CN117487869A - 一种酶法生产α-环糊精的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法生产α‑环糊精的方法，该方法是将通过BW/pBAD‑CGTase N16菌株和BW/pBAD–TfIA菌株分别发酵得到含α‑CGT酶和异淀粉酶的菌体制成的复合酶菌制剂；以预糊化淀粉为原料，通过得到的含α‑CGT酶和异淀粉酶的菌体制成的复合酶菌产品进行酶转化，使得30%预糊化淀粉的体系转化率可达70%‑75%；最后加入糖化酶酶解得α‑环糊精络合物湿固体；所得湿固体依次通过蒸馏、脱色等方法处理得到α‑环糊精白色粉末状成品。本申请提供的方法采用双酶法生产α‑环糊精，工艺流程简单，提升了转化底物的投料浓度，同时转化率也得到了很大提高，提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明属于酶催化合成技术领域，具体而言，涉及一种酶法生产α-环糊精的方法。
背景技术
α-环糊精在食品工业中，通过包合作用，稳定食品中的活性成分、去除食品中的某些异味、使某些食品形成稳定乳状液、增大食品的起泡力、将液体食品变为固体粉末、作为食品生产辅料等。同时，α-环糊精是一种良好的膳食纤维，具有减肥、降低胆固醇等功效。其水溶性不仅较高且不能在小肠内被消化吸收，并能明显促进大肠内乳酸菌和双歧杆菌生长，已成为食品中首选添加的膳食纤维之一。
在医药工业中，α-环糊精包合物是近年来发展起来的一种新型药物载体，是利用α-环糊精分子将药物分子全部或部分包裹于其中形成的一类非键类复合物。药物作为客体分子经包合后，溶解度增大、稳定性提高、生物利用度显著增加，同时刺激性、毒性、副作用降低。α-环糊精本身具有较高的水溶性，发生包合后可显著提高药物的溶解度，同时，α-环糊精体内代谢作用很慢，对所包合药物分子的缓释效果最好，因此，α-环糊精在医药领域越来越受到青睐。
除了食品、医药领域外，α-环糊精还可通过范德华力、疏水相互作用等与许多有机或无机分子形成包合物，从而成为超分子化学研究的重要对象之一，在分子组装、生物酶模拟和轮烷构造等方面受到众多研究者的青睐。Nakashima等曾利用α-环糊精与反式偶氮片段之间的氢键作用及主客体分子之间的憎水相互作用合成了一个具有光活性的分子开关；α-环糊精还可以与亲水性的聚乙二醇(PEG)分子之间通过包合作用形成管道式的超结构，在诸如化学工程和纳米材料等领域均具有广泛的应用潜力。α-环糊精还在环境治理、生物技术和日用化工等多个领域得到了应用与研究。α-环糊精在食品、医药等领域具有广阔的应用前景。
目前α-环糊精的生产制备主要通过合成工艺和生物工艺，但生产中淀粉浓度在5％-10％，转化率在60％-70％，整体产量偏低，耗能高，成本高等问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种酶法生产α-环糊精的方法。采用本发明中的酶法进行转化生产α-环糊精，α-CGT酶菌体、异淀粉酶菌体两种酶的作用下，提高了底物淀粉的浓度，提升了生成α-环糊精的转化率，有效的提高单批产品产量及降低生产成本。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明的一个方面提供了一种酶法生产α-环糊精的方法，所述方法包括以下步骤：
S1：将BW/pBAD-CGTase N16菌株和BW/pBAD–TfIA菌株保藏的菌种甘油管分别接种至摇瓶培养基中，控温37℃，转速220r/min培养4-5h至菌体OD600为2-2.5合格；
S2：将上述培养合格的菌种接种至发酵罐培养基中，控温37℃，浓氨水调控pH6.9-7.1，溶氧关联搅拌控制30％-40％，当OD600值达35-40时，控温至30℃加入诱导剂L-阿拉伯糖诱导，待初始葡萄糖消耗完后开始连续流加补料葡萄糖，过程检测葡萄糖残留低于1g/L，培养周期约30-32h，菌体OD600检测值为100-120时停止发酵离心收集得到湿菌体分别为α-CGT酶菌体和异淀粉酶菌体，储存-20℃环境备用；
S3：将自来水、α-CGT酶菌体、异淀粉酶菌体、正癸醇依次加入转化罐，调控pH6.0-6.5后，再搅拌缓慢加入预糊化淀粉，使转化液中预糊化淀粉浓度达到30％的预糊化淀粉液，控温45-50℃进行搅拌至检测预糊化淀粉转化率达70％以上停止转化，进行75-80℃灭活20min后降温至30-35℃，再加入糖化酶分解残留淀粉2-3h后离心得粗品α-环糊精络合物；
