CN117624675B - 再生丝素蛋白膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于丝素蛋白技术领域，具体涉及一种再生丝素蛋白膜及其制备方法和应用。所述方法包括：桑蚕丝脱胶、干燥，得到干燥丝素；以PEG300‑PEG600为溶剂，将干燥丝素配置成的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液；混合溶液置于40‑45℃搅拌10‑20h，得到预反应液；预反应液制备再生丝素蛋白膜。本发明制备的再生丝素蛋白膜力学性能好，生物相容性也好，应用价值高。
Description
技术领域
本发明属于丝素蛋白技术领域，具体涉及一种再生丝素蛋白膜及其制备方法和应用。
背景技术
丝素蛋白是一种高分子蛋白，主要含有18中氨基酸，丝素蛋白具有出色的机械性能、生物相容性和生物降解性，在生物材料和组织工程领域具有很好的应用前景。
目前，丝素蛋白以多种形式被应用(林楠,左保齐.医用再生丝素蛋白材料制备与研究进展[J].现代丝绸科学与技术,2020,35(3):9.)，包括：
(1)制备再生丝素溶液，具体包括脱胶步骤、溶解步骤。由于丝素蛋白和死角蛋白的协同作用会产生一定的免疫反应，所以脱胶是将丝素蛋白用作生物材料的关键步骤。蚕丝经过脱胶后可以溶解，溶解后的丝素蛋白可以制成多种剂型。
(2)制备丝素蛋白材料，包括制备水凝胶、多孔支架、薄膜、微球等材料。其中水凝胶的制备方法包括旋流剪切、超声振荡、酸处理、自然凝胶等；多孔支架通过冷冻干燥、粒子致孔灯步骤制备；薄膜采用浇筑法等方法制备；微球采用喷雾干燥、冷冻干燥等方法制备。
丝素蛋白具有出色的成膜能力，可制成丝素蛋白膜，现有技术也称作丝素膜或者丝蛋白膜(参考专利CN103200971B)。边瑞琦(边瑞琦.再生丝素蛋白/左旋聚乳酸——聚己内酯共聚物复合纳米纤维膜支架的制备及性能研究[D].浙江理工大学[2023-10-13])探究了再生丝素蛋白/左旋聚乳酸复合成的薄膜的制备方法，其研究结果显示，随着京尼平含量的增加，纳米纤维直径逐渐变大，形貌变得粗细不均，且交联程度逐渐增大，材料的热性能逐渐提高，常温下的力学性能也逐渐增强。体外细胞培养实验表明京尼平的加入对于L929细胞无毒副作用。为了进一步提高静电纺丝素蛋白纳米纤维膜的力学性能，其选用了高聚物左旋聚乳酸-聚己内酯共聚物[P(LLA-CL)]与丝素蛋白按不同混比共混，利用静电纺丝法制备左旋聚乳酸-聚己内酯共聚物[P(LLA-CL)]/丝素蛋白共混纳米纤维膜。为了提高材料的力学性能同时能保持较好的生物相容性，其通过同轴静电纺丝法制备丝素蛋白/P(LLA-CL)皮芯结构复合纳米纤维膜，并将为了进一步提高复合纤维膜的力学性能，将材料的芯层中混入多壁碳纳米管(MWCNTs)，且MwCNTs的混入有利于提高纳米膜的生物相容性。
通过分析上述现有技术，我们可以发现，丝素蛋白虽然具有不错的生物材料制备应用前景，但是丝素蛋白直接制备的膜力学性能差，需要改进。边瑞琦等人的方法虽然提高了再生丝素蛋白膜的力学性能，但是已经是2012年的技术了，年代久远，再生丝素蛋白膜的力学性能有待提高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种再生丝素蛋白膜及其制备方法和应用，相比于现有技术，本发明制备的再生丝素蛋白膜力学性能更好，应用价值高。
本发明的一个目的是提供一种再生丝素蛋白膜的制备方法，包括：
蚕丝脱胶、干燥，得到干燥丝素；
以PEG300-PEG600为溶剂，将干燥丝素配置成的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液；其中，京尼平在一定条件下能发生聚合反应，可与丝素蛋白上的自由氨基反应，形成分子内与分子间共价键，是成膜的关键。京尼平还可与羧甲基壳聚糖交联。甘油分散在膜中；其中，所述改良剂为羧甲基壳聚糖或者甘油。改良剂可以同时提高再生丝素蛋白膜的力学性能和生物相容性；优选的，以PEG300、PEG400、PEG600为溶剂；L-谷氨酸钠对光和热具有一定的稳定性，将其添加到桑蚕丝中进行处理，既能提高丝素蛋白的稳定性，还能够加速脱胶；
混合溶液置于40-45℃搅拌10-20h，得到预反应液；
预反应液制备再生丝素蛋白膜。
优选的，上述再生丝素蛋白膜的制备方法，将干燥丝素配置成质量分数8-10％的丝素水溶液；丝素水溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2-5％，改良剂的质量浓度为0.2-0.4％。
优选的，上述再生丝素蛋白膜的制备方法，以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.3％。
优选的，上述再生丝素蛋白膜的制备方法，预反应液采用延流法制备再生丝素蛋白膜。
优选的，上述再生丝素蛋白膜的制备方法，还包括微波处理步骤：预反应液经微波处理，然后制备再生丝素蛋白膜。
优选的，上述再生丝素蛋白膜的制备方法，微波处理条件为600-800W，20s。
