CN117730088A - 制备阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的方法及其用于治疗对传统抗真菌剂具有抗性的侵袭性真菌感染中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的方法及其用于改善治疗侵袭性真菌感染中的用途，所述侵袭性真菌感染有证据证明/普遍存在对传统抗真菌剂的抗性。

Description

制备阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的方法及其用于治疗对传统抗 真菌剂具有抗性的侵袭性真菌感染中的用途

发明内容

本发明涉及制备阿昔帕曲星二抗坏血酸盐(amcipatricin diascorbate)的方法及其用于改善治疗侵袭性真菌感染中的用途，所述侵袭性真菌感染有证据证明/普遍存在对传统抗真菌剂的抗性。

背景技术

侵袭性真菌疾病是一种公共健康威胁，并且目前仍然是发病率和死亡率的重要原因。真菌类疾病杀死超过170万人，并且影响超过十亿人。严重的真菌感染是由于不同的健康问题而发生的，包括哮喘、AIDS、癌症、器官移植和皮质类固醇治疗。过去，许多侵袭性真菌感染与预后不良有关，因为有效的治疗选择是有限的。具有新的作用机制的新的治疗活性的抗真菌剂的发现相对于传统的治疗选择扩大了可用的药物数量，并且已为临床医生提供了治疗选择。

两性霉素B自从1950年代发现以来一直是全身抗真菌治疗的金标准(Gallis等人，Rev Infect Dis 1990；12：308-29)。该物质属于多烯类药物，其还包括制霉菌素，然而其与两性霉素B相比，毒性更大。多烯剂通过与真菌细胞膜中的麦角甾醇结合而发挥其抗真菌活性。这种相互作用破坏细胞渗透性并导致快速细胞死亡。两性霉素B和灰黄霉素仍然是侵袭性真菌疾病独特的全身治疗选择，直到1970年代早期，此时氟胞嘧啶，一种抑制真菌细胞中DNA和蛋白质合成的嘧啶类似物，被批准。当用作单一疗法时，灰黄霉素的毒性和抗性的快速发展限制了其用于治疗侵袭性真菌感染的常规用途。1978年，发现了第一个系统性唑类(azole)广谱抗真菌剂酮康唑。唑剂通过阻断羊毛甾醇的脱甲基化从而抑制麦角甾醇的合成来发挥其抗真菌活性。酮康唑按时间顺序依次为伊曲康唑(1980)、氟康唑(1982)、伏立康唑(1991)和泊沙康唑(1995)。三唑的扩增谱具有对广谱的霉菌以及念珠菌属(Candidaspecies)和其它酵母菌(yeasts)的杀真菌活性。棘球白素类(echinocandins)代表了一类新的抗真菌剂。卡泊芬净属于这一类，在1994年发现，随后是阿尼芬净(1993)和米卡芬净(1996)。棘球白素类的作用机制是抑制(1→3)-β-D-葡聚糖的产生，其是真菌细胞壁中的必需组分。

上述列出的所有可用于治疗侵袭性真菌感染的药物都具有优点和缺点。两性霉素B仍然是最广泛使用的药物，用于治疗真菌感染和由芽生菌(Blastomyces)、念珠菌(Candida)、隐球菌(Cryptococcus)和组织胞浆菌(Histoplasma sp.)引起的严重的播散性双相型真菌和酵母菌感染。据报道两性霉素B会引起肾毒性、肾血流量减少、恶心、呕吐和厌食，而且两性霉素B的水溶性极差(在蒸馏水中＜0.001mg/ml)。制霉菌素毒性太大而不能全身使用，但是其可用于粘膜念珠菌病(mucous membrane candidiasis)的情况。灰黄霉素用于治疗某些由表皮癣菌(Epidermophyton)、小孢子菌(Microsporum)和发癣菌属(Trichophyton sp)引起的皮肤真菌感染，但可引起肝毒性和胃肠道不适。唑类药物的主要缺点是频繁发生毒性，包括肝坏死和腹部绞痛。因此，唑类主要局部用于治疗念珠菌病、球虫性脑膜炎、皮肤真菌和组织胞浆菌病。此外，已知这些药物与大量药物相互作用并导致肝毒性。唑类的另一个潜在的局限性是念珠菌属(Candida sp)对氟康唑的抗性的出现。卡泊芬净已证明具有抗曲霉属(Aspergillus sp)和念珠菌属的活性，并且耐受性良好，然而，它具有常见的副作用，包括发热、静脉炎、头痛和皮疹。这些可获得的抗真菌抗生素的局限性都推动了对新型和安全的广谱抗真菌抗生素的研究。

这些药剂的治疗用途证实了需要提高人们对其使用相关的抗生素抗性的认识。因此，例如，真菌类型如耳念珠菌(Candida auris，C.auris)可变得对上述类型的多烯剂、棘球白素类以及嘧啶和唑类衍生物具有抗性，使得真菌感染难以治疗(Lee，Wee Gyo等人，Journal of Clinical Microbiology(2011)，49(9)，3139-3142)。

