CN117460761B - 一种端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用。本申请的阳离子聚酯为单体P、单体S和单体M三种单体，或单体P和单体S两种单体，与单体T聚合形成的超支化聚合物，并且超支化聚合物端羧基具有聚乙二醇修饰；单体P为环内酯；单体S为端基含有两个或两个以上羧基的有机酸；单体M为含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物；单体T为含有三个或三个以上羟基的化合物；聚乙二醇的数均分子量为0.4～20k。本申请的阳离子聚酯，对超支化聚合物端羧基进行聚乙二醇修饰，与端基基团E修饰的阳离子聚酯一起进行活体递送时，能提高复合物的稳定性，从而显著提高活体递送效率。此外，本申请阳离子聚酯的制备成本低、环保无污染。

Description

一种端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用

技术领域

本申请涉及核酸递送材料技术领域，特别是涉及一种端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用。

背景技术

相较于DNA或病毒载体等其它技术，mRNA技术具有高效性、安全性高、生产周期更短、生产成本更低等优势。然而，由于mRNA分子的不稳定性及体内递送效率低等原因，mRNA技术的应用一直受到限制。要实现mRNA技术的广泛应用，就需要有合适的递送载体将其递送至体内，才能有可实用的效果。目前商业化成功的递送技术主要是Moderna和Biotech等公司所用的基于可电离阳离子脂质的脂质纳米粒(LNP)技术。虽然LNP已被广泛用于新冠疫苗，然而其相对低效率和显著副作用，极大的限制其应用范围。因此开发高效无毒的活体递送系统依然是抑制mRNA技术发展的瓶颈问题。

百达联康生物科技(深圳)有限公司在美国耶鲁大学报道的一种可用于DNA和mRNA递送的生物可降解阳离子聚酯的基础上研发了一种新的可用于DNA和mRNA递送的生物可降解的超支化阳离子聚酯。采用该超支化阳离子聚酯进行基因递送，其效率显著优于线性聚合物及现有最佳商用mRNA转染试剂，且细胞毒性更低。另外该超支化阳离子聚酯可溶于乙醇，具有潜在的临床应用潜力。然而，深入研究发现，超支化阳离子聚酯与基因药物形成的复合物具有高效的体外细胞水平的基因递送效率，但这种复合物在进行活体递送时效率显著降低。

因此，如何提高超支化阳离子聚酯与基因药物形成的复合物的活体递送效率是亟待解决的重要技术问题。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的端基修饰的阳离子聚酯、活体递送体系及应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种端基修饰的阳离子聚酯，该阳离子聚酯为单体P、单体S和单体M三种单体，或者单体P和单体S两种单体，与单体T聚合形成的超支化聚合物(缩写HBPA)，并且超支化聚合物的端羧基具有聚乙二醇(缩写PEG)修饰；其中，单体P为环内酯；单体S为端基含有两个或两个以上羧基的有机酸；单体M为含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物；单体T为含有三个或三个以上羟基的化合物；聚乙二醇的数均分子量为0.4～20k。

需要说明的是，本申请人之前研发了一种超支化聚合物的端基具有基团E修饰的阳离子聚酯(缩写HBPA-E)，提供基团E修饰的端基修饰化合物E为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。虽然HBPA-E具有较高的体外转染效率；但是，在进行活体递送时效率显著降低。分析认为，HBPA-E与核酸药物形成的复合物因其表面显著带正电，从而导致其在进行活体递送时效率显著降低。因此，本申请研发了一种新的端基修饰的阳离子聚酯，即端羧基PEG修饰的阳离子聚酯(缩写HBPA-PEG)。本申请的HBPA-PEG，一方面，PEG修饰能够消耗部分羧基，使得超支化聚合物的电性更趋于中性；另一方面，PEG修饰后具有更好的稳定性，并且，PEG具有亲水性，与HBPA-E联合使用，进行活体递送时，PEG在与核酸药物形成的复合物表面形成稳定结构，增强活体递送体系的稳定性，从而显著提高核酸药物的活体递送效率，解决了端基基团E修饰的阳离子聚酯在进行活体递送时效率显著降低的问题。

还需要说明的是，本申请的关键在于利用PEG修饰提高HBPA-PEG以及HBPA-PEG和HBPA-E组成的活体递送体系的稳定性；但是，单纯的PEG修饰的HBPA-PEG核酸递送效率并不好，尤其是随着PEG分子量的增加，虽然稳定性会提升，但是会影响递送效率；因此，本申请优选采用0.4～20k的PEG，更优选的，例如采用1～5k的PEG。

本申请的一种实现方式中，单体P为脂肪链长度6至35的环内酯。

本申请的一种实现方式中，单体P选自但不仅限于环己内酯、环十二烷内酯、环十五烷内酯和环十六烷内酯中的至少一种。

本申请的一种实现方式中，单体S为碳链长度3至18的有机酸。

本申请的一种实现方式中，单体S选自但不仅限于己二酸、癸二酸和1,2,3-丙烷三甲酸中的至少一种。

本申请的一种实现方式中，单体M为碳链长度4至36的含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物。

本申请的一种实现方式中，单体M选自但不仅限于二乙醇胺、甲基二乙醇胺和乙基二乙醇胺中的至少一种。

本申请的一种实现方式中，单体T为碳链长度4至54的含有三个或三个以上羟基的化合物。

本申请的一种实现方式中，单体T选自但不仅限于三羟甲基丙烷、3-(羟甲基)-1,5-戊二醇、三乙醇胺、N,N,N’,N’-四羟乙基乙二胺中的至少一种。

本申请的一种实现方式中，聚乙二醇与超支化聚合物的摩尔比为5:1～1:10。

需要说明的是，聚乙二醇与超支化聚合物的摩尔比实际上体现的是超支化聚合物端羧基被PEG修饰的数量或程度。可以理解，HBPA具有超分支结构，具有多个端羧基，在PEG分子量相同的情况下，端羧基被PEG修饰的数量越多，HBPA-PEG的稳定性越高，但是递送效率越低；在这种情况下，相应的在HBPA-PEG和HBPA-E组成的活体递送体系中，HBPA-PEG就需要减少占比。因此，聚乙二醇与超支化聚合物的摩尔比可以为一个较大的范围，例如5:1～1:10。总的来说，无论是PEG的分子量，还是PEG的端羧基修饰数量，都以最终HBPA-PEG和HBPA-E组成的活体递送体系在活体递送时的效率为准；原则上，如果HBPA-PEG中PEG的分子量越大，和/或PEG的端羧基修饰数量越多，则活体递送体系中HBPA-PEG的用量相对越少，这样才能够即保障HBPA-PEG、HBPA-E和核酸药物形成的组合物具有更好的稳定性，又具有良好的递送效率，进而具有更高的活体递送效率。

本申请的一种实现方式中，阳离子聚酯的数均分子量为1-30k，优选为2-20k。

本申请的一种实现方式中，超支化聚合物的端羧基还具有中性化合物封端和/或基团E修饰，其中，提供基团E修饰的端基修饰化合物E为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。

