CN117721033A

CN117721033A - 一株发酵粘液乳杆菌ks6及其在制备抗炎和助睡眠食品药品中的应用

Info

Publication number: CN117721033A
Application number: CN202311321763.1A
Authority: CN
Inventors: 陆勇军; 葛振煌; 许敏青
Original assignee: Guangdong Yuechuang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Yuechuang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-10-13
Filing date: 2023-10-13
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2043-10-13
Also published as: CN117721033B

Abstract

本发明属于益生菌及其应用技术领域，具体涉及一株发酵粘液乳杆菌KS6及其在制备抗炎和助睡眠食品药品中的应用。本发明从中国广东广州地区一名健康成年人的肠道粪便样品中分离纯化得到一株发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)KS6菌株，该菌株具有的多种益生功效，包括具有优越的蛋白酶活性，可产生3‑羟基丁酸，可抑制黄嘌呤氧化酶活性，可产生和分泌γ‑氨基丁酸，可产生和分泌透明质酸，可产生和分泌谷胱甘肽，可清除DPPH自由基，可清除羟自由基，具有超氧化物歧化酶活性，可降解胆固醇，可用于抗炎和助睡眠等领域，比如，制作成抗炎和助睡眠药品，具有重要的应用价值和经济价值。

Description

一株发酵粘液乳杆菌KS6及其在制备抗炎和助睡眠食品药品中的应用

技术领域

本发明属于益生菌及其应用技术领域，具体涉及一株发酵粘液乳杆菌KS6及其在制备抗炎和助睡眠食品药品中的应用。

背景技术

发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)，又名发酵乳杆菌，革兰氏阳性杆状细菌，兼性厌氧。发酵乳杆菌具有较高的耐受力，能够适应人体肠道当中的低酸和高胆盐环境。此外，发酵乳杆菌还具有较高的安全性及遗传稳定，是人体肠道当中最早定植的益生菌之一，会随着人体年龄的增长以及身体的变化而不断产生变化，当该菌数量低于正常值时，就会对人体健康产生影响。

发酵粘液乳杆菌广泛地存在于人和动物的肠道并随粪便排出。粘液乳杆菌是人体正常菌群的一部分，其作为肠道正常微生物体系的重要组成之一，并终生伴随宿主，对于维持肠道微生态平衡有重要意义。同时，作为肠道菌群中的益生菌，发酵粘液乳杆菌也是一种可食用型的乳杆菌，无毒副作用，可以起到帮助肠道蠕动的作用，并且还可以增强人体的消化能力以及提高免疫力等。目前，发酵粘液乳杆菌作为一种具有极大潜力的益生性粘液乳杆菌已成为研究的热点，并且正在不断被用来制作成适用于人和动物的益生菌制剂。

研究表明，不同的发酵粘液乳杆菌菌株具有不同的益生功能，比如：(1)提高宿主免疫力。比如，发酵粘液乳杆菌CECT5716能有效预防、缓解及治疗孕妇和哺乳期女性常见的不适症状，帮助胎儿在出生前预先建立肠道免疫保护系统，并显著提高婴幼儿的免疫力和抵抗力。(2)抗菌：预防呼吸道感染，降低感冒、咳嗽等疾病的发生率，防止阴道感染。(3)改善肠道健康：促进胃肠道消化系统健康，降低肠道有害物质，缓解便秘。(4)帮助胎儿建立自身免疫系统，给宝宝先天免疫力打下基础。(5)有效防治乳腺炎，缓解乳房酸、胀痛现象，促进乳腺健康，缓解紧张、焦虑情绪。

由于发酵粘液乳杆菌的来源具有多样性，导致其具有基因多样性和功能多样性。然而，目前针对发酵粘液乳杆菌的分离鉴定、益生特性和代谢机制的研究依然较少，已发现具有益生功能的发酵粘液乳杆菌还不是很多，且虽然目前针对发酵粘液乳杆菌的功能及应用已经取得了一定的研究进展，但其潜在功效仍远未得到较完整的开发。因此，有必要挖掘更多具有益生功能的发酵粘液乳杆菌，并根据发酵粘液乳杆菌的不同来源进一步挖掘其功能，使其更好地发挥作用，如根据菌株的功能或者益生代谢产物确定其功效，明确其应用前景。综上所述，深入研究益生性发酵粘液乳杆菌及其应用有很广阔的发展空间。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明从中国广东广州地区一名健康成年人的肠道粪便样品中分离纯化得到一株发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株，该菌株具有产3-羟基丁酸，可抑制黄嘌呤氧化酶活性，产生和分泌γ-氨基丁酸，产谷胱甘肽等多种功能，具有重要的潜在应用价值。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明第一方面提供了一株发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株，所述发酵粘液乳杆菌KS6菌株于2023年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 20231158；所述发酵粘液乳杆菌KS6菌株的16S rDNA全序列如SEQID No：1所示。