2009年首次发现，耳念珠菌是念珠菌属的子囊真菌的一种，其生长为酵母。大多数耳念珠菌感染可用棘球白素类治疗。然而，一些耳念珠菌感染对主要类型的抗真菌药物有抗性(Chodwhary，Anuradha等人，Emerging Infectious Diseases(2013)，19(10)，1670-1673.Kean，Ryan et al.，mSphere(2019)，4(4)，e00458-19/1-e00458-19/10)。在这种情况下，可能需要高剂量的多种类型的抗真菌剂来治疗感染，但是即使在治疗了侵袭性感染后，患者通常仍会长期受到耳念珠菌的感染。目前，耳念珠菌是一种对全球健康构成严重威胁的真菌，不仅因为它对通常用于治疗念珠菌感染的多种抗真菌药物具有抗性，而且因为它难以用标准实验室方法鉴定(错误鉴定可能导致管理不当)，并且它已经在医疗机构中引起爆发(Ben-Ami，Ronen等人，Emerging Infectious Diseases(2017)，23(2)，195-203)。

在真菌感染中，毛霉菌病(mucormycosis)，也称为接合菌病(zygomycosis)或黑色真菌，是另一种严重但罕见的真菌感染，其通常发生在免疫抑制的个体、控制不佳的糖尿病和高剂量皮质类固醇治疗中。这种真菌感染是由毛霉菌目(Mucorales order)的真菌引起的。在某些情况下，这种感染可能是致命的，这是由于根霉菌属(genus Rhizopus)(最常见的)、毛霉菌属(Mucor)、Lichterman、鳞质霉属(Apophysomyces)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、被孢霉属(Mortierella)和瓶霉属(Saksenaea)的真菌的侵袭所致。这些真菌的孢子通常存在于环境中(例如在发霉的面包和水果上)，并且经常被吸入，但仅在一些人中引起疾病。

毛霉菌病的药物治疗涉及两性霉素B的使用，最初缓慢地注入静脉，然后每天施用，持续两周，或者与唑类(艾沙康唑或泊沙康唑)交替使用。然后需要手术切除“真菌球”(fungus ball)。

在2021年早期，印度已经报道了大约12,000例“黑色真菌”(black fungus)，大多数是在从Covid-19恢复的患者中，最可能是由于用于治疗Covid-19患者的类固醇的处方过量。事实上，开具类固醇是为了帮助抵御过度的炎症反应(所谓的“细胞因子风暴”)，这种炎症反应伤害身体而不阻止由冠状病毒引起的感染。印度和巴基斯坦具有最高的发病率，每年每一百万人约有140例。

毛霉菌病通常是威胁生命的感染。对已公开的毛霉菌病病例的综述发现总体全因死亡率为54％(Roden MM等人，Clin Infect Dis.2005Sep 1；41(5)：634-53)。对用于治疗“黑色真菌”的更有活性的抗真菌药剂的需求促进了该领域的药理学研究，因为专家认为施用太多的类固醇来治疗Covid-19可能引发继发性感染和对传统使用的抗真菌药的抗生素抗性。

阿昔帕曲星二抗坏血酸盐(化学名称：克念菌素D(Candicidin D)，18-脱羧基-40-脱甲基-3，7-二脱氧-N3′-[(二甲基氨基)乙酰基]-18-[[[2-(二甲基氨基)乙基]-氨基]羰基]-3，7-二羟基-N47-甲基-5-氧代-，环状15，19-半缩醛，具有L-抗坏血酸(1：2)的化合物；注册号202748-83-2；还被编码为SPK-843、SPA-843或SPA-S-843；其它名称SPK-843；SPA-843、SPA-S-843；图1)自1992年以来是已知的(EP 489308)。

该化合物是合成的帕曲星A的酰胺衍生物(化学名称：克念菌素D，40-脱甲基-3，7-二脱氧-3，7-二羟基-N⁴⁷-甲基-5-氧代-，环状15，19-半缩醛；由注册号76551-64-9确定的化合物；图2)，对白色念珠菌的杀真菌最小抑制浓度为7.5ng/mL，对大鼠红细胞的溶血最低浓度为18mg/mL(Bruzzese，T.等人，European Journal of Medicinal Chemistry(1996)，31(12)，965-972)。

阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的抗菌谱已被进一步证实能对几种酵母有抗菌作用，并且对不同种类的念珠菌，包括光滑念珠菌(Candida glabrata)、克柔念珠菌(Candidakrusei，C.krusei)和热带念珠菌(Candida tropicalis)也有抗菌作用(Rimaroli等人；Antimicrobial Agents and Chemotherapy，42，11，3012-3013，1998；US 5908834)。在不同的哺乳动物细胞系和髓系祖细胞(myeloid committed progenitors)上评价阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的毒性。结果显示，阿昔帕曲星二抗坏血酸盐可以作为预防细胞培养物中酵母污染的预防剂，并且还能够治愈被真菌感染的细胞培养物。与化学相关化合物两性霉素B(图3)相比，阿昔帕曲星二抗坏血酸盐对13种曲霉属(Aspergillus spp.)菌株、4种毛霉菌属(Mucor sp.)菌株、4种米根霉属(Rhizopus oryzae，R.oryzae)菌株、2种多变拟青霉(Paecilomyces variotii，P.variotii)菌株、5种青霉属(Penicillium spp.)菌株、1种申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenkii)菌株、7种发癣菌属菌株和2种小孢子菌属(Microsporum spp)菌株的活性测定结果显示，阿昔帕曲星二抗坏血酸盐对毛霉菌属和多变拟青霉最具杀真菌作用。阿昔帕曲星二抗坏血酸盐和两性霉素B对曲霉属(最小杀真菌浓度的几何平均值为12.53μg/mL)、青霉属(约12μg/mL)和申克氏孢子丝菌(MFC 19.2μg/mL)显示出相同的杀真菌活性。两性霉素B的最小杀真菌浓度值的几何平均值低于阿昔帕曲星二抗坏血酸盐对米根霉属、小孢子菌属和发癣菌属的最小杀真菌浓度值的几何平均值。