S4：将粗品α-环糊精络合物加入解络罐，加自来水进行高温搅拌蒸馏，过程控制水量不低于粗品重量的5倍；当蒸馏至无沉淀且无正癸醇气味后加入活性炭脱色，得到无色澄清料液；
S5：将上述脱色后的无色澄清料液经减压蒸馏浓缩后得到浓缩液，将浓缩液依次经结晶、离心后，将所得固体粉末真空干燥得成品α-环糊精。
进一步地，步骤S1中所述摇瓶培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为自然pH，摇瓶分装100mL，消毒121℃，20min；接种时加入硫酸链霉素，终浓度为50ug/mL。
进一步地，步骤S2中所述发酵罐培养组成为：葡萄糖2％，柠檬酸0.17％，磷酸二氢钾1.4％，磷酸氢二铵0.4％，七水硫酸镁0.06％，微量无机盐10ml/L(微量无机盐溶液配制：840mg/L EDTA，250mg/L CoCl2.6H2O，1500mg/L MnCl2.4H2O，150mg/L CuCl2.2H2O，300mg/LH3BO3，250mg/L Na2MoO4.2H2O，1300mg/L Zn(CH3COO)2.2H2O，10g/L Fe(III)citrate(柠檬酸铁))，聚醚类消泡剂0.015％。
进一步地，步骤S2中所述诱导剂L-阿拉伯糖加入量2g/L，起始2.5L发酵液加入量5g；配制过程为：5g L-阿拉伯糖加入含50mL自来水的摇瓶中消毒，115℃±1，20min，降至室温备用。
进一步地，步骤S2中所述补料葡萄糖浓度为600g/L，补料速率为3-6g/L/h。
进一步地，步骤S3中按照每700mL自来水中加入α-CGT酶菌体6-8g、异淀粉酶菌体16-20g、正癸醇40g以及预糊化淀粉300g的比例加入；所述糖化酶加入量为300uL/L。
进一步地，步骤S4中所述脱色过程中活性炭的加入量为料液体积分数0.2％-0.4％；脱色条件为：温度60-70℃，时间1-2h。
进一步地，步骤S4中所述减压蒸馏条件为：压力-0.7Mpa，温度70℃。
进一步地，步骤S4中所述结晶温度为5-10℃。
进一步地，步骤S5中所述真空干燥的条件为：真空压力为-0.06～-0.09Mpa，温度50-60℃，干燥时间4-6h。
本发明预期效果与优点如下：
与其他生产工艺相比，本发明采用生物酶法进行转化生产α-环糊精，在α-CGT酶菌体、异淀粉酶菌体两种酶的作用下，提高了底物淀粉的浓度，提升了生成α-环糊精的转化率，有效的提高单批产品产量及降低生产成本。该方法是将通过BW/pBAD-CGTase N16菌株和BW/pBAD–TfIA菌株分别发酵得到含α-CGT酶和异淀粉酶的菌体制成的酶菌；在转化罐中依次加入水、正癸醇、酶菌调控pH，再缓慢加入预糊化淀粉，搅拌进行酶法转化，预糊化淀粉的转化率可达70％-75％；转化结束后灭活加入糖化酶搅拌后离心得α-环糊精络合物湿固体；湿固体加水高温解络，通过水蒸汽夹带出解络后的正癸醇，直至料液静止无沉淀无残留正癸醇，再加活性炭脱色后减压浓缩至粘稠状，然后采用低温结晶得到α-环糊精晶体，经离心后干燥得到α-环糊精白色粉末状成品。本申请提供的方法采用双酶法生产α-环糊精，工艺流程简单，提升了转化底物的投料浓度，同时转化率也得到了很大提高，提高了生产效率。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
(1)将甘油管1ml保藏的生产型菌种BW/pBAD-CGTase N16菌株和BW/pBAD–TfIA菌株的种子分别接种到500mL摇瓶100mL培养基中，摇瓶培养基配比为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为自然pH，摇瓶分装100mL，消毒121℃，20min；接种时加入硫酸链霉素，终浓度50ug/mL；控温37±1℃，转速200r/min摇床中培养4-6h，菌体检测OD600值2.2培养合格，待接种；
