案中，例如，通过检测用PET试剂(例如，18F-氟脱氧葡萄糖(FDG))以可检测方式标记的本发明抗体分子，体内测定相关抗原的水平和/或分布。
在一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述抗体分子和使用说明书的诊断试剂盒。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1、杂交瘤细胞的制备
过表达细胞系的构建
将人、猴和鼠的GPRC5D全长序列分别插入到PEE17.4质粒(Lonza,GS Xceed Expression System)中，通过电转化的方法将质粒转入宿主细胞GS-CHO中，通过加压筛选，构建过表达GPRC5D蛋白的稳定细胞系。同时将人的GPRC5D全长序列插入到pCHO1.0载体中，将其转入宿主细胞293F中，构建成过表达细胞株293F-huGPRC5D。
免疫
将人GPRC5D的全长序列构建到pcDNA3.1载体中，用该质粒免疫Balb\c和Harbour小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，每两周肌肉注射一次(每只小鼠50ug质粒)，共免疫3次。接着，再用过表达人GPRC5D的GS-CHO细胞株进行加强免疫，每两周腹腔注射一次(每只小鼠1×10 7)，共免疫2次。
细胞融合
当血清效价满足要求后，摘取小鼠的脾制备B淋巴细胞悬液，与SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC)以1:2～1:1的比例混合后进行电融合。将融合后的细胞从电极皿中转移入50ml离心管中，用HAT培养基稀释细胞至1～2×10 4个细胞/ml，96孔板中每孔加入100μl细胞悬液。融合后第7天更换筛选培养基，培养第10天(或更久，根据细胞生长状态)后进行流式细胞仪(FACS)检测，筛选阳性克隆。
杂交瘤细胞高通量筛选
通过流式细胞仪(FACS)筛选出特异性表达抗GPRC5D抗体的杂交瘤细胞。将待检测细胞(293F-huGPRC5D/GS-CHO-huGPRC5D)计数，并稀释至1×10 6个细胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g离心5min，去除细胞培养基。将杂交瘤96孔板培养上清和阳性对照抗体加入U型板并重悬细胞，每孔加100μl，冰上静置30min。500g离心5min去除上清，PBS洗细胞1遍。500g 5min去除PBS。向加入过杂交瘤上清的孔中每孔加入100μl goat anti-mouse IgG的FITC标记的二抗(Jackson Immunoresear,Cat#115-545-006，1:500稀释于PBS中)；向包括阳性对照抗体(Roche-5E11)孔加入100μl抗人Fc的PE标记的二抗(BioLegend,Cat#409304)。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗细胞1遍。用50μl 1×PBS重悬细胞，FACS上机检测。
将筛选出的阳性克隆，再用上述同样方法进行GS-cynoGPRC5D/GS-huGPRC5A细胞的复筛，共获得82株与人GPRC5D和猴GPRC5D都结合，且与人GPRC5A不结合的杂交瘤细胞。
阳性杂交瘤细胞亚克隆
根据细胞结合实验的结果，采用常规方式将候选克隆进行亚克隆。之后，用上述高通量的筛选方法检测，挑出目标阳性孔，进行细胞冻存。
实施例2、嵌合抗体的制备
对实施例1中获得的杂交瘤候选克隆进行抗体轻重链基因序列的调取，并将其构建成人鼠嵌合抗体。
取新鲜培养的每株细胞约5×10 6个，抽提RNA(Macherey-Nagel，Cat#740984.250)。利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反转录获得cDNA。以位于5’端FR1区的碱基序列设计上游引物，以位于抗体恒定区或FR4区的碱基设计下游引物，扩增出抗体轻链和重链可变区基因片段。将其连接到T载体中(Mighty TA-cloning Kit试剂盒，Takara)，挑取单克隆进行测序，将测序结果利用MEGA7软件进行分析比对。
经比对，选择抗体轻重链可变区序列正确且配对的克隆，分别将其轻重链可变区基因片段通过南京诺维赞公司的同源重组酶( 目录号：C112-01)连接到pcDNA3.1载体中，其中恒定区选择IgG1亚型，获得轻链和重链抗体的表达质粒。
然后将同一抗体的轻链质粒与重链质粒按1:1的摩尔比混合，经聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences，Cat#23966)转染293F细胞，培养5-7天后，细胞活力低于60％时，收集细胞培养上清并用Protein A亲和柱纯化出单克隆抗体。
实施例3、嵌合抗体的体外筛选
抗GPRC5D抗体的亲和力通过流式细胞术检测。不同浓度的抗体与表达人GPRC5D的细胞共同孵育30分钟，包括过表达人GPRC5D的GS-CHO细胞(huGPRC5D GS-CHO)，多发性骨髓瘤细胞MM1.R,H929和AMO-1。然后加入荧光标记的二抗(APC-小鼠抗人IgG Fc抗体，Biolegend,货 号：409306)，并使用Live/Dead yellow死细胞染色剂(Thermo Fisher,货号：L34967),通过流式细胞术检测细胞荧光强度，利用GraphPad Prism 8.0拟合曲线并计算EC50值，以示抗体与人GPRC5D结合的亲和力。
检测的抗体中，HB15H1G1(重链可变区SEQ ID NO：25，轻链可变区SEQ ID NO:26)为全人源抗体，ch5E12C4(重链可变区SEQ ID 98，轻链可变区SEQ ID 99)，ch11B7(重链可变区SEQ ID100，轻链可变区SEQ ID 101)和ch7F5D4抗体(重链可变区SEQ ID NO：27，轻链可变区SEQ ID NO:28)为嵌合抗体。结果显示在下表1中。
表1.示例抗体与人GPRC5D的亲和力检测
*ch5E12C4为hz5E12.1.P1人源化之前的序列；ch11B7为hz11B7.5人源化之前的序列。
对筛选的ch5E12C4和嵌合ch11B7抗体进行人源化，形成抗体hz5E12.1.P1和hz11B7.5。
实施例4、三特异性抗体(Ts)的分子结构设计和构建
同时靶向GPRC5D，BCMA和CD3的T细胞衔接器(T-cell engager)类多特异性抗体，可同时结合多发性骨髓瘤细胞(Multiple Myeloma,MM)表面的两类肿瘤相关抗原GPRC5D和BCMA以及T细胞表面的CD3受体。以4个抗GPRC5D抗体(HB15H1B1、ch7F5D4、hz5E12.1.P1、hz11B7.5)、1个抗BCMA抗体(ADI-38456)和两个不同亲和力的抗CD3抗体(较低亲和力CD3抗体hzsp34.87和较高亲和力CD3抗体hzsp34.24)为基础，设计同时靶向GPRC5D、BCMA和CD3的多特异性抗体。