优选的，上述再生丝素蛋白膜的制备方法，微波处理条件为700W，20s。
优选的，上述再生丝素蛋白膜的制备方法，所述脱胶的方法包括：
(1)用碱溶液煮沸蚕丝30min，过滤，收集沉淀；其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的；
(2)将沉淀继续用所述碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，检测是否脱胶完全；
(3)重复(2)操作，直至检测到桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液，浓缩、干燥、得到干燥丝素。
本发明还提供了一种上述方法制备的再生丝素蛋白膜。
优选的，上述再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60-80μm。
本发明还提供了一种再生丝素蛋白膜的应用，包括，将再生丝素蛋白膜用于促进细胞的渗透、生长和增殖。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用改进的碱溶液配方，提高桑蚕丝的脱胶效率，缩短脱胶时间，节能环保。
本发明在制备混合溶液的时候加入了改良剂，所述改良剂为羧甲基壳聚糖或者甘油，改良剂的加入可提高丝素蛋白膜的力学性能。
本发明还采用微波处理，增加交联效果，提高膜的力学性能。
综上，本发明制备的再生丝素蛋白膜力学性能更好，生物相容性也好，应用价值高。本发明制备的再生丝素蛋白膜更有利于细胞的渗透、生长和增殖。
附图说明
图1是实施例1制备的再生丝素蛋白膜的表面SEM图，标尺5μm。
图2是实施例1制备的再生丝素蛋白膜的力学拉伸曲线图。
图3是实施例2制备的再生丝素蛋白膜的力学拉伸曲线图。
图4是实施例3制备的再生丝素蛋白膜的力学拉伸曲线图。
图5是实施例4制备的再生丝素蛋白膜的力学拉伸曲线图。
图6是实施例5制备的再生丝素蛋白膜的力学拉伸曲线图。
图7是实施例6制备的再生丝素蛋白膜的力学拉伸曲线图。
图8是实施例7制备的再生丝素蛋白膜的力学拉伸曲线图。
图9是实施例8制备的再生丝素蛋白膜的力学拉伸曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。
1、主要实验试剂和设备
桑蚕丝：浙江市售，是天然纤维。是将桑蚕茧剪开，去除其内的蛹和蜕皮，获得白净的茧壳。
京尼平：CAS号6902-77-8，武汉克米克生物医药技术有限公司，含量＞98％。
羧甲基壳聚糖：CAS号83512-85-0，广东翁江化学试剂有限公司，BR级别。生物相容性和生物安全性良好。
微波条件在微波炉中进行。
下述实施例和试验中，预反应操作步骤时，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。
2、实施例
实施例1
一种再生丝素蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
1脱胶
1.1.1用碱溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。
其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的。
1.1.2将沉淀继续用1.1.1的碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，收集溶液，检测是否脱胶完全。
1.1.3重复步骤1.1.2，直至桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液。其中，用苦味酸胭脂红溶液检测是否脱胶完全。
1.2处理
1.2.1将1.1.3的丝素蛋白溶液用砂芯漏斗过滤，滤液用乙酸溶液调整pH值至4后用硫酸盐饱和溶液盐析2h，析出沉淀进行离心分离得到蛋白质沉淀。将蛋白质沉淀转移至放有0.2μm孔径的微孔滤膜的砂芯抽滤漏斗中，依次用体积分数75％乙醇和去离子水进行抽滤淋洗。将淋洗后的滤饼超声分散于去离子水中，移入截留分子量为3500Da的透析袋中，透析袋内溶液用体积分数30％的聚乙二醇20000的水溶液进行浓缩。将浓缩液置入冷冻干燥机，在-30℃下进行预冻，冷冻状态下真空干燥10h，得到干燥丝素。
1.2.2以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.3％。
所述改良剂为羧甲基壳聚糖。
1.3制膜
1.3.1预反应：将1.2.2制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。
1.3.2微波处理：将预反应液微波处理，微波处理条件为700W，20s。
1.3.3延流法制备薄膜：将微波处理后的预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
本实施例制备的拉伸断裂伸长率为62.8％，断裂强度为34.3MPa，膜SEM图参见图1，力学拉伸曲线图参见图2。
