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CN114657107B - 一株具有治疗痤疮作用的植物乳植杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有治疗痤疮作用的植物乳植杆菌及其应用 Download PDF

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CN114657107B CN202210423132.XA CN202210423132A CN114657107B CN 114657107 B CN114657107 B CN 114657107B CN 202210423132 A CN202210423132 A CN 202210423132A CN 114657107 B CN114657107 B CN 114657107B
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Abstract

本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有治疗痤疮作用的植物乳植杆菌及其应用。所述植物乳植杆菌分离自婴儿新鲜粪便，其保藏号为CCTCC NO：M2021683，对痤疮丙酸杆菌的生长有明显的抑制作用，能有效改善皮肤健康状况，预防及缓解痤疮症状。以所述植物乳植杆菌裂解液为唯一功效成分制备的净痘精华霜，经人体试验证实能有效改善轻中度痤疮，减小痤疮面积和皮肤油脂含量，降低经皮水分流水以及增加皮肤水分含量，使皮肤颜色趋于正常，毛孔变细，平衡皮肤酸碱度。所述植物乳植杆菌对机体无毒害作用，可以添加在护肤品中，用于预防和治疗痤疮，具有广阔的应用前景。

Description

一株具有治疗痤疮作用的植物乳植杆菌及其应用
技术领域
本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有治疗痤疮作用的植物乳植杆菌及其应用。
背景技术
痤疮是一种慢性炎症性损容性皮肤病，常发于青少年。痤疮发生后常出现色素沉着、毛孔粗大甚至形成瘢痕，给患者的容貌及心理带来巨大压力。研究发现，性激素分泌紊乱和皮脂腺内痤疮丙酸杆菌大量繁殖，皮脂腺导管异常角化以及皮脂大量分泌等都会导致痤疮发生。目前痤疮治疗方法包括光疗法、外用抗生素或激素药膏和口服中药等。现有治疗手段有的效果有限，有的治疗周期长，加之患者本身不重视等使痤疮恶化发展，严重影响患者的生活质量，给患者带来巨大的精神压力。因此，寻找一种简单、经济、有效的痤疮治疗方案对痤疮患者来说具有重要意义。
皮肤是人体的第一大器官，也是隔离人体内环境和外环境的第一道屏障。人类皮肤上的微生物大约有104～109个/cm2,根据其定殖时间的长短可分为常驻菌群和暂住菌群。常驻菌群可以视为皮肤的核心菌群，其长期定植于个体皮肤，已经完全适应皮肤环境，并且对皮肤环境产生依赖，这类菌群对皮肤的影响较为直接。毛囊和皮脂腺是皮肤微生物的主要寄居场所，研究也发现皮肤微生物的定植场所已不仅仅是皮肤表层，真皮层向内扩展也发现了常驻菌群的踪迹。
世界卫生组织/联合国粮农组织将益生菌定义为：活的微生物，当施以足够数量时能够对宿主带来健康益处。益生菌及其代谢物已被证明可与肠道相关淋巴组织存在相互作用，这种互动在帮助免疫系统应对病原体或过敏原或共生细菌方面至关重要。
以乳杆菌和双歧杆菌为代表的益生菌不仅具有抑制病原菌生长繁殖的能力，同时还具备提高宿主自身免疫力增强宿主对致病菌侵袭抵抗的能力。因此益生菌作为新一代的皮肤病抗菌生物制剂，已经具备替代抗生素疗法的潜力，弥补抗生素、激素药物治疗带来耐药性增加、复发率高等缺点。据报道，益生菌可抑制上皮细胞和角质形成细胞中的细胞因子IL-8，可以减少痤疮丙酸杆菌产生的炎症介质并减少血管扩张、水肿、肥大细胞脱颗粒和TNF-α释放。对于成人痤疮，一项2期临床试验报告表明，使用局部益生菌喷雾能够显著降低痤疮的严重程度和炎症损伤。另有研究也报导了痤疮患者使用局部益生菌喷雾带来的皮肤相关改善。因此，使用益生菌制剂作为有效成分防治痤疮成为近年来的研究热点，开发具有防治痤疮功效的益生菌株具有重要的社会效益和经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)及其应用，所提供的植物乳植杆菌分离自婴儿新鲜粪便，能够减轻皮肤炎症，改善皮肤健康状况，预防及缓解痤疮症状。
本发明所提供的植物乳植杆菌，为植物乳植杆菌VHProbi V22(Lactiplantibacillus plantarum VHProbi V22)，已于2021年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），其保藏编号为CCTCC NO：M2021683。
所述植物乳植杆菌VHProbi V22株，其16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。
本发明所提供的植物乳植杆菌VHProbi V22株，其MALDI-TOF核糖体蛋白分子量图谱如图3所示；其Riboprinter指纹图谱如图4所示；其RAPD指纹图谱如图5所示；rep-PCR指纹图谱如图6所示。
本发明所提供的植物乳植杆菌可用于制备功能性食品、保健品、药品或护肤品。