在药物浓度为0.25-0.62mg/L时，阿昔帕曲星二抗坏血酸盐抑制念珠菌属从酵母向菌丝体形式转化的能力是明显的(Strippoli，等人.Journal of AntimicrobialChemotherapy，45，2，235-237，2000)。将阿昔帕曲星二抗坏血酸盐与两性霉素B对具有临床意义的念珠菌属(n＝109)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)(n＝49)和曲霉属(n＝36)的分离物的体外杀真菌作用和抑制真菌活性进行比较(Kantaricoglu等人，Journal ofChemotherapy Volume：15，3，296-298，2003)。在大鼠中进行单次和多次施用试验(Bruzzese等人，Chemotherapy，47，2，77-85，2001)以评价阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的血清和组织浓度。单次和多次施用试验均使用静脉途径1.25mg/kg的剂量。进行单次施用试验，与静脉剂量1mg/kg的两性霉素B比较。注射后15min至96h间隔抽取血浆样品。阿昔帕曲星二抗坏血酸盐和两性霉素B的消除半衰期分别为22.15和18.15小时，趋近无穷大的曲线下面积(AUC(0-∞))数值分别为35.52和10.33μg.h.ml^-1。两种药物都显示广泛的组织分布，对于阿昔帕曲星二抗坏血酸盐，肾的摄取量较高，其次是肝、脾和肺，对于两性霉素B，脾的摄取较高，其次是肺、肝和肾。多次施用试验(1.25mg/kg/天，持续7天)导致持续的血清和组织浓度。在第七天，给药后5min至96h间隔对大鼠进行采血。血清消除半衰期和AUC(0-∞)数值大约是单剂量研究的两倍(分别为41.4h和72.1μg·h·ml^-1)。此外，组织的半衰期和从0至无穷大的AUC大于单剂量试验中的那些。

关于阿昔帕曲星二抗坏血酸盐用于全身性真菌感染的潜在治疗的综述发表于2005年(Kasanah等人，Current Opinion in Investigational Drugs(ThomsonScientific)，6，8，845-853，2005)。

尽管对阿昔帕曲星二抗坏血酸盐进行了有前景的初步体外和体内试验，证实其广谱抗真菌活性至少与两性霉素B相当，且毒性小，但该化合物由于若干原因而没有进入治疗，所述原因包括化学、技术原因，以及需要更好的定义阿昔帕曲星二抗坏血酸盐相对于两性霉素B的抗真菌谱。

升级原始生产方法的化学和技术困难包括：总收率低、纯度低、生产成本高、使用剧毒的、爆炸性试剂以及这一事实，即最终产物仅能通过多次色谱纯化来分离并且仅以无定形形式(而非结晶)存在。

Bruzzese等人公开的原始生产方法(Eur J Med Chem，1996，31，965-972)以帕曲星A为起始原料，采用两步合成法合成了SPK-843碱(阿昔帕曲星，amcipatricin)。该合成方法对于扩大相同的规模显示出一些缺点：摩尔产率低，所得产物的色谱纯度低(作者不能通过HPLC获得纯度超过95％的产物)，使用多种色谱纯化(描述了三种不同的色谱纯化方法)和使用剧毒和爆炸性试剂(叠氮磷酸二苯基酯(diphenylphosphoryl azide)；由注册号26386-88-9确定的化合物)。特别是阿昔帕曲星碱，当在Bruzzese等人公开的相同实验条件下进行进一步色谱纯化时，具有上述HPLC图谱，其色谱图未发生变化；此外，通过结晶纯化阿昔帕曲星碱或阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的任何尝试均失败，得到具有未经修饰的色谱图的产物。为了解决这些问题，显然需要开发更稳健的替代性方法，其可以提供色谱纯度增加的产物，适合用作原料药且避免使用剧毒和危险的试剂。

由于当与两性霉素B相比时，阿昔帕曲星二抗坏血酸盐对白色念珠菌(C.albicans)、克柔念珠菌、黄色念珠菌(C.flavus)和黑色念珠菌(C.niger)具有较好的抗真菌活性，较好的耐受性(更低的毒性)和良好的水溶性，其对已知抗生素抗性的念珠菌菌株如耳念珠菌和对毛霉菌属真菌的抗真菌作用已被进一步评价。

事实上，相对于两性霉素B，阿昔帕曲星二抗坏血酸盐(100mg/ml)的良好的水溶性允许在体内确定有效治疗耐药耳念珠菌感染和黑色真菌感染的最佳药代动力学参数，其中两性霉素B在生理pH值下基本不溶于水，因此显示低的胃肠吸收速率。尽管研究表明脂质体作为药物载体可以显著降低两性霉素B的毒副作用，但是这种替代性制剂仍然不能完全令人满意，因为脂质体制剂的抗菌活性低于两性霉素B，因此需要增加有效治疗剂量。