如图1所示，设计了四种不同format的多特异性抗体分子：包括1+1+1format 1(TS-F1)的2个示例抗体，1+1+1format 2(TS-F2)的6个示例抗体，2+2+2format 6(TS-F6)的4个示例抗体和1+1+2format 7(TS-F7)的5个示例抗体(见下表4)。示例抗体设计利用Fc“结入扣”(knob-in-hole)技术解决非对称IgG样双特异性抗体的重链错配，其中Fc为IgG1的重链恒定区；同时引入减弱效应子功能(effector function)的L234A，L235A(根据Kabat的“EU”编号)氨基酸突变。
TS-F2和TS-F7由4条多肽链组成左右非对称的IgG样四聚体，TS-F6由2条多肽链组成左右对称的IgG样四聚体。
TS-F2由一条包含重链可变结构域、免疫球蛋白CH1结构域和Fc结构域的肽链1#，一条包含轻链可变结构域、免疫球蛋白CL结构域的肽链2#，一条包含重链可变结构域、免疫球蛋白CH1 结构域、Fc结构域、和一段通过人工合成的连接肽连接而成的单链抗体scFv的肽链3#，以及一条包含轻链可变结构域、免疫球蛋白CL结构域的肽链4#组成。肽链#1的重链可变结枃域和肽链2#的轻链可变结构域配对形成第一抗原识别位点，肽链#3的重链可变结枃域和肽链4#的轻链可变结构域配对形成第二抗原识别位点，scFv形成第三抗原识别位点。
TS-F7由一条包含重链可变结构域、免疫球蛋白CH1结构域和Fc结构域的肽链1#，一条包含轻链可变结构域、免疫球蛋白CL结构域、和一段通过人工合成的连接肽连接而成的单链抗体scFv的肽链2#，一条包含重链可变结构域、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域的肽链3#，和一条包含轻链可变结构域、免疫球蛋白CL结构域，一段通过人工合成的连接肽连接而成的单链抗体scFv的肽链4#组成。肽链#1的重链可变结枃域和肽链2#的轻链可变结构域配对形成第一抗原识别位点，肽链#3的重链可变结枃域和肽链4#的轻链可变结构域配对形成第二抗原识别位点，肽链2#和肽链4#中的两个scFv为两个相同的第三抗原识别位点。
在TS-F2和TS-F7中，肽链#1和肽链#3各自的Fc结构域分别含有“结入扣”的对应稳定缔合突变。
TS-F6由两条相同的肽链1和两条相同的肽链2组成，其中肽链1#包含重链可变结构域、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域、和一段通过人工合成的连接肽连接而成的单链抗体scFv；肽链2#包含轻链可变结构域、免疫球蛋白CL结构域、和一段通过人工合成的连接肽连接而成的单链抗体scFv。肽链#1的重链可变结枃域和肽链2#的轻链可变结构域配对形成第一抗原识别位点，肽链#1中的scFv为第二抗原识别位点，肽链2#中的scFv为第三抗原识别位点。
TS-F1由肽链1和肽链2组成，其中肽链1#包含第一单链抗体scFv和Fc结构域；肽链2#包含第二单链抗体scFv和Fc结构域。肽链#1中的第一scFv形成第一抗原识别位点，肽链2#中的scFv形成第二抗原识别位点。
实施例5.TS抗体的表达及纯化
四个抗GPRC5D抗体(HB15H1B1、ch7F5D4、hz5E12.1.P1、hz11B7.5)，其中HB15H1B1为全人源抗体，ch7F5D4为嵌合抗体，hz5E12.1.P1和hz11B7.5为人源化的抗体，1个抗BCMA抗体(ADI-38456)和两个不同亲和力的抗CD3抗体(hzsp34.87和hzsp34.24)的CDR区、轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列在本申请的“序列表”部分列出，上述抗体的CDR区、轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列的序列编号见表2。
表2.抗GPRC5D抗体、抗BCMA抗体和抗CD3抗体的CDR区，轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列编号。
表3A.示例抗体中接头的氨基酸序列编号和序列描述
Name Seq ID 序列描述
linker 1 seq 51 (G4S)4
linker 2 seq 52 (G4S)2
linker 3 seq 53 (G4S)3
linker 4 seq 54 TS(G4S)3
表3B.示例抗体中单链抗体片段的氨基酸序列编号和序列描述
表4.示例TS抗体的氨基酸序列编号
同时设计了GPRC5DxCD3和BCMAxCD3双特异性抗体。如图2A所示，作为合理设计，双特异性抗体两端均为Fab形式，形成1+1format的非对称Ig样结构。利用Fc“结入扣”(knob-in-hole)技术解决该非对称IgG-样双特异性抗体的重链错配，其中Fc为IgG1的重链恒定区；同时引入减弱效应子功能(effector function)的L234A，L235A(根据Kabat的“EU”编号)氨基酸突变。
同时，还表达BCMAxCD3双特异性抗体46758。如图2B所示，该双特异性抗体的一个抗体臂为结合BCMA的Fab，另一抗体臂为结合CD3的scFv，其中所述Fab来自抗BCMA亲本抗体38456，所述scFv来自不同之前的抗CD3亲本抗体。组成该双特异性抗体的三条多肽链如SEQ ID NO:111-113所示。
同时，还表达纯化了Roche-5E11双特异性抗体(GPRC5DxCD3,2:1format,来源于专利WO2019/154890A1)。如图2C所示。双特异性抗体Roche_5E11由WO 2019/154890A1的序列SEQ ID NO:17,18,19和20组成，包含两个GPRC5D结合位点和一个CD3结合位点。
为了重组生产，委托苏州金唯智生物科技有限公合成了编码重链和轻链的核苷酸序列并分别插入载体pcDNA3.1中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。
在HEK293细胞中的表达和纯化：
将Expi293F细胞(购自Thermo Fisher scientific公司)传代培养于Expi293F细胞培养基(购自Thermo Fisher scientific公司)中。转染前一天检测细胞密度，用新鲜的Expi293细胞培养基调整到2×10 6个细胞/ml继续培养，转染当天将细胞密度调整为3×10 6个细胞/ml。