本发明第二方面提供了第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产3-羟基丁酸中的应用。

经研究发现，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产3-羟基丁酸(3-HB)，提示发酵粘液乳杆菌KS6菌株有望用于生产3-HB，并通过产3-HB的这一特性应用于为身体各种活动提供能量，抗骨质疏松，预防及治疗慢性综合征，改善脑部认知功能，改善脂代谢等领域。

本发明第三方面提供了第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产还原型谷胱甘肽(GSH)中的应用。

经研究发现，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产还原型谷胱甘肽(GSH)，提示发酵粘液乳杆菌KS6菌株有望用于生产GSH，并通过产GSH的这一特性应用于抗氧化美白、延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤和抗过敏等领域。

本发明第四方面提供了第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。

经研究发现，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)活性，提示发酵粘液乳杆菌KS6菌株有望通过抑制XOD活性这一特性应用于降低体内嘌呤，减少尿酸生成，从而控制尿酸水平，预防痛风发作等领域。

本发明第五方面提供了第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产蛋白酶中的应用。

经研究发现，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产蛋白酶，提示发酵粘液乳杆菌KS6菌株有望用于生产蛋白酶，并通过产蛋白酶的这一特性应用于促进人体对食物中蛋白质的消化吸收，抗过敏，帮助动物消化吸收营养等领域。

本发明第六方面提供了第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产γ-氨基丁酸中的应用。

经研究发现，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产γ-氨基丁酸(GABA)，提示发酵粘液乳杆菌KS6菌株有望用于生产GABA，并通过产GABA的这一特性应用于改善机体睡眠质量、抗抑郁、抗焦虑、降血压、改善脂质代谢、增强记忆能力并提高脑活力、加快大脑新陈代谢、健肝利肾、促进乙醇代谢、改善更年期综合症等领域。

本发明第七方面提供了第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产透明质酸中的应用。

经研究发现，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产透明质酸(HA)，提示发酵粘液乳杆菌KS6菌株有望用于生产HA，并通过产HA的这一特性应用于抗炎和抗血管生成，抗衰老、水润、抚平皱纹等领域。

本发明第八方面提供了第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在制备抗氧化剂中的应用，所述发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株通过清除DPPH自由基、清除羟自由基和超氧化物歧化酶活性发挥抗氧化作用。

益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以通过清除DPPH自由基和羟自由基(·OH)，从而避免这两种自由基给机体带来的危害，也可以通过超氧化物歧化酶(SOD)活性应用于抗氧化、抗炎、增强免疫力、抗衰老、降血脂、增强肝功能、改善视力、降血糖等领域。当然，本发明的发酵粘液乳杆菌KS6菌株还可以制成DPPH自由基清除剂、羟自由基清除剂、超氧化物歧化酶(SOD)活性增强剂等形式进行使用。

本发明第九方面提供了第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在制备降解或降低胆固醇的制剂中的应用。

经研究发现，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可降解胆固醇，提示发酵粘液乳杆菌KS6菌株有望用于制备降解或降低胆固醇的制剂，并通过降解胆固醇的功能，从而避免胆固醇过量给机体带来的危害。

本发明第十方面提供了一种具有益生功能的菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株。

优选地，所述菌剂为第一方面所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株经发酵后的产物。

优选地，在医药应用领域，所述菌剂还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

更优选地，上述赋形剂是指可用于药学领域的稀释剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂等以及一些药用基质。上述载体是药物领域中可得到的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(PLGA)、透明质酸等。

优选地，在医药应用领域，所述菌剂的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂、缓释剂、口服液制剂、注射剂。

