CN103341209B - 一种丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法。具体的制备方法为，以天然蚕丝为主要原料，经酸性盐溶液溶解、成膜、除盐后，再以甲酸或六氟异丙醇溶解配置成纺丝液，经静电纺丝制备成丝素蛋白基纳米纤维膜。该膜由直径在10nm～10μm的纤维组成，其具有优异的机械性能，干态断裂强度在8MPa、断裂伸长率在15%以上，湿态断裂强度在1MPa、断裂伸长率在100%以上；另外，本发明制备的膜结构稳定可控、生物相容性良好，可用作医用生物材料。本发明公开的制备方法简单、流程短、成膜与纺丝效率高，适合于工业化大规模生产。

Description

一种丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种纳米纤维膜及其制备方法，具体涉及一种丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法，该方法简单高效，可广泛应用于生物、医学领域。

背景技术

我国是蚕丝的主要生产国，蚕丝产量占世界产量的70%以上。近年来，蚕丝的研究与应用从传统的纺织领域延伸到高新技术领域，如光电子与生物医用材料，特别是作为生物医用材料已经取得了重要进展。丝素蛋白是由蚕茧缫丝脱胶得到，是一种无生理活性的天然结构性蛋白，主要由三种简单的氨基酸--甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，它们占蛋白总量的85％左右。脱胶后的蚕丝具有良好的生物相容性与力学性质，已被作为医用缝合线广泛应用于临床。

天然蚕丝为纤维状，而生物医用材料要求支架形状具有多样性与可塑性，因此，对天然丝素纤维的再生加工是拓宽其应用范围的必要步骤。目前蚕丝蛋白可以被加工成绳索、再生长丝、纳米纤维膜、丝素膜、多孔膜、水凝胶等，其中，纳米纤维膜因具有仿细胞外基质的纳米纤维结构而受到了广泛关注与研究。

与其他形状相比，纳米纤维膜更有利于细胞的黏附、增殖与细胞外基质的合成，并且通过纳米纤维直径和走向的变化可以调控细胞增殖、分化、迁移等细胞生物学行为，因此显示出更优异的生物学特性；然而，再生制备的丝素蛋白纳米纤维膜的力学性质较差，特别表现在处理后的脆性大，强度低，因此难以满足应用的要求。

现有技术中，研究人员都是通过共混、接枝、交联等方法来提高和改善丝素蛋白纳米纤维膜的力学性能，然而不可避免的是，这些方法或者对材料力学性能的提高有限，或者会显著降低丝素蛋白支架的生物相容性，并提高材料的炎症反应，难以获得满意效果。因此，提高丝素蛋白材料的力学性能的同时不降低材料的生物相容性对丝素蛋白材料作为医用材料的临床应用具有重要意义。

另一方面，在天然蚕丝内部，蚕吐丝前的丝腺内都有直径为几十纳米的线结构，该纳米结构在蚕丝的形成及蚕丝优异的力学性质中发挥关键作用；然而现有技术中，在天然蚕丝再生过程中，溶解步骤严重破坏了该纳米结构，这成为再生制备的丝素蛋白纳米纤维膜力学性质差的主要原因之一。

因此，寻找一种新的制备丝素蛋白纳米纤维的方法，从而在溶解蚕丝的过程中不破坏天然蚕丝内部的纳米结构很有必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种无毒性、生物相容性好、具有优良机械性能，适用于组织工程支架的丝素蛋白纳米纤维膜及其制备方法。

本发明采用如下技术方案实现本发明的目的：一种制备丝素蛋白纳米纤维膜的方法，包括以下步骤：

（1）将酸与水按比例混合，然后加入盐制得蚕丝溶解液；

（2）将桑蚕丝脱胶干燥后置于步骤（1）的蚕丝溶解液中，于10～100℃下搅拌0.5～6h后获得桑蚕丝素蛋白溶液，将其倒入聚乙烯皿中真空干燥成膜；

（3）将步骤（2）制得的膜置于流动的水中浸泡1～72h，真空干燥后获得再生丝素蛋白膜；

（4）利用甲酸或六氟异丙醇溶解步骤（3）中的再生丝素蛋白膜，配制成纺丝液，采用静电纺丝纺制纳米纤维膜；

（5）采用醇溶液浸泡步骤（4）纺制的纳米纤维膜获得所述丝素蛋白纳米纤维膜。

上述技术方案中，所述步骤（1）中的酸为甲酸、磷酸或甲酸与磷酸的共混物，优选为质量比为1∶0.25～4的甲酸与磷酸的共混物；所述盐为溴化锂、氯化钙、氯化锌、氯化镁、硫氰酸锂、硫氰酸钠、硫氰酸镁、硝酸钙、硝酸铜中的一种或几种。

