CN117683131A

CN117683131A - 一种抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（mog）抗体及其应用

Info

Publication number: CN117683131A
Application number: CN202410095226.8A
Authority: CN
Inventors: 郝峻巍; 万东山; 刘亮; 赵强
Original assignee: Xuanwu Hospital
Current assignee: Beijing Jingyi Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2024-01-24
Filing date: 2024-01-24
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2044-01-24
Also published as: CN117683131B

Abstract

本发明提供了一种抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）抗体及其应用。所述抗MOG抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。经过CBA、TBA、IP方法的验证，以及Alphafold2抗原结合位点预测，本发明的抗MOG抗体可以成功地特异性地识别MOG抗原的胞外区。

Description

一种抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）抗体及其应用。

背景技术

中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，是一种与自身免疫相关的疾病，与多种自身抗体相关，包括：抗水通道蛋白4（AQP4）抗体、抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体。

近年来有关MOG及其抗体的研究也逐渐增多。MOG抗原是一种单跨膜蛋白，特异性表达于中枢神经系统少突胶质细胞质膜上，位于髓鞘结构的最外层。抗MOG抗体通常被认为是致病性抗体，识别具有空间立体结构的折叠型MOG蛋白。抗MOG抗体相关疾病（MOGAD）国际诊断指南推荐CBA法检测血清及脑脊液中的抗MOG抗体。此外，血清中抗MOG抗体滴度与病情严重程度相关，抗体持续存在或滴度升高提示复发可能。

目前商业的抗MOG单抗一般都是由MOG抗原肽段片段产生，通常识别的是线性表位，能够用于WB、ELISA或者IHC等有限用途，例如：Thermo的 MA5-32857、MA5-24644、MA5-24645和MA5-42986鼠源单抗等。大鼠来源单抗8-18C5能够识别MOG的细胞外免疫球蛋白V样结构域上存在的不连续表位结合，从而能够识别MOG蛋白空间结构，例如：Abcam公司的兔源单抗ab233549及CST公司的#45268。识别MOG空间蛋白单抗能用于多种方法的免疫标记：流式细胞术（FC），细胞荧光染色（ICC），免疫组织荧光 (IHF)。上述这些抗MOG单抗识别的抗原表位不一，但是其来源都是鼠源或者兔源。

发明内容

本发明提供了一种人源抗MOG抗体或其抗原结合片段，它能够识别MOG的空间结构，并且可以用于FC，ICC，免疫组织荧光（IHF），及免疫沉淀（IP）实验。经过FC，ICC，IHF及IP方法的验证，本发明得到的抗MOG单克隆抗体可以成功地特异性地识别MOG抗原的胞外区。

因此，一方面，本发明提供了一种抗MOG抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。

在一些实施方式中，所述抗MOG抗体或其抗原结合片段的重链可变区可以包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:7具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列；以及所述抗MOG抗体或其抗原结合片段的轻链可变区可以包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述MOG抗体或其抗原结合片段可以包含重链和轻链，所述重链可以包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:9具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列；以及所述轻链可以包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗MOG抗体是单克隆抗体。

在一些实施方式中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体（scFv）、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区（dsFv）和包含CDR的肽的抗原结合片段。

另一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码上述抗MOG抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

再一方面，本发明提供了一种重组载体，特别是重组表达载体，其包含上述核酸分子。

在一些实施方式中，所述载体可以是原核表达载体或真核表达载体。

在一些实施方式中，所述载体可以是质粒。

又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其导入或含有上述重组载体。

在一些实施方式中，所述细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述细胞的实例包括但不限于，HEK293T细胞，Hela细胞，Hep2细胞，等等。

再一方面，本发明提供了上述抗MOG抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述方法包括使上述宿主细胞在培养物中进行培养以得到抗MOG抗体或其抗原结合片段的步骤。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括使从培养物中回收所述抗MOG抗体或其抗原结合片段的步骤。

又一方面，本发明提供了所述抗MOG抗体或其抗原结合片段的应用。

在一些实施方式中，本发明提供了所述抗MOG抗体或其抗原结合片段在制备用于检测抗MOG抗体的制品（特别是阳性对照品）中的应用。

在一些实施方式中，本发明提供了所述抗MOG抗体或其抗原结合片段在制备用于MOG抗原转染细胞的质检的制品中的应用。

在一些实施方式中，本发明提供了所述抗MOG抗体或其抗原结合片段在MOG抗原的抗原决定簇研究中的应用。

再一方面，本发明提供了一种抗MOG抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含所述抗MOG抗体或其抗原结合片段作为阳性标品。