最后，阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的良好的水溶性允许在水性介质中测试一些未开发的多烯衍生物的施用途径，如雾化器溶液、液体制剂和/或用于打算吸入使用的雾化器溶液的粉末(通过连续操作的雾化器或计量剂量(metered-dose)的雾化器或加压的吸入溶液转化为气溶胶的溶液)、雾化器溶液和固体形式的粉末(吸入粉末，以胶囊或片剂或其它计量剂量形式，预分配，以计量剂量形式)。对于最后一种方法，使用喷雾干燥技术从水溶液中获得90％的粒径分布等于或小于5μm的干粉的可能性允许治疗呼吸道中的真菌感染，所述干粉的粒径能够在吸入期间穿透肺部。对阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的冻干粉末进行操作不能获得该粒径，因为这种产物具有低流动性和高吸湿性，因此不适于微粉化过程。

发明概述

本发明提供了一种从帕曲星A制备阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的改进方法。本发明的方法在一锅法中提供了总收率22％的所需化合物，HPLC色谱纯度高于97％，并且避免了剧毒和爆炸性试剂的使用。

该化合物显示出与氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B和米卡芬净相当的抗真菌活性，用于治疗由耳念珠菌和由毛霉菌目真菌病原体如卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、米根霉(Rhizopus oryzae)和根霉小孢子(Rhizopus microspores)引起的感染，因此，使得阿昔帕曲星二抗坏血酸盐对治疗黑色真菌感染也具有潜在的活性。此外，使用喷雾干燥技术，阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的良好的水溶性使得可以获得90％的粒径等于或小于5μm(D90≤5μm)的干粉，从而允许开发固体吸入器制剂，其需要减小粒径以获得可接受的呼吸性，以及待喷雾的液体制剂，以用于治疗肺部真菌感染。

详细说明

阿昔帕曲星的制备

阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的制备方法包括以下步骤：

a)由N，N-二甲基甘氨酸、五氟苯酚和偶联剂制备N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯；

b)使在步骤a)中获得的N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯与帕曲星A反应，得到中间体1；

c)向含有中间体1的反应混合物中加入偶联剂，得到中间体2；

d)向含有中间体2的反应混合物中加入N，N’-二甲基氨基乙胺；

e)通过水稀释、过滤和干燥分离来自步骤d)的沉淀物；

f)通过正相色谱法(direct phase chromatography)纯化来自步骤e)的反应混合物，得到阿昔帕曲星粗品；

g)通过反相色谱法纯化来自步骤f)的阿昔帕曲星粗品，得到纯化的阿昔帕曲星；

h)向来自步骤g)的阿昔帕曲星的水溶液中加入L-抗坏血酸，得到阿昔帕曲星二抗坏血酸盐；

i)通过冷冻干燥或喷雾干燥分离固体阿昔帕曲星二抗坏血酸盐。

本发明方法的合成方案在方案1中报道。

N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯的制备是通过使五氟丙基苯酚在二氯甲烷溶液中与N，N-二甲基甘氨酸反应，使用偶联剂，优选氮杂苯并三唑四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，更优选N，N’-二环己基碳二亚胺，在15至30℃的温度范围，优选20-25℃，持续时间范围为10至34小时，优选24小时进行的。在五氟苯酚的浓度包括0.5-2.0mol/l的范围，优选0.78mol/l下，五氟苯酚/N，N-二甲基甘氨酸/N，N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1.0/1.0÷1.2/1.0÷1.4、优选1.0/1.0/1.3。

阿昔帕曲星粗品的制备是通过使N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯和帕曲星A以1.0÷0.8至1.2÷1的分子比，在15至30℃的温度范围，优选25℃，使用log P为-0.6至-1.2的非质子有机溶剂，优选N，N’-二甲基甲酰胺、N，N’-二甲基乙酰胺或二甲基亚砜，在帕曲星A的浓度为0.15至0.5摩尔，优选0.17摩尔下，持续时间范围为10至60分钟，优选20分钟反应进行的。然后将含有中间体1(2-(二甲基氨基)-N-((2R，3S，4S，5S，6R)-2-(((1R，3S，5S，7R，9R，13R，18S，19E，21E，23Z，25Z，27E，29E，31E，33R，36R，37S)-36-(氢过氧基-12-甲基)-1，3，5，7，9，13，37-七羟基-17-((2S，5R)-5-羟基-7-(4-(甲基氨基)苯基)-7-氧代庚-2-基)-18-甲基-11，15-二氧代-16，39-二氧杂双环[33.3.1]三十九烷-19，21，23，25，27，29，31-庚烯-33-基)氧基)-3，5-二羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺)的反应混合物直接用选自氮杂苯并三唑四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，优选N，N’-二环己基碳二亚胺的冷凝剂处理，以得到相应的五氟酯中间体(中间体2；(1R，3S，5S，7R，9R，13R，18S，19E，21E，23Z，25Z，27E，29E，31E，33R，36R，37S)-33-(((2R，3S，4S，5S，6R)-4-(2-(二甲基氨基)乙酰胺)-3，5-二羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1，3，5，7，9，13，37-七羟基-17-((2S，5R)-5-羟基-7-(4-(甲基氨基)苯基)-7-氧代庚-2-基)-18-甲基-11，15-二氧代-16，39-二氧杂双环[33.3.1]三十九烷-19，21，23，25，27，29，31-庚烯-36-甲酸全氟苯基酯)。所用偶联剂与帕曲星A初始量的摩尔比范围为1/1.5÷2.0，优选1/1.65。在15至40℃，优选20-25℃的温度范围，将N，N’-二甲基氨基乙胺加入到该反应混合物中。帕曲星A与N，N’-二甲基氨基乙胺的摩尔比范围为1/4，优选1/3。