更优选地，上述剂型是指临床上常用的剂型。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明从中国广东广州地区一名健康成年人的肠道粪便样品中分离纯化得到一株发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株，菌株KS6具有的多种益生功效，包括具有优越的蛋白酶活性，可产生3-羟基丁酸，可抑制黄嘌呤氧化酶活性，可产生和分泌γ-氨基丁酸，可产生和分泌透明质酸，可产生和分泌谷胱甘肽，可清除DPPH自由基，可清除羟自由基，具有超氧化物歧化酶活性，可降解胆固醇。因此，发酵粘液乳杆菌KS6菌株具有促进对蛋白食物的消化吸收，改善蛋白过敏；可改善肠道菌群；可预防和缓解高尿酸血症和痛风；可抗抑郁和助睡眠；抗皱和美白；抗过敏；抗氧化和抗炎；抗衰老；增强免疫力和护肝；降胆固醇和改善心血管健康等多种功能。可见，本发明新分离得到的发酵粘液乳杆菌KS6菌株具有多种益生功效，可用于抗炎和助睡眠等领域，比如，制作成抗炎和助睡眠药品，具有重要的应用价值和经济价值。

附图说明

图1为发酵粘液乳杆菌KS6菌株的系统发育树(菌株来源于NCBI的Genome数据库，其中Limosilactobacillusfermentum JF5为发明人之前申报的另一个菌株，保藏号为CCTCC NO:M 20221511，专利公开号为CN116814464A)；

图2为发酵粘液乳杆菌KS6菌株对牛奶平板的降解实验(左边，空白对照组；右边，实验组)；

图3为发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以产生3-羟基丁酸；

图4为发酵粘液乳杆菌KS6菌株可抑制XOD活性；

图5为发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以产生γ-氨基丁酸；

图6为发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以产生和分泌透明质酸；

图7为发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以产生和分泌GSH；

图8为发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以清除DPPH自由基；

图9为发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以清除羟自由基；

图10为发酵粘液乳杆菌KS6菌株发酵液具有SOD活性；

图11为胆固醇的标准曲线；

图12为发酵粘液乳杆菌KS6菌株可降胆固醇。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

下列实施例涉及的实验材料如下：

(1)发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)KS6菌株，分离自中国广东广州地区一名健康成年人(BMI＝19.5)的肠道粪便样品中，于甘油管内置于-80℃低温冷冻保藏。一般情况下，将该菌株接种于MRS固体培养基平板表面，并在37℃恒温厌氧培养箱中倒置培养24h可获得菌落，或在37℃恒温厌氧培养箱内于MRS液体培养基中振荡培养24-48h可获得发酵液。

(2)试剂盒：3-羟基丁酸(3-HB)检测试剂盒(Cloud-Clone Corp.,Cat:CEB022Ge)，黄嘌呤氧化酶活性测定试剂盒(盒子生工,Cat:AKAO006M)，GABA检测试剂盒(CEA900Ge)，透明质酸检测试剂盒(CEA182Ge)，还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(A006-2-1)，DPPH自由基清除能力试剂盒(南京建成,Cat:A153-1-1)，羟自由基(·OH)测定试剂盒(南京建成,Cat:A018-1-1)，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成,Cat:A001-3)。

(3)MRS平板：牛肉膏10g,蛋白胨10g,酵母膏5g,柠檬酸三铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,磷酸氢二钾2g,吐温80 1mL,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g,琼脂15g,ddH₂O补齐至1L，调pH至6.2-6.6，121℃高压灭菌20min，配置成MRS平板。

(4)MRS液体培养基：牛肉膏10g,蛋白胨10g,酵母膏5g,柠檬酸三铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,磷酸氢二钾2g,吐温80 1mL,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g,ddH₂O补齐至1L，调pH至6.2-6.6，121℃高压灭菌20min，配置成MRS液体培养基。

(5)MP平板：脱脂奶粉10g,氯化钠1g,牛肉膏10g,蛋白胨10g,酵母膏5g,葡萄糖20g,柠檬酸三铵2g,乙酸钠5g,磷酸氢二钾2g,吐温80 0.5mL,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g,琼脂15g,ddH₂O补齐至1L，调pH至6.2-6.6，121℃高压灭菌20min，配置成MP平板。