上述技术方案中，所述步骤（1）的蚕丝溶解液中酸浓度为10～100wt%；盐浓度为0.1～50wt%。

上述技术方案中，所述步骤（2）与步骤（3）中，真空干燥的温度为20～100℃，时间为1～24h。

上述技术方案中，所述步骤（4）中静电纺丝参数为：纺丝电压5～50kv，纺丝距离1～30cm，纺丝浓度1～20wt%，纺丝速度0.1～5ml/h。

优选的技术方案中，将桑蚕丝素蛋白纺丝液与其他高分材料溶液共混得到复合纺丝液，再采用静电纺丝纺制纳米纤维膜；其中其他高分材料为柞蚕丝素蛋白、蓖麻蚕丝素蛋白、胶原、明胶、壳聚糖、聚乳酸、透明质酸、羟基磷灰石、碳酸钙、聚乙烯醇、纤维素、聚己内酯或者聚羟基乙酸。

进一步优选的方案中，上述复合纺丝液中其他高分材料与桑蚕丝素蛋白的质量比为0～1∶1；即纺丝液的溶质中桑蚕丝素蛋白的质量分数为50～100%。

上述技术方案中，所述步骤（5）中的醇为甲醇、乙醇或异丙醇；所述醇溶液浓度为1～100wt%；经过醇处理后丝素蛋白纳米纤维膜为β-折叠结晶结构，从而保证该膜在水中的稳定性。

本发明采用滚筒收集装置制备平行取向丝素蛋白纳米纤维膜；所述滚筒直径0.1cm～50cm，滚筒旋转速度0～10000rpm，移动速度0～1m/s。

本发明还公开了根据上述制备方法制备得到的丝素蛋白纳米纤维膜，其结构稳定可控、生物相容性良好，可用作人工皮肤材料、硬脑膜、补片、食道、心脏瓣膜、血管、韧带、肌腱、神经导管、眼角膜等医用生物材料。

上述丝素蛋白纳米纤维膜由直径在10nm～10μm之间的纤维组成，纤维间孔隙为1～500μm，所述纳米纤维膜的厚度为50nm～5mm。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

（1）本发明利用酸和盐的水溶液溶解脱胶蚕丝而制备再生丝素蛋白膜，保护了天然蚕丝内部的纳米结构，与现有技术相比，由此获得的丝素蛋白纳米纤维膜具有优异的机械性能，其干态断裂强度在8MPa、断裂伸长率在15%以上，湿态断裂强度在1MPa、断裂伸长率在100%以上；同时纳米纤维膜保持着优异的生物相容性以及降解性能；

（2）本发明公开的加工方法简单高效，蚕丝的溶解快，并无需透析，静电纺丝速度达到1ml/h以上，远大于现有技术中的0.2ml/h。

附图说明

图1为实施例一中制备的丝素蛋白纳米纤维膜的扫描电镜图；

图2为实施例一中制备的丝素蛋白纳米纤维膜的红外谱图；

图3为实施例一中制备的丝素蛋白纳米纤维膜干态下的拉伸曲线图；

图4为实施例一中制备的丝素蛋白纳米纤维膜湿态下的拉伸曲线图；

图5为实施例五中制备的丝素蛋白/聚乳酸共混纳米纤维膜的X-射线衍射谱图；

图6为对比例一中制备的丝素蛋白纳米纤维膜干态下的力学拉伸曲线图；

图7为对比例一中制备的丝素蛋白纳米纤维膜湿态下的力学拉伸曲线图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例、对比例对本发明作进一步描述：

实施例一

（1）天然桑蚕丝用0.5wt%的碳酸钠溶液煮沸30min，脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝；