将反应混合物用冷水稀释，直接沉淀出阿昔帕曲星粗品，其可通过抽吸回收。在该步骤中使用的冷水的量是所使用的非质子有机溶剂的初始量的3-4倍，优选3.6倍，并且水温为0-15℃，优选10℃。

然后将得到的粗产物(76-80g)首先通过正相硅胶色谱法纯化，然后通过反相硅胶色谱法纯化。

在该纯化步骤中，正相硅胶与帕曲星A的初始量的重量比为1∶20。在该步骤中使用的合适的固定相是粒径分布包括35至230目，优选70-230目的硅胶；在该步骤中使用的流动相由三种组分组成：83/15/2v/v/v体积比的非质子有机溶剂/极性有机溶剂/碱性水溶液。用作流动相组分的非质子有机溶剂的实例包括二氯甲烷、氯仿、丙酮和乙酸乙酯，优选二氯甲烷。用作流动相组分的极性有机溶剂的实例包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇，优选甲醇。可用作流动相组分的合适的碱性水溶液包括10-30％w/v氨水溶液，优选25％w/v溶液。

通过HPLC分析洗脱的馏分，并在减压、最高35℃将所选的馏分浓缩至约初始体积的10-20％，得到沉淀物，通过抽吸回收沉淀物并在真空下于35℃的最高温度下干燥，得到13.1g阿昔帕曲星碱粗品(18-脱羧基-40-脱甲基-3，7-二脱氧-N^3′-[(二甲基氨基)乙酰基]-18-[[[2-(二甲基氨基)乙基]-氨基]羰基]-3，7-二羟基-N⁴⁷-甲基-5-氧代-，环状15，19-半缩醛)。

阿昔帕曲星粗品最终通过反相色谱法纯化。所用的固定相可以是反相硅胶RP18(40-63μm)。粗品与固定相的重量比范围为1/40÷70，优选1/65。将粗品上样到含有L-抗坏血酸的色谱柱上：阿昔帕曲星粗品与L-抗坏血酸的摩尔比范围为1/1÷7，优选1/7，相对于阿昔帕曲星的摩尔数，上样到柱上的水溶液的浓度包括1.2-2.0mol/l的范围。该柱用乙腈/L-抗坏血酸盐水溶液或甲酸盐缓冲液调节：乙腈与水性缓冲液的体积比范围为5÷10/95÷90的范围，优选5/95，并且酸的浓度范围为10-100mM，优选50mM。缓冲液的最终pH值范围为3.0至5.0，优选4.1。

以1床体积/5min的流速洗脱柱子，将乙腈与缓冲液的比例从5÷10/95÷90逐渐增加至30÷40/70÷60。

通过HPLC分析洗脱的馏分，并在5℃搅拌下用5-10％氨溶液25％v/v碱化所选馏分。在加入氨溶液25％v/v后，所选馏分的最终pH值范围为8.0-12.0，优选12.0。将所得溶液在搅拌下于0-15℃，优选5℃保持12-18小时，通过抽吸收集沉淀的固体，并在35℃的最高温度下真空干燥16-24小时，得到4.3g HPLC纯度＞97％的阿昔帕曲星。

阿昔帕曲星二抗坏血酸盐是由克念菌素D、18-脱羧基-40-脱甲基-3，7-二脱氧-N3′-[(二甲基氨基)乙酰基]-18-[[[2-(二甲基氨基)乙基]-氨基]羰基]-3，7-二羟基-N47-甲基-5-氧代-，环状15，19-半缩醛通过与2-3当量的L-抗坏血酸的水溶液，在阿昔帕曲星的浓度包括0.10-0.20mol/l，优选0.13mol/l，于20至40℃的温度范围，优选30℃成盐来制备。使用冷冻干燥或喷雾干燥技术，从所得溶液中能够分离固体阿昔帕曲星二抗坏血酸盐，其中阿昔帕曲星的收率大于130％。

具有乳糖一水合物的阿昔帕曲星二抗坏血酸盐制剂的制备

本发明具有乳糖一水合物的阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的固体制剂是使用喷雾干燥技术由阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的水溶液制备，其中阿昔帕曲星二抗坏血酸盐在水中的浓度包括0.5至20％w/v的范围，优选2％。将乳糖一水合物加入到该溶液中，保持在惰性气氛搅拌下，冷却至0至10℃的温度范围。阿昔帕曲星二抗坏血酸盐与乳糖一水合物的重量比包括1/1÷3的范围，优选1/2.3。过滤得到的澄清产物，并在1小时内用喷雾干燥器(入口温度为130-150℃)处理滤液，得到D90粒径分布低于5μm的具有乳糖一水合物的阿昔帕曲星二抗坏血酸盐制剂。