本发明提供的植物乳植杆菌可用于制备具有抗氧化功能的制品；
本发明提供的植物乳植杆菌可用于制备预防或治疗痤疮的制品。
所述制品为护肤品或功能性食品、药品、保健品。
本发明还提供了一种用于预防或治疗痤疮的制品，其中包含有植物乳植杆菌VHProbi V22株的活菌和/或其发酵产物。
本发明还提供了一种用于预防或治疗痤疮的制品，其中包含有植物乳植杆菌VHProbi V22株的裂解液。
本发明筛选获得的植物乳植杆菌VHProbi V22对人工肠胃液的耐受性强，对红霉素和氨苄西林等常见的抗生素敏感；该菌株在15℃下能正常生长，在45℃下不生长，最大耐受盐浓度为7％，能够发酵葡萄糖产酸不产气。植物乳植杆菌VHProbi V22抗氧化能力强，其发酵上清液抗脂质过氧化抑制率为52.94％，对 DPPH的清除率达到37.98％。该菌株能有效降解胆固醇，降解率达到29.61％。该菌株对皮肤细胞具有较强的黏附力，为2.75。
本发明的植物乳植杆菌VHProbi V22对痤疮丙酸杆菌的生长有明显的抑制作用，抑菌圈平均直径为26.33±0.58mm。申请人以植物乳植杆菌VHProbi V22 裂解液为唯一功效成分制备的净痘精华霜，经人体试验证实能有效改善轻中度痤疮，减小痤疮面积和皮肤油脂含量，降低经皮水分流水以及增加皮肤水分含量，使皮肤颜色趋于正常，毛孔变细，平衡皮肤酸碱度。中轻度痤疮受试者在使用净痘精华霜4周后，70％的受试者的Visia-CR青春痘面积占比减少，其中78.6％受试者的Visia-CR青春痘面积减少了50％；85％的受试者经皮水分流失速率降低，其中35.3％的受试者经皮水分流失速率降低40％以上；80％的受试者皮肤油脂含量出现下降。从而说明，植物乳植杆菌VHProbi V22裂解液在改善轻中度痤疮患者皮肤上效果明显，能达到控油祛痘的功效。
本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V22，对机体无毒害作用，可以添加在护肤品中，用于预防和治疗痤疮，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为V22菌株单菌落照片；
图2为V22菌株API 50CH试验结果图；
图3为V22菌株MALDI-TOF核糖体蛋白指纹图谱；
图4为V22菌株Riboprinter指纹图谱；
图5为V22菌株的RAPD指纹图谱；
图6为V22菌株的rep-PCR指纹图谱；
图7为V22菌株与痤疮丙酸杆菌共凝集试验结果图；
图8为V22菌株抗痤疮丙酸杆菌抑菌试验结果图；
图9为受试者面部痤疮改善例图。
具体实施方式
本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V22符合法规要求，经多相分类学鉴定，植物乳植杆菌VHProbi V22为一株新发现的菌株。本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V22能够有效预防和缓解轻中度痤疮，单独使用该菌株且无需与益生元和/或其它益生菌复配即可对痤疮有缓解功效；具有重要的应用价值。
申请人于2021年6月7日将所述植物乳植杆菌VHProbi V22保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021683。
本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。
实施例1植物乳植杆菌VHProbi V22的分离筛选
1、初筛
配制MRS琼脂培养基调pH 6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。
取1g新鲜婴儿粪便，取样过程遵循生物取样的伦理标准。经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μL混匀液梯度稀释，涂布于MRS琼脂培养基后于37℃厌氧培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出25株潜在乳酸杆菌，分别命名为V01、V02、……、 V20、V21、V22、V23、V24、V25。
2、复筛
配制1L的MRS液体培养基121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后加入 3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中水浴1h制成耐酸性培养基。
将筛选得到的25株乳酸杆菌V01、V02、……、V20、V21、V22、V23、 V24、V25按6％接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃条件下厌氧静置培养48h，取发酵液进行菌量计数。
结果显示，V22菌株经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，对数值高达8.22Log CFU/mL。从而说明V22菌株耐酸能力最高。
实施例2菌株鉴定
1、菌落形态鉴定
将V22菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h。菌落形态如图1所示，V22单菌落呈白色，菌落直径在1-2mm左右，表面湿润光滑呈圆形。