实施例1发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)KS6菌株的分离鉴定

发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillusfermentum KS6菌株分离自中国广东广州地区一名健康成年人(BMI＝19.5)的肠道粪便样品中，具体如下：

用无菌水将粪便样品反复清洗3次，置于研钵中，每100mg粪便加入500uL无菌水，彻底研磨匀浆，用移液器吸取适量研磨液，涂布于MRS平板上，室温培养3天。然后，用记号笔对分离实验平板中待划线纯化的菌落进行编号，并相应地在平板上标明菌株编号。标记后，挑取菌落接种到MRS平板上，用平板划线法纯化菌株。若此法不能将菌株分离则需要从富集平板上挑取菌落，经MRS液体培养基梯度稀释后，涂布于培养基上。最后，参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)和《真菌分类鉴定手册》，首先分辨属于细菌的菌株，然后观察菌落的生长状况：生长形态、是否有菌丝、颜色是否均匀一致，菌落个体表面及边缘。初步分离得到一株纯化菌株，培养24小时后观察到菌株的菌落呈圆形、乳白色、表面光滑、隆起、边缘整齐，菌株编号为KS6。

接着，通过16S rDNA通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT)对分离得到的KS6菌株进行分子鉴定后，由北京百迈客生物科技有限公司对KS6菌株进行全基因组测序。将得到的16S rDNA sequence(SEQ ID No：1)在NCBI的Genome数据库进行BLAST比对。结果表明，KS6菌株与已知的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)16S rDNA序列的同源性>99％，并与同源菌株进行进化分析(图1)，确认菌株KS6是同种不同株的发酵粘液乳杆菌。

最后，对菌株KS6进行保藏，保藏信息如下：保藏时间：2023年7月3日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏号：CCTCC NO:M 20231158；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；分类命名：Limosilactobacillusfermentum。

发酵粘液乳杆菌是国家批准可用于食品的益生菌菌株，其具有广泛的益生功效，如抗菌、抗炎和改善母婴健康等，但不同来源的菌株其功效不同，说明本发明从泡菜样品分离得到的一株新的发酵粘液乳杆菌KS6可以作为益生菌使用，并可能具有新的功效和功能。

Limosilactobacillusfermentum KS616S rDNA sequence(1450bp，SEQ ID No：1)：

TACTGCAGTCGACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACANCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAANGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCTAAGTG。

实施例2发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)KS6菌株的功能及应用

(1)发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产降解牛奶蛋白的蛋白酶

使用脱脂牛奶平板培养基(MP平板)按照琼脂孔扩散试验测定发酵粘液乳杆菌KS6分泌蛋白酶水解蛋白的能力。试验时，往实验组的MP平板中滴加3uL浓度为10Abs的发酵粘液乳杆菌KS6菌液，对照组则滴加3uL空白MRS培养基。并在37℃恒温厌氧培养箱中倒置培养3天。结果表明，与滴加空白培养基的对照相比，菌株KS6可以显著的降解蛋白，形成明显的降解圈(图2)，说明发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产降解牛奶蛋白的蛋白酶。

可见，发酵粘液乳杆菌KS6可产蛋白酶，其作为益生菌菌株使用可以促进人体对食物中蛋白质的消化吸收，提高对小肽和氨基酸的吸收。同时，也可用于抗过敏(改善蛋白消化不良或不吸收导致的食物过敏)。此外，也可以用于蛋白酶的提取，应用于食品工业或洗涤工业等蛋白酶领域的生产；也可用于微生物饲料中以帮助动物消化吸收营养，提高对饲料的利用率。

(2)发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产生3-羟基丁酸(3-HB)

将用MRS液体培养基培养至稳定期的发酵粘液乳杆菌KS6以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取培养后的菌体，所得菌体用buffer PBS(称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24gKH₂PO₄溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.2，最后加蒸馏水定容至1L，即得PBS缓冲液)裂解制成菌体裂解液后，通过3-HB特定ELISA试剂盒(CEB022Ge)测定培养后菌体的3-HB浓度。结果显示，与菌体裂解buffer PBS相比，菌株KS6的菌体裂解液中3-HB的浓度为290.71μg/mL，说明发酵粘液乳杆菌KS6可以在稳定期产生3-羟基丁酸(图3)。