实验部分

说明

MIC：最低抑菌浓度(MIC)被定义为具有抑菌作用的抗菌成分的最低浓度。

D90：在粉末中，直径低于限定值的颗粒部分(90％)。

呼吸性：可呼吸的性质或状态；通常与固体粉末吸入器相关联，其粒径在吸入过程中能够穿透肺部(约5μm以及更小)，以每次驱动或每次剂量为基础。

N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯的制备

在圆底烧瓶中加入二氯甲烷(140mL)和五氟苯酚(20.1g)。将该混合物保持在20-25℃搅拌下得到均匀溶液，然后依次加入N，N-二甲基甘氨酸(11.2g)和N，N’-二环己基碳二亚胺(28.1g)。将反应混合物在20-25℃搅拌下保持24小时，然后将获得的非均相混合物在真空下过滤。将滤液减压蒸发至干，得到36.8g的N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯，其不经进一步纯化即可用于下一步。

由帕曲星A制备克念菌素D粗品、18-脱羧基-40-脱甲基-3，7-二脱氧-N^3′-[(二甲氨基)乙酰基]-18-[[[2-(二甲氨基)乙基]氨基]羰基]-3，7-二羟基-N⁴⁷-甲基-5-氧代-，环状15，19-半缩醛(阿昔帕曲星粗品)

在氮气流、20-25℃搅拌下，向圆底烧瓶中依次加入N，N’-二甲基甲酰胺(250mL)和N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯(13.8g)。将所得混合物在搅拌下冷却至10℃，分批加入帕曲星A(50g)。该溶液含有中间体1，其可作为中间体分离或直接用于下一步；在该最后一种选择之后，将所得混合物在10℃搅拌下保持20’，然后加入N，N’-二环己基碳二亚胺(15g)。将所得反应混合物在氮气下搅拌24小时，反应温度自发升至20-25℃。该溶液含有中间体2，其可作为中间体分离或直接用于下一步；在该第二选择之后，在20-25℃搅拌下，在60’内将N，N’-二甲基氨基乙胺(15mL)逐滴加入到反应混合物中。在60’之后，将反应混合物在搅拌下加入到10℃温度的水(900mL)中，通过抽吸回收得到的沉淀物，并在过滤器上用水(100mL)和甲醇(100mL)洗涤。将产物在烘箱中于+35-40℃真空干燥，得到固体，将其在搅拌下于20-25℃悬浮于圆底烧瓶中的甲醇(0.56L)中。向所得悬浮液中逐滴加入25％氨水溶液(56mL)。然后加入二氯甲烷(2.24L)，并将混合物保持搅拌60’。此后，依次加入二氯甲烷(2.8L)和25％氨水溶液(56mL)，抽吸过滤不均匀混合物。将滤液上样到硅胶柱(70-230目；1000g)上，该硅胶柱预先用二氯甲烷/甲醇9/1v/v混合物调节。用8床体积的二氯甲烷/甲醇/25％氨水溶液83/15/2v/v/v洗脱柱子。通过HPLC分析洗脱的馏分，并在减压下将选择的馏分在最高35℃浓缩至初始体积的约20％。

然后通过抽吸过滤所得的非均相混合物，并将所得的湿固体在真空下于最高35℃干燥12小时，得到13g阿昔帕曲星粗品。

中间体1. 2-(二甲基氨基)-N-((2R，3S，4S，5S，6R)-2-(((1R，3S，5S，7R，9R，13R，18S，19E，21E，23Z，25Z，27E，29E，31E，33R，36R，37S)-36-(氢过氧基-l2-甲基)-1，3，5，7，9，13，37-七羟基-17-((2S，5R)-5-羟基-7-(4-(甲基氨基)苯基)-7-氧代庚-2-基)-18-甲基-11，15-二氧代-16，39-二氧杂双环[33.3.1]三十九烷-19，21，23，25，27，29，31-庚烯-33-基)氧基)-3，5-二羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺的分离

通过色谱纯化含有该化合物的反应混合物来分离该化合物。减压蒸发后，使用所得残余物与硅胶的重量比1/10，通过硅胶色谱(70-230目)纯化含有中间体1的反应混合物。用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱后，通过在35℃真空蒸发所选馏分来分离纯的中间体1。

元素分析C₆₂H₉₀N₃O₂₀计算：理论值：C，62.19；H，7.58；N，3.51；O，26.72；实测值：C，62.17；H，7.50；N，3.49；O，26.68。

中间体2.(1R，3S，5S，7R，9R，13R，18S，19E，21E，23Z，25Z，27E，29E，31E，33R，36R，37S)-33-(((2R，3S，4S，5S，6R)-4-(2-(二甲基氨基)乙酰胺基)-3，5-二羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1，3，5，7，9，13，37-七羟基-17-((2S，5R)-5-羟基-7-(4-(甲基氨基)苯基)-7-氧代庚-2-基)-18-甲基-11，15-二氧代-16，39-二氧杂双环[33.3.1]三十九烷-19，21，23，25，27，29，31-庚烯-36-甲酸全氟苯基酯)的分离

