CN113024652A - 人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用，具体的，提供了一种表达量高，免疫原性好，纯度高的真核重组MOG蛋白的制备方法，本发明运用基因工程技术，克隆得到MOG基因的胞外段，连接到表达载体上再转化入宿主细胞表达纯化大量稳定的MOG蛋白，为MOG抗体的体外诊断提供了基础。本发明在基因合成的过程中对MOG的基因进行了密码子的优化，运用了3个不同的信号肽最优表达时间的优化，确定了上清表达的最佳收样时间，本发明在纯化的缓冲液中加入了10％的乙醇，成功避免了蛋白聚集的情况，且在最终MOG表达的活性鉴定中，表达的MOG蛋白，可以准确的区分临床上MOG‑IgG的阳性和阴性样本。
Description
技术领域
本发明属于生物蛋白重组表达技术领域，具体的，涉及一种人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用。
背景技术
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glyco-protein，MOG)为少突胶质细胞膜结合糖蛋白，是中枢神经髓鞘的重要组成部分，研究显示抗MOG抗体在多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的病理过程中起着非常重要的作用，由MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental au-toimmune encephalomyelitis，EAE)是目前国际上公认的MS动物模型】。目前国内所使用的MOG多为人工合成的MOC肽段。MOG细胞外Ig样结构域(extracellular immunoglobulin domain ofMOG，MOG'8)含有多个抗原表位，具有很强的免疫原性。
本发明涉及提供一种表达量高，免疫原性好，纯度高的真核重组MOG蛋白的制备方法，本发明运用基因工程技术，克隆得到MOG基因的胞外段，连接到表达载体上再转化入宿主细胞表达纯化大量稳定的MOG蛋白，为MOG抗体的体外诊断提供了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，具体包括如下步骤：
第一步，重组质粒构建
通过基因合成技术将重组MOG的Ig样结构域密码子优化后亚克隆至带有不同信号肽序列的pTT5中，构建重组MOG质粒。
第二步，抽提转染级别质粒
第三步，转染
S1、转染Expi293FTM细胞的前准备
S2、转染Expi293FTM细胞
S21、转染前一天(第-1天)，将Expi293FTM培养物分裂成2.5–3×106活细胞/mL的最终密度，并使细胞生长过夜；
S22、用预热至37℃的新鲜Expi293TM表达培养基将步骤S21中的细胞稀释至3×106活细胞/mL的终密度，轻轻摇动烧瓶以混合细胞；
S23、制备ExpiFectamineTM293/质粒DNA复合物；
S24、在室温下孵育步骤S23中的步骤d制备的ExpiFectamineTM293/质粒DNA复合物10–20分钟，然后将溶液缓慢转移至步骤4的摇瓶中，在添加过程中轻轻摇动烧瓶；
S25、在37℃的培养箱中，8％CO2的潮湿环境中孵育细胞在轨道振动筛上的空气中；
S26、转染第三天开始收集0.3mL培养物，3000r/min,4度离心5min，将培养基上清加2×SDS Loading buffer，水浴锅中煮沸5min；
S27、连续取样4天，将制备的样本进行WB检测，验证上清液表达的情况；
第四步，纯化目的蛋白
(1)取1mL镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10mL1*PBS，10％乙醇，pH 7.4；
(2)将培养上清样品加入乙醇到培养上清中至终浓度10％，用0.22微米微孔滤膜过滤，然后以0.5mL/min上样，收集流出液，将流出液再次上样，以使蛋白样品充分结合到凝胶上；
(3)用30mL缓冲液去洗未吸附的样品，流速1-2mL/min；
(4)分别用30mLWashbuffer洗去未吸附的样品，流速1-2mL/min；
(5)用1mL Elutionbuffer将靶蛋白洗脱下来，流速1-2mL/min；
(6)再用50mL缓冲液冲洗柱子，灌满20％乙醇，封闭，以备下次使用。
作为本发明的进一步方案，第一步中表达的重组蛋白序列为：
MASLSRPSLPSCLCSFLLLLLLQVSSSYAGQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCRISPGKNATGMEVGWYRPPFSRVVHLYRNGKDQDGDQAPEYRGRTELLKDAIGEGKVTLRIRNVRFSDEGGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVEDPFYWVSPGHHHHHHHH。
作为本发明的进一步方案，pTT5所带信号肽的序列分别为：