需要说明的是，PEG修饰只能对超支化聚合物的部分羧基进行封端，剩余的没有封端的羧基使HBPA-PEG的电性仍然为负电。在与核酸药物形成复合物的过程中，核酸药物的电性为负电，与带正电的HBPA-E相互吸引形成复合物；因此，如果HBPA-PEG的电性为负电，会对HBPA-E或其他带正电的脂质造成不必要的损失。基于这样的考虑，本申请的进一步改进方案中，对进行PEG修饰的端羧基以外的其余羧基，都进行中性化合物封端和/或基团E修饰。

本申请中，对于其余羧基的封端可以采用本领域常规使用的小分子聚合物，例如分子量小于1000的聚合物，包括但不仅限于伯胺化合物、醇类化合物和环氧化合物等。这些小分子聚合物仅仅是对羧基进行封端，使得HBPA-PEG的电性从负电变为中性；因此，本申请将其统一称为中性化合物或中性化合物封端。基团E修饰，实际上就是HBPA-E中的端基修饰方式；因此，基团E修饰能够使HBPA-PEG带正电。这种情况下，带正电的HBPA-PEG不仅能够具有更好的稳定性，还能够与核酸药物相互吸引，起到部分HBPA-E的功能，从而使得活体递送体系具有更高的递送效率。本申请研究证实，无论是中性化合物封端，还是基团E修饰，只要对其余羧基有进行封端，其活体递送效率都优于没有进行封端的HBPA-PEG。

本申请的一种实现方式中，中性化合物包括伯胺化合物、醇类化合物和环氧化合物中的至少一种。

本申请的一种实现方式中，伯胺化合物为含有一个伯胺的分子量小于1000的小分子化合物。

本申请的一种实现方式中，伯胺化合物为乙胺、丙胺、丁胺、乙醇胺和正丙醇胺等中的至少一种。

本申请的一种实现方式中，醇类化合物为乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。

本申请的一种实现方式中，对HBPA-PEG的其余羧基进行修饰的端基修饰化合物E为E1至E26中的至少一种；优选的，端基修饰化合物E为E1至E10、E12、E14至E21、E25、E26中的至少一种；更优选的，端基修饰化合物E为E2、E4、E9、E10、E12、E14、E15、E25、E26中的至少一种。

本申请的一种实现方式中，阳离子聚酯为式一所示结构的超支化聚合物；

式一

其中，x、y、z为1至200的独立整数，

n为0至200的整数，

j、k为0至30的整数，

l、m、o、p、q为1至20的独立整数，

R_x为氢，或者取代或未取代的含1-18个碳原子的烷基，或者取代或未取代的含至少1个苯环的芳香基，或者取代或未取代的含至少1个杂环的杂环基，或者取代或未取代的含1-18个碳原子及至少1个氧原子的烷氧基；

J为氢，R₁中至少一个为聚乙二醇修饰形成的基团，其它为中性化合物封端形成的基团或端基修饰化合物E提供的基团E修饰，此时没有R₂；或者，J为羰基，此时R₁和R₂中至少一个为聚乙二醇修饰形成的基团，其它为中性化合物封端形成的基团或端基修饰化合物E提供的基团E修饰；

式一中，截断线表示分支结构，分支结构连接的第一个单体为P或S，后续连接其他单体形成超支化结构。

其中，连接其他单体是指，例如，后续按照式一的顺序连接单体，在分支结构的基础上再形成支化结构，如此循环，形成类似树枝状的超支化结构。

需要说明的是，本申请中，在只有单体P、S与单体T聚合形成超支化聚合物时，即n为0，此时J如果为羰基，羰基一端连接R₂，另一端连接单体T的羟基。可以理解，这种情况下，式一通式的结构会适应性的调整，即单体T在末端，与羰基J相连。

本申请的第二方面公开了一种活体递送体系，其包括第一聚合物和第二聚合物；第一聚合物为本申请的阳离子聚酯；第二聚合物为超支化聚合物的端基具有基团E修饰的聚合物，即端基基团E修饰阳离子聚酯，其中，提供基团E修饰的端基修饰化合物E为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。

需要说明的是，本申请的活体递送体系，即用于活体递送的基因递送材料，主要由本申请的HBPA-PEG和之前研发的HBPA-E组成，两者组合能够显著提高活体递送效率，解决单独使用端基基团E修饰的阳离子聚酯在进行活体递送时效率显著降低的问题。分析认为，本申请的活体递送体系与核酸药物形成复合物时，HBPA-PEG中的PEG具有亲水性，会在复合物的表面形成稳定结构，提高活体递送过程中复合物的整体稳定性，从而提高活体递送的效率。

本申请中，第二聚合物HBPA-E的端基基团E修饰阳离子聚酯的端基修饰化合物E为E1至E26中的至少一种。

优选的，端基修饰化合物E为E1至E10、E12、E14至E21、E25、E26中的至少一种。

更优选的，端基修饰化合物E为E2、E4、E9、E10、E12、E14、E15、E25、E26中的至少一种。

需要说明的是，本申请采用端基修饰化合物E1至E26进行端基修饰获得的端基基团E修饰阳离子聚酯都具有较好的转染效率和较低的细胞毒性；尤其是，E2、E4、E9、E10、E12、E14、E15、E25、E26端基修饰获得的端基基团E修饰阳离子聚酯转染效率明显优于其他端基修饰的阳离子聚酯，也明显优于当前效率最高的商业转染试剂LipoMM。

本申请的一种实现方式中，第二聚合物，即端基基团E修饰阳离子聚酯，为式二所示结构的超支化聚合物；

式二

其中，x、y、z为1至200的独立整数，

n为0至200的整数，

j、k为0至30的整数，

l、m、o、p、q为1至20的独立整数，

R_x为氢，或者取代或未取代的含1-18个碳原子的烷基，或者取代或未取代的含至少1个苯环的芳香基，或者取代或未取代的含至少1个杂环的杂环基，或者取代或未取代的含1-18个碳原子及至少1个氧原子的烷氧基；

J为氢，R₁为端基修饰化合物E提供的基团E修饰，此时没有R₂；或者，J为羰基，此时R₁和R₂两者都是端基修饰化合物E提供的基团E修饰；

式二中，截断线表示分支结构，分支结构连接的第一个单体为P或S，后续连接其他单体形成超支化结构。

需要说明的是，本申请中，HBPA-PEG和HBPA-E，两者的主链，即超支化聚合物，其结构原理是相同的，只是端基修饰不同而已。当然，在活体递送体系中，HBPA-PEG和HBPA-E，两者的具体数均分子量，或者单体的排列顺序可能有所不同。