本发明从脑脊液抗MOG抗体阳性诊断MOGAD患者的脑脊液中通过10X Genomics公司单细胞免疫组库及转录组测序，通过基因表达模式选取浆细胞，并获得数百个单个浆细胞重链轻链配对序列。选取部分抗体序列并补全，构建到真核表达质粒中，转染Expi293™细胞，收取细胞上清纯化抗体。经过筛选验证，从中挑选出1种重组表达的人源抗MOG单抗。性能分析表明这种抗体由于识别的是人/大鼠MOG抗原的胞外区，不用对细胞或者组织进行通透处理，就能够直接用于免疫荧光检测。

因此，本发明具有以下技术效果：

（1）本发明的人源抗MOG单抗可直接用于细胞或者组织样本MOG抗原的免疫荧光检测，不用提前进行通透处理；

（2）本发明的人源抗MOG单抗可以耐受Triton、Saponin等多种细胞通透试剂，能够稳定地用于免疫荧光检测；

（3）本发明的人源抗MOG单抗可以作为抗MOG抗体检测试剂盒的阳性标品，使用同一套抗人的荧光二抗，简化了试剂盒的成分。

附图说明

图1为MOG抗原结构以及Alphafold2对人源抗MOG单抗和MOG蛋白结合预测的示意图。

图2为实施例3中纯化的人源抗MOG单抗经过二硫苏糖醇（DTT）还原或非还原处理后，进行SDS-PAGE胶电泳分离并进行考马斯亮蓝染色的图。

图3为MOG-HIS重组蛋白示意图。

图4为显示实施例4中的免疫荧光实验结果的图，其中：A为本发明的人源抗MOG单抗在不进行破膜通透处理的情况下的结果（Anti-MOG Ab（+）），B为本发明的人源抗MOG单抗在使用Saponin进行破膜通透处理后的结果（Anti-MOG Ab（+）），C为本发明的人源抗MOG单抗在使用TritonX-100进行破膜通透处理后的结果（Anti-MOG Ab（+）），D为作为对照的不加抗MOG抗体染色结果（Anti-MOG Ab（-）），E为His小鼠单抗（Thermo，R930-25）在不进行破膜通透处理的情况下的结果（Anti-HIS Ab（+）），F为His小鼠单抗（Thermo，R930-25）在使用Triton X-100进行破膜通透处理后的结果（Anti-HIS Ab（+））。比例尺：5μm。

图5为显示实施例5中的免疫荧光实验结果的图。比例尺：100μm。

图6为显示实施例6中的IP实验结果的电泳图。

图7为显示实施例7中的流式分析实验结果的图，其中：A为检测细胞仅转染对照空质粒并使用本发明抗MOG抗体流式检测的结果；B为检测细胞仅转染MOG质粒并使用本发明抗MOG抗体流式检测的结果。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试剂：

PCR酶：PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 购自Takara，货号：R045A；KOD DNAPolymerase购自Toyobo，货号：KOD-201；

细胞系：HEK293T细胞购自ATCC，货号: crl-3216；Expi293™Expression Medium购自ThermoFisher，货号：A1435101；

胶回收试剂盒：Omega gel extraction kit，货号：D2500-02；

质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit，货号：6943；

质粒：pCDNA3.4购自纽普生物，货号：V001453；pEGFP-N1购自Addgene，货号：54767；MOG表达质粒购自义翘神州生物技术有限公司，货号：HG10364-CH，其表达载体为pCMV3-C-His，插入的表达蛋白C末端会带有His标签；

基因合成由通用生物公司合成；

同源重组试剂盒：NEBuilder® HIFI DNA Assembly Master Mix，货号：E2621L；

Anti-His小鼠源单抗购自ThermoFisher，货号：R930-25；

正常人IgG购自Merck，货号：I4506；

Valproic Acid (VPA) 购自Sigma，货号：P4543；

Alexa Fluor 488 Anti-human IgG购自ThermoFisher，货号：A11013；

小牛白蛋白（BSA）购自Vetec，货号：V900933；

辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）购自中杉金桥，货号：ZB-5305；

小鼠抗GFP购自CMCTAG，货号：AT0028；

ECL底物Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate购自Millipore，货号：WBULS0500；