3-HB可以为身体各种活动提供能量，是潜在的能量/功能型食物，已被添加到运动员饮料中，因此益生菌发酵粘液乳杆菌KS6可作为能量型食品的添加剂。同时，鉴于3-HB可以有效的抗骨质疏松，预防及治疗慢性综合征(高血压，酒精性脂肪肝，肠炎，肠癌)，改善脑部认知功能(提高学习记忆的能力，保护神经胶质细胞，改善阿尔兹海默症)，改善脂代谢。因此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可通过产生3-羟基丁酸的功效发挥以上多个用途。

此外，3-羟基丁酸是是机体天然产生的一种内源性小分子物质，对维持结肠直肠组织完整性具有重要作用，并且具有维持肠道健康、防止结肠疾病和消炎产能的作用。通过3-HB处理可以促进肠道有益菌增殖，缓解多发性硬化的症状，在调节菌群改善健康方面具有巨大的潜力。因此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株也有助于改善肠道菌群，缓解肠道炎症。

(3)发酵粘液乳杆菌KS6菌株可抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)活性

将用MRS液体培养基培养至稳定期的发酵粘液乳杆菌KS6菌株以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过黄嘌呤氧化酶活性测定试剂盒(盒子生工,Cat:AKAO006M)测定发酵液上清中黄嘌呤氧化酶的活性。结果显示，与空白培养基MRS对黄嘌呤氧化酶活性无抑制作用相比，菌株KS6的发酵上清液对黄嘌呤氧化酶活性具有明显的抑制作用，抑制率为100％(*P<0.05)，说明发酵粘液乳杆菌KS6可以在稳定期产生并分泌代谢物以抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)的活性(图4)。

黄嘌呤氧化酶是嘌呤分解代谢过程中的关键酶，可以催化次黄嘌呤和黄嘌呤直接生成尿酸。因此当体内黄嘌呤氧化酶活性异常活跃时，会导致大量尿酸的生成，从而引发高尿酸血症或痛风。

黄嘌呤氧化酶抑制剂，如别嘌呤醇能抑制黄嘌呤氧化酶活性，阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸，从而减少尿酸生成，改善痛风和高尿酸血症。黄嘌呤氧化酶抑制剂还可以减少自由基造成的应激反应和对组织的伤害，有望在临床上用于治疗痛风及过氧化物自由导致的疾病。当前，别嘌呤醇是治疗高尿酸血症及痛风的主要药物之一，也是临床上唯一一种抑制尿酸生成的化学药物，但该药物有很多副作用，不但会引起发热，还引发过敏性皮疹腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少和多器官受损，甚至有引起死亡的报道，安全性受到质疑。由于其对黄嘌呤氧化酶有很好的抑制作用所以一直沿用至今。因此，研究新的低毒高效的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有十分重要的意义。

由此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株有望通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，降低体内嘌呤，减少尿酸生成，从而控制尿酸水平，预防痛风发作。

(4)发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产生和分泌γ-氨基丁酸(GABA)

将用MRS液体培养基培养至稳定期的发酵粘液乳杆菌KS6以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过GABA特定ELISA试剂盒(CEA900Ge)测定发酵液上清的GABA浓度。结果显示，与空白MRS对照相比，菌株KS6的发酵上清液中GABA的浓度显著性增加，可积累量为85.80pg/mL，说明发酵粘液乳杆菌KS6可以在稳定期产生和分泌γ-氨基丁酸(图5)。

γ-氨基丁酸是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，广泛存在于动植物、微生物体内。现已证实，作为小分子量非蛋白质氨基酸的GABA具备食用安全性，可作为食品添加剂。研究表明，摄入一定量的GABA具有改善机体睡眠质量、抗抑郁、抗焦虑、降血压、改善脂质代谢、增强记忆能力并提高脑活力、加快大脑新陈代谢、健肝利肾、促进乙醇代谢(解酒)、改善更年期综合症等生理功效。

因此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可通过产生γ-氨基丁酸的功效发挥以上多个用途。

(5)发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产生和分泌透明质酸(HA)

将用MRS液体培养基培养至稳定期的发酵粘液乳杆菌KS6以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过透明质酸(又名玻尿酸，HA)特定ELISA试剂盒(CEA182Ge)测定发酵液上清的HA浓度。结果显示，与空白MRS对照相比，菌株KS6的发酵上清液中HA的浓度显著性增加，可积累量为76.12ng/mL，说明发酵粘液乳杆菌KS6可以在稳定期产生并分泌透明质酸(图6)。

