CN117448227B - 一株副干酪乳酪杆菌及其在预防和治疗痤疮中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)，该菌株LPH01在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 20231510。还公开了一种菌剂，其活性成分包括副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)LPH01或其发酵产物，优选所述菌剂为冷冻干燥粉剂。还公开了该菌剂在制备抑制痤疮丙酸杆菌的产品中的应用，以及在制备用于预防和/或治疗痤疮的产品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株副干酪乳酪杆菌及其在预防和治疗痤疮中的应用。
背景技术
寻常痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，好发于皮脂腺丰富的部位，如面部、胸部和背部，常伴有丘疹、脓包、结节、囊肿和疤痕等多种损害，是美容皮肤科中最常见的病种之一。痤疮的发病率可高达85％，普遍存在于青少年、成人，甚至儿童。痤疮严重影响患者生活质量和身心健康，导致自卑、焦虑、抑郁，甚至自杀的风险增加。痤疮丙酸杆菌为革兰氏阳性厌氧菌，通常寄居在皮肤的毛囊和皮脂腺内。痤疮丙酸杆菌在痤疮发展中的作用似乎与参与宿主分子降解的酶活性的产生有关，痤疮丙酸杆菌脂肪酶已被认为是涉及痤疮发病机理的毒力因子之一。当皮脂腺内皮脂大量堆积，造成毛孔堵塞形成厌氧环境，痤疮丙酸杆菌将利用皮脂作为主要营养物进行大量增殖，进而产生脂肪酶，将皮脂中的甘油三脂分解为甘油和游离脂肪酸。此外，痤疮的发生与痤疮丙酸杆菌菌株类型有关。研究发现，痤疮的严重程度与痤疮丙酸杆菌的丰富呈正相关，系统型IA1与痤疮的相关性更强。
临床上出现了一系列针对寻常痤疮病理因素的防治手段，现有策略虽已改善了寻常痤疮的管理，但细菌耐药性和严重的不良反应等安全性问题给传统防治措施的使用带来了巨大挑战。抗生素作为治疗痤疮的常规用药，能起到抑制痤疮丙酸杆菌繁殖、减少炎症等效果。但长期使用抗生素治疗会增加耐药性的风险，甚至破坏皮肤微生物群，并消除对皮肤有益的共生菌。因此，在抗生素耐药性日益增加的背景下，有必要寻找一些安全、有效的方法来抑制痤疮丙酸杆菌或减少痤疮丙酸杆菌诱导的炎症反应进而改善痤疮。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)LPH01，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO:M20231510。
本发明的再一目的是提供一种菌剂，其活性成分包含上述的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)LPH01或其发酵产物；优选所述菌剂为冷冻干燥粉剂。
优选地，所述菌剂为副干酪乳酪杆菌LPH01的发酵产物，且分子量＞10KDa。
优选地，所述菌剂是通过将上述的副干酪乳酪杆菌LPH01发酵得到的发酵液经超滤分级得到的。
优选地，所述发酵产物的制备方法为：将活化后的菌种接种至液体培养基中，30～37℃下培养至对数期后，离心收集发酵上清液，即得发酵产物；优选所述培养基为MRS液体培养基。
本发明的再一目的是提供上述的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)LPH01或上述的菌剂在制备抑制痤疮丙酸杆菌的产品中的应用。
本发明的再一目的是提供上述的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)LPH01或上述的菌剂在制备用于预防和/或治疗痤疮的产品中的应用。
在上述的应用的技术方案中，所述产品为功能性食品、保健品、药品或护肤品。
在上述的应用的技术方案中，所述副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)LPH01的发酵产物抑制痤疮丙酸杆菌降解甘油三酯的能力，并下调细胞外脂肪酶相关基因GehA、PPA1796、PPA2105和PPA1761的表达。