取转染Expi293F细胞终体积1/10的Opti-MEM培养基(购自Gibco公司)作为转染缓冲液，每mL转染缓冲液中加入10μg的1:1摩尔比率的上述制备的分别包含配对的重链和轻链的核苷酸序列的重组质粒，混匀，每mL转染缓冲液中再加入30ug聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)(Polysciences)，混匀，室温温育20分钟，然后将PEI/DNA混合物轻柔倒入Expi293F细胞悬浮液中混匀，置于摇床培养，培养条件为8％CO2、36.5℃、120rpm。
培养16～18小时后，向培养瓶中补加转染后培养物体积1/50的浓度为200g/L的FEED(100g/L Phytone Peptone+100g/L Difco Select Phytone)、终浓度为4g/L的葡萄糖溶液和终浓度为2mM/L的VPA(Gibco)，轻轻混匀，置于8％CO2、36.5℃、120rpm摇床继续培养。连续培养6天，收集培养物，以4000转/分钟离心30分钟，取细胞上清用0.45μM滤膜过滤，通过亲和层析和离子交换层析进行亲本蛋白纯化。对于对称结构的IgG样抗体，纯化出来最终分子。
下面显示了，针对上述不同Format的TS抗体和双特异性抗体，通过重组产生的亲本蛋白：
对于非对称IgG样抗体，纯化出来的两个亲本蛋白无需换液，蛋白浓度分别>1mg/ml，按照摩尔比1:1混合，混合液中蛋白浓度1～10mg/ml。然后加入适量的GSH：GSH/蛋白摩尔比控制在500-700倍，GSH终浓度>5mM。最后用1M Arg pH 10.0调节上述混合液的pH至8.0-8.5。Arg终浓度>＝50mM。上述反应液于室温过夜，不超过24h。第二天将过夜反应的反应液换液去掉GSH，换液buffer可以是上述不含GSH的重组反应0.2M PB溶液(Ph6.0)。自然氧化2-3h后，通过monoS(GE Cat.17516801)纯化即可。
Roche-5E11双特异性抗体按照WO 2019/154890A1中公开的方法制备。
收获根据上述方法制备的对称性抗体和非对称抗体，利用亲和层析和离子交换层析，进行纯化。
利用大小排阻层析(size exclusion chromatography；SEC)检测层析收集的各级分管中样品的纯度。根据SEC结果将纯度大于95％的级分管中的样品合并。
将纯化后的双特异性抗体溶液使用15ml超滤离心管，4500转/分钟离心30分钟，使用PBS将蛋白稀释后继续离心，4500转/分钟离心30分钟，重复该操作几次，以更换缓冲液。将更换缓冲液后的抗体合并，测抗体浓度。进一步利用毛细管电泳(CE-SDS)和液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)相结合对多特异性抗体的成分和含量进行定性和定量。
实施例6.三特异性抗体亲和力测定
在示例的三特异性抗体中，检查来自人源化抗体hz5E12.1.P1和hz11B7.5的抗原结合位点与GPRC5D的结合亲和力。按照与实施例3相同的方式，将不同浓度的三特异性抗体与huGPRC5D GS-CHO细胞共同孵育30分钟，然后加入荧光标记的二抗，通过流式细胞仪(BD)检测细胞荧光强度，利用GraphPad Prism 8.0拟合曲线并计算EC50值，以示抗体与人GPRC5D结合的亲和力。结果显示在下表5中。
表5.示例抗体与人GPRC5D的亲和力
在示例三特异性抗体中，抗BCMA端和抗CD3端的亲和力通过生物膜层光学干涉技术(BLI)检测。测定了示例抗体与人BCMA、猴BCMA，人CD3E和猴CD3E的结合动力学。
将偶联链霉亲和素蛋白(streptavidin protein，SA)或抗human-Fc(AHC)的探针sensors(Fortebio，货号18-5019)浸泡于200ul SD buffer(1x PBS,0.1％BSA,0.05％tween-20)中预湿。示例抗体和生物素标记的或带Fc-tag的BCMA和CD3D&E异源二聚体抗原分别用SD buffer稀释。取200μl的SD buffer、各稀释样品(100nM)分别加入到96孔黑板(Greiner,货号655209)中。将探针和样品置于Octet中(Fortebio，Red96e)。打开Data Acquisition 10.0，选择“New Kinetic Experiment”，根据样品位置布板，选择sensors位置，设置运行步骤及时间：Baseline 60s、Loading 250s、Baseline100s、Association 600s和Dissociation 600s。实验转速为1000rpm，温度为30℃。
在“Data Analysis 10.0”软件中对结果分析，扣除buffer参比通道，选择1：1binding对数据进行拟合，计算出示例抗体的kon、koff、KD值。
在如以上测定法所述进行的实验中，使用人BCMA抗原(ACRO Biosystems)和猴BCMA抗原(ACRO Biosystems)检测示例抗体。与人BCMA的亲和力检测结果如表6所示；与猴BCMA的亲和力检测结果如表7所示。
表6.示例抗体与人BCMA的亲和力检测
由以上图表结果可见，本发明上述3个示例抗体均显示与BCMA极高的亲和力。
表7.示例抗体与猴BCMA的亲和力检测
在如以上测定法所述进行的实验中，使用人CD3D&E异源二聚体抗原(ACRO Biosystems)和猴CD3D&E异源二聚体抗原(ACRO Biosystems)检测示例抗体的亲和力，结果如表8、表9所示。同时也检查了GPRC5DXCD3双特异性抗体，hz5E12.1-P1/SP34.24和hz5E12.1-P1/SP34.87，与人/猴CD3D&E的结合亲和力。
表8示例抗体与人CD3D&E的亲和力检测
表9示例抗体与猴CD3D&E的亲和力检测
实施例7、抗GPRC5DxBCMAxCD3抗体介导的Jurkat细胞激活实验
通过Jurkat-NFAT-Luc报告系统检测抗GPRC5DxBCMAxCD3抗体对CD3E下游信号通路的激活活性。当抗GPRC5DxBCMAxCD3多抗与多发性骨髓瘤(MM)细胞株表面的GPRC5D和/或BCMA结合，同时与Jurkat-NFAT-Luc细胞(Jurkat)表面的CD3E结合时，可以通过肿瘤相关抗原(GPRC5D和/或BCMA)依赖性的CD3交联，刺激Jurkat-NFAT-Luc细胞中CD3E下游信号。因此，通过Luciferase报告系统评估示例抗体介导的T细胞激活水平。
在Jurkat NFAT luciferase细胞与MM肿瘤细胞中，加入不同浓度的示例抗体，观察Jurkat细胞荧光素酶的表达。
试剂与材料
简言之，首先稀释样品：将抗体用RPMI medium 1640(5％FBS)稀释到100nM浓度，然后5倍梯度稀释。然后准备细胞：Jurkat细胞和肿瘤细胞在300g离心5min，倒掉上清，重悬于RPMI medium1640(5％FBS),计数(Countstar)后调整细胞密度至：Jurkat NFAT 2x10 6cell/ml,肿瘤细胞根据效应 细胞与靶细胞比例调整。在96孔白色细胞培养板中每孔加入45μl的肿瘤细胞，加入30μl梯度稀释的样品，加入45μl Jurkat NFAT细胞。然后将96孔板放入37摄氏度5％CO2培养箱继续培养。培养一段时间后，取出培养板细胞培养板，室温放置5min，每孔加入80ul Bio-Glo(Promega，G7940),避光孵育10min,在SpectraMax i3(MOLECULAR DEVICES)读取荧光值。利用GraphPad Prism 8.0拟合曲线并计算EC50值，以比较示例抗体对T细胞的激活活性。结果显示为实验组读值与对照hIgG1组读值的倍数比值。