透明质酸，又名玻尿酸，是一种可生物降解、生物相容性、无毒、无致敏性的聚合物，具有多种生物学功能。既具有抗炎和抗血管生成作用，又具有较强的抗衰老、水润、抚平皱纹的能力。由于其有助于皮肤抗皱，促进伤口消炎及愈合，可用于抗皱剂，具有开发皮肤化妆品的潜力。此外，由于HA具有很高的润滑、吸水和保水能力，可以影响多种细胞功能，如迁移、粘附和增殖，使得HA也被广泛应用于眼科手术，关节炎治疗，伤口愈合支架，组织工程，以及植入材料等生物医学领域。

因此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可通过产生透明质酸的功效发挥以上多个用途。

(6)发酵粘液乳杆菌KS6菌株可产生和分泌还原型谷胱甘肽(GSH)

将用MRS液体培养基培养至稳定期的发酵粘液乳杆菌KS6菌株以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(A006-2-1)测定发酵液上清GSH的浓度。结果显示，与空白MRS对照相比，菌株KS6的发酵上清液中GSH的浓度为301.47μmol/L，经KS6发酵后GSH的浓度显著增加(****P<0.0001)，说明发酵粘液乳杆菌KS6可以在稳定期产生并分泌谷胱甘肽(GSH)(图7)。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，且含有γ-酰胺键和巯基的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。半胱氨酸上的巯基为谷胱甘肽活性基团(故谷胱甘肽常简写为GSH)。谷胱甘肽有助于维持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，在多种细胞生化过程中发挥重要作用，如自由基中和、解毒、半胱氨酸的运输和储存、细胞氧化还原作用的维持、抗坏血酸和维生素E的再生等。主要包括以下几个方面：

①解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；

②参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；

③保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团(-SH)维持还原状态；

④维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。

由此，GSH的多种生物学功能赋予了其多种功效和用途，主要表现在：

1)抗氧化剂：清除人体内的自由基，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被有害物质氧化，从而保证蛋白质和酶等分子生理功能的正常发挥；人体红细胞中谷胱甘肽的含量很多，这对于保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态，防止溶血具有重要意义；还可防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化能力，并使皮肤产生光泽。

2)临床药物：利用其巯基螯合重金属、氟化物、芥子气等毒素而防止中毒；还可以在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病等方面作为治疗或辅助治疗的药物；还可以纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用。

3)食品添加剂：强化食品营养、稳定维生素C、强化风味。

综上所述，谷胱甘肽不仅可以用于药物，而且可以作为功能性食品的基料，在抗氧化美白、延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤和抗过敏等功能性食品领域具有广泛的应用价值。

由此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以通过产生的GSH的功能，从而发挥以上多个功效。

(7)发酵粘液乳杆菌KS6菌株可清除DPPH自由基

将用MRS液体培养基培养至稳定期的发酵粘液乳杆菌KS6菌株以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过DPPH自由基清除能力试剂盒(南京建成,Cat:A153-1-1)测定发酵液上清对DPPH的清除能力。结果显示，与空白对照MRS相比，菌株KS6的发酵上清液对DPPH自由基清除率为12.34％(**P<0.01)，说明发酵粘液乳杆菌KS6具有较好的清除DPPH自由基的能力，表现出良好的抗氧化能力(图8)。

自由基，化学上也称为“游离基”，是指化合物的分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。由于自由基含未配对的电子，所以极不稳定(特别是羟自由基)，因此会从邻近的分子(包括脂肪、蛋白质和DNA)上夺取电子，让自己处于稳定的状态。这样一来，邻近的分子又变成一个新的自由基，然后再去夺取电子。如此连锁反应会让细胞的结构受到破坏，造成细胞功能丧失、基因突变，甚至死亡。