本发明的最后一目的是提供一种产品，所述产品用于抑制痤疮丙酸杆菌或者用于预防和/或治疗痤疮，所述产品的活性成分包含上述的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)LPH01或上述的菌剂；所述产品为功能性食品、保健品、药品或护肤品。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一株副干酪乳酪杆菌LPH01菌株，其无细胞代谢物具有有效抑制痤疮丙酸杆菌的功效，抑菌圈平均直径为24.65±0.27mm，抑菌效果显著。LPH01发酵液抑菌活性成分具有耐热、耐酸，且对蛋白酶不敏感的特性。通过对LPH01发酵液进行超滤分级处理后，分子量在＞10KDa的抑菌效果最佳，对痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度为12.5mg/mL。除此之外，LPH01发酵液抑菌物质还可有效抑制痤疮丙酸杆菌降解甘油三酯的能力，并下调细胞外脂肪酶相关基因的表达。因此，本发明提供的LPH01菌株在预防或治疗寻常痤疮，以及在制备功能性食品、保健品、药品或护肤品中的应用中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为副干酪乳酪杆菌LPH01对痤疮丙酸杆菌的抑制活性。
图2为菌株LPH01菌落形态图(A)及革兰氏染色结果(B)。
图3为菌株LPH01的系统发育树。
图4为菌株LPH01的最小抑菌浓度。
图5为热处理对菌株LPH01代谢产物抑菌效果的影响。
图6为pH处理对菌株LPH01代谢产物抑菌效果的影响。
图7为酶处理对菌株LPH01代谢产物抑菌效果的影响。
图8为菌株LPH01发酵液抑菌物质相对分子量范围。
图9为菌株LPH01代谢产物对痤疮丙酸杆菌降解甘油三酯能力的影响。
图10为菌株LPH01代谢产物对痤疮丙酸杆菌细胞外脂肪酶基因的定量分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；如无特殊说明，所用生物、化学试剂均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。
实施例1、菌株LPH01的抑菌实验及鉴定
1实验材料
副干酪乳酪杆菌LPH01菌株、发酵粘液乳杆菌菌株U22、卷曲乳杆菌菌株h11、植物乳植杆菌菌株S22：来源于西南大学食品科学学院索化夷实验室菌种库。
LPH01分离自健康成年人体粪便。
LPH01菌株保藏信息：
将副干酪乳酪杆菌LPH01菌株于2023年8月送于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2023年8月21日；保藏编号：CCTCC NO:M 20231510；分类命名为：副干酪乳酪杆菌LPH01Lacticaseibacillusparacasei LPH01。
痤疮丙酸杆菌ATCC 6919：购自美国典型菌种保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，作为指示菌株。
2实验方法
2.1乳酸菌发酵液的制备及浓缩
将活化后的乳酸菌按2％(V/V)的接种量接种于200mLMRS液体培养基中，37℃下培养24h后，在4℃下，8000rpm离心10min，弃去菌体，收集发酵上清液。用旋转蒸发仪在60℃下，80rpm旋蒸30min后，放置于-80℃超低温冰箱冷冻24h。然后置于真空冷冻干燥机干燥48h，得到乳酸菌发酵上清液冻干粉。
2.2抑制痤疮丙酸杆菌的乳酸菌筛选
采用牛津杯双层平板法进行抑制痤疮丙酸杆菌的乳酸菌筛选，向无菌平板中加入8mL 2％的灭菌琼脂，待凝固后，向琼脂层中放置5个无菌牛津杯。配制半固体BHI培养基(含体积分数为1％的琼脂)，灭菌后待其冷却至45℃左右，将对数期的痤疮丙酸杆菌菌悬液添加到BHI半固体培养基中(指示菌终浓度为1×107CFU/mL)，混合均匀后，吸取15mL含指示菌的培养基至琼脂层上。待半固体培养基凝固后，用无菌镊子取出牛津杯，打开平板盖子，在无菌操作台中放置0.5h，使水分挥发。用移液枪吸取100μL乳酸菌发酵上清液(将冻干粉用无菌水溶解并稀释至400mg/mL后，用0.22μm水系滤膜进行过滤除菌)加入到牛津杯孔内。密封好平板后，将其放置在4℃冰箱4h，使得乳酸菌发酵上清液充分扩散。最后置于37℃的恒温培养箱中，厌氧培养48h。采用十字交叉法测定抑菌圈直径(平行实验3次，并计算3次测量值的平均值)。并设置空白对照：100μLMRS培养基(MRS液体培养基冻干粉用无菌水溶解并稀释至400mg/mL后，用0.22μm水系滤膜进行过滤除菌。筛选出抑菌效果最佳的乳酸菌做进一步试验。