实施例2
一种再生丝素蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
2.1脱胶
2.1.1用碱溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的。
2.1.2将沉淀继续用2.1.1的碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，收集溶液，检测是否脱胶完全。
2.1.3重复步骤2.1.2，直至桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液。其中，用苦味酸胭脂红溶液检测是否脱胶完全。
2.2处理
2.2.1将2.1.3的丝素蛋白溶液用砂芯漏斗过滤，滤液用乙酸溶液调整pH值至4后用硫酸盐饱和溶液盐析2h，析出沉淀进行离心分离得到蛋白质沉淀。将蛋白质沉淀转移至放有0.2μm孔径的微孔滤膜的砂芯抽滤漏斗中，依次用体积分数75％乙醇和去离子水进行抽滤淋洗。将淋洗后的滤饼超声分散于去离子水中，移入截留分子量为3500Da的透析袋中，透析袋内溶液用体积分数30％的聚乙二醇20000的水溶液进行浓缩。将浓缩液置入冷冻干燥机，在-30℃下进行预冻，冷冻状态下真空干燥10h，得到干燥丝素。
2.2.2以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为3％，改良剂的质量浓度为0.3％。
所述改良剂为羧甲基壳聚糖。
2.3制膜
2.3.1预反应：将2.2.2制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。
2.3.2微波处理：将预反应液微波处理，微波处理条件为700W，20s。
2.3.3延流法制备薄膜：将微波处理后的预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
本实施例制备的拉伸断裂伸长率为61.3％，断裂强度为34.9MPa，力学拉伸曲线图参见图3。
实施例3
一种再生丝素蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
3.1脱胶
3.1.1用碱溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的。
3.1.2将沉淀继续用3.1.1的碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，收集溶液，检测是否脱胶完全。
3.1.3重复步骤3.1.2，直至桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液。其中，用苦味酸胭脂红溶液检测是否脱胶完全。
3.2处理
3.2.1将3.1.3的丝素蛋白溶液用砂芯漏斗过滤，滤液用乙酸溶液调整pH值至4后用硫酸盐饱和溶液盐析2h，析出沉淀进行离心分离得到蛋白质沉淀。将蛋白质沉淀转移至放有0.2μm孔径的微孔滤膜的砂芯抽滤漏斗中，依次用体积分数75％乙醇和去离子水进行抽滤淋洗。将淋洗后的滤饼超声分散于去离子水中，移入截留分子量为3500Da的透析袋中，透析袋内溶液用体积分数30％的聚乙二醇20000的水溶液进行浓缩。将浓缩液置入冷冻干燥机，在-30℃下进行预冻，冷冻状态下真空干燥10h，得到干燥丝素。
3.2.2以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为4％，改良剂的质量浓度为0.3％。
所述改良剂为羧甲基壳聚糖。
3.3制膜
3.3.1预反应：将3.2.2制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。
3.3.2微波处理：将预反应液微波处理，微波处理条件为700W，20s。
3.3.3延流法制备薄膜：将微波处理后的预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
本实施例制备的拉伸断裂伸长率为60.1％，断裂强度为36.4MPa，力学拉伸曲线图参见图4。
实施例4
一种再生丝素蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
4.1脱胶
4.1.1用碱溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的。
4.1.2将沉淀继续用4.1.1的碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，收集溶液。
4.1.3重复步骤4.1.2，直至桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液。其中，用苦味酸胭脂红溶液检测是否脱胶完全。
4.2处理