(2)将培养合格的摇瓶菌种无菌操作接种至灭菌配制的5L发酵罐培养基中，其中培养基配制总体积2.5L，培养基配比：葡萄糖2％，柠檬酸0.17％，磷酸二氢钾1.4％，磷酸氢二铵0.4％，七水硫酸镁0.06％，微量无机盐10ml/L(微量无机盐溶液配制：840mg/L EDTA，250mg/L CoCl2·6H2O，1500mg/L MnCl2·4H2O，150mg/L CuCl2·2H2O，300mg/L H3BO3，250mg/L Na2MoO4·2H2O，1300mg/L Zn(CH3COO)2·2H2O，10g/L Fe(III)citrate(柠檬酸铁))，聚醚类消泡剂0.015％，定容体积2L消毒，121℃±1下消毒20min，消毒结束后通无菌空气降温至37℃±1待用；其中50g葡萄糖补料定容500mL，单独灭菌115℃±1，20min，待降至室温后补加进5L发酵罐中待接种；接种后初始培养条件控温37℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，通气量3L/h，溶氧关联搅拌控制30％-40％，当OD600值达37时，控温至30℃加入L-阿拉伯糖诱导，过程控温30℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，溶氧关联搅拌控制30％-40％，初葡萄糖消耗完后开始连续流加补料葡萄糖，补糖速率3-6g/L/h，过程检测葡萄糖残留低于1g/L，培养周期约30h停止发酵离心收集菌体，BW/pBAD–CGTase发酵结束OD600为115，得湿菌体(α-CGT酶菌体)300g；BW/pBAD–TfIA发酵结束OD600为120，得湿菌体(异淀粉酶菌体)340g，分别收集菌体储存-20℃环境备用转化；
(3)将700ml自来水、6gα-CGT酶菌体、16g异淀粉酶菌体、40g正癸醇依次加入转化罐，浓氨水(磷酸)调控pH6.0后，再搅拌缓慢加入300g预糊化淀粉，使转化液中预糊化淀粉浓度达到30％的预糊化淀粉液，控温45℃进行搅拌6h，液相检测预糊化淀粉质量转化率达72％，生成α-环糊精216g，停止转化，再进行75℃灭活后降温至30℃，加入300ul糖化酶分解残留淀粉2h后离心得湿粗品α-环糊精络合物530g；
(4)将530g湿粗品α-环糊精络合物加入解络罐，加3180mL自来水进行高温搅拌蒸馏，过程补加控制水量不低于粗品重量得5倍；当蒸馏至静止基本无沉淀，同时基本无正癸醇气味后加入料液体积的0.2％活性炭60℃脱色1h，脱色得到无色澄清料液3200g；
(5)将上述3200g脱色后无色澄清料液经减压蒸馏浓缩后得到浓缩液，蒸馏压力-0.7Mpa，温度70℃，将浓缩液在缓慢搅拌的条件下降温结晶，最终降温结晶温度5℃，当充分结晶后，进行离心后，得到湿α-环糊精固体粉末310g，将固体粉末进行真空干燥，真空压力为-0.08Mpa，温度50℃，干燥时间6h得到白色粉末α-环糊精207g，液相HPLC检测纯度99.1％，产品收率：207/(300*72％)＝95.8％。
实施例2：
(1)将甘油管1ml保藏的生产型菌种BW/pBAD-CGTase N16菌株和BW/pBAD–TfIA菌株的种子分别接种到500mL摇瓶100mL培养基中，摇瓶培养基配比为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为自然pH，摇瓶分装100mL，消毒121℃，20min；接种时加入硫酸链霉素，终浓度50ug/mL；控温37±1℃，转速200r/min摇床中培养4-6h，菌体检测OD600值2.2培养合格，待接种；
(2)将培养合格的摇瓶菌种无菌操作接种至灭菌配制的5L发酵罐培养基中，其中培养基配制总体积2.5L，培养基配比：葡萄糖2％，柠檬酸0.17％，磷酸二氢钾1.4％，磷酸氢二铵0.4％，七水硫酸镁0.06％，微量无机盐10ml/L(微量无机盐溶液配制：840mg/L EDTA，250mg/L CoCl2·6H2O，1500mg/L MnCl2·4H2O，150mg/L CuCl2·2H2O，300mg/L H3BO3，250mg/L Na2MoO4·2H2O，1300mg/L Zn(CH3COO)2·2H2O，10g/L