结果：
TsF2-1和Ts-F2-2
在H929细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养16小时条件下，以及在L363细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养16小时条件下，TS-F2-1和TS-F2-2均可以随着抗体浓度增加，显著提高Jurkat细胞荧光素酶的表达(图3A和3B)；且其激动活性高于Ts-F1与对照组GPRC5DxCD3双抗和BCMAxCD3双抗。所检测抗体的具体EC50见表10。其中示例抗体TS-F2-1和TS-F2-2均由来自HB15H1G1(GPRC5D抗体)、hzsp34.24(CD3抗体)和38456(BCMA抗体)的三个结合特异性组成，但HB15H1G1和38456结合特异性的位置不同。
表10示例抗体介导的T细胞激活
TsF2-3
在H929细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养16小时条件下，在L363细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养16小时条件下，以及在U266细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养16小时条件下，TS-F2-3均可以随着抗体浓度增加，显著提高Jurkat细胞荧光素酶的表达(图4A、4B和4C)；且其激动活性显著高于TS-F6抗体，并高于对照组GPRC5DxCD3双抗(ch7F5D4/hzsp34.24)和BCMAxCD3(46758)双抗。所检 测抗体的具体EC50见表11。示例抗体TS-F2-3和TS-F6(TS-F6-1至-4)由来自ch7F5D4(GPRC5D抗体)、hzsp34.24(CD3抗体)和38456(BCMA抗体)的三个结合特异性组成。
将构建的过表达huGPRC5D的GS-CHO(huGPRC5D-GS-CHO)细胞和Jurkat细胞共同培养16小时，加入示例抗体以模拟仅表达GPRC5D的多发性骨髓瘤细胞介导的T细胞激活。其中效应细胞(Jurkat细胞)与靶细胞(huGPRC5D-GS-CHO细胞)比例为50:1。实验结果表明，TS-F2-3可以随着抗体浓度增加，显著提高Jurkat细胞荧光素酶的表达(图4D)；且其激动活性高于Ts-F6抗体和对照组GPRC5DxCD3双抗和BCMAxCD3双抗(46758)。具体EC50见表11。
表11示例抗体介导的T细胞激活
TsF2-4和Ts-F2-5
在H929细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养5个小时条件下，
在L363细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养5个小时条件下，
在8226细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养5个小时条件下，以及
在U266细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养5个小时条件下，
TS-F2-4和TS-F2-5均可以随着抗体浓度增加，显著提高Jurkat细胞荧光素酶的表达(图5A、5B、5C)；且其激动活性高于对照组GPRC5DxCD3,BCMAxCD3双抗(38456/hzsp34.24)和46758双抗。具体EC50见表12。其中示例抗体TS-F2-4由hz5E12.1.P1(GPRC5D抗体)、hzsp34.24(高亲和力CD3抗体)和38456(BCMA抗体)组成，示例抗体TS-F2-5由hz5E12.1.P1(GPRC5D抗体)、hzsp34.87(低亲和力CD3抗体)和38456(BCMA抗体)组成。
表12示例抗体介导的T细胞激活
在MM1.S细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为10:1)共同培养5个小时条件下，以及在ARD细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为10:1)共同培养5个小时条件下，TS-F2-4和TS-F2-5可以随着抗体浓度增加，显著提高Jurkat细胞荧光素酶的表达(图5E)；且其激动活性高于对照组GPRC5DxCD3双抗和BCMAxCD3双抗46758。具体EC50见表13。
表13示例抗体介导的T细胞激活
Ts-F7-1和TS-F7-2
在H929细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养5个小时条件下，
在L363细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养5个小时条件下，
在8226细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养5个小时条件下，以及
在U266细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养5个小时条件下，
TS-F7-1和TS-F7-2可以随着抗体浓度增加，显著提高Jurkat细胞荧光素酶的表达(图6A，6B,6C，6D)；且其激动活性高于对照组GPRC5DxCD3双抗和BCMAxCD3双抗46758。具体EC50见表14。其中示例抗体TS-F7-1由hz5E12.1.P1(GPRC5D抗体)、hzsp34.24(CD3抗体)和38456(BCMA抗体)组成，示例抗体TS-F7-2由hz11B7.5(GPRC5D抗体)、hzsp34.87(CD3抗体)和38456(BCMA抗体)组成。
表14示例抗体介导的T细胞激活
Ts-F7-3和TS-F7-4
在L363细胞和Jurkat细胞(效应细胞与肿瘤细胞比例为5:1)共同培养16个小时条件下，TS-F7-3和TS-F7-4可以随着抗体浓度增加，显著提高Jurkat细胞荧光素酶的表达(图7)；但其激动活性低于Ts-F2-3。其中示例抗体TS-F7-3和TS-F7-4由ch7F5D4(GPRC5D抗体)、hzsp34.24(CD3抗体)和38456(BCMA抗体)组成，hzsp34.24抗体形成单链抗体时TS-F7-3为VL在前，VH在后，TS-F7-4为VH在前，VL在后。