Triton购自Sigma，货号：X100-500mL；

Saponin购自Sigma，货号：232-462-6；

转染试剂PEI MAX 40K，购自Polysciences，货号：24765-100；

Dynabeads™Protein G for Immunoprecipitation 购自ThermoFisher，货号：10004D；

SurePAGE™Bis-Tris SDS-PAGE电泳凝胶购自金斯瑞，货号：M00656；

4X LDS蛋白上样缓冲液购自ThermoFisher，货号：NP0007；

脱脂奶粉购自索莱宝，货号：D8340；

二硫键还原剂：二硫苏糖醇（DTT）购自Sigma，货号：D9779；

PBS缓冲液购自索莱宝，货号：P1020；

TBS缓冲液购自索莱宝购自索莱宝，货号：T1082；

1M PH=7.5 Tris-盐酸购自索莱宝，货号：T1140；

0.5M EDTA溶液购自索莱宝，货号：E1170；

10%FBS+DMEM细胞培养基购自procell，货号：PM150210B；

Chromium单细胞5'文库试剂盒：Chromium Next GEM Single Cell 5' Kit v2, 4rxns，货号：100265；

V(D)J扩增试剂盒：Chromium Single Cell Human BCR Amplification Kit, 16rxns，货号：1000253。

仪器：

纯水仪：Millipore Direct-Q® 5 UV Water Purification System；

移液器：Eppendorf；

PCR仪：Bio-Rad T100；

曝光仪：Bio-Rad ChemiDoc XRS+

流式细胞分选仪：BD FACS ARIAIII。

实施例1、BCR测序获得配对的人源抗体序列

1. 患者纳入：纳入脑脊液抗体阳性临床诊断明确MOGAD患者，为临床诊断目的获取脑脊液，检测后多余的脑脊液细胞进行离心分离。患者已签署临床知情同意。

2. 10X Genomics转录组测序、VDJ 5′RACE扩增测序及数据分析：

使用10X Genomics Chromium^TM微流控系统，将去除死细胞的脑脊液样本细胞与含有标签（Barcodes）信息的凝胶微珠形成油包水单细胞反应微体系进行反应建立cDNA文库。

液滴封装的逆转录cDNA分为2份，使用Chromium单细胞5'文库试剂盒和Chromium单细胞VDJ富集试剂盒分别用于5'单细胞转录组、B细胞VDJ测序文库建库。

在Illumina NovaSeq平台上测序。将汇集的5'单细胞转录组在Illumina NextSeq500上进行测序。

将得到的FASTQ文件输入基于Linux的CellRanger软件首先进行测序数据清洗，然后根据GEX测序文库与ref data-CellRanger-GRCh38参考基因组进行比对，根据细胞特异barcode产生单细胞基因表达矩阵，通过单细胞转录组分析识别表达成熟BCR/抗体的记忆B细胞/浆细胞；VDJ测序文库与VDJ GRCh38 alts ensembl参考比对，分析配对的重链/轻链可变区V、（D）、J及恒定C区基因家族使用情况，并对重链和轻链使用相同可变区V（D）J且序列相似性大于70%的BCR序列定义为相同克隆型。

实施例2、人源抗MOG抗体的小试表达和初筛

人源抗MOG抗体的小试表达：

基于实施例1中的单细胞测序结果，选定有克隆扩增并且重链区为IgG的克隆型6组配对BCR重链轻链可变区碱基序列，密码子优化后合成基因插入含有分泌前导肽和重链IgG1恒定区序列或轻链κ/λ恒定区序列真核表达载体pcDNA3.4中（由通用生物公司合成并完成亚克隆）。

使用六孔板的HEK293T生产抗体。具体步骤如下：

步骤1：HEK293T细胞按照1 x 10⁶细胞/孔接种到6孔板中，加入2mL DMEM高糖培养基，混合均匀，置于CO₂培养箱37℃过夜培养；

步骤2：细胞密度在80%左右，进行转染：在250µL OptiMEM中加入配对的抗体轻重链表达质粒共2µg（轻重链质粒比例2:1）和6µL的转染试剂PEI MAX 40K（1mg/mL）混匀，室温静置10-15分钟；