Fe(III)citrate(柠檬酸铁))，聚醚类消泡剂0.015％，定容体积2L消毒，121℃±1下消毒20min，消毒结束后通无菌空气降温至37℃±1待用；其中50g葡萄糖补料定容500mL，单独灭菌115℃±1，20min，待降至室温后补加进5L发酵罐中待接种；接种后初始培养条件控温37℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，通气量3L/h，溶氧关联搅拌控制30％-40％，当OD600值达37时，控温至30℃加入L-阿拉伯糖诱导，过程控温30℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，溶氧关联搅拌控制30％-40％，初葡萄糖消耗完后开始连续流加补料葡萄糖，补糖速率3-6g/L/h，过程检测葡萄糖残留低于1g/L，培养周期约30h停止发酵离心收集菌体，BW/pBAD–CGTase发酵结束OD600为115，得湿菌体(α-CGT酶菌体)300g；BW/pBAD–TfIA发酵结束OD600为120，得湿菌体(异淀粉酶菌体)340g，分别收集菌体储存-20℃环境备用转化；
(3)将700ml自来水、7gα-CGT酶菌体、18g异淀粉酶菌体、40g正癸醇依次加入转化罐，浓氨水(磷酸)调控pH6.2后，再搅拌缓慢加入300g预糊化淀粉，使转化液中预糊化淀粉浓度达到30％的预糊化淀粉液，控温47℃进行搅拌7h，液相检测预糊化淀粉质量转化率达74％，生成α-环糊精222g，停止转化，再进行78℃灭活后降温至32℃，加入300ul糖化酶分解残留淀粉3h后离心得湿粗品α-环糊精络合物547g；
(4)将547g湿粗品α-环糊精络合物加入解络罐，加3282ml自来水进行高温搅拌蒸馏，过程补加控制水量不低于粗品重量得5倍；当蒸馏至静止基本无沉淀，同时基本无正癸醇气味后加入料液体积的0.3％活性炭65℃脱色1h，脱色得到无色澄清料液3300g；
(5)将上述3300g脱色后无色澄清料液经减压蒸馏浓缩后得到浓缩液，蒸馏压力-0.8Mpa，温度70℃，将浓缩液在缓慢搅拌的条件下降温结晶，最终降温结晶温度7℃，当充分结晶后，进行离心后，得到湿α-环糊精固体粉末343g，将固体粉末进行真空干燥，真空压力为-0.08Mpa，温度55℃，干燥时间5h得到白色粉末α-环糊精212g，液相HPLC检测纯度99.4％，产品收率：212/(300*74％)＝95.4％
实施例3：
(1)将甘油管1ml保藏的生产型菌种BW/pBAD-CGTase N16菌株和BW/pBAD–TfIA菌株的种子分别接种到500mL摇瓶100mL培养基中，摇瓶培养基配比为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为自然pH，摇瓶分装100mL，消毒121℃，20min；接种时加入硫酸链霉素，终浓度50ug/mL；控温37±1℃，转速200r/min摇床中培养4-6h，菌体检测OD600值2.2培养合格，待接种；
(2)将培养合格的摇瓶菌种无菌操作接种至灭菌配制的5L发酵罐培养基中，其中培养基配制总体积2.5L，培养基配比：葡萄糖2％，柠檬酸0.17％，磷酸二氢钾1.4％，磷酸氢二铵0.4％，七水硫酸镁0.06％，微量无机盐10ml/L(微量无机盐溶液配制：840mg/L EDTA，250mg/L CoCl2·6H2O，1500mg/L MnCl2·4H2O，150mg/L CuCl2·2H2O，300mg/L H3BO3，250mg/L Na2MoO4·2H2O，1300mg/L Zn(CH3COO)2·2H2O，10g/L Fe(III)citrate(柠檬酸铁))，聚醚类消泡剂0.015％，定容体积2L消毒，121℃±1下消毒20min，消毒结束后通无菌空气降温至37℃±1待用；其中50g葡萄糖补料定容500mL，单独灭菌115℃±1，20min，待降至室温后补加进5L发酵罐中待接种；接种后初始培养条件控温37℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，通气量3L/h，溶氧关联搅拌控制30％-40％，当OD600值达37时，控温至30℃加入L-阿拉伯糖诱导，过程控温30℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，溶氧关联搅拌控制30％-40％，初葡萄糖消耗完后开始连续流加补料葡萄糖，补糖速率3-6g/L/h，过程检测葡萄糖残留低于1g/L，培养周期约30h停止发酵离心收集菌体，BW/pBAD–CGTase发酵结束OD600为115，得湿菌体(α-CGT酶菌体)300g；BW/pBAD–TfIA发酵结束OD600为120，得湿菌体(异淀粉酶菌体)340g，分别收集菌体储存-20℃环境备用转化；