4.2.1将4.1.3的丝素蛋白溶液用砂芯漏斗过滤，滤液用乙酸溶液调整pH值至4后用硫酸盐饱和溶液盐析2h，析出沉淀进行离心分离得到蛋白质沉淀。将蛋白质沉淀转移至放有0.2μm孔径的微孔滤膜的砂芯抽滤漏斗中，依次用75％乙醇和去离子水进行抽滤淋洗。将淋洗后的滤饼超声分散于去离子水中，移入截留分子量为3500Da的透析袋中，透析袋内溶液用体积分数30％的聚乙二醇20000的水溶液进行浓缩。将浓缩液置入冷冻干燥机，在-30℃下进行预冻，冷冻状态下真空干燥10h，得到干燥丝素。
4.2.2以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为5％，改良剂的质量浓度为0.3％。
所述改良剂为羧甲基壳聚糖。
4.3制膜
4.3.1预反应：将4.2.2制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。
4.3.2微波处理：将预反应液微波处理，微波处理条件为700W，20s。
4.3.3延流法制备薄膜：将微波处理后的预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
本实施例制备的拉伸断裂伸长率为60.0％，断裂强度为36.5MPa，力学拉伸曲线图参见图5。
实施例5
一种再生丝素蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
5.1脱胶
5.1.1用碱溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的。
5.1.2将沉淀继续用5.1.1的碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，收集溶液，检测是否脱胶完全。
5.1.3重复步骤5.1.2，直至桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液。其中，用苦味酸胭脂红溶液检测是否脱胶完全。
5.2处理
5.2.1将5.1.3的丝素蛋白溶液用砂芯漏斗过滤，滤液用乙酸溶液调整pH值至4后用硫酸盐饱和溶液盐析2h，析出沉淀进行离心分离得到蛋白质沉淀。将蛋白质沉淀转移至放有0.2μm孔径的微孔滤膜的砂芯抽滤漏斗中，依次用体积分数75％乙醇和去离子水进行抽滤淋洗。将淋洗后的滤饼超声分散于去离子水中，移入截留分子量为3500Da的透析袋中，透析袋内溶液用体积分数30％的聚乙二醇20000的水溶液进行浓缩。将浓缩液置入冷冻干燥机，在-30℃下进行预冻，冷冻状态下真空干燥10h，得到干燥丝素。
5.2.2以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.2％。
所述改良剂为羧甲基壳聚糖。
5.3制膜
5.3.1预反应：将5.2.2制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。
5.3.2微波处理：将预反应液微波处理，微波处理条件为700W，20s。
5.3.3延流法制备薄膜：将微波处理后的预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
本实施例制备的拉伸断裂伸长率为66.8％，断裂强度为32.4MPa，力学拉伸曲线图参见图6。
实施例6
一种再生丝素蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
6.1脱胶
6.1.1用碱溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的。
6.1.2将沉淀继续用6.1.1的碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，收集溶液，检测是否脱胶完全。
6.1.3重复步骤6.1.2，直至桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液。其中，用苦味酸胭脂红溶液检测是否脱胶完全。
6.2处理
6.2.1将6.1.3的丝素蛋白溶液用砂芯漏斗过滤，滤液用乙酸溶液调整pH值至4后用硫酸盐饱和溶液盐析2h，析出沉淀进行离心分离得到蛋白质沉淀。将蛋白质沉淀转移至放有0.2μm孔径的微孔滤膜的砂芯抽滤漏斗中，依次用体积分数75％乙醇和去离子水进行抽滤淋洗。将淋洗后的滤饼超声分散于去离子水中，移入截留分子量为3500Da的透析袋中，透析袋内溶液用体积分数30％的聚乙二醇20000的水溶液进行浓缩。将浓缩液置入冷冻干燥机，在-30℃下进行预冻，冷冻状态下真空干燥10h，得到干燥丝素。
6.2.2以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.4％。
所述改良剂为羧甲基壳聚糖。
6.3制膜
6.3.1预反应：将6.2.2制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。
6.3.2微波处理：将预反应液微波处理，微波处理条件为700W，20s。
6.3.3延流法制备薄膜：将微波处理后的预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