2.3形态学鉴定
将活化后的菌株在MRS平板上划线，37℃下培养24h后，观察并拍照记录单一菌落的形态。同时用接种环挑取单一菌落均匀涂抹于载玻片，经革兰氏染色后于显微镜下观察并拍照记录菌体形态。
2.4API50试剂盒生化鉴定
采用碳水化合物鉴定试剂盒(API 50CH)鉴定筛选菌株的生化特性。将菌株接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h后，取2mL菌悬液于4℃、4000rpm离心5min，弃去菌上清，用无菌生理盐水洗涤2次，加入2mL无菌生理盐水重悬。取0.5mL菌悬液接种到API 50CH液体培养基中，混合均匀后，取90μL接种到试剂条中，50μL无菌液体石蜡封口，最后在培养盒的每个凹糟中加入80μL无菌水后，将试剂条放入培养盒，在37℃下培养48h后观察颜色变化。最终结果将录入API LAB plus系统进行菌株鉴定。
2.516S rDNA扩增及DNA序列
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取纯化菌株的DNA。采用25μL的PCR反应体系，即：1μL细菌基因组DNA，正向引物27F(SEQ ID NO.1:5'-AGAGAGTTTGGCTCAG-3')1μL，1492R(SEQ ID NO.2:5'-GGTTACTTGTTACGATT-3')1μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，ddH2O9.5μL。PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃末端延伸5min。PCR反应结束后，采用1.5％的琼脂糖凝胶检验PCR扩增后的DNA片段，105V电压下进行45min。将跑完电泳的胶板置于凝胶成像系统上观察、拍照。将扩增成功的样品送往华大科技有限公司进行测序，测序结果通过NCBI中的BLAST程序进行同源性比对分析。
2.6系统发育树的构建
从Gene Bank中与试验菌株16S rDNA基因序列同源性大于99％的菌株及Genome中的标准菌株作为参考序列，采用MEGA 5.0软件中邻接法(Neighbor-Joining)进行系统发育树的构建。
3结果与分析
3.1菌株LPH01对痤疮丙酸杆菌的抑菌活性
将保藏于本实验室的副干酪乳酪杆菌LPH01发酵得到发酵液，进一步制备成冷冻干燥粉剂，接着测定其对痤疮丙酸杆菌的抑菌活性。结果如图1所示，菌株U22和h11对痤疮丙酸杆菌无抑制作用，菌株S22表现出较强的抑菌效果(抑菌圈直径为10.57±0.35mm)，而菌株LPH01对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直径达到24.65±0.27mm。这说明副干酪乳酪杆菌LPH01是一株具有拮抗痤疮丙酸杆菌的潜力菌株。
3.2菌株LPH01形态学鉴定结果
菌株LPH01纯化后在MRS培养基中形成单菌落，菌落形态几乎一致，菌落表面光滑湿润，凸出，边缘整齐，圆形，呈乳白色(图2A)；革兰氏染色后在显微镜下观察到紫色细胞形态，判定为革兰氏阳性菌(G+)，显微镜下呈杆状，大小均匀(图2B)。
3.316S rDNA基因测序分析结果
菌株LPH01的16S rDNA PCR扩增成功后，由华大基因科技有限公司完成测序。LPH01的16S rDNA基因扩增产物的双向序列如SEQ ID NO.3所示。16SrDNA同源性分析结果显示，编号为LPH01的菌株与Gene Bank数据库中已知Lacticaseibacillusparacasei(Accession：MT515983.1)的同源性达100％。菌株LPH01与副干酪乳酪杆菌以100％自举支持率聚在一起，说明菌株LPH01与副干酪乳酪杆菌的亲缘关系最近。因此，综合菌落形态、生理生化特征及其遗传特性，将该菌鉴定为Lacticaseibacillusparacasei副干酪乳酪杆菌，将其命名为Lacticaseibacillusparacasei LPH01。建立的系统发育树如图3所示。
