CN117481196A

CN117481196A - 一种富含成骨生长肽fppqsvl发酵乳的制备方法及其应用

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Publication number: CN117481196A
Application number: CN202311329246.9A
Authority: CN
Inventors: 刘小鸣; 夏傲喃; 杨波; 赵建新; 陈卫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2023-10-13
Filing date: 2023-10-13
Publication date: 2024-02-02

Abstract

本发明公开了一种富含成骨生长肽FPPQSVL发酵乳的制备方法及其应用，属于乳制品加工技术领域。本发明通过将瑞士乳杆菌CCFM1263接种到脱脂牛乳中进行发酵，制备富含成骨生长肽FPPQSVL的瑞士乳杆菌发酵乳。所述发酵乳具有显著增强骨密度、显著提高骨小梁数目和厚度、显著增加骨体积分数、显著增强大鼠的骨骼生物力学，并显著降低血清中骨转换生物标志物TRAP，CTX‑1，DPD的含量，同时显著提高BALP含量的功能。本发明提供的富含成骨生长肽FPPQSVL的瑞士乳杆菌发酵乳可以有效预防或治疗骨质疏松，促进骨骼健康，对开发具有促进骨骼健康的保健品和药品具有十分重要的意义。

Description

一种富含成骨生长肽FPPQSVL发酵乳的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种富含成骨生长肽FPPQSVL发酵乳的制备方法及其应用，属于乳制品加工技术领域。

背景技术

骨质疏松症(Osteoporosis)是一种全身代谢性骨病，其主要特征是全身骨量减少、骨组织显微结构被破坏。在健康的个体中可通过骨吸收与骨形成之间的平衡维持骨代谢平衡。然而，内分泌失调、钙吸收不良、营养、激素调节、衰老和许多病理过程破坏了这种平衡，最终引起骨质疏松症。现阶段，临床上治疗骨质疏松症仍以化学药物为主，但它们往往具有一定的风险，长期服用可能引起乳腺癌和心血管疾病等疾病。因此，寻找能够促进骨形成和逆转骨结构损伤的更安全、更健康的功能性食品正受到越来越多的关注。

随着居民生活条件的改善，消费者对食品的消费需求也在不断升级，其中营养健康元素是多数人关注的重点。发酵乳由牛乳经乳酸菌发酵而成，是补充蛋白质和矿物质等营养物质的有效途径，然而目前市售发酵乳制品同质化问题严重，逐渐成为影响乳企发展的问题之一。而功能型乳制品的崛起改变了这一现状，由于其符合了消费者对健康生活方式的追求，受到强烈关注，成为乳品企业竞争中的热点。多肽是蛋白质降解产物，已报道有多种生物活性肽具有调节免疫、预防心血管疾病、促进骨骼健康等作用。这些多肽可以通过微生物发酵、消化酶解、基因工程的人工合成，化学合成等途径获得。但消化酶解，副反应多，且许多氨基酸衍生物在水中稳定性差；基因工程技术工作才刚起步，技术存在困难；化学合成法设备和试剂费用昂贵，成本高，且副产物对人体有害；通过微生物发酵途径获取生物活性肽可以克服上述问题，具有成本低、成分安全、获取途径简单、可应用性强等优点，因此受到越来越多的关注。大多数生物活性肽是由2-20个氨基酸残基组成，易于被人体消化吸收。因此含有丰富蛋白的乳制品是生物活性肽的良好来源，但乳源成骨生长肽的研究还较少，尤其是通过微生物发酵获取的乳源生物活性肽，并且，目前并没有天然发酵产生的具有预防骨质疏松功能的生物活性肽乳制品。因此，开发一种预防骨质疏松功能性发酵乳具有重要意义，也具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明提供一种富含功能肽的发酵乳制备方法及其应用。所述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)已于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.62417。

具体地，本发明提一种供富含功能肽的发酵乳制备方法，所述方法以瑞士乳杆菌CCFM1263为发酵剂，在30～42℃发酵脱脂乳12～72h。

在一种实施方式中，所述脱脂乳为将5～20％(w/w)的脱脂乳粉溶于水中配制得到。

在一种实施方式中，所述方法将已纯化的瑞士乳杆菌CCFM1263先后经MRS培养基和脱脂乳体系适应性培养，至菌浓度达10⁸～10⁹CFU/mL。

在一种实施方式中，所述方法将已活化的瑞士乳杆菌CCFM1263以10⁶～10⁸CFU/mL的浓度接种于脱脂乳中发酵。

在一种实施方式中，所述脱脂乳灭菌条件为100～120℃，30s～30min。

在一种实施方式中，所述发酵乳中成骨生长肽FPPQSVL的含量为1～500mg/L。

本发明还提供了所述发酵乳在制备改善骨密度的保健品中的应用。

在一种实施方式中，所述保健品中成骨生长肽FPPQSVL的含量≥1mg/L。

在一种实施方式中，所述保健品包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、液体制剂或散剂，所述液体制剂包括乳饮料或口服液，所述片剂包括奶酪、奶片或糖果。