本实施例制备的拉伸断裂伸长率为61.5％，断裂强度为38.9MPa，力学拉伸曲线图参见图7。
实施例7
一种再生丝素蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
7.1脱胶
7.1.1用碱溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的。
7.1.2将沉淀继续用7.1.1的碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，收集溶液，检测是否脱胶完全。
7.1.3重复步骤7.1.2，直至桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液。其中，用苦味酸胭脂红溶液检测是否脱胶完全。
7.2处理
7.2.1将7.1.3的丝素蛋白溶液用砂芯漏斗过滤，滤液用乙酸溶液调整pH值至4后用硫酸盐饱和溶液盐析2h，析出沉淀进行离心分离得到蛋白质沉淀。将蛋白质沉淀转移至放有0.2μm孔径的微孔滤膜的砂芯抽滤漏斗中，依次用体积分数75％乙醇和去离子水进行抽滤淋洗。将淋洗后的滤饼超声分散于去离子水中，移入截留分子量为3500Da的透析袋中，透析袋内溶液用体积分数30％的聚乙二醇20000的水溶液进行浓缩。将浓缩液置入冷冻干燥机，在-30℃下进行预冻，冷冻状态下真空干燥10h，得到干燥丝素。
7.2.2以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数9％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.3％。
所述改良剂为羧甲基壳聚糖。
7.3制膜
7.3.1预反应：将7.2.2制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。
7.3.2微波处理：将预反应液微波处理，微波处理条件为700W，20s。
7.3.3延流法制备薄膜：将微波处理后的预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
本实施例制备的拉伸断裂伸长率为61.3％，断裂强度为37.5MPa，力学拉伸曲线图参见图8。
实施例8
一种再生丝素蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
8.1脱胶
8.1.1用碱溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的。
8.1.2将沉淀继续用8.1.1的碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，收集溶液，检测是否脱胶完全。
8.1.3重复步骤8.1.2，直至桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液。其中，用苦味酸胭脂红溶液检测是否脱胶完全。
8.2处理
8.2.1将8.1.3的丝素蛋白溶液用砂芯漏斗过滤，滤液用乙酸溶液调整pH值至4后用硫酸盐饱和溶液盐析2h，析出沉淀进行离心分离得到蛋白质沉淀。将蛋白质沉淀转移至放有0.2μm孔径的微孔滤膜的砂芯抽滤漏斗中，依次用75％乙醇和去离子水进行抽滤淋洗。将淋洗后的滤饼超声分散于去离子水中，移入截留分子量为3500Da的透析袋中，透析袋内溶液用体积分数30％的聚乙二醇20000的水溶液进行浓缩。将浓缩液置入冷冻干燥机，在-30℃下进行预冻，冷冻状态下真空干燥10h，得到干燥丝素。
8.2.2以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数10％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.3％。
所述改良剂为羧甲基壳聚糖。
8.3制膜
8.3.1预反应：将8.2.2制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。
8.3.2微波处理：将预反应液微波处理，微波处理条件为700W，20s。
8.3.3延流法制备薄膜：将微波处理后的预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
本实施例制备的拉伸断裂伸长率为60.1％，断裂强度为39.0MPa，力学拉伸曲线图参见图9。
3、本发明的重点创新点的说明
(1)创新点1：本发明采用改进的碱溶液配方，提高脱胶效率，缩短脱胶时间。不同方法设计如下：
试验1-1：用碱溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的。将沉淀继续用所述碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，检测是否脱胶完全。重复步骤“用所述碱溶液水溶液煮沸桑蚕丝30min，检测是否脱胶完全”直至桑蚕丝脱胶完全。