本申请的一种实现方式中，第二聚合物的数均分子量为1-30k，优选为2-20k。

本申请的一种实现方式中，第一聚合物和第二聚合物的质量比为0.01:9.99～2.5:7.5。

需要说明的是，本申请的关键在于HBPA-PEG和HBPA-E两者联合使用；可以理解，原则上，只要在HBPA-E中添加HBPA-PEG都能不同程度的起到提高活体递送效率的效果；但是，本申请研究发现，第一聚合物和第二聚合物的质量比为0.01:9.99～2.5:7.5形成的活体递送体系，其活体递送效率相对较高。其中，第一聚合物HBPA-PEG的用量太少，则递送体系在活体中不够稳定，从而导致递送效率降低；反之，如果第一聚合物HBPA-PEG的用量太多，其细胞递送效率极低从而导致几乎没有活体递送效率。

本申请的第三方面公开了本申请的阳离子聚酯或本申请的活体递送体系在核酸药物递送中的应用。

本申请的一种实现方式中，核酸药物包括但不仅限于mRNA、环状RNA、siRNA、microRNA、saRNA和DNA。

需要说明的是，本申请的关键在于，改进了一种新的核酸药物递送材料，即本申请的阳离子聚酯HBPA-PEG，能够解决单独使用端基基团E修饰阳离子聚酯进行活体递送的效率显著降低的问题。本申请的活体递送体系同样能够用于细胞转染，例如采用本申请的活体递送体系包裹核酸药物，将其递送到细胞内。这些细胞的种类包括但不限于HEK293T、A549、HeLa、U87、HUVEC、Jurkat、RAW264.7、iPSC和MSC。

本申请的第四方面公开了一种核酸递送颗粒，包括包裹材料和包裹于包裹材料内的核酸；包裹材料为本申请的阳离子聚酯或包裹材料中至少包含本申请的阳离子聚酯，又或者包裹材料为本申请的活体递送体系或包裹材料中至少包含本申请的活体递送体系；核酸为mRNA、环状RNA、siRNA、microRNA、saRNA和DNA中的至少一种。

需要说明的是，采用本申请活体递送体系的核酸递送颗粒，由于采用本申请的活体递送体系，不仅具有细胞毒性小、能更好满足临床使用需求等优点；还能够显著提高活体递送效率，解决单独使用端基基团E修饰的阳离子聚酯进行活体递送时的效率显著降低的问题。可以理解，本申请核酸递送颗粒的关键在于采用本申请的阳离子聚酯或本申请的活体递送体系，至于具体的包埋方法和核酸递送方法可以参考现有技术。

还需要说明的是，本申请的包裹材料可以根据包裹层的不同设计或需求，还包含本申请阳离子聚酯或本申请活体递送体系以外的其他材料，在此不作具体限定。

本申请的一种实现方式中，核酸递送颗粒的粒径为30-500nm。

本申请的第五方面公开了一种核酸药物递送的试剂盒，包括以下组分中的至少一种：

(a)本申请的阳离子聚酯；

(b)本申请的活体递送体系；

(b)本申请的核酸递送颗粒。

需要说明的是，本申请的核酸药物递送的试剂盒，可以是已经包埋好的某种特定核酸药物的试剂盒，也可以是本申请的阳离子聚酯或本申请的活体递送体系，使用者根据需求自行设计和包埋相应的核酸药物。可以理解，本申请试剂盒的关键在于含有本申请的阳离子聚酯、活体递送体系或核酸递送颗粒，至于核酸递送所需的其他常规试剂，例如一些脂质或聚合物材料等，可以参考现有技术或市售购买获得。当然，为了使用方便，也可以将部分试剂组合到本申请的试剂盒中，在此不作具体限定。

本申请的第六方面公开了本申请的阳离子聚酯，或者本申请的活体递送体系，或者本申请的核酸递送颗粒，或者本申请的试剂盒在基于核酸药物递送的疾病治疗中的应用。

本申请的第七方面公开了一种在体内施用核酸药物的方法，包括采用本申请的活体递送体系或者含有本申请活体递送体系的包裹材料，对核酸药物进行包裹，形成核酸递送颗粒，利用核酸递送颗粒进行核酸药物递送。

需要说明的是，本申请的施用方法，其关键在于采用本申请的活体递送体系进行核酸药物递送，至于体内递送的具体操作以及所需要的其他辅助材料，都可以参考现有技术，在此不作具体限定。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的阳离子聚酯，对超支化聚合物的端羧基进行聚乙二醇修饰，与端基基团E修饰的阳离子聚酯一起进行活体递送时，能够提高复合物的稳定性，从而显著提高活体递送效率。

附图说明

图1是本申请实施例中超支化聚合物及端基基团E和PEG修饰的合成路线图；

图2是本申请实施例中HBPA-E14-3在进行端基修饰前后的1H-NMR谱图；

图3是本申请实施例中HBPA-E14-1和PACA-E14的GPC谱图；

图4是本申请实施例中HBPA-E14-1和PACA-E14的端基修饰E14的定量图；

图5是本申请实施例中HBPA-PEG在进行PEG修饰前后的1H-NMR谱图；

图6是本申请实施例中HBPA-PEG在进行PEG修饰前后的GPC谱图；

图7是本申请实施例中HBPA-E14-2和mRNA的复合物的粒径测试结果；

图8是本申请实施例中不同HBPA-E在A549和HEK 293T细胞中的mRNA转染效率测试结果；

图9是本申请实施例中不同HBPA-E在HEK 293T细胞中的DNA转染效率测试结果；

图10是本申请实施例中修饰26种不同端基E的HBPA-E在A549细胞中的mRNA转染效率测试结果；

图11是本申请实施例中HBPA-E14/HBPA-PEG/mRNA的复合物的体外转染效率结果；

图12是本申请实施例中HBPA-E14/HBPA-PEG/mRNA的复合物的活体肺部递送效果。

具体实施方式

现有商用的基因递送材料转染效率不足，且毒性较大，极大的限制了基于核酸药物递送的基因疗法的广泛应用。尽管有研究报道，基于体外合成生物学技术，通过固定化脂肪酶催化P、S、M三种单体聚合得到的可生物降解的线性聚合物(PACA)，具有较高的转染效率和更低的细胞毒性；但是，该线性聚合物的转染效率依然不理想，且制备的基因递送材料因需要用有毒有机溶剂溶解而难以用于实际临床。

本申请人创造性的在原有三种单体聚合的基础上，增加一种新的单体T，或者利用单体T替换单体M，从而制备得到一种具有超支化结构的新型的超支化聚合物。具体的，由单体P、单体S和单体M三种单体，或者单体P和单体S两种单体，与单体T聚合形成的超支化聚合物，并且超支化聚合物的端基具有基团E修饰，由此形成端基基团E修饰阳离子聚酯。其中，单体P为环内酯；单体S为端基含有两个或两个以上羧基的有机酸；单体M为端基含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物；单体T为含有三个或三个以上羟基的化合物；提供基团E修饰的端基修饰化合物E为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。

本申请人研发的端基基团E修饰阳离子聚酯，其基因转染效率显著提高，显著优于原有的线性聚合物及现有最佳商用mRNA转染试剂，且细胞毒性更低；更为重要的是，其可溶于乙醇，不需要用有毒的有机溶剂溶解，易于工业放大且能够更好的满足临床使用需要，具有极大的实际应用前景。