步骤3：每孔细胞进行换液，加入1mL OptiMEM，然后再加入步骤2中的转染试剂，轻柔混匀，在CO₂培养箱37℃培养4小时，再换成含3% FBS OptiMEM继续培养，每3天换液一次，取2次培养基进行Pall 30K超速离心浓缩，得到抗MOG抗体的粗产物。

人源抗MOG抗体的初筛：

通过细胞免疫荧光实验来筛选已经表达的可能的人源抗MOG抗体，主要步骤如下：

抗MOG抗体检测细胞的制备：

步骤1：HEK293T/Hep2细胞使用10%FBS+DMEM高糖培养基，于37℃，5%CO₂培养箱中培养；

步骤2：待细胞密度达到40%-50%，将MOG重组质粒载体pCMV-MOG-His用转染试剂PEI MAX 40K转染进入细胞，转染6小时后更换新鲜培养基；

步骤3：细胞固定：转染24-48小时后，待细胞密度达到80%-90%，使用4%多聚甲醛将细胞于室温固定5-15分钟，用PBS 200µL清洗3次。

细胞免疫荧光实验：

步骤1：将浓缩的候选抗MOG抗体稀释到200µL PBS中，终浓度为5μg/mL，加到检测孔；

步骤2：避光37℃孵育1小时；

步骤3：使用PBS清洗5次；

步骤4：加入1：1000稀释于PBS中的Alexa Fluor 488 Anti-human IgG二抗孵育1小时；

步骤5：使用PBS清洗5次；

步骤6：荧光显微镜20X物镜下观察绿色荧光信号。

经检测，表达了6个抗体，其中5个和转染MOG细胞爬片反应后没有绿色荧光信号，为阴性结果，但是其中有1个和转染MOG细胞爬片反应产生了明显的绿色荧光信号。因此这个抗体为特异性的抗MOG抗体，命名为MOG BCR。MOG BCR的重链为MOG BCR H：SEQ ID NO:9；MOG BCR的轻链为MOG BCR L：SEQ ID NO:10。

利用生物信息学分析测序结果，经过IMGT IgBlast比对，得到MOG BCR的重链可变区（VH）为QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYTMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVRTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGSELWFRELLFSMDVWGQGTTVTVSS（SEQ ID NO:7），MOG BCR的轻链可变区（VL）为MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYSTSNKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCLLYYGGVGVFGTGTKVTVL（SEQID NO:8）。

经IMGT IgBlast分析，MOG BCR的重链可变区具有如TYTMN（SEQ ID NO:1）所示的HCDR1，如WINTNTGNPTYAQGFTG（SEQ ID NO:2）所示的HCDR2，如GSELWFRELLFSMDV（SEQ IDNO:3）所示的HCDR3，以及MOG BCR的轻链可变区具有如ASSTGAVTSGFYPN（SEQ ID NO:4）所示的LCDR1，如STSNKHS（SEQ ID NO:5）所示的LCDR2，如LLYYGGVGV（SEQ ID NO:6）所示的LCDR3。

如图1所示，通过Uniprot注释及Alphafold2预测显示本发明中由上述重链/轻链序列构成的抗MOG抗体的可变区通过HCDR区和LCDR区结合于MOG胞外区IGV结构域的三级折叠结构。

实施例3、人源抗MOG抗体的表达和纯化

人源抗MOG抗体的表达质粒构建：

人源抗MOG抗体基因分别由通用公司合成，并亚克隆到表达载体pCDNA3.4中，MOGBCR 的轻重链表达质粒分别为pCDNA3.4-MOG BCR-H和pCDNA3.4-MOG BCR-L。

人源抗MOG抗体的表达：

步骤1：Expi293™细胞培养到密度为2.5-3.0 x 10⁶细胞/mL，准备转染；

步骤2：将人源抗MOG单抗表达质粒pCDNA3.4-MOG BCR-H/L按重轻链质粒比1:2加入到3mL OptiMEM中，混匀；然后加入120µL的转染试剂PEI MAX 40K（1mg/mL）混匀，室温静置10-15分钟；