试验1-2：用0.05％的碳酸钠水溶液煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。将沉淀继续用0.05％的碳酸钠水溶液煮沸桑蚕丝30min，检测是否脱胶完全。重复步骤“用0.05％的碳酸钠水溶液煮沸桑蚕丝30min，检测是否脱胶完全”直至桑蚕丝脱胶完全。
试验1-3：用自来水煮沸桑蚕丝30min，过滤，收集沉淀。将沉淀继续用自来水煮沸桑蚕丝30min，检测是否脱胶完全。重复步骤“自来水煮沸桑蚕丝30min，检测是否脱胶完全”直至桑蚕丝脱胶完全。
本试验中，用苦味酸胭脂红溶液检测是否脱胶完全。不同方法的脱胶时间的对比结果参见表1。其中，现有技术的质量分数0.05％的碳酸钠水溶液和自来水处理作为对照组。
表1不同方法的脱胶时间的对比结果
| 试验方法 | 脱胶时间(min) | 效率提高率(％) |
| 试验1-1 | 120min | 50％ |
| 试验1-2 | 180min | 25％ |
| 试验1-3 | 240min | - |
注：表1中，效率提高率是以试验1-3的时间为对照计算的，故“-”的含义是不计算试验1-3的效率提高率。
表1的结果显示，使用碳酸钠水溶液与L-谷氨酸钠水溶液的混合液煮沸桑蚕丝脱胶时间最短。所以我们还探究了不同0.05％碳酸钠水溶液与0.03％L-谷氨酸钠水溶液的脱胶时间，以期获得最佳的比例。结果参见表2。表2结果显示，随着碳酸钠用量的逐渐减少，脱胶时间呈现先降低后增高的趋势，其中，当碳酸钠水溶液与L-谷氨酸钠水溶液为10-30:1的范围内时，脱胶时间较短，利于节约时间成本。
表2不同碳酸钠水溶液与L-谷氨酸钠水溶液的脱胶时间
| 比例 | 脱胶时间(min) |
| 40:1 | 240min |
| 30:1 | 150min |
| 20:1 | 120min |
| 10:1 | 150min |
| 5:1 | 240min |
(2)创新点2：本发明在制备混合溶液的时候加入了改良剂，所述改良剂为羧甲基壳聚糖或者甘油，改良剂的加入可提高丝素蛋白膜的力学性能。实验设置如下。
试验2-1：采用实施例1的方法制备脱胶完全的干燥丝素。以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素水溶液；丝素水溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.3％，所述改良剂为羧甲基壳聚糖。将制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。将预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
试验2-2：采用实施例1的方法制备脱胶完全的干燥丝素。以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素水溶液；丝素水溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.3％，所述改良剂为甘油。将制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。将预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
试验2-3：采用实施例1的方法制备脱胶完全的干燥丝素。以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素水溶液；丝素水溶液中加入京尼平，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％。将制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。将预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
不同改良剂制备的再生丝素蛋白膜的力学性能对比结果参见表3。其中，不加改良剂的方法(试验2-3)作为对照组。表3的结果显示，试验2-2的膜力学性能好，说明甘油和羧甲基壳聚糖能提高膜的力学性能。
表3不同改良剂制备的再生丝素蛋白膜的力学性能
以羧甲基壳聚糖为例，我们还探究了混合液中不同浓度改良剂制备的再生丝素蛋白膜的力学性能，结果参见表4。结果显示，0.2-0.4％浓度下的再生丝素蛋白膜的力学性能较佳。
表4不同改良剂制备的再生丝素蛋白膜的力学性能
(3)创新点3：本发明微波处理，增加交联效果，提高膜的力学性能。
不同方法设计如下：
试验3-1：采用实施例1的方法制备脱胶完全的干燥丝素。以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素水溶液；丝素水溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.3％，所述改良剂为羧甲基壳聚糖。将制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。将预反应液微波处理，微波处理条件为700W，20s。将微波处理后的预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