然而，深入研究发现，单独采用端基基团E修饰阳离子聚酯进行活体递送时效率显著降低。为了解决该问题，本申请创造性的提出对超支化聚合物端羧基进行聚乙二醇修饰，由此形成的聚合物即本申请的HBPA-PEG。

本申请的HBPA-PEG同样具有细胞毒性小、能更好满足临床使用的优点；而且，与端基基团E修饰的阳离子聚酯组合，形成新的递送体系，能够显著提高活体递送效率，解决端基基团E修饰的阳离子聚酯在进行活体递送时效率显著降低的问题。

本申请中，端基基团E修饰的阳离子聚酯的制备方法包括，将各单体和催化剂加入溶剂中，在惰性气氛中依序进行第一阶段聚合反应和第二阶段聚合反应，反应完成后，去除催化剂，获得超支化聚合物；然后，在偶联剂的作用下，采用端基修饰化合物E对超支化聚合物进行端基修饰，获得端基具有基团E修饰的阳离子聚酯；其中，第一阶段聚合反应的条件为，温度85～95℃，反应真空度50～1000mbar，反应时间12～24h；第二阶段聚合反应的条件为，温度85～95℃，反应真空度1-30mbar，反应时间12～72h。单体P和单体S的摩尔比为0.1:10～4:1，单体M和单体S的摩尔比为0:10～20:10，单体T和单体S的摩尔比为0.1:10～20:10。催化剂为固定化脂肪酶，固定化脂肪酶的用量为各单体总质量的3-50wt％。溶剂为二苯醚、正十二烷、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、二甲基乙酰胺和邻苯二甲醚中的至少一种，溶剂的用量为各单体总质量的100-500wt％。其中，去除催化剂，具体包括，反应结束后用过滤装置对反应液进行过滤，收集滤液；获得超支化聚合物，具体包括，向滤液中加入正己烷，使超支化聚合物析出，离心，去上清液，沉淀加入二氯甲烷溶解，再加入正己烷使超支化聚合物析出，离心，去上清液，重复采用二氯甲烷溶解、正己烷析出、离心至少2次；最后，将沉淀干燥，即获得超支化聚合物。偶联剂为N,N’-羰基二咪唑、碳化二亚胺类、磷正离子类和脲正离子类中的至少一种。碳化二亚胺类包括但不限于二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。磷正离子类包括但不限于苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；脲正离子类包括但不限于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸。偶联剂和超支化聚合物的摩尔比为2:1～50:1；优选的，偶联剂和超支化聚合物的摩尔比为4:1～15:1；另外，偶联剂和端基修饰化合物E的摩尔比为5:1～1:10。采用端基修饰化合物E对超支化聚合物进行端基修饰，具体包括，将超支化聚合物溶于二氯甲烷中，加入偶联剂，在惰性气氛中，室温搅拌至少10h，将反应液浓缩后，加入至少3倍体积的乙醚，离心，去除沉淀，获得上清液；将去除上清液中的溶剂，将干燥的产物加入二氯甲烷中溶解，在搅拌下加入端基修饰化合物E，室温反应至少10h，获得端基具有基团E修饰的超支化聚合物，即本申请的阳离子聚酯。进一步的，在加入端基修饰化合物E室温反应结束后，向反应液中加等体积去离子水，涡旋、离心分层后，除去上层水相；重复加等体积去离子水、涡旋、离心分层、除去上层水相操作至少3次；最后，加入至少3倍体积的正己烷，涡旋、离心，去上清液，将沉淀物干燥，即获得端基基团E修饰的阳离子聚酯。

本申请中，HBPA-PEG的制备方法包括，将各单体和催化剂加入溶剂中，在惰性气氛中依序进行第一阶段聚合反应和第二阶段聚合反应，反应完成后，去除催化剂，获得超支化聚合物；然后，在偶联剂的作用下，先加入聚乙二醇进行端羧基的聚乙二醇修饰，如果还需要对其余羧基进行封端，则再加入中性化合物封端的化合物或基团E修饰的端基修饰化合物E对其余羧基进行封端，获得HBPA-PEG；其中，第一阶段聚合反应的条件为，温度85～95℃，反应真空度50～1000mbar，反应时间12～24h；第二阶段聚合反应的条件为，温度85～95℃，反应真空度1-30mbar，反应时间12～72h。单体P和单体S的摩尔比为0.1:10～4:1，单体M和单体S的摩尔比为0:10～20:10，单体T和单体S的摩尔比为0.1:10～20:10。催化剂、溶剂、偶联剂及其用量都与端基基团E修饰的阳离子聚酯的制备方法相同。偶联剂和超支化聚合物的摩尔比为2:1～50:1；优选的，偶联剂和超支化聚合物的摩尔比为4:1～15:1；聚乙二醇和偶联剂的摩尔比为1:5～10:1，中性化合物封端的化合物或基团E修饰的端基修饰化合物E与偶联剂的摩尔比为1:1～50:1。本申请中，先加入聚乙二醇进行端羧基的聚乙二醇修饰，再加入对其余羧基进行封端的化合物，具体包括，将超支化聚合物溶于二氯甲烷中，加入偶联剂，在惰性气氛中，室温搅拌至少3h，加入聚乙二醇，室温反应至少48h；然后，向反应液中补充偶联剂，室温搅拌至少3h，加入中性化合物封端的化合物或基团E修饰的端基修饰化合物E，室温反应至少10h，获得HBPA-PEG。进一步的，加入中性化合物封端的化合物或基团E修饰的端基修饰化合物E，室温反应至少10h后，向反应液中加等体积去离子水，涡旋、离心分层后，除去上层水相；重复加等体积去离子水、涡旋、离心分层、除去上层水相操作至少5次；最后，加入至少3倍体积的正己烷，涡旋、离心，去上清液，将沉淀物干燥，即获得本申请的HBPA-PEG。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

一、超支化聚合物(HBPA)合成及端基修饰

(1)HBPA合成

本例先采用P、S、M和T四种单体聚合形成的超支化聚合物(HBPA)，然后再对HBPA进行端基基团E修饰，获得HBPA-E。具体的，本例的单体P采用环十五烷内酯(PDL)，单体S采用癸二酸(SA)，单体M采用甲基二乙醇胺(MDEA)，单体T采用三乙醇胺(TEA)，HBPA合成路线如图1的(a)图所示，本例设计了七个试验和两个对照，按照表1中四种单体P(PDL)/S(SA)/M(MDEA)/T(TEA)的投料摩尔比将原料加入圆底烧瓶中，并按总原料质量的10Wt％加入固定化脂肪酶(CALB)，最后加入原料200Wt％的二苯醚。将反应体系用氩气置换3次后，60mbar下搅拌加热至90℃反应24小时，接着2.1mbar压力下继续反应48小时。反应结束后将反应液过滤除去脂肪酶。滤液加正己烷，涡旋、离心后，倒去上清液，沉淀加二氯甲烷溶解，再加正己烷使其析出，离心，倒去上清液。上述操作重复3次。将沉淀物真空干燥一天得到HBPA。其中，对照合成的聚合物为线性聚合物PACA，参考US20200399424 A1。