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSG、MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC与MOG蛋白自身的信号肽。
作为本发明的进一步方案，步骤S1中转染Expi293FTM细胞的前准备包括如下步骤：
S11、从液氮中取出小瓶，并在37℃水浴中旋转1至2分钟，以迅速解冻细胞，直到仅剩少量冰为止。
S12、在细胞完全融化之前，用70％乙醇擦拭小瓶，然后在层流通风橱中打开小瓶，以对其进行净化。
S13、使用1mL移液器将冷冻管的全部内容物转移到125mL聚碳酸酯，一次性，无菌，通风口的锥形瓶中，其中装有20mL预热的Expi293TM表达培养基。
S14、在轨道振动台上，在相对湿度≥80％和8％CO2的37℃培养箱中培养细胞。
S15、解冻后让细胞培养3-4天，然后确定存活的细胞密度和存活率，当细胞活力应≥90％，此时活细胞密度通常>1×106活细胞/mL时，开始传代，将其亚培养至0.3–0.5×106个细胞/mL。
作为本发明的进一步方案，步骤S23中制备ExpiFectamineTM293/质粒DNA复合物的具体步骤为：
a.轻轻倒置ExpiFectamineTM293试剂瓶4-5次以进行混合；
b.用Opti-MEMTMI还原血清培养基稀释质粒DNA。通过旋转管和/或反转来混合；
c.用Opti-MEMTMI还原血清培养基稀释ExpiFectamineTM293试剂。旋转试管2至3次进行混合，并在室温下孵育5分钟，然后再启动质粒DNA络合反应；
d.将稀释的ExpiFectamineTM293试剂添加到稀释的质粒DNA中，旋转试管2至3次进行混合。
作为本发明的进一步方案，第四步中所用预洗缓冲液为1*PBS，10％乙醇，pH 7.4。
作为本发明的进一步方案，第四步中所用Wash buffer包括5mM咪唑，1*PBS，10％乙醇，pH 7.4以及20mM咪唑，1*PBS，10％乙醇，pH 7.4两种。
作为本发明的进一步方案，第四步中Elution buffer包括250mM咪唑，10％乙醇，0.05％吐温-20。
本发明的有益效果：
1、在基因合成的过程中对MOG的基因进行了密码子的优化，运用了3个不同的信号肽最优表达时间的优化，确定了上清表达的最佳收样时间。
2、本发明在纯化的缓冲液中加入了10％的乙醇，成功避免了蛋白聚集的情况。
3、在最终MOG表达的活性鉴定中，表达的MOG蛋白，可以准确的区分临床上MOG-IgG的阳性和阴性样本。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，具体包括如下方法：
第一步，重组质粒构建
通过基因合成技术将重组MOG的Ig样结构域密码子优化后亚克隆至pTT5中(分别带有不同的信号肽)，构建重组MOG质粒。
表达的重组蛋白序列为：
MASLSRPSLPSCLCSFLLLLLLQVSSSYAGQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCRISPGKNATGMEVGWYRPPFSRVVHLYRNGKDQDGDQAPEYRGRTELLKDAIGEGKVTLRIRNVRFSDEGGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVEDPFYWVSPGHHHHHHHH
信号肽的序列为：
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSG、MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC与MOG蛋白自身的信号肽；
第二步，抽提转染级别质粒
第三步，转染
S1、转染Expi293FTM细胞的前准备
S11、从液氮中取出小瓶，并在37℃水浴中旋转1至2分钟，以迅速解冻细胞，直到仅剩少量冰为止。
S12、在细胞完全融化之前，用70％乙醇擦拭小瓶，然后在层流通风橱中打开小瓶，以对其进行净化。
S13、使用1mL移液器将冷冻管的全部内容物转移到125mL聚碳酸酯，一次性，无菌，通风口的锥形瓶中，其中装有20mL预热的Expi293TM表达培养基。
S14、在轨道振动台上，在相对湿度≥80％和8％CO2的37℃培养箱中培养细胞。
S15、解冻后让细胞培养3-4天，然后确定存活的细胞密度和存活率，当细胞活力应≥90％，此时活细胞密度通常>1×106活细胞/mL时，开始传代，将其亚培养至0.3–0.5×106个细胞/mL。
S2、转染Expi293FTM细胞
S21、转染前一天(第-1天)，将Expi293FTM培养物分裂成2.5–3×106活细胞/mL的最终密度，并使细胞生长过夜；
S22、用预热至37℃的新鲜Expi293TM表达培养基将步骤S21中的细胞稀释至3×106活细胞/mL的终密度，轻轻摇动烧瓶以混合细胞；
S23、按照说明制备ExpiFectamineTM293/质粒DNA复合物；
注意：要转染的每毫升培养物体积的总质粒DNA为1.0μg，适合大多数蛋白质。