实施例8、抗GPRC5DxBCMAxCD3抗体对人多发性骨髓瘤细胞的杀伤实验
通过乳酸脱氢酶(LDH)法检测PBMC与GPRC5D和/或BCMA阳性的MM细胞共培养条件下示例抗体介导的T细胞对人多发性骨髓瘤细胞的杀伤能力。当抗GPRC5DxBCMAxCD3多抗与MM细胞表面的GPRC5D和/或BCMA结合，同时与primary T细胞表面的CD3E结合时，可以通过肿瘤相关抗原(GPRC5D和/或BCMA)依赖性的与T细胞交联，刺激T细胞激活，介导肿瘤细胞的杀伤。利用多因子检测试剂盒(Human Th1/Th2/Th17,BD)同时检测多种细胞因子的水平；同时通过流式细胞仪(BD)检测T细胞中CD69阳性细胞的百分比。
使用如下试剂和材料。
实验步骤：
将PBMC细胞从液氮中取出，于37度水浴锅迅速化开，加入9ml无血清培养基中，300g离心4min，弃上清，重悬于10％FBS无酚红1640培养基，调整细胞密度为4×10 6cell/ml。收集一定量对数期H929细胞，离心，用10％FBS无酚红1640培养基调整肿瘤细胞密度至2×10 5cells/ml。将抗体按上表用10％FBS无酚红1640培养基稀释到100nM，从5nM 5倍梯度稀释。在96孔细胞培养板(U型)中加入100μL的肿瘤细胞、50μL梯度稀释的样品和50μL PBMC细胞。同时，设置对照孔，用培养基补齐至200μL/孔。放入37度CO2培养箱培养16h。培养16h后，取出细胞培养板，室温放置5min，TM孔每孔加入10％Lysis Solution,避光裂解15min。400g，5min离心细胞培养板，取50μl上清转移至新的平底96孔板中。加入LDH显色试剂50μl，室温避光显色30min，加入终止液50μl。酶标仪读取吸光值，通过吸光值计算杀伤。再取90μL上清至新的96孔板(V型)中，用于后续细胞因子检测。将细胞培养板中每孔加200μL FACS buffer洗一遍，离心后倾去液体，每孔加入45μL染液(用FACS buffer配制)，4度避光孵育20min，用200μL FACS buffer洗1遍，用150μL FACS buffer重悬后上机检测。
CBA检测细胞因子：
用2ml assay diluent溶解标准品，成为standard 0(std 0)，然后2倍梯度稀释8个孔std1-8，std9为assay diluent空白对照。将每种beads涡旋5-10s，各吸出322ul，然后加入2254ul assay diluent，涡旋混匀，准备一块96孔V型板，每孔加入50ul混合均匀的beads，每孔加入30ul assay diluent，然后每孔加入30ul样品，即将所有样品稀释2倍。PE detection reagent：用assay diluent 1:1稀释后使用。在孔中加入50ul std或sample以及PE detection reagent，用封口膜封板，并用铝箔覆盖。在平板振荡器上以1100rpm的转速室温震荡5min。然后室温孵育3h。孵育结束后，每孔加入120ul wash buffer，300g离心5min，吸弃上清。加120μL Wash Buffer重悬，用流式细胞仪检测。
实验结果：
通过流式细胞术检测，发现示例抗体可以剂量依赖性的激活primary T细胞(图8A和图8B)，并且T细胞的激活程度与CD3的亲和力存在一定的相关性：抗CD3亲和力越高则对T细胞激活能力越强，从而介导PBMC对H929细胞的杀伤作用(图9)，杀伤过程中伴随的多种细胞因子释放水平见图11A-D。
实施例9、示例抗体在H929荷瘤人源化小鼠模型体内的抗肿瘤药效
雌性NOG小鼠(35-41天)购自北京维通达实验动物技术有限公司。等级为SPF级。小鼠在到达后驯化检疫7天，随后开始研究。
将H929细胞进行常规传代培养用于后续体内实验，离心收集细胞，以PBS分散H929细胞。 将NOG小鼠右侧背腹部剃毛接种H929细胞，5x10 6个/只，接种体积200ul/只。H929细胞接种后第五天进行小鼠静脉注射PBMC细胞，5x10 6个/只，接种体积200ul/只。
给药：PBMC细胞接种后第3天，根据小鼠瘤体积进行分组(每组7只)给药。每7天给药一次,总共给药3次。每周2次监测小鼠瘤体积与体重。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W 2/2。采用电子天平测定体重。在整个研究期间，当肿瘤达到端点时或当小鼠具有>20％体重减轻时，使小鼠安乐死。统计肿瘤大小。
实验结果
肿瘤生长曲线见图12，示例抗体可以显著抑制H929细胞的生长。同时在给药的小鼠组中，均没有发现体重减轻的现象。
实施例10、不同多发性骨髓瘤表面GPRC5D和BCMA的表达水平
通过qifikit试剂盒，利用饱和浓度的BCMA抗体和GPRC5D抗体与MM细胞染色，通过流式定量不同多发性骨髓瘤细胞株表面BCMA和GPRC5D分子。
实验试剂
名称 公司或来源 货号
BCMA(CD269) Biolegend 357502
Mgprc5d-17G1B8 Innoventbio NA
Qifikit试剂盒 Dako K0078
加入1x10 5个不同的MM细胞于96-well板，GS-CHO-huGPRC5D和GS-CHO-huBCMA细胞作为阳性对照，并且互为阴性对照。400g离心5min，去上清。加入10μL鼠来源一抗(BCMA和Mgprc5d-17G1B8)在4℃条件下孵育1h。阴性对照IgG1。QIFIKIT/Beads准备：分别加入100μL混合均匀的beads(Vial 1和Vial 2)。加入200uL FACS buffer，洗3遍后去除上清，加入100uL二抗(FITC Conjugate,Vial 3(共200uL),1:50稀释在0.01mol/L PBS中)混匀，在4℃避光条件下孵育45分钟。加入200uL FACS缓冲液，洗3遍后，加入100uL PBS，混匀，通过流式细胞术检测。
实验结果：在测试的不同MM细胞上具有不同的表面GPRC5D和BCMA表达水平，如图13所示。如图5A-F和图6A-D和图7所示，与对照GPRC5D/CD3二抗和BCMA/CD3二抗相比，所评价的Format 2和Format 7三特异性抗体在具有不同GPRC5D和BCMA表达水平的多种MM细胞(H929，L363,8226，U266，MM1.S和ARD)上都诱导了有利的生物活性。这说明，通过组合靶向GPRC5D和BCMA，本发明的三特异性抗体将既可以覆盖GPRC5D阳性肿瘤患者，也可以覆盖BCMA阳性肿瘤患者，提高对多发性肿瘤患者的覆盖率；同时也可以避免由于单一抗原如BCMA的丢失带来的肿瘤复发，改善治疗功效。

Claims (26)

  1. 一种三特异性Y型抗体分子，所述抗体分子具有下式(I)的结构：
    (M1:M2-(X1)p)-Fc::Fc-(X2)q， (I)