(3)将700ml自来水、8g菌体、20g异淀粉酶菌体、40g正癸醇依次加入转化罐，浓氨水(磷酸)调控pH6.5后，再搅拌缓慢加入300g预糊化淀粉，使转化液中预糊化淀粉浓度达到30％的预糊化淀粉液，控温50℃进行搅拌8h，液相检测预糊化淀粉质量转化率达75％，生成α-环糊精225g，停止转化，再进行80℃灭活后降温至35℃，加入300ul糖化酶分解残留淀粉2h后离心得湿粗品α-环糊精络合物561g；
(4)将561g湿粗品α-环糊精络合物加入解络罐，加3366ml自来水进行高温搅拌蒸馏，过程补加控制水量不低于粗品重量得5倍；当蒸馏至静止基本无沉淀，同时基本无正癸醇气味后加入料液体积的0.4％活性炭70℃脱色2h，脱色得到无色澄清料液3350g；
(5)将上述3350g脱色后无色澄清料液经减压蒸馏浓缩后得到浓缩液，蒸馏压力-0.8Mpa，温度70℃，将浓缩液在缓慢搅拌的条件下降温结晶，最终降温结晶温度10℃，当充分结晶后，进行离心后，得到湿α-环糊精固体粉末353g，将固体粉末进行真空干燥，真空压力为-0.08Mpa，温度60℃，干燥时间4h得到白色粉末α-环糊精215g，液相HPLC检测纯度99.2％，产品收率：215/(300*75％)＝95.6％。
对比实施例1-3，采用单一α-CGT酶菌体转化，具体步骤如下：
对比实施例1：
一种用生物酶法生产α-环糊精的方法，包括以下步骤：
(1)将甘油管1ml保藏的生产型菌种BW/pBAD-CGTase N16菌株的种子接种到500mL摇瓶100mL培养基中，摇瓶培养基配比为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为自然pH，摇瓶分装100mL，消毒121℃，20min；接种时加入硫酸链霉素，终浓度50ug/mL；控温37±1℃，转速200r/min摇床中培养4-6h，菌体检测OD600值2.2培养合格，待接种；
(2)将培养合格的摇瓶菌种无菌操作接种至灭菌配制的5L发酵罐培养基中，其中培养基配制总体积2.5L，培养基配比：葡萄糖2％，柠檬酸0.17％，磷酸二氢钾1.4％，磷酸氢二铵0.4％，七水硫酸镁0.06％，微量无机盐10ml/L(微量无机盐溶液配制：840mg/L EDTA，250mg/L CoCl2·6H2O，1500mg/L MnCl2·4H2O，150mg/L CuCl2·2H2O，300mg/L H3BO3，250mg/L Na2MoO4·2H2O，1300mg/L Zn(CH3COO)2·2H2O，10g/L Fe(III)citrate(柠檬酸铁))，聚醚类消泡剂0.015％，定容体积2L消毒，121℃±1下消毒20min，消毒结束后通无菌空气降温至37℃±1待用；其中50g葡萄糖补料定容500mL，单独灭菌115℃±1，20min，待降至室温后补加进5L发酵罐中待接种；接种后初始培养条件控温37℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，通气量3L/h，溶氧关联搅拌控制30％-40％，当OD600值达37时，控温至30℃加入L-阿拉伯糖诱导，过程控温30℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，溶氧关联搅拌控制30％-40％，初葡萄糖消耗完后开始连续流加补料葡萄糖，补糖速率3-6g/L/h，过程检测葡萄糖残留低于1g/L，培养周期约30h停止发酵离心收集菌体，BW/pBAD–CGTase发酵结束OD600为115，得湿菌体(α-CGT酶菌体)300g，收集菌体储存-20℃环境备用转化；
(3)将700ml自来水、6gα-CGT酶菌体、40g正癸醇依次加入转化罐，浓氨水(磷酸)调控pH6.0后，再搅拌缓慢加入300g预糊化淀粉，使转化液中预糊化淀粉浓度达到30％的预糊化淀粉液，控温45℃进行搅拌6h，液相检测预糊化淀粉质量转化率达61％，生成α-环糊精183g，停止转化，再进行70℃灭活后降温至30℃，加入300ul糖化酶分解残留淀粉2h后离心的湿粗品α-环糊精络合物447g；
(4)将447g湿粗品α-环糊精络合物加入解络罐，加2682ml自来水进行高温搅拌蒸馏，过程补加控制水量不低于粗品重量得5倍；当蒸馏至静止基本无沉淀，同时基本无正癸醇气味后加入料液体积的0.2％活性炭60℃脱色1h，脱色得到无色澄清料液2700g；