2、生理生化特性鉴定
本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜V22菌液， 5000rpm/min离心5min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重菌体后稀释50倍，作为接种液。
2.1、温度耐受性试验
取适量新鲜菌液(24h，37℃)，5000rpm离心5min，用PSP溶液洗一次，再用同体积PSP溶液重悬后稀释50倍，作为接种液。
将接种液按10％的接种量接种到10mL MRS液体培养基中，不接菌的5mL MRS液体培养基作为对照，分别置于15℃恒温培养箱培养7天，45℃恒温培养箱培养2天，观察菌液是否变浑浊。
结果显示，V22菌株在15℃大量繁殖，45℃不生长。
2.2、碳源代谢试验
利用API 50CH试剂条对V22菌株进行碳源代谢实验，实验方法及结果判读具体参见API 50CH试剂盒说明书。V22菌株鉴定结果为：％ID＝99且T值＝0.97，API结果为植物乳植杆菌，鉴定评语为好的鉴定，碳源代谢结果如图2 所示。
2.3、盐度耐受性试验
在无菌条件下，向96孔板中分别加入190μL盐浓度为1％、2％、3％、4％、 5％、6％、7％、8％的BSM液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入 10μL接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μL高压灭菌过的石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养，观察培养基是否变浑浊。
结果显示，V22菌株最大耐受盐浓度为7％。
2.4、葡萄糖产酸产气试验
本实施例中所用的培养基配方如下：
蛋白胨0.5g；酵母提取物0.3g；吐温80 0.1mL；盐溶液A 0.5mL；盐溶液 B 0.5mL；乙酸钠0.5g；葡萄糖2.5g；2％溴甲酚绿(w/v)0.05mL；蒸馏水100mL； pH6.8～7.0。
将配制好的培养基分装至含有倒置小试管的大试管中，3mL/管，121℃，高压灭菌15min。
盐溶液A成分：KH2PO4 10g、K2HPO4 1.0g，溶于蒸馏水，定容至100mL。
盐溶液B成分：MgSO4·7H2O 11.5g、MnSO4·2H2O 2.4g、FeSO4·7H2O 0.68g，溶于蒸馏水，定容至100mL。
在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种培养基，不接菌的培养基作为对照，然后用2mL无菌液体石蜡封住顶部，置于37℃培养24h,观察培养基颜色有无变化。
结果显示：37℃培养24h后，培养基由绿色变为黄色，小倒管内无气体，说明V22菌株发酵葡萄糖产酸，不产气。
3、分子生物学鉴定
3.1 16s rDNA基因序列分析
3.1.1、基因组DNA提取
参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作。
3.1.2、16s rDNA基因扩增
引物序列：
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。
通过测序获得V22菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，并将该序列在NCBI 数据库中进行比对，初步确定V22菌株为植物乳植杆菌。
3.2 Riboprinter指纹图谱
用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入Riboprinter系统中，样品经过DNA制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，V22菌株为植物乳植杆菌，其 Riboprinter指纹图谱结果见图3。
3.3 MALDI-TOF-MS检测菌株核糖体蛋白表达
按照0.1％的接种量在MRS液体培养基中接种新鲜菌液，37℃，150rpm培养48h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μL裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μL基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品中蛋白质电离，离子在10～20KV电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同检测蛋白质的分子量。利用 Autofms 1000分析软件Autof Analyzer v1.0获取蛋白指纹图谱，V22菌株主要核糖体蛋白的离子峰为：m/z5204.361、7891.650、3946.735、5373.481、7875.818、3938.509、2603.241、2595.273、4748.037、7859.458。鉴定结果如图4所示。
3.4 RAPD和rep-PCR指纹图谱鉴定
3.4.1、RAPD指纹图谱鉴定
1)引物序列：GAGGGTGGCGGTTCT。
2)RAPD反应体系
表1：RAPD反应体系表