实施例2、菌株LPH01发酵液的理化特性研究
1实验材料
副干酪乳酪杆菌LPH01菌株：CCTCC NO:M 20231510。
痤疮丙酸杆菌ATCC 6919：购自美国典型菌种保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，作为指示菌株。
2实验方法
2.1最小抑菌浓度(MIC)的测定
采用二倍稀释法测定副干酪乳杆菌LPH01的MIC，探究其发酵上清液对痤疮丙酸杆菌的抑制效果。首先将菌株LPH01发酵上清液冻干粉用无菌水进行2倍稀释，稀释后浓度为400、200、100、50、25、12.5、6.25mg/mL。于96孔培养板中分别加入各浓度发酵上清液100μL，再加入指示菌菌悬液100μL(终浓度为1×107CFU/mL)。同时设置阴性对照(加发酵上清液，不加指示菌菌液)和阳性对照(加指示菌菌液，不加发酵上清液)。将96孔培养板置于37℃厌氧培养48h后，测定600nm处的吸光度值，以抑菌率≥90％或无细菌生长的最低浓度为MIC，实验平行测定3次。
2.2热处理对乳酸菌代谢产物抑菌效果的影响
将副干酪乳杆菌LPH01发酵上清液冻干粉用无菌水进行稀释至25mg/mL，将其分为若干份，分别在60、80、100、121℃下加热处理30min后，冷却至室温，用0.22μm水系滤膜进行过滤除菌，在96孔板中分别加入100μL痤疮丙酸杆菌菌悬液(终浓度为1×107CFU/mL)及100μL经不同热处理后的发酵液(终浓度为12.5mg/mL)。将96孔培养板置于37℃厌氧培养48h后，测定600nm处的吸光度值。以未经过热处理的发酵液作为对照，测定热处理对菌株LPH01代谢产物抑菌效果的影响。
2.3pH处理对乳酸菌代谢产物抑菌效果的影响
将副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液冻干粉用无菌水进行稀释至25mg/mL，将其分为若干份，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节发酵液的pH值至2、3、4、5、6、7、8、9后，用0.22μm水系滤膜进行过滤除菌，在96孔板中分别加入100μL痤疮丙酸杆菌菌悬液(终浓度为1×107CFU/mL)及100μL经不同pH处理后的发酵液(终浓度为12.5mg/mL)。将96孔培养板置于37℃厌氧培养48h后，测定600nm处的吸光度值。以未调整pH的发酵液作为对照，测定pH处理对菌株LPH01代谢产物抑菌效果的影响。
2.4酶处理对乳酸菌代谢产物抑菌效果的影响
将副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液冻干粉用无菌水进行稀释至25mg/mL，将其分为若干份，将发酵液的pH调至不同酶的最适pH，分别添加胃蛋白酶(pH 2.0)、胰蛋白酶(pH7.0)、木瓜蛋白酶(pH 7.0)、蛋白酶K(pH 7.0)、碱性蛋白酶(pH 9.0)和风味蛋白酶(pH 7.0)，使各蛋白酶终浓度为1.0mg/mL，在37℃下孵育2h后，将发酵液在100℃下加热5min，使酶灭活，最后将其pH调回至发酵液初始pH(pH 4.0)。用0.22μm水系滤膜进行过滤除菌，在96孔板中分别加入100μL痤疮丙酸杆菌菌悬液(终浓度为1×107CFU/mL)及100μL经不同酶处理后的发酵液(终浓度为12.5mg/mL)。将96孔培养板置于37℃厌氧培养48h后，测定600nm处的吸光度值。以未经酶处理的发酵液作为对照，测定酶处理对菌株LPH01代谢产物抑菌效果的影响。
3结果与分析
3.1最小抑菌浓度
由图4所示，副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液冻干粉浓度大于12.5mg/mL时，无细菌生长，对痤疮丙酸杆菌的抑制率超过90％；当发酵液冻干粉浓度小于12.5mg/mL时，细菌生长量逐渐增多，对痤疮丙酸杆菌的抑制活性逐渐下降。结果表明，副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液对痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度为12.5mg/mL。