(5)将上述2700g脱色后无色澄清料液经减压蒸馏浓缩后得到浓缩液，蒸馏压力-0.8Mpa，温度70℃，将浓缩液在缓慢搅拌的条件下降温结晶，最终降温结晶温度5℃，当充分结晶后，进行离心后，得到湿α-环糊精固体粉末242g，将固体粉末进行真空干燥，真空压力为-0.08Mpa，温度50℃，干燥时间6h得到白色粉末α-环糊精172g，液相HPLC检测纯度99.21％，产品收率：172/(300*61％)＝94％。
对比实施例2：
(1)将甘油管1ml保藏的生产型菌种BW/pBAD-CGTase N16菌株的种子接种到500mL摇瓶100mL培养基中，摇瓶培养基配比为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为自然pH，摇瓶分装100mL，消毒121℃，20min；接种时加入硫酸链霉素，终浓度50ug/mL；控温37±1℃，转速200r/min摇床中培养4-6h，菌体检测OD600值2.2培养合格，待接种；
(2)将培养合格的摇瓶菌种无菌操作接种至灭菌配制的5L发酵罐培养基中，其中培养基配制总体积2.5L，培养基配比：葡萄糖2％，柠檬酸0.17％，磷酸二氢钾1.4％，磷酸氢二铵0.4％，七水硫酸镁0.06％，微量无机盐10ml/L(微量无机盐溶液配制：840mg/L EDTA，250mg/L CoCl2·6H2O，1500mg/L MnCl2·4H2O，150mg/L CuCl2·2H2O，300mg/L H3BO3，250mg/L Na2MoO4·2H2O，1300mg/L Zn(CH3COO)2·2H2O，10g/L Fe(III)citrate(柠檬酸铁))，聚醚类消泡剂0.015％，定容体积2L消毒，121℃±1下消毒20min，消毒结束后通无菌空气降温至37℃±1待用；其中50g葡萄糖补料定容500mL，单独灭菌115℃±1，20min，待降至室温后补加进5L发酵罐中待接种；接种后初始培养条件控温37℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，通气量3L/h，溶氧关联搅拌控制30％-40％，当OD600值达37时，控温至30℃加入L-阿拉伯糖诱导，过程控温30℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，溶氧关联搅拌控制30％-40％，初葡萄糖消耗完后开始连续流加补料葡萄糖，补糖速率3-6g/L/h，过程检测葡萄糖残留低于1g/L，培养周期约30h停止发酵离心收集菌体，BW/pBAD–CGTase发酵结束OD600为115，得湿菌体(α-CGT酶菌体)300g，收集菌体储存-20℃环境备用转化；
(3)将700ml自来水、7gα-CGT酶菌体、40g正癸醇依次加入转化罐，浓氨水(磷酸)调控pH6.2后，再搅拌缓慢加入300g预糊化淀粉，使转化液中预糊化淀粉浓度达到30％的预糊化淀粉液，控温47℃进行搅拌7h，液相检测预糊化淀粉质量转化率达64％，生成α-环糊精192g，停止转化，再进行75℃灭活后降温至33℃，加入300ul糖化酶分解残留淀粉3h后离心得湿粗品α-环糊精络合物472g；
(4)将472g湿粗品α-环糊精络合物加入解络罐，加2832ml自来水进行高温搅拌蒸馏，过程补加控制水量不低于粗品重量得5倍；当蒸馏至静止基本无沉淀，同时基本无正癸醇气味后加入料液体积的0.3％活性炭65℃脱色1.5h，脱色得到无色澄清料液2800g；
(5)将上述2800g脱色后无色澄清料液经减压蒸馏浓缩后得到浓缩液，蒸馏压力-0.8Mpa，温度70℃，将浓缩液在缓慢搅拌的条件下降温结晶，最终降温结晶温度7℃，当充分结晶后，进行离心后，得到湿α-环糊精固体粉末267g，将固体粉末进行真空干燥，真空压力为-0.08Mpa，温度55℃，干燥时间5h得到白色粉末α-环糊精179g，液相HPLC检测纯度99.3％，产品收率：179/(300*64％)＝93.2％。
对比实施例3：
(1)将甘油管1ml保藏的生产型菌种BW/pBAD-CGTase N16菌株的种子接种到500mL摇瓶100mL培养基中，摇瓶培养基配比为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为自然pH，摇瓶分装100mL，消毒121℃，20min；接种时加入硫酸链霉素，终浓度50ug/mL；控温37±1℃，转速200r/min摇床中培养4-6h，菌体检测OD600值2.2培养合格，待接种；