在一种实施方式中，所述保健品还包括常用辅料。

本发明还提供了所述的发酵乳在制备预防或治疗骨质疏松的药品中的应用。

在一种实施方式中，将所述发酵乳干燥后作为药粉。

在一种实施方式中，所述对卵巢切除大鼠诱导的骨质疏松预防或治疗作用包括但不限于如下方面：

(1)显著增加骨密度；

(2)显著提高骨小梁数目和厚度；

(3)显著提高骨体积分数；

(4)显著提高骨骼力学强度；

(5)显著降低大鼠血清中酒石酸磷酸酶(TRAP)的含量；

(6)显著降低大鼠血清中Ⅰ型原胶原C-末端肽(CTX1)的含量；

(7)显著降低大鼠血清中尿脱氧吡啶啉(DPD)的含量；

(8)显著提高大学血清中骨特异性碱性磷酸酶的含量。

有益效果：

1、本发明中应用的瑞士乳杆菌CCFM1263是可用于食品的菌株，安全健康，可用于制备各类食品、药品、微生物制剂。

2、本发明的瑞士乳杆菌CCFM1263发酵乳富含成骨生长肽FPPQSVL，与模型组相比，所述发酵乳可以显著增强骨密度15％，显著提高骨小梁数目和厚度30％，显著增加骨体积分数30％，显著增强大鼠的骨骼生物力学强度28％，并显著降低血清中TRAP，CTX-1，DPD的含量，同时显著提高50％的BALP含量。

生物材料保藏

本发明所提供的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1263，于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62417，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1不同样品中成骨生长肽FPPQSVL的含量；

图2对卵巢切除大鼠骨小梁重建图；

图3对卵巢切除大鼠骨密度的影响；

图4对卵巢切除大鼠骨体积分数的影响；

图5对卵巢切除大鼠骨小梁厚度；

图6对卵巢切除大鼠骨骼生物力学的影响；

图7对卵巢切除大鼠股转换血清生化标志物的影响；(a)：TRAP；(b)：CTX-1；(c)：DPD；(d)：BALP。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

下述实施例中用于配制MRS液体/固体培养基的试剂购于国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的脱脂乳粉购于光明乳业股份有限公司；下述实施例中涉及的SPF级7周龄雌性SD大鼠购于维通利华实验动物有限公司。下述用于检测成骨生长肽FPPQSVL含量的标准样品通过化学合成的方式获得，纯度超过98％。

实施例1瑞士乳杆菌CCFM1263发酵乳的制备方法

S1菌株的筛选与鉴定

1、制备合适的样品稀释梯度并培养

取出-80℃冰箱中贮藏的青海西宁地区的曲拉，置于冰上缓慢解冻。震荡混匀后取0.5mL样品加入4.5mL无菌生理盐水中，完成一次10倍稀释，振荡混匀后再从该稀释液中取出0.5mL稀释液加入4.5mL无菌生理盐水中，完成第二次10倍稀释，以此类推，直至完成第五次10倍稀释(稀释到10^-5)，从每个梯度的稀释液中吸取100μL，均匀涂布于MRS固体培养基平板上，倒置于37℃条件下培养48h。

2、划线分离与纯化

取出长出菌落的平板，选取单菌落明显的梯度平板，挑取不同菌落形态的菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。

3、菌种保藏

将纯化完成后每种菌株的单菌落挑入5mL MRS液体培养基中，置于37℃条件下培养24h，混匀后吸取1mL菌液至保菌管中，6000rpm离心3min，弃掉上清，加入1mL 30％(v/v)无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。

4、16S rDNA序列扩增

混匀后吸取1mL菌液6000rpm离心3min，倾去上清，无菌水洗两次，离心弃掉上清液，获得菌泥，以此为模板，进行PCR扩增。扩增体系共20μL，其中模板量为1μL，双向引物各0.5μL，Taq酶MasterMix为10μL，ddH₂O为8μL。所用引物为27F：AGA GTT TGA TCC TGG CCTCA(SEQ ID No 1)，1492R：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T(SEQ ID No 2)。扩增条件为：预变性，94℃，10min；变性，94℃，30s；退火，55℃，30s；延伸，72℃，2min；循环30次；最后72℃延伸10min；12℃保持10min。