（2）将脱胶桑蚕丝以20wt%的浓度置于含溴化锂5wt%的95wt%甲酸中，常温下搅拌溶解2h，然后倒入聚乙烯板中干燥成膜；

（3）将步骤（2）中的膜置于流动水中浸泡3h去除溴化锂，然后置于真空干燥箱中40℃干燥24h；

（4）将步骤（3）中的膜溶于80wt%的甲酸中配制成5wt%和8wt%纺丝液，然后进行静电纺丝获得纳米纤维膜；

（5）步骤（4）所获得的纳米纤维膜放置48小时，或者直接经乙醇溶液浸泡30分钟后获得丝素蛋白纳米纤维膜。

附图1为上述丝素蛋白纳米纤维膜的扫描电镜图，由其可以看出5wt%和8wt%纺丝液获得的纤维平均直径分别约为120nm和470nm；附图2为上述丝素蛋白纳米纤维膜的红外谱图，由其可以看出初生丝素蛋白纳米纤维主要为无定形结构，放置与乙醇后处理均引起丝素蛋白从无定形向β-折叠结构的转变；附图3、4为上述丝素蛋白纳米纤维膜的拉伸曲线图，其中附图3为干态、4为湿态，从中看出该纳米纤维膜的断裂强度和断裂伸长率如下：干态为9.4MPa，13.8%；湿态为1.6 MPa，139.2%。

实施例二： 

（1）天然桑蚕丝用0.5wt%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝；

（2）将脱胶桑蚕丝以10wt%的浓度置于含硫氰酸锂5wt%的50wt%混合酸（磷酸：甲酸=1:4，质量比）中，60℃搅拌溶解1h，然后倒入聚乙烯板中干燥成膜；

（3）将步骤（2）中的膜置于流动水中浸泡3h去除盐和残留的酸，然后置于真空干燥箱中60℃干燥20h；

（4）将步骤（3）中的膜溶于六氟异丙醇中配制10wt%溶液，同时将壳聚糖溶解于六氟异丙醇配制10wt%溶液，然后将两种溶液按1:1体积共混配制浓度为10wt%，丝素与壳聚糖1:1（质量比）的共混纺丝液；

（5）采用静电纺丝方法加工步骤（4）中的共混纺丝液，制备出丝素与壳聚糖1:1的共混纳米纤维膜；

（6）将步骤（5）所获得的纤维膜置于75wt%乙醇溶液中处理30分钟，获得丝素蛋白纳米纤维膜，其丝素蛋白从无定形转变为β-折叠结构。

实施例三： 

（1）天然桑蚕丝用0.5wt%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝；

（2）将脱胶桑蚕丝以10wt%的浓度置于含氯化锌10wt%的80wt%甲酸中，常温下搅拌溶解2h，然后倒入聚乙烯板中干燥成膜；

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白膜置于流动水中浸泡3h去除氯化锌和残留的酸，然后置于真空干燥箱中80℃干燥15h；

（4）将步骤（3）中的膜溶于80wt%的甲酸中配制成8wt%纺丝液，然后进行静电纺丝获得丝素蛋白纳米纤维膜；

（5）将步骤（4）所获得的丝素蛋白纳米纤维膜置于80wt%甲醇中处理30分钟，实现丝素蛋白结构从无定形向β-折叠转变。

实施例四： 

（1）天然桑蚕丝用0.5wt%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝；

（2）将脱胶桑蚕丝以15wt%的浓度置于含氯化钙5wt%的30wt%磷酸中，常温下搅拌溶解2h，然后倒入聚乙烯板中干燥成膜；

（3）将步骤（2）中的膜置于流动水中浸泡2h去除氯化钙和磷酸，然后置于真空干燥箱中60℃干燥18h；

（4）将步骤（3）中的膜溶于80wt%的甲酸中配制7wt%纺丝液，然后进行静电纺丝获得纳米纤维膜；

（5）将步骤（4）获得的纤维膜置于75%浓度乙醇中处理30min获得以β-折叠结构为主的丝素蛋白纳米纤维膜。

实施例五： 

（1）天然桑蚕丝用0.5wt%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝；

（2）将脱胶桑蚕丝以10wt%的浓度置于含硫氰酸锂5wt%的50wt%混合酸（磷酸：甲酸=1:4质量比）中，60℃搅拌溶解1h，然后倒入聚乙烯板中干燥成膜；

（3）将步骤（2）中的丝素蛋白膜置于流动水中浸泡3h去除盐和残留的酸，然后置于真空干燥箱中50℃干燥20h；

（4）将步骤（3）中的膜溶于六氟异丙醇中配制10wt%溶液，同时将聚乳酸（PLA）溶解于六氟异丙醇中配制10wt%溶液，然后将两种溶液按1:1体积共混配制浓度为10wt%，丝素与聚乳酸1:1的共混纺丝液；