(2)将培养合格的摇瓶菌种无菌操作接种至灭菌配制的5L发酵罐培养基中，其中培养基配制总体积2.5L，培养基配比：葡萄糖2％，柠檬酸0.17％，磷酸二氢钾1.4％，磷酸氢二铵0.4％，七水硫酸镁0.06％，微量无机盐10ml/L(微量无机盐溶液配制：840mg/L EDTA，250mg/L CoCl2·6H2O，1500mg/L MnCl2·4H2O，150mg/L CuCl2·2H2O，300mg/L H3BO3，250mg/L Na2MoO4·2H2O，1300mg/L Zn(CH3COO)2·2H2O，10g/L Fe(III)citrate(柠檬酸铁))，聚醚类消泡剂0.015％，定容体积2L消毒，121℃±1下消毒20min，消毒结束后通无菌空气降温至37℃±1待用；其中50g葡萄糖补料定容500mL，单独灭菌115℃±1，20min，待降至室温后补加进5L发酵罐中待接种；接种后初始培养条件控温37℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，通气量3L/h，溶氧关联搅拌控制30％-40％，当OD600值达37时，控温至30℃加入L-阿拉伯糖诱导，过程控温30℃，浓氨水调控pH 6.9-7.1，溶氧关联搅拌控制30％-40％，初葡萄糖消耗完后开始连续流加补料葡萄糖，补糖速率3-6g/L/h，过程检测葡萄糖残留低于1g/L，培养周期约30h停止发酵离心收集菌体，BW/pBAD–CGTase发酵结束OD600为115，得湿菌体(α-CGT酶菌体)300g，收集菌体储存-20℃环境备用转化；
(3)将700ml自来水、8gα-CGT酶菌体、40g正癸醇依次加入转化罐，浓氨水(磷酸)调控pH6.5后，再搅拌缓慢加入300g预糊化淀粉，使转化液中预糊化淀粉浓度达到30％的预糊化淀粉液，控温50℃进行搅拌8h，液相检测预糊化淀粉质量转化率达66％，生成α-环糊精198g，停止转化，再进行80℃灭活后降温至35℃，加入300ul糖化酶分解残留淀粉3h后离心得湿粗品α-环糊精络合物448g；
(4)将448g湿粗品α-环糊精络合物加入解络罐，加2688ml自来水进行高温搅拌蒸馏，过程补加控制水量不低于粗品重量得5倍；当蒸馏至静止基本无沉淀，同时基本无正癸醇气味后加入料液体积的0.4％活性炭70℃脱色2h，脱色得到无色澄清料液2650g；
(5)将上述2650g脱色后无色澄清料液经减压蒸馏浓缩后得到浓缩液，蒸馏压力-0.8Mpa，温度70℃，将浓缩液在缓慢搅拌的条件下降温结晶，最终降温结晶温度10℃，当充分结晶后，进行离心后，得到湿α-环糊精固体粉末256g，将固体粉末进行真空干燥，真空压力为-0.08Mpa，温度60℃，干燥时间4h得到白色粉末α-环糊精183g，液相HPLC检测纯度99.17％，产品收率：183/(300*66％)＝92.4％
对以上实施例1-3和对比实施例1-3的数据统计如下表1所示：
表1不同实施例数据统计
另外需要注意的是由于异淀粉酶是辅助作用，可将淀粉的支链进行水解形成直链，自身单一作用不产α-环糊精，因此未做单一异淀粉酶的实验。
由表1的结果可以看出，上述对比实施例1-3中均采用单一α-CGT酶菌体转化预糊化淀粉产α-环糊精，通过实施例1-3与对比实施例1-3对比可知，同样工艺操作条件下，α-CGT酶菌体和异淀粉酶菌体共同作用转化的产品(实施例1-3)质量转化率达70％以上，而单一α-CGT酶菌体转化的产品(对比实施例1-3)质量转化率最高只有66％，说明同样工艺条件下，本发明实施例1-3的产品质量转化率明显优于对比例；另外，从两者产品最终收率对比实施例收率可达95％以上，对比例收率低于95％，这说明两种酶的转化产品效率明显优于单一酶转化产品，因此α-CGT酶菌体和异淀粉酶菌体共同作用转化更利于α-环糊精产品的转化生产。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容做出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种酶法生产α-环糊精的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：将BW/pBAD-CGTase N16菌株和BW/pBAD–TfIA菌株保藏的菌种甘油管分别接种至摇瓶培养基中，控温37℃，转速220r/min培养4-5h至菌体OD600为2-2.5合格；