3.2热处理对乳酸菌代谢产物抑菌效果的影响
副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液在不同温度下处理30min后，测定其对痤疮丙酸杆菌的抑制效果，以未经热处理的发酵液作为对照，结果如图5所示，随着处理温度的升高，发酵液对痤疮丙酸杆菌仍保持较高的抑菌效果，即使经过121℃的高温处理，其抑菌效果与对照组相比无显著差异(p>0.05)。结果表明，副干酪乳酪杆菌LPH01代谢产物具有一定的耐高温特性，热稳定性强。
3.3pH处理对乳酸菌代谢产物抑菌效果的影响
副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液在不同pH下对痤疮丙酸杆菌的抑制效果如图6所示，LPH01在pH 2～4范围内具有良好的抑菌活性，pH为5时，LPH01对痤疮丙酸杆菌的抑菌活性明显下降，且随着pH的增加抑菌活性逐渐降低。在pH>6时，对痤疮丙酸杆菌的生长有促进作用。结果显示，副干酪乳酪杆菌LPH01代谢产物在酸性环境下较为稳定，在碱性环境下抑菌活性物质容易失活，由此可见副干酪乳酪杆菌LPH01代谢产物对pH较为敏感。
3.4酶处理对乳酸菌代谢产物抑菌效果的影响
选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、碱性蛋白酶和风味蛋白酶共6种极具代表性的蛋白酶，探究了副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液对蛋白酶的敏感性，结果如图7所示，发酵液经蛋白酶处理2h后，其对痤疮丙酸杆菌的抑菌活性与对照组相比无显著差异(p>0.05)。结果表明，副干酪乳酪杆菌LPH01代谢产物不易被蛋白酶降解。实施例3、菌株LPH01发酵液对痤疮丙酸杆菌的抗菌作用机制
1实验材料
副干酪乳酪杆菌LPH01菌株：CCTCC NO:M 20231510。
痤疮丙酸杆菌ATCC 6919：购自美国典型菌种保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，作为指示菌株。
2实验方法
2.1菌株LPH01发酵液抑菌物质分子量估算
将副干酪乳杆菌LPH01发酵上清液冻干粉用无菌水进行稀释至100mg/mL。向10KDa超滤离心管中添加10mL样液，于4℃下，4000rpm离心40min，得到＞10KDa和＜10KDa的发酵液组分。然后将＜10KDa的发酵液组分用3KDa超滤管重复超滤，得到3-10KDa和＜3KDa的发酵液组分。将不同组分收集于50mL离心管中，置于-80℃下过夜。然后置于真空冷冻干燥机干燥48h，收集发酵液冻干粉并测定各组分质量。将各组分发酵液冻干粉复溶于无菌水中，测定菌株LPH01发酵液不同组分对痤疮丙酸杆菌的抑制效果。以未经分级处理的发酵液作为对照，实验平行测定3次。此外，采用二倍稀释法测定副干酪乳杆菌LPH01发酵液不同组分的MIC值。
2.2菌株LPH01发酵液抑菌物质对痤疮丙酸杆菌降解甘油三酯能力的影响
收集对数生长期的痤疮丙酸杆菌，用PBS洗涤3次，并将细胞密度调节至2×107CFU/mL，分别与等体积的LPH01和分子量＞10KDa的亚组分(终浓度为1/4MIC、1/2MIC和1MIC)混合。向细菌悬液中按2％的量加入甘油三酯标准品，在37℃下厌氧孵育48h。孵育结束后，培养液于4℃下，3000rpm离心10min，收集上清液。取10μL上清液，加入1mL工作液，混匀，37℃下孵育10min，于500nm处测定甘油三酯含量。
2.3乳酸菌产抑菌物质对指示菌细胞外脂肪酶基因的定量分析
为了探究菌株LPH01发酵液和＞10KDa的亚组分对痤疮丙酸杆菌的影响，收集对数生长期的痤疮丙酸杆菌，用PBS洗涤3次，并将细胞密度调节至2×107CFU/mL，分别与等体积的LPH01和分子量＞10KDa的亚组分(终浓度为1/4MIC、1/2MIC和1MIC)混合，在37℃下厌氧孵育48h。孵育结束后，培养液于4℃下，8000rpm离心10min，收集菌体。使用Trizol试剂法提取总RNA并进行浓度及纯度检测。按照cDNA逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转为cDNA，随后使用20μLPCR体系进行序列扩增。PCR反应条件为95℃预变性1min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，45个循环。实验采用2-△△Ct法计算表1中的目的基因的相对含量，16S RNA为内参基因。