表1不同投料比合成的聚合物及其修饰E14的产物表征

表1中，“a”是根据1H-NMR结果计算，“b”是根据GPC结果。

(2)端基基团E修饰

本例按照表1所示，采用端基修饰化合物E14，本例采用N,N’-羰基二咪唑(CDI)做偶联剂进行聚合物的端基修饰。

如图1的(b)图所示，用CDI做偶联剂，取250mg HBPA溶于5mL超干二氯甲烷(DCM)，搅拌下加入40eq的CDI。将反应体系用氩气置换3次后，室温搅拌过夜。将反应液浓缩至3mL，加3倍体积乙醚，涡旋、离心，除去沉淀物。将上清液减压旋干，加超干DCM溶解，再搅拌下加40eq的E14，室温反应24小时。反应结束后，往反应液中加等体积去离子水，涡旋、离心分层后，除去上层水相。再加等体积去离子水，重复上述操作5次。向下层的二氯甲烷溶液中加3倍体积正己烷，涡旋、离心。将沉淀物真空干燥一天得到HBPA-E14。对于对照1则是获得PACA-E14。

用类似试验2的方法，本例进一步采用除E14以外的，E1至E26的25种端基修饰化合物对HBPA进行端基修饰，合成其他的HBPA-E。

E1至E26的26种端基修饰化合物如下：

(3)PEG修饰

端羧基PEG修饰且伯胺化合物封端的阳离子聚酯的合成路线如图1的(c)图所示，取HBPA溶于超干二氯甲烷(DCM)，搅拌下加入CDI(0.5eq-COOH)。将反应体系用氩气置换3次后，室温搅拌3小时后，加入mPEG_2K-NH₂(0.1eq-COOH)，室温继续反应48小时。如果需要对其他羧基进行封端，则进行继续进行封端处理，否则跳过该步骤进行后续反应，封端处理：往反应液中补充CDI(1eq-COOH)，室温搅拌3小时后加入乙醇胺(5eq-COOH)，室温继续反应过夜。

反应结束后，往反应液中加等体积去离子水，涡旋、离心分层后，除去上层水相。再加等体积去离子水，重复上述操作5次。再往二氯甲烷溶液加3倍体积正己烷，涡旋、离心。将沉淀物真空干燥一天得到端羧基PEG修饰且伯胺化合物封端的阳离子聚酯，标记为HBPA-PEG。用类似的方法，将不同分子量的PEG，本例具体分别采用了子量为1k、5k、10k和20k的PEG，修饰HBPA得到不同的HBPA-PEG。

本例分别制备了其余羧基封端和不封端的HBPA-PEG用于后续试验，以下试验中提到的“HBPA-PEG”，除非特别说明是其余羧基不封端的HBPA-PEG，否则都是正常的其余羧基封端的HBPA-PEG。

二、HBPA、HBPA-PEG和HBPA-E的结构表征

(1)HBPA和HBPA-E的结构表征

HBPA和HBPA-E可以通过1H-NMR表征其分子结构。结果如表1所示，部分结果如图2所示。图2分别为试验3的HBPA在进行端基修饰前后的谱图，即HBPA-3和HBPA-E14-3的1H-NMR谱图，溶剂为CDCl₃。谱图中，PDL单元的特征峰为f(δ≈4.08ppm)，SA单元的特征峰为b(δ≈1.60ppm)，MDEA单元的特征峰为g(δ≈4.20ppm)，TEA单元的特征峰为h(δ≈2.85ppm)。TEA单元的存在表明该聚合物结构符合预期设想，可能存在超支化的结构，而特征峰k(δ≈2.22ppm)可以证明端基已经成功修饰基团E。通过计算各特征峰的积分面积可以换算得到聚合物各重复单元的比例，结果表明通过CDI修饰得到的HBPA-E14-3，其P/S/M/T重复单元摩尔比分别为1:9:4.5:1.9，和1:9:6:2的投料比很接近。这说明该反应中各单体原料反应都基本反应完全，反应效率非常高。其它1H-NMR结果如表1所示。结果显示，即使随着T投料的不断增加，酶催化的反应都接近完全，且反应可以非常可控的得到超支化聚合物，而不会产生交联。

试验显示，单体M的降低对超支化聚合物的影响较小；因此，本例进一步的研究了将单体M的比例降到0的情况，即直接用单体P、单体S和单体T三种单体进行聚合物反应，具体的，投料摩尔比P:S:T＝1:9:6，其余步骤和参数都与“(1)HBPA合成”相同。结果显示，P、S和T三种单体也能够获得具有超支化结构的聚合物，而不产生交联。P、S和T三种单体获得的超支化聚合物，与P、S、M和T四种单体获得的超支化聚合物，两者具有类似的理化特性。

同时，通过GPC来表征HBPA-E的分子量及分布。GPC测量是利用Waters 1515色谱柱及2414折光指数(RI)检测器在35℃下进行。流动相为含有0.1％ LiBr的DMF，流速1mL/min，用线性聚甲基丙烯酸甲酯标样做标准品。结果如表1所示，部分结果如图3所示。图3分别为试验1的HBPA-E14-1和对照1的PACA-E14的GPC谱图。图3的结果显示，超支化HBPA-E14-1和线性PACA-E14的GPC谱图都为单峰，数均分子量M_n分别为8296和8769Da，PDI分别为4.12和1.97。二者的分子量接近，但PDI差异明显。其它HBPA-E14的PDI如表1所示，都和HBPA-E14-1类似。

另外，本例将表1制备的HBPA-E14和PACA-E14溶于乙醇，测试其溶解性。结果如表1所示。表1的结果显示，本例支化的HBPA-E都很容易溶于乙醇，溶解性都大于25mg/mL，而线性PACA-E难溶于乙醇，溶解性都小于10mg/mL。

最后，本例通过茚三酮法定量数均分子量相似的HBPA-E14(Mn＝8769)和PACA-E14(Mn＝8296)端基修饰的E14含量。具体方法如下：1、配制茚三酮显色剂：称取200mg的茚三酮，溶于9mL乙醇，加乙醇定容到10mL，配成20mg/mL的茚三酮乙醇溶液。2、样品测定：各取约10mg的HBPA-E14和PACA-E14样品，配成5mg/mL的乙醇溶液，各取100μL分别与200μL茚三酮乙醇溶液混合均匀，置于摇床上60℃加热振荡10min，冷却至室温，各取200μL测其570nm处的吸光度值，并将其吸光度值换算成端基E14的相对浓度。结果如图4所示，PACA-E14中端基E14的相对浓度是1，而在相同材料浓度时，HBPA-E14-1的端基E14的相对浓度是3.01，表明其端基E14含量接近PACA-E14的3倍。考虑到两者的分子量非常接近，HBPA-E14-1端基含量显著高于PACA-E14应该是因其支化结构造成，这也再一次验证了HBPA的支化结构。