    其中，
    M1和M2分别表示抗体分子的第一抗体臂和第二抗体臂,且M1和M2分别包含结合第一和第二抗原的抗原结合位点，所述抗原结合位点是Fab或scFab，优选Fab，
    Fc::Fc表示抗体分子的茎，由配对并二聚化的第一Fc结构域和第二Fc结构域组成，其中第一和第二抗体臂分别直接或通过连接肽(优选地铰链区)连接在第一Fc结构域和第二Fc结构域的N端；
    X1表示缀合在抗体臂C端上的缀合部件，X2表示缀合在茎C端上的缀合部件，其中所述缀合部件包含结合第三抗原的抗原结合位点，且
    其中p和q分别表示0，1或2的整数，p和q之一为0，
    优选地，其中，当p＝0时，q＝1；M1和M2的抗原结合位点分别是Fab或scFab，缀合部件
    X2缀合在抗体分子茎的两个Fc结构域之一上，或
    当q＝0时，p＝2，M1和M2的抗原结合位点分别是Fab，缀合部件X1缀合在抗体分子抗体臂M1和M2两者的Fab轻链上，
    其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRC5D、BCMA和CD3。
  2. 权利要求1的抗体分子，其中，缀合部件包含选自scFv、Fv、dsFv、和dsAb的抗原结合位点，优选scFv。
  3. 权利要求1的抗体分子，其中所述抗体分子具有结构：
    (M1:M2)-Fc::Fc-(X2)q， (Format_2)
    其中，
    q＝1，
    M1和M2分别包含结合第一和第二抗原的抗原结合位点Fab或scFab，优选Fab，且
    X2包含结合第三抗原的抗原结合位点scFv，优选dsscFv，
    其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRC5D、BCMA和CD3。
  4. 权利要求1的抗体分子，其中所述抗体分子具有结构：
    (M1:M2-(X1)p)-Fc::Fc， (Format_7)
    其中，
    p＝2，
    M1和M2分别包含结合第一和第二抗原的抗原结合位点Fab，且
    X1包含结合第三抗原的抗原结合位点scFv，优选dsscFv，
    其中，第一、第二和第三抗原互不相同，彼此独立地选自：GPRC5D、BCMA和CD3。
  5. 权利要求1-4任一项的抗体分子，其中抗体臂的Fab抗原结合位点包含两条链，其中一条链从N端到C端包含VH-CH1，另一条链从N端到C端包含VL-CL；或其中，一条链从N端到C端 包含VH-CL，另一条链从N端到C端包含VL-CH1。
  6. 权利要求1-5任一项的抗体分子，其中包含在缀合部件中的scFv从N端到C端包含：VH-接头-VL，或VL-接头-CH。
  7. 权利要求1-6任一项的抗体分子，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域是来自IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白的Fc结构域，优选地，来自IgG1免疫球蛋白的Fc结构域，更优选地，来自人IgG1免疫球蛋白的Fc结构域。
  8. 权利要求1-7任一项的抗体分子，其中结合GPRC5D的抗原结合位点包含选自下组的VH和VL：
    (a)包含SEQ ID NOs:1-3的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:4-6的LCDR1-3序列的VL；
    (b)包含SEQ ID NOs:7-8的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:10-12的LCDR1-3序列的VL；
    (c)包含SEQ ID NOs:13-15的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:16-18的LCDR1-3序列的VL；或
    (d)包含SEQ ID NOs:19-21的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:22-24的LCDR1-3序列的VL；
    优选地，所述抗原结合位点包含选自下组的VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:25/26,SEQ ID NOs:27/28,SEQ ID NOs:29/30,和SEQ ID NOs:31/32，
    且优选地，当所述抗原结合位点为dsscFv时，还包含引入所述VH和VL序列中的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换。
  9. 权利要求1-8任一项的抗体分子，其中结合CD3的抗原结合位点包含选自下组的VH和VL：
    (a)包含SEQ ID NOs:41-43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序列的VL；或
    (b)包含SEQ ID NOs:47,42,43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序列的VL；
    优选地，所述抗原结合位点包含选自下组的VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:48/49,SEQ ID NOs:50/49,且更优选地SEQ ID NOs:48/49，
    且优选地，当所述抗原结合位点为dsscFv时，还包含引入所述VH和VL序列中的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换。
  10. 权利要求1-9任一项的抗体分子，其中结合BCMA的抗原结合位点包含如下VH和VL：
    包含SEQ ID NOs:33-35的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs：36-38的LCDR1-3序列的VL；
    优选地，所述抗原结合位点包含VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:39/40，
    且优选地，当所述抗原结合位点为dsscFv时，还包含引入所述VH和VL序列中的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换。
  11. 权利要求3的抗体分子，其中抗体分子包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
    第一重链多肽链从N端到C端包含：重链可变结构域VH、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域；