步骤3：将步骤2混匀好的质粒DNA和转染试剂的混合物加到27 mL步骤1的Expi293细胞中，37℃摇床振荡培养；

步骤4：转染后24小时，加入VPA，使得VPA终浓度至1mM；

步骤5：继续振荡培养4天，然后收取培养基。

人源抗MOG抗体的纯化：

步骤1：将收取的Expi293细胞培养基在15000rpm，4℃下离心10分钟，去除死细胞和细胞碎片；

步骤2：每200mL培养基上清液加入1mg Protein G beads，然后将培养基上清液和Protein G beads旋转、结合孵育；

步骤3：孵育1小时后，用含PBS漂洗Protein G beads，漂洗3-5次，去除与beads或抗体结合弱的杂质；

步骤4：然后利用酸性甘氨酸缓冲液（pH3.0-3.5）洗脱Protein G上结合的抗体，利用1/10体积1M PH=7.5 Tris-盐酸缓冲液中和至中性；

步骤5：将步骤4得到的洗脱液使用Superdex 200 Increase进行分子筛层析，使用PBS作为洗脱液，流速0.45ml/min，逐管收集蛋白流穿液，选择通过蛋白分子量指示剂指示含IgG分子的蛋白流穿液管，使用超滤管离心浓缩即得本发明的人源抗MOG抗体。

纯化得到的抗体经过DTT还原或非还原处理后，进行SDS-PAGE胶电泳分离并进行考马斯亮蓝染色，结果见图2。图2显示本发明所得人源抗MOG抗体分子由两条重链轻链通过二硫键结合而成，分子质量在180KD左右，经过二硫键还原剂DTT处理后的本发明的人源抗MOG抗体分开为重链和轻链，并对应处于约55KD和30KD位置。

实施例4、重组人源抗MOG单抗用于ICC及细胞免疫荧光法（Cell based assay，CBA）抗体检测质控的优点

目前抗MOG抗体的检测有两种方法：基于细胞的间接免疫荧光法（Cell beasedassay，CBA）以及ELISA。CBA法仍然被公认为金标准，因为细胞表达的抗原蛋白固定后仍然能够保持其天然的空间结构，具有更佳的抗原性。

目前市场上流通的MOG CBA法检测试剂盒都未包含阳性对照，在获得阴性结果时不能排除因为细胞表达的问题，例如：转染操作失误，无法让使用者完全放心。很多实验室依赖在患者群体中筛选到阳性样本作为阳性对照品，但是单个的样本比较有限，使用完后只能寻找新的阳性样本，无法保持很好的一致性。

尽管市场上有商业化的抗MOG抗体，但是由于价格昂贵，并且大都是鼠源或者兔源的，需要相应的二抗，和检测人源自身抗体使用的抗人二抗不一样，增加了额外的试剂费用。

图3显示市场上的MOG-HIS重组蛋白示意图。如图3中所示，MOG的N端位于胞外，而C端位于胞内，His标签添加在MOG蛋白的C端。当使用该标签抗体（如His）进行免疫荧光染色时，需要提前对细胞进行通透处理。

而MOG自身免疫抗体主要识别胞外区，因此采用本发明的抗MOG抗体进行检测不需要进行通透处理，从而本发明的抗MOG抗体可以作为CBA法检测的阳性标品，以使得检测方法更加简便。

本发明的人源抗MOG抗体相比其它形式的阳性标准品（如阳性患者血清、针对His标签的单克隆抗体）具有多种优势：一是本发明的人源抗MOG抗体无需通透破膜处理，即可用于免疫荧光反应。并且即使破膜处理，也不会影响其免疫荧光反应；二是本发明的人源抗MOG抗体可以识别MOG抗原的空间结构，相比于普通的标签抗体具有明显的优势。

本实施例中的抗MOG抗体检测细胞的制备实验步骤同实施例2人源抗MOG抗体的初筛抗中抗MOG抗体检测细胞的制备。

将制备的48孔细胞，使用本发明的抗MOG抗体和His抗体（Thermo，R930-25）进行免疫荧光实验，具体步骤如下：

步骤1：对表达MOG的细胞检测孔，分为不破膜组、Saponin破膜组和Triton X-100破膜组，不破膜组仅用PBS处理10分钟，破膜组分别用溶于PBS中的0.2% Saponin或0.2%Triton X-100分别进行破膜处理10分钟，然后用PBS漂洗一次；