自由基有诸多坏处。诸如：(1)削弱细胞的抵抗力，使身体易受细菌和病菌感染；(2)产生破坏细胞的化学物质，形成致癌物质；(3)阻碍细胞的正常发展，干扰其复原功能，使细胞更新率低于枯萎率；(4)破坏体内的遗传基因(DNA)组织，扰乱细胞的运作及再生功能，造成基因突变，演变成癌症；(5)破坏细胞内的线粒体(能量储存体)，造成氧化性疲劳；(6)破坏细胞膜，干扰细胞的新陈代谢，使细胞膜丧失保护细胞的功能；(7)侵袭细胞组织及荷尔蒙所必须的氨基酸，干扰体内系统的运作，导致恶性循环，以致产生更多自由基，其连锁反应会导致自由基危害遍及全身；(8)破坏蛋白质，破坏体内的酶，导致炎症和衰老；(9)破坏脂肪，使脂质过氧化，导致动脉粥样硬化，发生心脑血管疾病；(10)破坏碳水化合物，使透明质酸降解，导致关节炎等。

由此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以通过清除DPPH自由基的功能，从而避免该自由基给机体带来的危害。

(8)发酵粘液乳杆菌KS6菌株可清除羟自由基(·OH)

将用MRS液体培养基培养至稳定期的发酵粘液乳杆菌KS6菌株以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过羟自由基(·OH)测定试剂盒(南京建成,Cat:A018-1-1)测定发酵液上清对羟自由基的清除能力。结果显示，与空白对照MRS相比，菌株KS6的发酵上清液对羟自由基清除率为24.76％(**P<0.01)，说明发酵粘液乳杆菌KS6具有较好的清除羟自由基的能力，表现出良好的抗氧化能力(图9)。

羟基自由基(·OH)是一种重要的活性氧，从分子式上看是由氢氧根(OHˉ)失去一个电子形成的。羟基自由基具有极强的得电子能力，也就是氧化能力，氧化电位为2.8V，是自然界中仅次于氟的氧化剂。

羟基自由基几乎可以破坏所有类型的大分子，包括碳水化合物、核酸(突变)、脂质(脂质过氧化)和氨基酸(例如苯丙氨酸转化为间酪氨酸和邻酪氨酸)等。羟自由基对人体的攻击首先是从细胞膜开始的，导致细胞膜失去弹性和功能，引发心血系统疾病。大量资料证明，炎症、肿瘤、衰老、血液病，以及心、肝、脾、肺和皮肤等各方面疾病的发生机理均与体内自由基产生过多或者清除自由基能力下降有着密切的关系。

由此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以通过清除羟自由基的功能，从而避免该自由基给机体带来的危害。

(9)发酵粘液乳杆菌KS6菌株具有超氧化物歧化酶(SOD)活性

将用MRS液体培养基培养至稳定期的发酵粘液乳杆菌KS6菌株以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成,Cat:A001-3)测定发酵液上清的SOD活性。其中，每毫升反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。结果显示，与空白对照MRS相比，菌株KS6的发酵上清液SOD活性为9.52U/mg，说明发酵粘液乳杆菌KS6发酵液具有较好的SOD活性，表现胡良好的抗氧化能力(图10)。

超氧化物歧化酶(SOD)是一种抗氧化酶，具有抗氧化、抗炎、增强免疫力等功效与作用。主要表现在：(1)抗氧化：SOD能够清除细胞内的自由基，减轻氧化应激对细胞的损伤，保护细胞免受自由基的攻击。(2)抗炎：SOD能够抑制炎症反应，减少炎症细胞的释放，降低炎症的程度和持续时间。(3)增强免疫力：SOD能够促进免疫细胞的产生，提高身体的免疫力，预防疾病的发生和恢复身体的健康。(4)抗衰老：可防止脂质过氧化，有效清除自由基，使细胞保持活性，防止机体过快衰老。(5)降血脂：能清除血管内阻力，软化血管，降低血液粘稠度，使血脂水平逐渐恢复正常。(6)增强肝功能：可以减少血液中的毒素，减轻氧自由基对肝脏造成的损伤。(7)改善视力：有助于清除眼内过多的自由基，从而提高视力，预防白内障。(8)降血糖：可使胰岛细胞恢复活力，加快分裂速度，进而达到降血糖的目的。

由此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以通过具有超氧化物歧化酶(SOD)活性的功能，从而发挥以上多个功效。