5、测序与鉴定

将PCR样品送到苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，得到菌株编号DQHXN-Q32M42的扩增核苷酸序列测序结果，将测序结果在美国国家生物技术信息中心(NCBI)序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行BLAST比对，可以确定本发明提供的菌株为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。

S2接种菌液的制备

将瑞士乳杆菌CCFM1263接种于MRS培养基中，在37℃下培养18～24h，传代培养2～3次，然后用无菌生理盐水洗涤两次并重悬，至菌浓度达10⁸～10⁹CFU/mL。

S3接种培养

11％(w/w)脱脂乳于100～120℃灭菌30s～30min，然后将菌悬液接种到灭菌后的脱脂乳中，调整菌浓度为10⁶～10⁸CFU/mL，30～42℃发酵12～72h，得到瑞士乳杆菌发酵乳。

实施例2成骨生长肽FPPQSVL含量的测定

1.多肽样品的制备

将实施例1中的瑞士乳杆菌发酵乳样品，加入50％(v/v)的乳酸或1M的氢氧化钠溶液调节样品pH至4.6，于12000g，4℃条件下离心10min，取上清液，用0.45μm有机滤膜过滤，随后采用10kDa的超滤离心管于4000g，4℃条件下离心15min，滤过液即为发酵牛乳多肽样品。

2.成骨生长肽FPPQSVL含量的测定

发酵乳中成骨生长肽FPPQSVL含量的测定采用三重四级杆线性离子阱液质联用仪并建立合适的靶向MRM监测方法进行。成骨生长肽FPPQSVL标准样品用纯净水溶液配制混标母液，制备系列浓度的混标液，绘制成骨生长肽FPPQSVL的标准曲线，采用外标法计算样品的含量。

液相色谱参数：色谱柱BEH T3柱(1.7μm，2.1×100mm)，流动相A含0.1％甲酸的水溶液，流动相B乙腈溶液，柱温40℃，进样体积2μL，流速0.3mL/min。

发酵乳成骨生长肽FPPQSVL含量的测定结果如图1所示。由图1可知，瑞士乳杆菌CCFM1263发酵乳乳清中的FPPQSVL含量为19.87mg/L，而瑞士乳杆菌ATCC15009发酵乳乳清和未发酵牛乳乳清的FPPQSVL含量分别为5.13mg/L和1.63mg/L。因此，瑞士乳杆菌CCFM1263发酵乳具有高的成骨生长肽FPPQSVL含量。

实施例3瑞士乳杆菌CCFM1263发酵乳对卵巢切除大鼠诱导的骨质疏松的影响

1.动物实验方案

取SPF级7周龄雌性SD大鼠30只饲养于昼夜等分、恒温恒湿的屏障内。适应性喂养一周后，随机分为5组，每组6只，5组分别为：假手术组、模型组、灌胃雌二醇阳性组，灌胃瑞士乳杆菌ATCC15009发酵乳组、灌胃瑞士乳杆菌CCCFM1263发酵乳组。其中，ATCC15009是瑞士乳杆菌模式菌株。实验共15周：第一周为大鼠适应期，适应期大鼠饲养在温度22±2℃、湿度40～70％、12h昼夜交替的环境下，自由饮食，所用饲料为购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司的大鼠繁殖配合饲料，普通饮食适应一周后进行实验。第一周结束后，将模型对照组、阳性对照组、瑞士乳杆菌ATCC15009发酵乳组和瑞士乳杆菌CCCFM1263发酵乳组大鼠采用异氟烷吸入式麻醉，通过背部双侧手术方式，切除大鼠两侧卵巢，分两层缝合切口(OVX)；假手术组按照同样的方式，切除卵巢周围部分脂肪组织，不摘除卵巢，分两层缝合切口；术后连续3天按10000U/100g的剂量给各组大鼠注射青霉素抗感染。恢复两周后，在第4周开始灌胃直至实验结束，每日参照表1进行灌胃。

表1动物实验分组及处理方法

2.大鼠骨形态力学指标分析

灌胃结束后采用浓度为1％的戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，具体方式为腹腔注射，剂量为40mg/kg。麻醉后取大鼠左右股骨和胫骨，并包裹在生理盐水浸湿的纱布中，其中需长期保存的骨骼可储存于-80℃环境中，其余骨骼保存在4℃环境中。

大鼠骨骼形态力学采用Micro-CT测定。具体拍摄条件为：扫描电压90kV，电流88μA，FOV为86μm，扫面方式为高分辨率模，扫描时间为4min，采用0.1mm Cu滤波器。使用仪器自带软件进行图像和数据分析，所有骨骼分析部位体积参数相同，均为股骨远股端。