S2：将上述培养合格的菌种接种至发酵罐培养基中，控温37℃，浓氨水调控pH6.9-7.1，溶氧关联搅拌控制30％-40％，当OD600值达35-40时，控温至30℃加入诱导剂L-阿拉伯糖诱导，待初始葡萄糖消耗完后开始连续流加补料葡萄糖，过程检测葡萄糖残留低于1g/L，培养周期约30-32h，菌体OD600检测值为100-120时停止发酵离心收集得到湿菌体分别为α-CGT酶菌体和异淀粉酶菌体，储存-20℃环境备用；
S3：将自来水、α-CGT酶菌体、异淀粉酶菌体、正癸醇依次加入转化罐，调控pH6.0-6.5后，再搅拌缓慢加入预糊化淀粉，使转化液中预糊化淀粉浓度达到30％的预糊化淀粉液，控温45-50℃进行搅拌至检测预糊化淀粉转化率达70％以上停止转化，进行75-80℃灭活20min后降温至30-35℃，再加入糖化酶分解残留淀粉2-3h后离心得粗品α-环糊精络合物；
S4：将粗品α-环糊精络合物加入解络罐，加自来水进行高温搅拌蒸馏，过程控制水量不低于粗品重量的5倍；当蒸馏至无沉淀且无正癸醇气味后加入活性炭脱色，得到无色澄清料液；
S5：将上述脱色后的无色澄清料液经减压蒸馏浓缩后得到浓缩液，将浓缩液依次经结晶、离心后，将所得固体粉末真空干燥得成品α-环糊精。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述摇瓶培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为自然pH，摇瓶分装100mL，消毒121℃，20min；接种时加入硫酸链霉素，终浓度为50ug/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述发酵罐培养组成为：葡萄糖2％，柠檬酸0.17％，磷酸二氢钾1.4％，磷酸氢二铵0.4％，七水硫酸镁0.06％，微量无机盐10ml/L(微量无机盐溶液配制：840mg/L EDTA，250mg/L CoCl2.6H2O，1500mg/L MnCl2.4H2O，150mg/L CuCl2.2H2O，300mg/L H3BO3，250mg/L Na2MoO4.2H2O，1300mg/L Zn(CH3COO)2.2H2O，10g/L Fe(III)citrate(柠檬酸铁))，聚醚类消泡剂0.015％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述诱导剂L-阿拉伯糖加入量2g/L，起始2.5L发酵液加入量5g；配制过程为：5g L-阿拉伯糖加入含50mL自来水的摇瓶中消毒，115℃±1，20min，降至室温备用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述补料葡萄糖浓度为600g/L，补料速率为3-6g/L/h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中按照每700mL自来水中加入α-CGT酶菌体6-8g、异淀粉酶菌体16-20g、正癸醇40g以及预糊化淀粉300g的比例加入；所述糖化酶加入量为300uL/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中所述脱色过程中活性炭的加入量为料液体积分数0.2％-0.4％；脱色条件为：温度60-70℃，时间1-2h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中所述减压蒸馏条件为：压力-0.7Mpa，温度70℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中所述结晶温度为5-10℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中所述真空干燥的条件为：真空压力为-0.06～-0.09Mpa，温度50-60℃，干燥时间4-6h。
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