步骤2：将实施例3得到的纯化的本发明的抗MOG抗体稀释到5μg/mL，分别加到破膜组或不破膜组的检测孔中；将His小鼠单抗（Thermo，R930-25）按说明书要求加到Triton X-100破膜组的检测孔中；

步骤3：避光37°C孵育1小时；

步骤4：使用PBS清洗5次；

步骤5：加入1：1000稀释于PBS中的Alexa Fluor 488 Anti-human IgG或者AlexaFluor 488 Anti-mouse IgG二抗孵育1小时；

步骤6：使用PBS清洗5次；

步骤7：荧光显微镜20X物镜下观察并拍摄荧光照片。

检测结果如图4所示，其中，A为本发明的人源抗MOG单抗在不进行破膜通透处理的情况下的结果，B为本发明的人源抗MOG单抗在使用Saponin进行破膜通透处理后的结果，C为本发明的人源抗MOG单抗在使用TritonX-100进行破膜通透处理后的结果，表明破膜或者不破膜处理，本发明的人源抗MOG单抗都能和MOG表达细胞反应，产生特异性的绿色荧光信号，但不破膜处理荧光强度明显高于破膜组；D为作为对照的不加抗MOG抗体染色结果，表明无自发荧光或二抗非特异着色；E显示His小鼠单抗（Thermo，R930-25）在不进行破膜通透处理的情况下，由于His单抗无法进入细胞和His标签反应而无法反应产生荧光信号。F显示His小鼠单抗只有在使用如Triton X-100进行破膜通透处理后才能产生绿色荧光信号。此外，该实验也说明本发明的人源抗MOG抗体可以耐受Triton、Saponin等多种细胞通透试剂，能够稳定地用于免疫荧光检测。

另外，检测试剂的保存时间也是检测试剂稳定性的一个重要考量。通过Alphafold2预测证实，本发明的人源抗MOG单抗能够识别空间构像，更适合作为阳性标品去质检CBA法中检测抗MOG自身免疫抗体所用的细胞基质，因为使用常用的标签抗体可以检测到抗原末端的小标签是否存在，但是它不能反映抗原蛋白构像的改变。本发明同时使用人源抗MOG抗体和标签抗体（抗MOG抗体）检测抗MOG抗原表达细胞基质，发现本发明的人源抗MOG抗体可以用于质检保存不同时间CBA法检测产品中MOG的空间结构完成性，从而明确是否因MOG构象破坏而导致CBA法检测产品过期而导致的结果假阴性。

实施例5、重组人源抗MOG单抗用于免疫组织荧光（IHF）

本发明的人源抗MOG抗体能够有效地识别质粒转染细胞表达MOG。本发明进一步地使用大鼠的脑组织检测了本发明的人源抗MOG抗体是否能够识别大鼠源的天然的MOG蛋白。具体实验步骤如下：

步骤1：冰冻大鼠脑组织15μm切片从-80℃冰箱中取出复温；

步骤2：将步骤1中得到的复温的切片用PBS洗涤5分钟；

步骤3：加入50μL溶于PBS中的0.2% Triton X-100处理20分钟对组织进行破膜处理；

步骤4：加入50μL溶于PBS中的10% BSA处理1小时对组织进行封闭；

步骤5：使用50μL按5μg/mL稀释于PBS中的纯化的抗MOG抗体孵育4℃过夜；

步骤6：用PBS洗涤3次；

步骤7：使用按1：1000稀释于PBS中的抗人的荧光二抗Alexa Fluor 488 Anti-human IgG，在室温孵育1小时；

步骤8：PBS洗涤3次；

步骤9：滴加DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole)）避光孵育15分钟；

步骤10：用甘油封片，37℃烘干保存；

步骤11：荧光显微镜10X物镜下观察并拍摄荧光照片。

检测结果如图5所示，在大鼠的海马区可见髓鞘染色，这表明使用本发明的人源抗MOG单抗在大鼠脑组织切片上能够识别大鼠脑组织髓鞘中的MOG蛋白。比例尺：100μm。

实施例6、重组人源抗MOG单抗和MOG蛋白的免疫沉淀（IP）实验

本发明的人源抗MOG抗体能够有效地识别质粒转染细胞表达的人源MOG及大鼠脑组织中的MOG，本发明进一步使用瞬时转染MOG的HEK293T细胞检测了本发明的人源抗MOG抗体是否能够在IP技术中识别人源MOG蛋白，并对MOG和其结合蛋白进行沉淀，从而研究与MOG相互作用蛋白。