试验3-2：采用实施例1的方法制备脱胶完全的干燥丝素。以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素水溶液；丝素水溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.3％，所述改良剂为羧甲基壳聚糖。将制得的混合溶液置于40℃搅拌10h，得到预反应液。预反应操作步骤中，将混合溶液置于磁力搅拌器上加热搅拌，以满足交联需求。将预反应液置于聚乙烯板上，用玻璃棒将溶液均匀摊开，室温风干，得到再生丝素蛋白膜，再生丝素蛋白膜厚度为60μm。
不同处理方法的再生丝素蛋白膜的力学性能对比结果参见表5。结果显示，微波处理有助于增强膜的力学性能。
表5不同处理方法制备的再生丝素蛋白膜的力学性能
我们还探究了不同微波功率处理制备的再生丝素蛋白膜的力学性能，结果参见表6。结果显示，600-800W的微波功率下，膜的力学性能较佳。
表6不同微波功率处理制备的再生丝素蛋白膜的力学性能
4.应用
4.1测试细胞：SD大鼠骨髓间充质干细胞
4.2细胞接种
将再生丝素蛋白膜切成小圆片，直径8mm，进行紫外辐照20min灭菌。将再生丝素蛋白膜在大鼠间充质干细胞生长的培养基(该培养基采用SD大鼠骨髓间充质干细胞完全培养基，赛业(苏州)生物科技有限公司)中浸泡4小时，随后转入6孔板中，用移液枪吸除与接种细胞悬液等量的培养基，以确保再生丝素蛋白膜可以充分吸收细胞悬液，接种量1×105cell/孔。随后将接种细胞后的再生丝素蛋白膜放入培养箱中，孵育3小时后加入5m1 SD大鼠骨髓间充质干细胞完全培养基进行培养。
材料的细胞相容性通过研究细胞在再生丝素蛋白膜的细增殖和生长情况进行评估。在再生丝素蛋白膜上培养骨髓间充质干细胞，并于1、6天观察膜上细胞的生长情况。结果显示细胞接种1天后细胞在再生丝素蛋白膜上分布均匀，培养至6天后细胞密度增多。通过上述细胞粘附和增殖实验可知，本发明制备的再生丝素蛋白膜更有利于细胞的渗透、生长和增殖。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.再生丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，包括：
蚕丝脱胶、干燥，得到干燥丝素；
以PEG300-PEG600为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8-10％的丝素水溶液；丝素水溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2-5％，改良剂的质量浓度为0.2-0.4％；
其中，改良剂为羧甲基壳聚糖或者甘油；
混合溶液置于40-45℃搅拌10-20h，得到预反应液；
预反应液先微波处理，然后制备再生丝素蛋白膜；
微波处理条件为600-800W，20s。
2.根据权利要求1所述的再生丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，以PEG400为溶剂，将干燥丝素配置成质量分数8％的丝素溶液；丝素溶液中加入京尼平和改良剂，得到混合溶液，混合溶液中京尼平的质量浓度为2％，改良剂的质量浓度为0.3％。
3.根据权利要求2所述的再生丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，预反应液采用延流法制备再生丝素蛋白膜。
4.根据权利要求1所述的再生丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，所述脱胶的方法包括：
(1)用碱溶液煮沸蚕丝30min，过滤，收集沉淀；其中，所述碱溶液为质量分数0.05％的碳酸钠水溶液与质量分数0.03％的L-谷氨酸钠水溶液按照20:1体积比例混合而成的；
(2)将沉淀继续用所述碱溶液水溶液煮沸，直至桑蚕丝脱胶完全，脱胶完全的物料称作丝素蛋白溶液。
5.根据权利要求1-4任一种方法制备的再生丝素蛋白膜。
6.根据权利要求5所述的再生丝素蛋白膜，其特征在于，再生丝素蛋白膜厚度为60-80μm。
7.根据权利要求6所述的再生丝素蛋白膜的应用，其特征在于，再生丝素蛋白膜用于促进细胞的渗透、生长和增殖。
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| 丝素/羧甲基壳聚糖共混膜的结构性能探讨;徐倩等;《合成纤维工业》;20080210;第31卷(第1期);37-38 * |
| 徐倩等.丝素/羧甲基壳聚糖共混膜的结构性能探讨.《合成纤维工业》.2008,第31卷(第1期),37-38. * |
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