通过色谱纯化含有该化合物的反应混合物来分离该化合物。在低于35℃的温度下减压蒸发后，使用所得残余物与硅胶的重量比2/10，通过硅胶色谱(70-230目)纯化含有中间体2的反应混合物。在用二氯甲烷/丙酮梯度洗脱后，通过在35℃真空蒸发所选馏分，得到纯的中间体2。

元素分析C₆₉H₉₂F₅N₃O₂₀计算：理论值：C，60.12；H，6.73；F，6.89；N，3.05；O，23.21；实测值：C，60.08；H，6.69；F，6.82；N，3.08；O，23.16。

克念菌素D粗品、18-脱羧基-40-脱甲基-3，7-二脱氧-N^3′-[(二甲氨基)乙酰基]-18-[[[2-(二甲氨基)乙基]氨基]羰基]-3，7-二羟基-N⁴⁷-甲基-5-氧代-，环状15，19-半缩醛(阿昔帕曲星粗品)的纯化

在圆底烧瓶中，将L-抗坏血酸(7.7g)溶于水(50mL)中，然后加入由前面步骤得到的阿昔帕曲星粗品(7.7g)。将所得溶液上样到填充有反相硅胶RP 18(40-63μm；500g)的柱子中，所述反相硅胶RP预先用乙腈/L-抗坏血酸盐缓冲液(50mM水溶液，pH 4.1)5/95v/v混合物调节。使用乙腈/L-抗坏血酸盐缓冲液(50mM水溶液，pH 4.1)5/95v/v混合物至乙腈/L-抗坏血酸盐缓冲液(50mM水溶液，pH 4.1)30/70v/v混合物作为洗脱剂，以100ml/min的流速洗脱柱子。通过HPLC分析洗脱的馏分，并在5℃搅拌下用5-10％氨溶液25％v/v碱化所选馏分。将所得混合物在搅拌下于该温度保持12-18小时，通过抽吸收集沉淀的固体并在最高35℃真空干燥18小时，得到4.3g HPLC纯度＞97％的阿昔帕曲星碱。

克念菌素D、18-脱羧基-40-脱甲基-3，7-二脱氧-N^3′-[(二甲基氨基)乙酰基]-18-[[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]羰基]-3，7-二羟基-N⁴⁷-甲基-5-氧代-，环状15，19-半缩醛的二抗坏血酸盐的制备(阿昔帕曲星二抗坏血酸盐)

向圆底烧瓶反应器中加入软化水(480ml)，然后将氮气鼓泡30分钟，并在30℃的温度下搅拌，依次加入L-抗坏血酸(24.2g)和阿昔帕曲星(80g)，保持悬浮液在剧烈搅拌下以获得澄清溶液。将该溶液在0.45μm过滤器上过滤，将滤液冷冻干燥，得到104g阿昔帕曲星二抗坏血酸盐。

或者，阿昔帕曲星二抗坏血酸盐可以在0.45μm过滤器上过滤后，或用水稀释至获得1％w/v浓度后，在入口温度130∶150℃使用喷雾干燥技术，通过上述溶液(约20％w/v溶液)分离。

所得产物的化学-物理性质与公开的文献数据一致。

具有乳糖一水合物的阿昔帕曲星二抗坏血酸盐制剂的制备

在圆底烧瓶中，在0℃和氮气气氛搅拌下，加入阿昔帕曲星二抗坏血酸盐(2g)和水(200m1)。将该混合物在0℃搅拌10’，然后分批加入乳糖一水合物(4.6g)，将该混合物再搅拌10’。将所得溶液在1小时内用喷雾干燥器(入口温度130-150℃)以3-4ml/min的进料速率处理，得到D90粒径分布小于5μm的具有乳糖一水合物30/70w/w(5.28g)的阿昔帕曲星二抗坏血酸盐制剂。

临床分离的耳念珠菌不同菌株中阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的MIC测定

根据临床和实验室标准化协会(CLSI，doc M27，第4版)的方案，进行化合物阿昔帕曲星二抗坏血酸盐对真菌病原体耳念珠菌的22种临床分离株的抗真菌活性测试，以确定最小抑制浓度(MIC)。对每种分离株进行三次测试。所得结果列于表1。

阿昔帕曲星二抗坏血酸盐抗不同ATCC和毛霉目真菌病原体临床分离株的MIC测定

根据临床和实验室标准化协会(CLSI，doc M27，第4版)的方案，进行阿昔帕曲星二抗坏血酸盐对不同ATCC和毛霉菌目真菌病原体的临床分离株的抗真菌活性测试，以确定最小抑制浓度(MIC)。对每种分离株进行三次测试。所得结果列于表2。

表2.阿昔帕曲星二抗坏血酸盐抗不同ATCC和毛霉菌目真菌病原体临床分离株的MIC值及其与其它抗真菌化合物的比较

Claims (21)

1.一种制备阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的方法，包括以下步骤：

a)由N，N-二甲基甘氨酸、五氟苯酚和偶联剂制备N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯；

b)使在步骤a)中获得的N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯与帕曲星A反应，得到中间体1；

c)向含有中间体1的反应混合物中加入偶联剂，得到中间体2；

d)向含有中间体2的反应混合物中加入N，N’-二甲基氨基乙胺；

e)通过水稀释、过滤和干燥分离来自步骤d)的沉淀物；

f)通过正相色谱法纯化来自步骤e)的反应混合物，得到阿昔帕曲星粗品；

g)通过反相色谱法纯化来自步骤f)的阿昔帕曲星粗品，得到纯化的阿昔帕曲星；

h)向来自步骤g)的阿昔帕曲星的水溶液中加入L-抗坏血酸，得到阿昔帕曲星二抗坏血酸盐；

i)通过冷冻干燥或喷雾干燥分离固体阿昔帕曲星二抗坏血酸盐。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤a)和c)中的偶联剂选自氮杂苯并三唑四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)。