    第一轻链多肽链从N端到C端包含：轻链可变结构域VL、免疫球蛋白CL结构域；
    第二重链多肽链从N端到C端包含：重链可变结构域VH、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域；
    第二轻链多肽链从N端到C端包含：轻链可变结构域VL、免疫球蛋白CL结构域；
    且其中第一重链多肽链或第二重链多肽链还包含直接或优选地通过连接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)缀合在其Fc结构域C端的scFv结构域；
    其中，
    第一重链多肽链的VH-CH1与第一轻链多肽链的VL-CL配对形成结合第一抗原的第一抗体臂(M1)；
    第二重链多肽链的VH-CH1与第二轻链多肽链的VL-CL配对形成结合第二抗原的第二抗体臂(M1)；
    第一重链多肽链的Fc结构域与第二重链多肽链的Fc结构域配对并二聚化形成抗体茎(Fc::Fc)；且
    缀合在第一重链多肽链或第二重链多肽链C末端的scFv结构域形成结合第三抗原的缀合部件(X2)，
    其中第一、第二和第三抗原各不相同，并彼此独立地选自：GPRC5D，BCMA，和CD3。
  12. 权利要求4的抗体分子，其中抗体分子包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
    第一重链多肽链从N端到C端包含：重链可变结构域VH、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域；
    第一轻链多肽链从N端到C端包含：轻链可变结构域VL、免疫球蛋白CL结构域；
    第二重链多肽链从N端到C端包含：重链可变结构域VH、免疫球蛋白CH1结构域、Fc结构域；
    第二轻链多肽链从N端到C端包含：轻链可变结构域VL、免疫球蛋白CL结构域；
    且其中第一轻链多肽链和第二轻链多肽链还包含直接或优选地通过连接肽(例如(G4S)2或TS(G4S)2)缀合在其CL结构域C端的scFv结构域；
    其中，
    第一重链多肽链的VH-CH1与第一轻链多肽链的VL-CL配对形成结合第一抗原的第一抗体臂(M1)；
    第二重链多肽链的VH-CH1与第二轻链多肽链的VL-CL配对形成结合第二抗原的第二抗体臂(M1)；
    第一重链多肽链的Fc结构域与第二重链多肽链的Fc结构域配对并二聚化形成抗体茎(Fc::Fc)；且
    缀合在第一轻链多肽链和第二轻链多肽链C末端的scFv结构域形成结合第三抗原的缀合部件 (X1)，
    其中第一、第二和第三抗原各不相同，并彼此独立地选自：GPRC5D，BCMA，和CD3。
  13. 权利要求11或12的抗体分子，其中：
    (a)所述抗体分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别结合GPRC5D和CD3且缀合部件结合BCMA；或者
    (b)所述抗体分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别结合BCMA和CD3且缀合部件结合GPRC5D；或者
    (c)所述抗体分子的抗体臂M1和抗体臂M2分别结合GPRC5D和BCMA且缀合部件结合CD3。
  14. 权利要求11的抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
    (a)第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:65的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二重链多肽链包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；或
    (b)第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:69的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二重链多肽链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；或
    (c)第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:72的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二重链多肽链包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；或
    (d)第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:75的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二重链多肽链包含SEQ ID NO:77或78的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；或
    (e)第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:79的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二重链多肽链 包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
  15. 权利要求12的抗体分子，其包含或由第一重链多肽链、第一轻链多肽链、第二重链多肽链和第二轻链多肽链组成，其中，
    (a)第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:87的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二重链多肽链包含SEQ ID NO:77或78的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；或
    (b)第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:90的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二重链多肽链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；或