(10)发酵粘液乳杆菌KS6菌株可降解胆固醇

制备邻苯二甲醛溶液：准确称量0.05g邻苯二甲醛试剂，用冰乙酸溶解并定容至100mL，备用。同时制备胆固醇标准储备液(0.1mg/mL)，4℃冷藏备用。按2倍梯度稀释胆固醇储备液并加入冰乙酸至2mL，然后加入邻苯二甲醛溶液4mL，室温放置10min，再于冷水浴中缓慢加入18.4M浓硫酸4mL，涡旋混匀后，自然冷却，静置10min后，在20min内测定550nm处的吸光度值，构建胆固醇的标准曲线(图11)。

将用MRS液体培养基培养至稳定期的发酵粘液乳杆菌KS6菌株以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS-胆固醇培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后测定上清液在550nm处的吸光度值，并根据胆固醇的标准曲线，计算上清液中的胆固醇含量。结果显示，与空白对照MRS相比，菌株KS6的发酵上清液对胆固醇的清除率为16.20％(***P<0.001)，说明发酵粘液乳杆菌KS6具有降解胆固醇的能力(图12)。

胆固醇是身体组织的重要组成部分，过高的胆固醇摄入已经成为诱发冠心病、动脉粥样硬化、脑中风等心脑血管疾病的重要因素。一项大规模的研究结果显示，控制胆固醇含量的升高不仅能够减少患心脏病的风险，而且还有助于避免患肾衰竭之类的肾脏疾病。

总胆固醇过高会导致各种疾病。主要表现在：(1)胆固醇结石：肝胆固醇的高量分泌会导致胆固醇过饱和，胆固醇的结晶与晶体生长过快，进而破坏胆汁酸肝肠循环系统的平衡，引起机体胆固醇结石的形成。(2)肺癌：高胆固醇饮食可能与肺癌的发生风险增加相关，但饮食中胆固醇摄入量受个人体质、膳食组成或其他高脂饮食的影响，并不能准确反应体内胆固醇的真实水平，而肺内胆固醇水平与肺癌发病风险呈更为密切的正相关。(3)冠状动脉硬化：血清LDL和三酰甘油水平增高是动脉粥样硬化病变形成的重要原因。降低LDL胆固醇水平已成为减少动脉粥样硬化病变以及由此引发的心脑血管疾病等并发症的重要目标。动脉粥样硬化病变始于LDL的局部累积，LDL通过黏附于富含蛋白多糖的细胞外基质蛋白上而被隔离在内皮下，并通过内皮通透性的改变、细胞间转运以及活性受体介导的胞移等机制发生累积作用。(4)高胆固醇血症：膳食胆固醇摄入过量(≥300mg/d)的男女性人群发生高胆固醇血症的危险性明显增高。(5)冠心病和缺血性脑卒：胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇升高是冠心病和缺血性脑卒中的独立危险因素。血浆高密度脂蛋白胆固醇可能与炎症、血栓形成等疾病相关。

由此，益生菌发酵粘液乳杆菌KS6菌株可以通过降解胆固醇的功能，从而避免胆固醇过量给机体带来的危害。

综上可知，本发明新分离的发酵粘液乳杆菌KS6菌株具有的多种益生功效：(1)具有优越的蛋白酶活性；(2)可产生3-羟基丁酸；(3)可抑制黄嘌呤氧化酶活性；(4)可产生和分泌γ-氨基丁酸；(5)可产生和分泌透明质酸；(6)可产生和分泌谷胱甘肽；(7)可清除DPPH自由基；(8)可清除羟自由基；(9)具有超氧化物歧化酶活性；(10)可降解胆固醇。可见，本发明新分离得到的发酵粘液乳杆菌KS6菌株具有重要的应用价值和经济价值。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一株发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株，其特征在于，所述发酵粘液乳杆菌KS6菌株于2023年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO:M 20231158；所述发酵粘液乳杆菌KS6菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。

2.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产3-羟基丁酸中的应用。

3.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产还原型谷胱甘肽中的应用。

4.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。

5.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产蛋白酶中的应用。

6.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产γ-氨基丁酸中的应用。

7.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在产透明质酸中的应用。

8.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在制备抗氧化剂中的应用，其特征在于，所述发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株通过清除DPPH自由基、清除羟自由基和超氧化物歧化酶活性发挥抗氧化作用。

9.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株在制备降解或降低胆固醇的制剂中的应用。

10.一种具有益生功能的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)KS6菌株。