a.轻轻倒置ExpiFectamineTM293试剂瓶4-5次以进行混合；
b.用Opti-MEMTMI还原血清培养基稀释质粒DNA。通过旋转管和/或反转来混合；
c.用Opti-MEMTMI还原血清培养基稀释ExpiFectamineTM293试剂。旋转试管2至3次进行混合，并在室温下孵育5分钟，然后再启动质粒DNA络合反应；
d.将稀释的ExpiFectamineTM293试剂添加到稀释的质粒DNA中，旋转试管2至3次进行混合；
S24、在室温下孵育步骤S23中的步骤d制备的ExpiFectamineTM293/质粒DNA复合物10–20分钟，然后将溶液缓慢转移至步骤4的摇瓶中，在添加过程中轻轻摇动烧瓶；
S25、在37℃的培养箱中，8％CO2的潮湿环境中孵育细胞在轨道振动筛上的空气中；
S26、转染第三天开始收集0.3mL培养物，3000r/min,4度离心5min，将培养基上清加2×SDS Loading buffer，水浴锅中煮沸5min；
S27、连续取样4天，将制备的样本进行WB检测，验证上清液表达的情况。
经过检测，在转染后第4天，带有序列MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSG的信号肽的质粒转染的上清中有较多的MOG蛋白表达；
第四步，纯化目的蛋白
(1)取1mL镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10mL1*PBS，pH 7.4；
(2)为了完全去除杂质，将乙醇加到培养上清至终浓度为10％，培养上清样品用0.22微米l微孔滤膜过滤，然后以0.5mL/min上样，收集流出液，将流出液再次上样，以使蛋白样品充分结合到凝胶上；
(3)用30mL，预洗缓冲液去洗未吸附的样品，流速1-2mL/min；
(4)分别用30mLWashbuffer洗去未吸附的样品(依浓度梯度洗脱)，流速1-2mL/min；
(5)用1mL Elutionbuffer将靶蛋白洗脱下来，流速1-2mL/min；
(6)再用50mL，预洗缓冲液冲洗柱子，灌满20％乙醇，封闭，以备下次使用。
第四步中所用预洗缓冲液：1*PBS，10％乙醇，pH 7.4；
Wash buffer:5mM咪唑，1*PBS，10％乙醇，pH 7.4；20mM咪唑，10％乙醇，1*PBS，pH7.4；Elution buffer:250mM咪唑，10％乙醇，0.05％吐温-20。
活性测定
用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将MOG蛋白稀释至蛋白质含量为1μg/mL，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(PBST)洗1次200μl/well，每次1分钟。
封闭：2％BSA封闭酶标板300μl/well RT 1h；
加样：弃封闭液拍干后用洗涤缓冲液洗1次200μl/well，每次1分钟；用临床检测MOG-IgG抗体阳性的脑脊液，稀释2倍和4倍于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1h然后洗涤，(同时做空白孔，阴性对照孔)。
加酶标抗体：弃样品拍干后用洗涤缓冲液洗6次200μl/well，每次6分钟。于各反应孔中，加入1:10000新鲜稀释的酶标抗体(HRP标记的羊抗人IgG抗体)100μl，37℃(置RT孵育)孵育1小时；
加底物液显色：弃样品拍干后用洗涤缓冲液洗6次200μl/well，每次6分钟，于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，37℃(置RT孵育)10分钟。
终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50μl。
结果显示，临床检测MOG-IgG抗体阳性的样本相对于阴性值和空白值，都有较高的检测值，说明表达纯化的MOG抗体是有很好的活性的。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，具体包括如下步骤：
第一步，重组质粒构建
通过基因合成技术将重组MOG的Ig样结构域密码子优化后亚克隆至带有不同信号肽序列的pTT5中，构建重组MOG质粒。
第二步，抽提转染级别质粒
第三步，转染
S1、转染Expi293FTM细胞的前准备
S2、转染Expi293FTM细胞
S21、转染前一天，将Expi293FTM培养物分成2.5–3×106细胞/mL的最终密度，并使细胞生长过夜；
S22、用预热至37℃的新鲜Expi293TM表达培养基将步骤S21中的细胞稀释至3×106细胞/mL的终密度，轻轻摇动烧瓶以混合细胞；
S23、制备ExpiFectamineTM293/质粒DNA复合物；
S24、在室温下孵育步骤S23中的步骤d制备的ExpiFectamineTM293/质粒DNA复合物10–20分钟，然后将溶液缓慢转移至步骤4的摇瓶中，在添加过程中轻轻摇动烧瓶；