3)电泳
制备1.5％的琼脂糖凝胶板，DL2000 DNA Marker作为结果对照，稳压 100V电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。V22菌株的RAPD指纹图谱如图5所示。
3.4.2、rep-PCR指纹图谱
1)引物序列：CTACGGCAAGGCGACGCTGACG。
2)rep-PCR的反应体系
表2：rep-PCR的反应体系表
3)电泳
DL2000 DNA Marker作为结果对照。电压100V，电泳时间80min检测扩增结果。V22菌株的的rep-PCR指纹图谱如图6所示。
3.5全基因组测序
取新鲜V22菌液按照1％的体积比例接种到500mL MRS肉汤培养基中， 37℃培养20h，8000rpm离心10min，收集菌体。菌体送到测序中心，得到该菌的全基因组序列。将全基因组序列上传至NCBI基因数据库，GenBank登录号为CP095386-CP095389。
综上，将V22菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.htmL，同时结合文献De Clerck E，etal.Systematic and applied microbiology,2004,27(1)50公布的结果，进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，V22菌株为一株新的植物乳植杆菌，将其命名为植物乳植杆菌VHProbi V22。
申请人于2021年6月7日将所述植物乳植杆菌VHProbi V22(Lactiplantibacillus plantarum VHProbi V22)保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021683。
实施例3植物乳植杆菌VHProbi V22的抗生素耐受性实验
1、抗生素配制：氨苄青霉素、克林霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、万古霉素均配制成2048μg/mL的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用BMS液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为 1～1024μg/mL共11个梯度。
2、接种液制备：接种液的准备：取适量新鲜菌液(24～48h，40℃培养)， 5000rpm离心5min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。
3、微量肉汤稀释法测定抗生素对植物乳植杆菌VHProbi V22的最小抑菌浓度MIC。
a.96孔板第1列次加入不含抗生素的BMS液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μL含不同浓度抗生素的BMS液体培养基，然后分别接种10μL上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。
b.加入50μL石蜡油覆盖防止水分蒸发。
c.将96孔板于40℃振荡培养48h后取出，测定OD600值，用48h的结果统计抗生素对菌株的MIC值，具体结果见表3。
表3：植物乳植杆菌VHProbi V22的抗生素MIC值表
MIC单位μg/mL
从表3的结果可以看出，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V22对红霉素和氨苄西林等常见抗生素敏感，生物安全性良好。
实施例4植物乳植杆菌VHProbi V22对人工胃液和人工肠液的耐受性试验
1、人工胃液的配制
分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000mL 蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
2、人工肠液的配制
分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH2PO4 6.8g和牛胆盐 3.0g，加入77mL的0.2mol/L的NaOH溶液，定容至1000mL，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调pH6.8±0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
3、试验方法
取2mL新鲜菌液，5000rpm/min离心5min收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2mL生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到24mL 人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm/min)3h，取样1mL，检测活菌量。
活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，该菌株经过人工肠液消化后的活菌量(Log CFU/mL)见表4。