    (c)第一重链多肽链包含：SEQ ID NO:92的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第一轻链多肽链包含SEQ ID NO:93或96的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二重链多肽链包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列；第二轻链多肽链包含SEQ ID NO:95或97的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
  16. 一种特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其包含选自如下的CDR序列组合：
    (i)分别如SEQ ID NO:1-6所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
    (ii)分别如SEQ ID NO:7-12所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
    (iii)分别如SEQ ID NO:13-18所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
    (iv)分别如SEQ ID NO:19-24所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列，或者
    (v)分别如SEQ ID NO:13，110和15-18所示的重链可变结构域HCDR1、2和3序列和轻链可变结构域LCDR1、2和3序列。
  17. 权利要求16的抗体，其中所述抗体包含选自如下的VH和VL氨基酸序列组合：
    (a)包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％ 或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
    (b)包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
    (c)包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
    (d)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
    (e)包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域；
    (f)包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域；和包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域，
    任选地，所述VH和VL序列中包含引入的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换，由此在所述VH和VL之间形成二硫键。
  18. 权利要求16或17的抗体，其为单特异性、双特异性或三特异性抗体，优选地，所述抗体还包含结合CD3的抗原结合位点，或还包含结合BCMA的抗原结合位点和结合CD3的抗原结合位点。
  19. 权利要求18的抗体，其为结合GPRC5D和CD3的双特异性抗体，
    优选地，其中，所述抗体包含结合CD3的选自下组的VH和VL对：
    (a)包含SEQ ID NOs:41-43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序列的VL；或
    (b)包含SEQ ID NOs:47,42,43的HCDR1-3序列的VH和包含SEQ ID NOs:44-46的LCDR1-3序列的VL；
    优选地，包含选自下组的VH和VL氨基酸序列对：SEQ ID NOs:48/49,和SEQ ID NOs:50/49,
    任选地，所述VH和VL序列中包含引入的半胱氨酸置换，例如，VH序列中44位和VL序列中100位的半胱氨酸置换，由此在所述VH和VL之间形成二硫键。
  20. 多核苷酸，其编码权利要求1－19中任一项所述的抗体分子。
  21. 载体，优选地表达载体，其包含权利要求20的多核苷酸。
  22. 宿主细胞，其包含权利要求20所述的多核苷酸或权利要求21所述的载体，例如，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
  23. 用于生产权利要求1-19中任一项所述的抗体分子的方法，所述方法包括：在适于表达所述抗体的多肽链的条件下培养包含编码所述多肽链的宿主细胞；和在适于所述多肽链装配为所述抗体分子的条件下使多肽链装配产生所述抗体，优选地，
    所述方法包括步骤(i)在适于表达所述抗体分子的第一重链多肽链和第一轻链多肽链的条件下，培养包含编码所述第一重链和第二轻链的宿主细胞，产生第一亲本蛋白，(ii)在适于表达所述抗体分子的第二重链多肽链和第二轻链多肽链的条件下，培养包含编码所述第二重链和第二轻链的宿主细胞，产生第二亲本蛋白，(ii)将第一亲本蛋白和第二亲本蛋白等摩尔比例混合，并置于体外适宜的氧化还原条件下，使其装配形成所述抗体。
  24. 药物组合物，其包含权利要求1－19中任一项所述的抗体分子和可药用载体。
  25. 根据权利要求1－19中任一项所述的抗体分子、权利要求24所述的药物组合物的用途，用于在体内和/或体外：
    -以高亲和力，例如KD小于10nM，结合GPRC5D抗原，包括细胞表面表达GPRC5D抗原；
    -使T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)靶向表面表达GPRC5D的细胞，尤其是GPRC5D阳性肿瘤细胞；
    -使T细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)靶向表面表达BCMA的细胞，尤其是BCMA阳性肿瘤细胞；
    -激活T细胞的CD3下游信号通路；
    -介导T细胞对GPRC5D阳性和/或BCMA阳性的肿瘤细胞的杀伤作用；
    -诱导T细胞释放细胞因子，例如TNF-α，IFN-γ,和IL-2；
    -抑制或杀伤GPRC5D阳性和/或BCMA阳性的肿瘤细胞，或
    -治疗GPRC5D阳性和/或BCMA阳性的多发性骨髓瘤，例如治疗BCMA阳性患者群、GPRC5D阳性患者群，或在抗BCMA分子施用后BCMA丢失的GPRC5D阳性患者群。
  26. 权利要求25的用途，其中所述抗体分子或药物组合物用作在个体中治疗和/或预防疾病的药物或用作疾病的诊断工具，优选地，所述个体是哺乳动物，更优选地是人。
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