S25、在37℃的培养箱中，8％CO2的潮湿环境中孵育细胞在轨道振动筛上的空气中；
S26、转染第三天开始收集0.3mL培养物，3000r/min,4度离心5min，将培养基上清加2×SDS Loading buffer，水浴锅中煮沸5min；
S27、连续取样4天，将制备的样本进行WB检测，验证上清液表达的情况；
第四步，纯化目的蛋白
(1)取1mL镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10mL1*PBS，10％乙醇，pH 7.4冲洗预装柱；
(2)将培养上清样品添加乙醇，至终浓度10％；然后用0.22微米l微孔滤膜过滤，然后以0.5mL/min上样，收集流出液，将流出液再次上样，使蛋白样品充分结合到凝胶上；
(3)用30mL超声破碎缓冲液去洗未吸附的样品，流速1-2mL/min；
(4)分别用30mL Wash buffer洗去未吸附的样品，流速1-2mL/min；
(5)用1mL Elution buffer将靶蛋白洗脱下来，流速1-2mL/min；
(6)再用50mL超声破碎缓冲液冲洗柱子，灌满20％乙醇，封闭，以备下次使用。
2.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，第一步中表达的重组蛋白序列为：
MASLSRPSLPSCLCSFLLLLLLQVSSSYAGQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCRISPGKNATGMEVGWYRPPFSRVVHLYRNGKDQDGDQAPEYRGRTELLKDAIGEGKVTLRIRNVRFSDEGGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVEDPFYWVSPGHHHHHHHH。
3.根据权利要求2所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，pTT5所带信号肽的序列分别为：
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSG、MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC与MOG蛋白自身的信号肽。
4.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，步骤S1中转染Expi293FTM细胞的前准备包括如下步骤：
S11、从液氮中取出小瓶，并在37℃水浴中旋转1至2分钟，以迅速解冻细胞，直到仅剩少量冰为止。
S12、在细胞完全融化之前，用70％乙醇擦拭小瓶，然后在层流通风橱中打开小瓶，对其进行净化。
S13、使用1mL移液器将冷冻管的全部内容物转移到125mL聚碳酸酯，一次性，无菌，通风口的锥形瓶中，其中装有20mL预热的Expi293TM表达培养基。
S14、在轨道振动台上，在相对湿度≥80％和8％CO2的37℃培养箱中培养细胞。
S15、解冻后让细胞培养3-4天，然后确定存活的细胞密度和存活率，当细胞活力应≥90％，此时活细胞密度通常>1×106活细胞/mL时，开始传代，将其亚培养至0.3–0.5×106个细胞/mL。
5.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，步骤S23中制备ExpiFectamineTM293/质粒DNA复合物的具体步骤为：
a.轻轻倒置ExpiFectamineTM293试剂瓶4-5次以进行混合；
b.用Opti-MEMTMI还原血清培养基稀释质粒DNA。通过旋转管和/或反转来混合；
c.用Opti-MEMTMI还原血清培养基稀释ExpiFectamineTM293试剂。旋转试管2至3次进行混合，并在室温下孵育5分钟，然后再启动质粒DNA络合反应；
d.将稀释的ExpiFectamineTM293试剂添加到稀释的质粒DNA中，旋转试管2至3次进行混合。
6.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，第四步中所用超声破碎缓冲液为1*PBS，pH 7.4。
7.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，第四步中所用Wash buffer包括5mM咪唑，1*PBS，pH 7.4以及20mM咪唑，1*PBS，pH 7.4两种。
8.根据权利要求1所述的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达，其特征在于，第四步中Elution buffer包括250mM咪唑，0.05％吐温-20。
9.根据权利要求1所述的方法重组表达的人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白在免疫检测方面的应用。
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