由图2可知，卵巢切除大鼠骨小梁数目显著降低，与模型组相比，雌二醇和CCFM1263发酵乳可显著增加骨小梁数目，并且CCFM1263发酵乳明显高于ATCC15009发酵乳的作用，趋向于空白组和阳参组。

由图3可知，与假手术组相比，卵巢切除后大鼠的骨密度显著降低，ATCC15009发酵乳和CCFM1263发酵乳干预后分别恢复到了正常大鼠骨密度的94％和95％。与模型组相比，ATCC15009发酵乳和CCFM1263发酵乳干预后骨密度分别增加了14％和15％。

由图4可知，与假手术组相比，卵巢切除后大鼠的骨体积分数显著降低，CCFM1263发酵乳干预后恢复到了正常大鼠骨体积分数的73％。与模型组相比，ATCC15009发酵乳干预后没有显著的变化，但CCFM1263发酵乳干预后显著增加了30％。

由图5可知，与假手术组相比，卵巢切除后大鼠的骨小梁厚度显著降低，CCFM1263发酵乳干预后恢复到了正常大鼠骨小梁厚度的88％。与模型组相比，ATCC15009发酵乳干预后没有显著的变化，但CCFM1263发酵乳干预后显著增加了30％。

3.大鼠骨骨骼力学指标分析

骨骼最大载荷和挠度使用质构仪进行分析，选用剪切探头。采用三点弯曲试验测量最大断裂力，即骨最大载荷，试验速度为1mm/s。将骨骼水平放置，前表面朝上，探头以1mm/s的测试速度压缩，直到发生断裂。骨的中间垂直承受荷载，支架间距为16mm。

由图6可知，与假手术组相比，卵巢切除后大鼠的骨骼力学显著降低，ATCC15009发酵乳和CCFM1263发酵乳干预后分别恢复到了正常大鼠骨骼力学的88％和94％。与模型组相比，ATCC15009发酵乳和CCFM1263发酵乳干预后最大载荷分别增加了19％和28％。

4.大鼠骨转换血清生物标志物分析

灌胃结束后采用浓度为1％的戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，具体方式为腹腔注射，剂量为40mg/kg。麻醉后进行腹主动脉取血，并在4℃，5000g的条件下离心15min得到血清。血清保存在-80℃的环境下，避免反复冻存。

大鼠血清中酒石酸磷酸酶(TRAP)，Ⅰ型原胶原C-末端肽(CTX-1)，尿脱氧吡啶啉(DPD)和骨特异性碱性磷酸酶(BALP)中的含量，通过ELISA试剂盒测定，检测结果如图7所示。

由图7可知，卵巢切除后大鼠的TRAP、CTX-1和DPD含量显著升高，而BALP含量显著降低；与模型组相比，ATCC15009发酵乳干预后没有显著的变化，CCFM1263发酵乳干预后分别显著降低了33％，27％和27％，并显著增加了50％的BALP含量，使各指标恢复至与对照组相当的水平。

综上所述，大鼠的骨形态学分析、骨骼力学分析和骨转换血清生物标志物分析实验表明，CCFM1263发酵乳能够有效的预防骨质疏松的发生和发展。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种制备富含成骨生长肽FPPQSVL的发酵乳的方法，其特征在于，将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CCFM1263接种于牛乳中，于30～42℃发酵12～72h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述瑞士乳杆菌CCFM1263已于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62417。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵乳中瑞士乳杆菌CCFM1263的菌浓为10⁸～10⁹CFU/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牛乳包括但不限于脱脂乳。

5.由权利要求1～4任一所述方法制备的发酵乳，其特征在于，所述发酵乳中含有成骨生长肽FPPQSVL。

6.权利要求5所述的发酵乳在制备改善骨密度的保健品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述保健品中成骨生长肽FPPQSVL的含量≥1mg/L。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述保健品包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、液体制剂或散剂，所述液体制剂包括乳饮料或口服液，所述片剂包括奶酪、奶片或糖果。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述保健品还包括常用辅料。

10.权利要求5所述的发酵乳在制备预防或治疗骨质疏松的药品中的应用，其特征在于，所述预防或治疗骨质疏松包括：

(1)增加骨密度；

(2)提高骨小梁数目和厚度；

(3)提高骨体积分数；

(4)提高骨骼力学强度；

(5)降低大鼠血清中酒石酸磷酸酶的含量；

(6)降低大鼠血清中Ⅰ型原胶原C-末端肽的含量；

(7)降低大鼠血清中尿脱氧吡啶啉的含量；

(8)提高大鼠血清中骨特异性碱性磷酸酶的含量。