表4：人工胃肠液消化后的活菌量表
从表4可知，本发明筛选到的植物乳植杆菌VHProbi V22经人工肠胃液消化后，活菌量有少量上升，说明该菌株能耐受人工胃肠液，并能萌发。
实施例5植物乳植杆菌VHProbi V22抗氧化功能测定
1、菌株清除DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)
取1mL待测菌株的PBS菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长 517nm处的吸光度A样本，测3次平行。对照组样品以等体积PBS溶液和 DPPH·乙醇混合液，并以等体积PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率％＝[1-(A样品-A空白)/A对照]×100％。结果见表5。
表5：DPPH自由基清除率表
2、菌株抗脂质过氧化实验鉴定
亚油酸乳化液的制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween 20，19.7mL去离子水。 0.5mL的PBS溶液(pH 7.4)中加入1mL亚油酸的乳化液，1mLFeSO4(1％)，再加入0.5mL样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2mL TCA(4％)，2mL TBA (0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000rpm/min离心15min，收集上清液在532nm下测吸光度即为A；对照组以0.5mL蒸馏水代替样品即为A0。抑制率/％＝(A0－A)/A0×100％
注：A为样品组吸光度；A0为对照组吸光度，结果见表6。
表6：抗脂质过氧化抑制率表
实施例6植物乳植杆菌VHProbi V22体外胆固醇降解实验
1.胆固醇胶束溶液的配制：准确称取1g胆固醇，溶于无水乙醇中，并定容至100mL，在无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
2.称取蛋白胨10.0g牛肉膏10.0g酵母膏5.0g柠檬酸氢二铵2.0g葡萄糖 20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g,硫酸镁0.1g,硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾 2.0g,胆盐1g，蒸馏水1000mL调节pH值7.3，115℃灭菌30min，然后加入胆固醇溶液使胆固醇终浓度为0.1％。按照0.1％的接种量接种新鲜菌液，37℃静止培养48h，然后取0.2mL菌液，加入1.8mL无水乙醇，混匀，静止10分钟，3000 转离心5分钟，取上清液用于测定胆固醇含量。胆固醇测定方法按照GB/T5009.128-2003<食品中胆固醇的测定>。
结果显示：本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V22对胆固醇的降解率达到29.61％(此为不含胆盐的数据)。
实施例7植物乳植杆菌VHProbi V22的Caco-2细胞黏附力试验
Caco-2细胞以2×106cells/孔的接种量接种于六孔板，二氧化碳培养箱培养24h，用于细胞粘附实验；
将稳定期的菌株用MRS培养基重悬至5×107CFU/mL；
取1mL上述菌株加入已有细胞贴壁的六孔板，二氧化碳培养箱培养2h；
PBS反复洗涤3次，去除未粘附的细菌；
加入500ul胰酶消化3分钟，再加入1.5mL细胞培养液终止消化，反复吹打，并将所得溶液收集至无菌EP管中，并将收集的溶液进行10倍，100倍，1000 倍，10000倍梯度稀释，涂板计数。同时对空白组的细胞进行计数。根据以下公式计算供试菌株的粘附能力：
粘附能力(CFU/cells)＝每个培养孔内粘附的细菌总数/每个培养孔的总细胞数。
结果显示：本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V22的细胞黏附力为2.75，标准差为0.32。
实施例8植物乳植杆菌VHProbi V22抑制致病菌试验
1.凝集试验
取冷冻保藏的植物乳植杆菌VHProbi V22无菌操作划线至MRS平板，37℃培养48～72h。将痤疮丙酸杆菌ATCC6919和痤疮丙酸杆菌ATCC11827接种至 BHI肉汤培养基，37℃厌氧培养3～4d。
取适量上述活化好的植物乳植杆菌和痤疮丙酸杆菌新鲜菌液，6000rpm离心4min，浓缩适合的倍数用tris盐缓冲液洗2次，然后用同种缓冲液重悬。
取植物乳植杆菌菌悬液300μL加入24孔酶标板，再加入300μL痤疮丙酸杆菌混合悬液作为实验组，另取等量的植物乳植杆菌菌悬液和缓冲液混合作为对照组，每个对照及样本设2平行。将24孔板置于微孔板恒温振荡器，400rpm，室温振荡孵育至少24h。期间每振荡30min停机30min，拍照记录初始孔板状态及每次停机时的孔板状态，观察是否有凝集现象出现。
结果显示：植物乳植杆菌VHProbi V22与痤疮丙酸杆菌共孵育至18h后出现交互凝集现象，结果如附图7所示。结果表明植物乳植杆菌VHProbi V22能有效抑制痤疮丙酸杆菌的生长，拮抗效果显著。
2.抑菌圈试验