(2)HBPA和HBPA-PEG的结构表征

HBPA和HBPA-PEG通过1H-NMR表征其分子结构。图5分别为试验2的HBPA在进行端基修饰前后的谱图，即HBPA-2和HBPA-PEG_2k的1H-NMR谱图，溶剂为CDCl₃。谱图中，PDL单元的特征峰为f(δ≈4.05ppm)，SA单元的特征峰为b(δ≈1.60ppm)，MDEA单元的特征峰为g(δ≈4.16ppm)，TEA单元的特征峰为h(δ≈2.83ppm)，PEG单元的特征峰为p(δ≈3.65ppm)，ETA(乙醇胺)单元的特征峰为r(δ≈3.71ppm)和q(δ≈3.42ppm)。TEA单元的存在证明该聚合物结构符合预期设想，是超支化的结构，而特征峰k(δ≈2.19ppm)和p、r、q可以证明端基已经成功修饰ETA和PEG。通过计算各特征峰的积分面积可以换算得到聚合物各重复单元的比例，结果表明通过CDI修饰得到的HBPA-PEG，其P/S/M/T重复单元摩尔比分别为1:9:5.8:1.1，和1:9:6.2:1的投料比很接近，说明HBPA在经过PEG_2k修饰后其分子结构并未改变。同时可以计算出PEG_2k与HBPA的摩尔比为1:1，说明平均一个HBPA分子修饰一个PEG_2k。

另外，也可以通过GPC来表征HBPA-PEG的分子量及分布。GPC测量是利用Waters1515色谱柱及2414折光指数(RI)检测器在35℃下进行。流动相为含有0.1％ LiBr的DMF，流速1mL/min，用聚苯乙烯标样做标准品。如图6所示，超支化HBPA-PEG和HBPA的GPC谱图都为单峰，数均分子量M_n分别为6948和3791Da，PDI分别为1.85和1.98。二者PDI接近，但分子量差异明显。这表明HBPA-PEG和HBPA相比，端基修饰了PEG和ETA导致分子量的显著增加。

另外，经PEG_2k修饰的HBPA-PEG都很容易溶于乙醇(>25mg/mL)，这和未经修饰的HBPA性质很不一样。

三、材料和mRNA复合物的表征

在制备得到聚合物材料HBPA-E14-2之后，将其和Firefly Luciferase mRNA(N1-Me-Pseudo UTP，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)按不同的质量比混合并测定其复合物的直径，同时也用PACA-E14和mRNA的复合物作为对照。具体的，将聚合物材料HBPA-E14-2和PACA-E14分别溶于乙醇和DMSO中制成25mg/mL的聚合物溶液，然后将不同量的聚合物溶液加入一定体积的pH 4.9的NaAc缓冲液中，漩涡震荡。同时配置含有20μg/mL mRNA的pH 4.9的NaAc溶液，将等体积的聚合物溶液加入mRNA溶液中并漩涡混合，最终得到聚合物和mRNA质量比分别为25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1的复合物溶液。HBPA-E14-2和PACA-E14分别做以上质量比的对照试验。HBPA-E14-2和PACA-E14的用量根据质量比进行计算，例如，聚合物和mRNA质量比为25:1，则取25mg/mL的聚合物溶液20μL，即500μg聚合物加入980μL的pH 4.9的NaAc缓冲液中，漩涡震荡；同时配置含有20μg/mL mRNA的pH 4.9的NaAc溶液，将等体积的聚合物溶液加入mRNA溶液中并漩涡混合，即得到聚合物和mRNA的质量比为25:1。

同时将得到的聚合物材料HBPA-E14-2和HBPA-PEG，按照表2的质量比混合制成活体递送体系。

表2不同比例HBPA-E14/HBPA-PEG/mRNA的复合物的理化性质表征

将不同的活体递送体系和Firefly Luciferase mRNA按75:1的质量比混合并测定其复合物的直径，同时按照表2的对照例1，用HBPA-E14和mRNA的复合物作为对照。具体的，将聚合物材料HBPA-E14-2和HBPA-PEG分别溶于乙醇中制成25mg/mL的聚合物溶液，然后将不同HBPA-PEG含量的聚合物混合溶液，HBPA-PEG质量含量分别为0，0.1，1，5，10，25，50及100％，加入pH 4.9的NaAc缓冲液中，漩涡震荡。同时配置含有20μg/mL mRNA的pH 4.9的NaAc溶液，将等体积的聚合物溶液加入mRNA溶液中并漩涡混合，最终得到活体递送体系。

在25℃下通过粒度仪(Malvern Panalytical Zetasizer Pro)测试HBPA-E14/mRNA复合物的粒径。结果如图7所示，图7的横坐标为聚合物和mRNA的质量比，纵坐标为复合物的粒径，单位为nm。

图7的结果显示，HBPA-E14-2/mRNA复合物在质量比为25:1时，直径超过300nm，而在质量比50:1-200:1时，直径显著降低且逐渐趋于稳定，都为100-200nm。这说明在质量比大于50:1后，HBPA-E14-2和mRNA的复合趋于稳定。PACA-E14和mRNA也表现出类似的结果。

同时，本例也测试了表2中不同HBPA-PEG含量的活体递送体系，HBPA-PEG质量含量分别为0，0.1，1，5，10，25，50及100％，与mRNA复合物的粒径，结果列于表2中。其中HBPA-E14与mRNA的质量比都为75:1。从表2的结果可知，复合物的粒径随HBPA-PEG含量的改变而发生显著改变。在HBPA-PEG含量小于50％时，随着复合物中HBPA-PEG的不断增加，复合物的粒径不断降低并逐渐趋于稳定。而当HBPA-PEG增加到100％时，其粒径相比50％又有所增加。这些结果说明适量的PEG会让复合物的粒径更小。

四、HBPA-E14/HBPA-PEG在体外细胞的mRNA转染效率测试

在得到HBPA-PEG和表达荧光素酶(luciferase)的mRNA或DNA(FireflyLuciferase DNA，广州艾基生物技术有限公司)的复合物后，本例在不同的细胞模型中测试其转染效率。细胞转染的具体方法如下：将A549及HEK293T等细胞(ATCC)接种于48孔细胞培养板中(2.5×10⁴/孔)，细胞在37℃且含有5％CO₂的DMEM中培养12h贴壁后，更换DMEM培养基(250μL/孔)，加入待测样品及阳性对照分别培养24h(mRNA)或48h(DNA)，按最终每孔2μg/mLmRNA计算加入样品。待测材料和mRNA或DNA的复合物制备方法同“三、材料和mRNA复合物的表征”。mRNA转染的阳性对照采用赛默飞的Lipofectamine MessengerMAX(LipoMM)，DNA转染的阳性对照采用Lipofectamine2000(Lipo2k)。