3.根据权利要求1的方法，其中在步骤a)中，五氟苯酚/N，N-二甲基甘氨酸/偶联剂的摩尔比为1.0/1.0÷1.2/1.0÷1.4。

4.根据权利要求1的方法，其中在步骤b)中使用摩尔比为1.0/0.8至1.2的N，N-二甲基甘氨酰五氟苯基酯和帕曲星A，温度范围为15至30℃，使用log P为-0.6至-1.2的非质子有机溶剂。

5.根据权利要求4的方法，其中所述非质子有机溶剂是N，N’-二甲基甲酰胺、N，N’-二甲基乙酰胺或二甲基亚砜或其混合物。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤d)中帕曲星A与N，N’-二甲基氨基乙胺的摩尔比范围为1/3至1/4。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤f)中的固定相是具有35至230目的粒径分布的硅胶，并且流动相由以下组成：非质子有机溶剂、极性有机溶剂和碱性水溶液，其体积比为83/15/2v/v/v。

8.根据权利要求7的方法，其中所述非质子有机溶剂是二氯甲烷、氯仿、丙酮或乙酸乙酯；所述极性有机溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇或正丙醇；所述碱性水溶液包括10-30％w/v的氨水溶液。

9.根据权利要求1的方法，其中步骤g中的固定相为反相硅胶RP18(40-63μm)或等同物；阿昔帕曲星粗品与所述固定相的重量比包括1/40÷70的范围；在1床体积/5min的流速下进行洗脱，将乙腈与缓冲液的相对比率从5∶10÷95∶90提高到30∶40÷70∶60的范围。

10.根据权利要求9的方法，其中所述缓冲液是L-抗坏血酸盐或甲酸盐缓冲液；乙腈与所述水性缓冲液的体积比范围为5∶10/95∶90；酸的浓度范围为10-100mM；缓冲液的最终pH值范围为3.0至5.0。

11.根据权利要求1的方法，其中步骤h)中的盐形成是使用2-3当量的L-抗坏血酸、在水溶液中、在阿昔帕曲星的浓度为0.10-0.20mol/1、在20至40℃的温度范围进行的。

12.根据权利要求1的方法，其中步骤i中阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的分离是使用喷雾干燥器、由1-20％水溶液、在130-150℃的入口温度进行的。

13.根据权利要求12的方法，其中所获得的粒径分布DL90低于5μm。

14.式1的化合物2-(二甲基氨基)-N-((2R，3S，4S，5S，6R)-2-(((1R，3S，5S，7R，9R，13R，18S，19E，21E，23Z，25Z，27E，29E，31E，33R，36R，37S)-36-(氢过氧基-12-甲基)-1，3，5，7，9，13，37-七羟基-17-((2S，5R)-5-羟基-7-(4-(甲基氨基)苯基)-7-氧代庚-2-基)-18-甲基-11，15-二氧代-16，39-二氧杂双环[33.3.1]三十九烷-19，21，23，25，27，29，31-庚烯-33-基)氧基)-3，5-二羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-4-基)乙酰胺

15.式2的化合物(1R，3S，5S，7R，9R，13R，18S，19E，21E，23Z，25Z，27E，29E，31E，33R，36R，37S)-33-(((2R，3S，4S，5S，6R)-4-(2-(二甲基氨基)乙酰胺基)-3，5-二羟基-6-甲基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-1，3，5，7，9，13，37-七羟基-17-((2S，5R)-5-羟基-7-(4-(甲基氨基)苯基)-7-氧代庚-2-基)-18-甲基-11，15-二氧代-16，39-二氧杂双环[33.3.1]三十九烷-19，21，23，25，27，29，31-庚烯-36-甲酸全氟苯基酯

16.治疗由耳念珠菌和/或由毛霉菌目真菌病原体如卷枝毛霉菌、米根霉菌和/或根霉小孢子引起的、具有不同病因的感染的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的阿昔帕曲星二抗坏血酸盐。

17.药物组合物，其包含有效量的、单独的或与其它治疗剂组合的阿昔帕曲星或阿昔帕曲星二抗坏血酸盐，与合适的载体和/或赋形剂一起配制，用于口服、皮肤/皮下、口腔、耳、吸入、心内、鼻、眼、阴道或注射/输注施用。

18.根据权利要求17的组合物，其中所述其它治疗剂选自抗生素剂、支气管扩张剂、类固醇、磷酸二酯酶-4(PDE-4)抑制剂。

19.根据权利要求17的组合物，其为通过喷雾干燥制备的、具有乳糖一水合物的阿昔帕曲星二抗坏血酸盐的固体制剂，所述乳糖一水合物的DL90≤5μm。

20.根据权利要求19的组合物，其为干粉吸入器(DPI)制剂的形式。

21.根据权利要求17的组合物，其为液体定量吸入器(MDI)的形式。