（5）采用静电纺丝方法加工步骤（4）中的共混纺丝液，制备出丝素与聚乳酸（质量比1:1）的共混纳米纤维膜；

（6）将步骤（5）所获得的纤维膜置于75wt%乙醇溶液中浸泡处理30分钟，获得丝素蛋白纳米纤维膜，其丝素蛋白从无定形转变为β-折叠结构。

附图5为上述丝素蛋白/聚乳酸共混纳米纤维膜的X-射线衍射谱图，从图中可以看出共混纤维谱图中包含丝素蛋白和聚乳酸两种成分的衍射峰，说明丝素蛋白与聚乳酸在共混纤维中是相分离的。

对比例一： 

（1） 天然桑蚕丝用0.5wt%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得脱胶桑蚕丝；

（2）将步骤（1）制得的脱胶蚕丝溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，溶解温度60℃，溶解时间6h；

（3）将步骤（2）获得的丝素蛋白溶液注入透析袋中置于流动去离子水中透析3d；

（4）将步骤（3）获得的纯丝素蛋白溶液倒入聚乙烯板中干燥成膜；

（5）将步骤（4）获得的丝素蛋白膜溶解于98%甲酸中获得15wt%纺丝液，经静电纺丝获得丝素蛋白纳米纤维膜；

（6）将步骤（5）获得的丝素蛋白纳米纤维膜浸入纯乙醇溶液中30分钟后获得以β-折叠结构为主的丝素蛋白纳米纤维膜。

附图6、7为上述丝素蛋白纳米纤维膜的力学拉伸曲线，从图中可以看出该纳米纤维膜的断裂强度和断裂伸长率如下：干态为4.1 MPa，3.2%；湿态为0.9 MPa，38%，其机械性能远差于本发明方法制备的丝素蛋白纳米纤维膜。

Claims (8)

1.一种制备丝素蛋白纳米纤维膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）混合酸与水，然后加入盐制得蚕丝溶解液；所述蚕丝溶解液中酸浓度为95wt%；盐浓度为5wt%；

（2）将桑蚕丝脱胶干燥后置于步骤（1）的蚕丝溶解液中，于10～100℃下搅拌0.5～6h后获得桑蚕丝素蛋白溶液，将其倒入聚乙烯皿中真空干燥成膜；

（3）将步骤（2）制得的膜置于流动的水中浸泡1～72h，真空干燥后获得再生丝素蛋白膜；

（4）利用甲酸或六氟异丙醇溶解步骤（3）中的再生丝素蛋白膜，配制成纺丝液，采用静电纺丝纺制纳米纤维膜；

（5）采用醇溶液浸泡步骤（4）纺制的纳米纤维膜获得所述丝素蛋白纳米纤维膜。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的酸为甲酸、磷酸或甲酸与磷酸的共混物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的盐为溴化锂、氯化钙、氯化锌、氯化镁、硫氰酸锂、硫氰酸钠、硫氰酸镁、硝酸钙、硝酸铜中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中静电纺丝参数为：纺丝电压5～50kv，纺丝距离1～30cm，纺丝浓度1～20wt%，纺丝速度0.1～5ml/h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中的纺丝液还包括柞蚕丝素蛋白、蓖麻蚕丝素蛋白、胶原、明胶、壳聚糖、聚乳酸、透明质酸、羟基磷灰石、碳酸钙、聚乙烯醇、纤维素、聚己内酯或者聚羟基乙酸。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中的醇为甲醇、乙醇或异丙醇；所述醇溶液浓度为1～100wt%。

7.根据权利要求1～6所述的任意一种制备方法制备得到的丝素蛋白纳米纤维膜。

8.根据权利要求7所述的纳米纤维膜，其特征在于：所述纳米纤维膜的厚度为50nm～5mm。