细胞转染后裂解及发光效果测试的具体方法如下：细胞在转染24小时(mRNA)或者48小时(DNA)后，将孔板中的培养基吸掉，之后放在-80℃冰箱10分钟。取出孔板放置到4℃，取40μL裂解液到48孔板，覆盖底面，静置5min，再取280μL测试液到48孔板，然后取160μL混合物到黑色酶标仪板，最后用排枪取40μL D-Luciferin加入每个孔。常温反应2分钟之后放入酶标仪测试560nm发光。

不同HBPA-E在A549和HEK 293T细胞中的mRNA和DNA转染效率测试结果如图8至10所示。各具体试验设计如下：

本例测试了对照1、试验1、试验2、试验3、试验5、试验6和试验7的聚合物分别与mRNA按聚合物:mRNA质量比为75:1复合后，分别在A549和HEK293T细胞中的mRNA转染效率，结果如图8所示。

图8的结果显示，在A549细胞中，所有的超支化材料都表现出比商业对照LipoMM显著更高的mRNA转染效果，且远高于线性PACA-E14的转染效果。其中HBPA-E14-3的转染效率最高，接近LipoMM的4倍。而线性PACA-E14则比LipoMM效果要更弱一些。HEK293T细胞的转染结果和A549结果是一致的。这说明超支化聚合物对mRNA的细胞转染效果相比线性聚合物有显著提高，也优于当前效率最高的商业转染试剂，这个效果也在不同的细胞上得到验证。考虑到这种超支化聚合物还可以溶于乙醇，其在体外和体内mRNA转染都具有巨大的应用潜力。

另外本例也测试了不同HBPA-E在HEK 293T细胞中的DNA转染效率，具体的，分别测试了对照1、试验1、试验2、试验3、试验5、试验6和试验7的聚合物分别与DNA按聚合物:DNA质量比为75:1复合后，在HEK 293T细胞中的DNA转染效率，结果如图9所示。

图9的结果显示，所有的超支化材料都表现出比商业对照Lipo2k显著更高的DNA转染效果，且远高于线性PACA-E14的转染效果，其中HBPA-E14-2的转染效率最高。这说明超支化聚合物材料也可用于DNA转染。

本例还测试了修饰26种不同端基修饰化合物对端基进行基团E修饰的HBPA-E在A549细胞中的mRNA转染效率，具体的，测试了E1至E26这26种端基修饰化合物进行端基修饰的26种HBPA-E分别与mRNA按聚合物:mRNA质量比为75:1复合后，分别在A549细胞中的mRNA转染效率，结果如图10所示。

图10的结果显示，不同端基修饰对mRNA转染效率有影响，其中有多种端基修饰的HBPA-E表现出显著比LipoMM更高的转染效率，如E2、E4、E9、E10、E12、E14、E15、E25及E26等。除E11、E13、E22、E23和E24修饰的聚合物对mRNA的转染效率明显低于LipoMM以外，E8、E17、E18和E21修饰的聚合物对mRNA的转染效率与LipoMM相当，其余端基修饰的聚合物对mRNA的转染效率都高于LipoMM。

最后，本例测试了表2中不同HBPA-PEG含量的活体递送体系(HBPA-PEG质量含量分别为0，0.1，1，5，10，25，50及100％)在A549细胞中的mRNA转染效率，结果如图11所示。

图11的结果显示，当HPBA-PEG含量为0.1％时，其细胞中的mRNA递送效率相比含量为0时只有略微下降。而随着递送体系中HPBA-PEG含量的增加，含量为1-10％时，其mRNA递送效率有部分降低，如HPBA-PEG含量为10％时，其转染效率为HPBA-PEG含量为0时的70％。而当HPBA-PEG大于25％时，其细胞递送效率极大降低，几乎为0。这也说明虽然PEG被广泛报道具有提高递送系统在活体中稳定性的作用，然而PEG含量过高会显著抑制体系对mRNA的递送效率。因此活体递送体系中的HPBA-PEG含量需要适量。

五、HBPA-E14/HBPA-PEG在活体的mRNA转染效果测试

本例测试了HBPA-E14/HBPA-PEG-2在活体的mRNA转染效果，具体方法如下：4～6周龄C57小鼠(体重约20g)购自广东省医学实验动物中心，并在SPF(specific pathogen-free)环境级别监控及饲养。将HBPA-E14与HBPA-PEG2k及mRNA按照质量比75:8.3:1进行混合形成HBPA-E14/HBPA-PEG2k/mRNA复合物，其中HBPA-PEG2k-1为只进行PEG修饰但其余羧基没有封端的HBPA-PEG2k，而HBPA-PEG2k-2为进行PEG修饰且其余羧基全部封端的HBPA-PEG2k。同时将HBPA-E14与其它不同分子量HBPA-PEG(1k，5k，10k及20k，都做了封端修饰)按照相同的PEG含量混合，再与mRNA形成不同的HBPA-E14/HBPA-PEG/mRNA复合物。然后将HBPA-E14/mRNA及不同的HBPA-E14/HBPA-PEG/mRNA复合物分别通过肺部给药(用肺部喷雾针插入气管给药，5μg剂量)注入小鼠体内，观察其在体内的荧光素酶表达效果，以生理盐水及单纯mRNA作为对照。结果如图12所示，图12以采用HBPA-E14/mRNA复合物进行肺部给药的荧光素酶表达强度为1，统计其余各组相对于HBPA-E14/mRNA组的强度。

图12中，横坐标“Control”表示空白组，“mRNA”表示直接采用mRNA进行肺部给药，“HBPA-E/mRNA”表示采用HBPA-E14/mRNA复合物进行肺部给药，“HBPA-E/HBPA-PEG/mRNA”表示采用HBPA-E14/HBPA-PEG/mRNA复合物进行肺部给药(PEG1k-20k分别代表不同分子量的PEG)。

图12的结果显示，直接mRNA肺部给药和空白组都没有检测到荧光，而HBPA-E/mRNA及HBPA-E/HBPA-PEG/mRNA组都显示出显著的荧光素酶表达效果，且所有的HBPA-E/HBPA-PEG/mRNA组都表现出比HBPA-E/mRNA组更高的肺部给药递送效率。其中HBPA-E/HBPA-PEG2k-2/mRNA的递送效率最高，是HBPA-E/mRNA组的2倍多。这些结果说明，HBPA-E/HBPA-PEG组成的活体递送体系相比于单一的HBPA-E能够提高活体mRNA递送的效率，且PEG2k相比其它分子量的PEG修饰的效果更佳。另外HBPA在进行PEG修饰后，对其余羧基进行封端比未封端的效果也更佳。

根据以上试验，PEG分子量为1k-20k修饰的HBPA-PEG都能够不同程度的提高活体mRNA递送的效率。对于分子量小于1k的PEG，例如0.4-1k的PEG，这些小分子量的PEG有被大量用于药物的修饰，且被证明具有很好的安全性(Phlebology.2010；25(3):124-131l；https://asclera.com；)；因此，可以合理的预期，这些分子量的PEG或者更小分子量的PEG也能够安全的用于本申请的活体递送，并能够不同程度的提高活体递送的效率。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (28)