由于MOG存在于细胞膜表面，其空间结构依赖于细胞膜。为了在IP前后对MOG进行检测，因此需要使用离子去垢剂破坏脂质细胞膜以及MOG蛋白三级空间结构来进行蛋白印迹（WB）技术检测。

本发明的人源抗MOG单抗因识别空间结构，因此该抗体不能用于WB中三级结构经过破坏的变性蛋白肽段的检测（数据未示）。为解决这一问题，对表达质粒上MOG序列的N端加入绿色荧光蛋白（GFP）标签，并通过小鼠抗GFP抗体对MOG进行WB检测。

具体实验步骤如下：

步骤1：抗MOG抗体检测细胞的制备同实施例2人源抗MOG抗体的初筛抗中抗MOG抗体检测细胞的制备的步骤1和2。转染质粒为pCMV-GFP-MOG-His。

步骤2：转染1天后，使用含1% Triton X-100的50mM Tris-盐酸对细胞进行裂解，离心去除细胞碎片或不可溶物质。

步骤3：使用未加载抗体Dynabeads Protein G的磁珠对细胞裂解样品进行预孵育1小时，去除和磁珠粘连的非特异性蛋白。

步骤4：将本发明的抗MOG抗体或正常人IgG与Protein G磁珠常温孵育30分钟，从而将MOG抗体5μg加载于50μl Protein G磁珠之上。使用加载本发明的人源抗MOG抗体或正常人IgG的Protein G磁珠与步骤3预处理的细胞裂解样品4℃孵育6-12小时。

步骤5：使用PBS充分洗涤后，使用20μl 稀释2X的4X LDS蛋白上样缓冲液70℃加热10分钟，收集包含IP蛋白的上清液。

步骤6：对细胞裂解液和IP上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳，并转至PVDF膜上。

步骤7：PDVF膜使用5%脱脂奶粉进行封闭，与小鼠抗GFP抗体按照说明书要求在4℃孵育过夜，然后用TBS洗涤数次，再加入1：10000稀释的辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，在常温孵育1小时。

步骤8：用PBS洗涤数次后，使用Millipore ECL显影发光液对PVDF膜进行曝光检测，读取结果。

检测结果如图6所示，对转染GFP-MOG-his细胞进行IP前总细胞裂解液（Totallysate）和使用本发明中抗MOG抗体IP后组分在通过WB在相应分子量位置（25KD）可以被抗GFP抗体检测。而使用正常人IgG进行IP后并未在相应位置出现条带。表明本发明中人源抗MOG抗体可以用于MOG蛋白的IP实验。

实施例7、重组人源抗MOG单抗标记表达MOG抗原的HEK293T细胞的流式分析

活细胞流式细胞表面蛋白检测依赖于标记抗体可以识别活细胞表面有空间构象的活性蛋白。为验证本发明的抗MOG抗体是否可以用于活细胞流式细胞术，进行下面的实验。具体实验步骤如下：

步骤1：抗MOG抗体检测细胞的制备同实施例2人源抗MOG抗体的初筛抗中抗MOG抗体检测细胞的制备的步骤1和2。

步骤2：转染1天后使用含0.1% EDTA的PBS溶液对瞬时转染MOG的HEK293T细胞在37℃进行消化10分钟处理为悬浮单个细胞。

步骤3：使用实施例3得到的本发明的人源抗MOG抗体按5μg/mL与1-2 x 10⁴个细胞在4℃孵育1小时。

步骤4：用PBS洗涤后，使用1：1000稀释的Alexa Fluor 488 Anti-human IgG按照说明书要求在4℃孵育1h。

步骤5：洗涤后使用筛网滤除粘连细胞。

步骤6：使用流式细胞仪进行检测。

检测结果如图7所示，其中，A为检测细胞仅转染对照空质粒并使用本发明抗MOG抗体流式检测的结果；B为检测细胞仅转染MOG质粒并使用本发明抗MOG抗体流式检测的结果。上述结果显示，使用本发明抗MOG抗体流式检测转染MOG蛋白的细胞较转染对照空质粒的细胞MOG阳性细胞比例明显升高，表明本发明的抗MOG抗体可以识别活细胞表面表达的MOG抗原并与之结合，从而本发明的抗MOG抗体应用于MOG蛋白的活细胞流式检测。