表1引物序列
3结果与分析
3.1菌株LPH01发酵液抑菌物质分子量估算
结果如图8所示，经过超滤分级处理后的发酵液仍具有抗菌活性。其中分子量＞10KDa的发酵液的得率最高(52.87％)，其次是分子量3-10KDa和＜3KDa的发酵液，其得率分别为26.97％和9.90％。通过将不同分子量的发酵液亚组分复溶至原体系，测定其对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果。结果发现，当菌株LPH01发酵液浓度为25mg/mL时，分子量＞10KDa的抑菌效果与未分级处理的发酵液抑菌效果无显著差异，且抑菌效果显著，其最小抑菌浓度为12.5mg/mL。由此可见，菌株LPH01发酵液抑菌物质的分子量在大于10KDa。
3.2菌株LPH01发酵液抑菌物质对痤疮丙酸杆菌降解甘油三酯能力的影响
皮脂主要有甘油三酯，甘油酯，角鲨烯以及其他的胆固醇类等组成，其中甘油三酯的含量最高，大概能占到50％左右。甘油三酯能够被痤疮丙酸杆菌等细菌分解，并生成大量的游离脂肪酸，进一步刺激毛囊及周围产生炎症的反应，从而导致痤疮。因此，以痤疮丙酸杆菌作为指示菌，探究菌株LPH01发酵液抑菌物质对痤疮丙酸杆菌降解甘油三酯能力的影响。实验结果如图9所示，与对照组相比，1/2-2MIC的菌株LPH01发酵液和＞10KDa的亚组分可显著抑制痤疮丙酸杆菌对甘油三酯的降解(p<0.05)。而用1/4MIC的菌株LPH01发酵液和＞10KDa的亚组分处理痤疮丙酸杆菌后，甘油三酯降解率与对照组相比差异无统计学意义(p>0.05)。结果表明，菌株LPH01发酵液和＞10KDa的亚组分可抑制痤疮丙酸杆菌的生长，进一步抑制甘油三酯的转化，减少游离脂肪酸的生成，缓解炎症损伤。
3.3菌株LPH01发酵液抑菌物质对细胞外脂肪酶基因的定量分析
痤疮丙酸杆菌脂肪酶被认为是参与痤疮发病机制的毒力因子之一，可改变人体皮肤脂质成分，诱导痤疮丙酸杆菌的定植和痤疮的发生。脂肪酶可将皮脂中的甘油三脂分解为甘油和游离脂肪酸。脂肪酸对皮脂腺毛囊细胞具有高度的炎症性、趋化性和刺激性。因此，抑制脂肪酶相关基因的表达对于改善痤疮是至关重要的。通过qRT-PCR检测了LPH01发酵液和＞10KDa亚组分作用下，痤疮丙酸杆菌脂肪酶相关基因(GehA、PPA2105、PPA1761和PPA1796)的表达水平。结果如图10所示，在浓度为1/4MIC-1MIC时，菌株LPH01发酵液和＞10KDa的亚组分可显著抑制GehA、PPA2105、PPA1761和PPA1796基因的表达，与对照组相比差异具有统计学意义(p<0.05)。这一发现表明，LPH01发酵液和＞10KDa亚组分可以有效抑制痤疮丙酸杆菌脂肪酶相关基因的表达，从而减少痤疮丙酸杆菌的定植和炎症的发生。
总之，本发明阐明了副干酪乳酪杆菌LPH01对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性和机制，并对抑菌物质进行了初步探究。结果表明，副干酪乳酪杆菌LPH01具有明显的抗菌活性，其发酵液抑菌活性成分具有耐热、耐酸，且对蛋白酶不敏感的特性。通过对菌株LPH01发酵液进行超滤分级处理后，分子量在＞10KDa的抑菌效果最佳。此外，菌株LPH01发酵液表现出抗甘油三酯降解和抑制脂肪酶相关毒力因子基因表达的能力。因此，在食品和制药工业中，菌株LPH01可能是天然抗菌剂，并具有一定的改善寻常痤疮的作用。
应用例
应用例1、利用副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液制备面膜精华液
称取0.05g EDTA二钠、4g甘油、4g丁二醇、0.2g透明质酸钠、0.5g烟酰胺、0.5g对羟基苯乙酮、5g副干酪乳杆菌LPH01发酵液冻干粉和适量水，按照一定比例加入搅拌，并在水浴搅拌下加入0.3g卡波姆，直至透明，制得面膜精华液(100g)，祛痘面膜载体选取生物纤维和天丝纤维。
应用例2、利用副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液制备祛痘霜