1.一种端基修饰的阳离子聚酯，其特征在于：所述阳离子聚酯为单体P、单体S和单体M三种单体，或者单体P和单体S两种单体，与单体T聚合形成的超支化聚合物，并且超支化聚合物的端羧基具有聚乙二醇修饰；

其中，单体P为环内酯；

单体S为端基含有两个或两个以上羧基的有机酸；

单体M为含有两个羟基，以及一个仲胺或叔胺的化合物；

单体T为含有三个或三个以上羟基的化合物；

聚乙二醇的数均分子量为0.4～20k。

2.根据权利要求1所述的阳离子聚酯，其特征在于：单体P为脂肪链长度6至35的环内酯。

3.根据权利要求2所述的阳离子聚酯，其特征在于：单体P为环己内酯、环十二烷内酯、环十五烷内酯和环十六烷内酯中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的阳离子聚酯，其特征在于：单体S为碳链长度3至18的有机酸。

5.根据权利要求4所述的阳离子聚酯，其特征在于：单体S为己二酸、癸二酸和1,2,3-丙烷三甲酸中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的阳离子聚酯，其特征在于：单体M为碳链长度4至36的化合物。

7.根据权利要求6所述的阳离子聚酯，其特征在于：单体M为二乙醇胺、甲基二乙醇胺和乙基二乙醇胺中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的阳离子聚酯，其特征在于：单体T为碳链长度4至54的化合物。

9.根据权利要求8所述的阳离子聚酯，其特征在于：单体T为三羟甲基丙烷、3-(羟甲基)-1,5-戊二醇、三乙醇胺、N,N,N’,N’-四羟乙基乙二胺中的至少一种。

10.根据权利要求1-5任一项所述的阳离子聚酯，其特征在于：聚乙二醇与超支化聚合物的摩尔比为5:1～1:10。

11.根据权利要求10所述的阳离子聚酯，其特征在于：所述阳离子聚酯的数均分子量为1-30k。

12.根据权利要求11所述的阳离子聚酯，其特征在于：所述超支化聚合物的羧基还具有中性化合物封端和/或基团E修饰，其中，提供基团E修饰的端基修饰化合物E为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。

13.根据权利要求12所述的阳离子聚酯，其特征在于：所述中性化合物包括伯胺化合物、醇类化合物和环氧化合物中的至少一种。

14.根据权利要求12所述的阳离子聚酯，其特征在于：所述伯胺化合物为含有一个伯胺的分子量小于1000的小分子化合物。

15.根据权利要求12所述的阳离子聚酯，其特征在于：所述伯胺化合物为乙胺、丙胺、丁胺、乙醇胺和正丙醇胺等中的至少一种。

16.根据权利要求12所述的阳离子聚酯，其特征在于：所述醇类化合物为乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。

17.根据权利要求12所述的阳离子聚酯，其特征在于：所述端基修饰化合物E为E1至E26中的至少一种；

18.根据权利要求12所述的阳离子聚酯，其特征在于：所述阳离子聚酯为式一所示结构的超支化聚合物；

式一

其中，x、y、z为1至200的独立整数，

n为0至200的整数，

j、k为0至30的整数，

l、m、o、p、q为1至20的独立整数，

R_x为氢，或者取代或未取代的含1-18个碳原子的烷基，或者取代或未取代的含至少1个苯环的芳香基，或者取代或未取代的含至少1个杂环的杂环基，或者取代或未取代的含1-18个碳原子及至少1个氧原子的烷氧基；

J为氢，R₁中至少一个为聚乙二醇修饰形成的基团，其它为中性化合物封端形成的基团和/或端基修饰化合物E提供的基团E修饰，此时没有R₂；或者，J为羰基，此时R₁和R₂中至少一个为聚乙二醇修饰形成的基团，其它为中性化合物封端形成的基团和/或端基修饰化合物E提供的基团E修饰；

式一中，截断线表示分支结构，分支结构连接的第一个单体为P或S，后续连接其他单体形成超支化结构。

19.一种活体递送体系，其特征在于：包括第一聚合物和第二聚合物；

所述第一聚合物为权利要求1-18任一项所述的阳离子聚酯；

所述第二聚合物为权利要求1-18任一项所述的阳离子聚酯中的超支化聚合物的端基具有基团E修饰的聚合物，其中，提供基团E修饰的端基修饰化合物E为至少含有一个伯胺、仲胺或叔胺基团的化合物。

20.根据权利要求19所述的活体递送体系，其特征在于：所述端基修饰化合物E为E1至E26中的至少一种；

21.根据权利要求19或20所述的活体递送体系，其特征在于：所述第二聚合物为式二所示结构的超支化聚合物；

式二

其中，x、y、z为1至200的独立整数，

n为0至200的整数，

j、k为0至30的整数，

l、m、o、p、q为1至20的独立整数，

R_x为氢，或者取代或未取代的含1-18个碳原子的烷基，或者取代或未取代的含至少1个苯环的芳香基，或者取代或未取代的含至少1个杂环的杂环基，或者取代或未取代的含1-18个碳原子及至少1个氧原子的烷氧基；

J为氢，R₁为端基修饰化合物E提供的基团E修饰，此时没有R₂；或者，J为羰基，此时R₁和R₂两者都是端基修饰化合物E提供的基团E修饰；

式二中，截断线表示分支结构，分支结构连接的第一个单体为P或S，后续连接其他单体形成超支化结构。

22.根据权利要求19或20所述的活体递送体系，其特征在于：所述第二聚合物的数均分子量为1-30k。

23.根据权利要求19或20所述的活体递送体系，其特征在于：第一聚合物和第二聚合物的质量比为0.01:9.99～2.5:7.5。

24.根据权利要求1-18任一项所述的阳离子聚酯，或者权利要求19-23任一项所述的活体递送体系在核酸药物递送中的应用。

25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于：所述核酸药物包括但不仅限于mRNA、环状RNA、siRNA、microRNA、saRNA和DNA。

26.一种核酸递送颗粒，其特征在于：包括包裹材料和包裹于包裹材料内的核酸；

所述包裹材料包含权利要求1-18任一项所述的阳离子聚酯，或者权利要求19-23任一项所述的活体递送体系；

所述核酸为mRNA、环状RNA、siRNA、microRNA、saRNA和DNA中的至少一种。

27.根据权利要求26所述的核酸递送颗粒，其特征在于：所述核酸递送颗粒的粒径为30-500nm。

28.一种核酸药物递送的试剂盒，其特征在于：包括以下组分中的至少一种，

(a)权利要求1-18任一项所述的阳离子聚酯；

(b)权利要求19-23任一项所述的活体递送体系；

(c)权利要求26或27所述的核酸递送颗粒。