经过FC、ICC、IHF和IP实验的验证，本发明筛选的人源抗MOG抗体能够有效地识别未变性的有蛋白三级空间结构的MOG，可以用于上述多种实验来探测组织或活细胞表面的MOG蛋白，也可以作为临床CBA法检测MOG抗体的阳性标品。另外本发明筛选的人源抗MOG抗体可以作为MOG自身抗体检测试剂盒的阳性标品。所述人源MOG 单抗作为阳性标品存在具有2个优点：一是可以和检测人体样本共用抗人二抗，不需要增加额外的试剂组分；二是它能够更加精准地反映出转染MOG抗原细胞基质的保存状态，是否丧失了空间构像而不能用于抗MOG抗体的检测。

序列表

MOG BCR HCDR1（SEQ ID NO:1）：TYTMN

MOG BCR HCDR2（SEQ ID NO:2）：WINTNTGNPTYAQGFTG

MOG BCR HCDR3（SEQ ID NO:3）：GSELWFRELLFSMDV

MOG BCR LCDR1（SEQ ID NO:4）：ASSTGAVTSGFYPN

MOG BCR LCDR2（SEQ ID NO:5）：STSNKHS

MOG BCR LCDR3（SEQ ID NO:6）：LLYYGGVGV

MOG BCR VH（SEQ ID NO:7）：

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYTMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVRTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGSELWFRELLFSMDVWGQGTTVTVSS

MOG BCR VL（SEQ ID NO:8）：

QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYSTSNKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCLLYYGGVGVFGTGTKVTVL

MOG BCR 重链（SEQ ID NO:9）：

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYTMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVRTAYLQISSLKAEDTAVYYCARGSELWFRELLFSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWSSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDQEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

MOG BCR 轻链（SEQ ID NO:10）：

QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGFYPNWFQQKPGQAPRALIYSTSNKHSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCLLYYGGVGVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。

Claims

1. 一种抗MOG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗MOG抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，

所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及

所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。

2. 根据权利要求1所述的抗MOG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，

所述抗MOG抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:7具有至少70%同一性的氨基酸序列；以及

所述抗MOG抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8具有至少70%同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗MOG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，

所述抗MOG抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，

所述重链包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:9具有至少70%同一性的氨基酸序列；以及

所述轻链包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10具有至少70%同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗MOG抗体或其抗原结合片段，其特征在于，

所述抗MOG抗体是单克隆抗体，

所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体、二聚化的V区、二硫键稳定化的V区和包含CDR的肽的抗原结合片段。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码如权利要求1-4中任一项所述的抗MOG抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求5所述的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是重组表达载体。

8.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是原核表达载体或真核表达载体。

9.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是质粒。

10.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞导入或含有如权利要求6-9中任一项所述的重组载体。

11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。

12.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

13.根据权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自HEK293T细胞，Hela细胞，Hep2细胞。

14.一种制备抗MOG抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述制备抗MOG抗体或其抗原结合片段的方法包括使如权利要求10-13中任一项所述的宿主细胞在培养物中进行培养以得到抗MOG抗体或其抗原结合片段的步骤。

15.如权利要求1-4中任一项所述的抗MOG抗体或其抗原结合片段的应用，其特征在于，所述应用选自：所述抗MOG抗体或其抗原结合片段在制备用于检测抗MOG抗体的制品中的应用；所述抗MOG抗体或其抗原结合片段在制备用于MOG抗原转染细胞的质检的制品中的应用；所述抗MOG抗体或其抗原结合片段在MOG抗原的抗原决定簇研究中的应用。

16.一种抗MOG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗MOG抗体检测试剂盒包含如权利要求1-4中任一项所述的抗MOG抗体或其抗原结合片段作为阳性标品。