称取5.0g凡士林、4.0g十八醇、1.5g单甘脂、3.0g石腊油和0.5g十二烷基硫酸钠，加入适量的蒸馏水中，加热至80℃以上，搅拌使溶解，放凉后再加入2.5g甘油、5g副干酪乳杆菌LPH01发酵液冻干粉和适量香料，搅拌均匀后即成为O/W型的祛痘霜制剂(100g)。
应用例3、利用副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液制备祛痘精华液
称取0.3g对羟基苯乙酮、0.2g苯氧乙醇、0.5g己二醇、2％丁二醇、0.02gEDTA二钠、0.1g卡波姆、0.1g尿囊素、0.2g氨甲基丙醇、5g副干酪乳杆菌LPH01发酵液冻干粉和适量水配制而成祛痘精华液(100g)。
应用例4、利用副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液制备痘痘贴
称取15g氢化粘性树脂、20g热塑性弹性体、5g副干酪乳杆菌LPH01发酵液冻干粉、5gβ-烟酰胺单核苷酸、5g蒸馏薄荷精油、5g白千层精油、5g远红外矿粉和10g羧甲基纤维素钠，制备成祛痘水胶体，最后将所得的产品进行裁切、压痕、模切和包装处理，最终得到制备完成的痘痘贴。
应用例5、利用副干酪乳酪杆菌LPH01发酵液制备祛痘洁面乳
称取5g脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、3g椰子油酰胺丙基甜菜碱、15g烷基糖苷、1g乙二醇二硬脂酸、0.2g尿囊素、0.2g乙二胺四乙酸二钠、0.4g库拉索芦荟凝胶冻干、2g二甲基二烯丙基氯化铵、5g副干酪乳杆菌LPH01发酵液冻干粉和少量防腐剂、适量香精和水配制而成祛痘洁面乳(100g)。
以上所述，仅为本发明的具体实施例，但本发明的特征并不局限于此，任何熟悉该项技术的人在本发明领域内，可轻易想到的变化或修饰，都应涵盖在本发明的申请专利范围中。
Claims (10)
1.一株副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)LPH01，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 20231510。
2.一种菌剂，其活性成分包含权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌
(Lacticaseibacillus paracasei)LPH01或其发酵液。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为冷冻干燥粉剂。
4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂是通过将权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌发酵得到的发酵液经超滤分级得到的。
5.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于：所述发酵液的制备方法为：将活化后的菌种接种至液体培养基中，30～37℃下培养至对数期后，离心收集发酵上清液，即得。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述培养基为MRS液体培养基。
7.权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)LPH01或权利要求2所述的菌剂在制备抑制痤疮丙酸杆菌的产品中的应用。
8.权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)LPH01或权利要求2所述的菌剂在制备用于预防和/或治疗痤疮的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述产品为药品或护肤品。
10.一种产品，所述产品用于抑制痤疮丙酸杆菌或者用于预防和/或治疗痤疮，其特征在于：所述产品的活性成分包含权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)LPH01或权利要求2所述的菌剂；所述产品为药品或护肤品。
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