取冷冻保藏的乳酸菌甘油管，无菌操作，划线至MRS平板，37℃培养48～72h。待平板长出单菌落后，无菌下挑至MRS肉汤，37℃静置培养24h。取1mL菌液 5000rpm离心5min得菌泥，用无菌水漂洗2次菌泥，再用2mL无菌的1％蛋白胨溶液复溶待用。将痤疮丙酸杆菌ATCC11827和痤疮丙酸杆菌ATCC6919，接种至强化梭菌培养基，37℃，厌氧培养48h。
铺下层培养基，配置1.5％的琼脂溶液，灭菌后倒入平板中，铺满平板即可。待琼脂凝固后，均匀放置适宜个数的无菌牛津杯。铺上层培养基，上层半固体培养基：强化梭菌培养基加入0.7％琼脂和1％吐温-80，之后稍微加热使吐温-80溶解。121℃灭菌15min，待冷却至不烫手备用(45℃左右)。
将培养48h的2株痤疮丙酸杆菌等量混合，充分混匀后取0.4％(v/v)加入上层半固体培养基中，混匀后，取14mL倾注到下层培养基上。待凝固后取出牛津杯，并在平板底部标记加入的样品。取100uL菌体+蛋白胨溶液加入孔中，另加入1％蛋白胨溶液做对照。抑菌结果观察。培养72h以后，取出平板，观察有无抑菌圈，拍照并用直尺测量抑菌圈的大小。
结果显示平板均出现抑菌圈，如图8所示，抑菌圈平均直径为26.33±0.58 mm。结果表明植物乳植杆菌VHProbi V22能明显抑制痤疮丙酸痤疮杆菌的生长，效果显著。
实施例9植物乳植杆菌VHProbi V22裂解液抗痘功效试验
1.1植物乳植杆菌VHProbi V22裂解液制备
植物乳植杆菌VHProbi V22使用MRS肉汤培养至对数期；按照1％的接种量将活化好的菌株加入培养基(红糖2％，骨胶原蛋白肽3％，酵母粉0.3％，磷酸氢二胺0.25％)中，37℃静置发酵24h；冰浴收集菌体，超声破壁30min，离心取上清液；将上清液75℃，加热15min，进行热灭活，得到裂解液。
1.2乳酸菌净痘精华霜的制备：
参照表7所述配方，使用去离子水配制乳酸菌净痘精华霜。植物乳植杆菌 VHProbiV22裂解液是乳酸菌净痘精华霜中唯一的功效组分，其含量为8％。
表7：乳酸菌抗痘精华霜配方表
2、人群试验方案
选择18～25周岁且脸部有轻度或中度痤疮的健康受试者20名。受试者每日早晚洁面后使用乳酸菌净痘精华霜，共持续4周。并且分别在使用产品前、连续使用产品1周、2周、3周、4周时拍摄圈梁照片，分别在使用产品前、连续使用产品2周、4周时检测角质层水分含量、经皮水分流失速率、皮肤油脂含量和皮肤酸碱度。本次试验的环境温度为20.4℃～21.5℃，相对湿度为47.7％～51.9％。
3、样本完成情况
3.1纳入标准：
3.1.1健康人群，年龄在18～45岁
3.1.2左右脸部都伴有轻度或中度的痤疮
3.1.3能很好配合试验者，在研究期间能保持生活的规律性
3.1.4能够阅读和理解知情同意书的所有内容，并自愿签署知情同意书
3.1.5试验期间同意不使用任何对结果有影响的化妆品、药物和保健品
3.2排除标准，凡具有下列任一条件的患者必须排除进入本项研究：
3.2.1面部有皮肤疾病而可能影响对试验结果判断者
3.2.2有高度过敏体质者
3.2.3妊娠、哺乳或在试验期间打算怀孕的女性者
3.2.4有严重心、肝、肾功能损害及严重免疫功能低下者
3.2.5有精神疾病、严重内分泌疾病者以及口服避孕药者
3.2.6 30天内参加药物临床试验者或其它试验者，或近1周内有系统用对试验结果有影响的药物者
3.2.7 14天内有口服和外用可能对试验结果有影响的美容产品者
3.2.8不能配合试验者
3.2.9研究者认为不适于参加本研究者
3.2.10其他相应的排除标准
表8：受试者信息表
序号 性别 年龄 是否完成试验 是否纳入统计
S001 男 22 是 是
S002 男 20 是 是
S003 女 18 是 是
S004 女 19 是 是
S005 女 23 是 是
S006 女 18 是 是
S007 男 20 是 是
S008 女 19 是 是
S009 女 23 是 是
S010 男 19 是 是
S011 女 20 是 是
S012 男 24 是 是
S013 男 22 是 是
S014 女 20 是 是
S015 男 23 是 是
S016 男 19 是 是
S017 男 19 是 是
S018 男 21 是 是
S019 女 21 是 是
S020 女 22 是 是
4、试验流程
1)受试者面部清洁并用纸巾吸干水分后，在21±1℃、相对湿度50±10％的功效评价室中静坐20min；
2)技术人员操作CK-MPA、Visia-CR两台仪器对受试者的受试部位进行基础值指标的测定。
5、统计方法
统计分析软件为SPSS。在不同时间点的测量值与基础值比较，采用重复测量方差分析，检验水准α＝0.05。
改善率即相对使用前的变化率，计算公式如下：
使用产品1周的△1＝W1-W0；
使用产品2周的△2＝W2-W0；
使用产品3周的△3＝W3-W0；
使用产品4周的△4＝W4-W0；
使用产品1周的改善率＝△1/W0*100％；
使用产品2周的改善率＝△2/W0*100％；
使用产品3周的改善率＝△3/W0*100％；
使用产品4周的改善率＝△4/W0*100％。
其中，W0——受试区使用产品前皮肤参数基础值；
W1——受试区使用产品1周皮肤参数值；
W2——受试区使用产品2周皮肤参数值；
W3——受试区使用产品3周皮肤参数值；
W4——受试区使用产品4周皮肤参数值；
6、检测结果
6.1青春痘占比面积检测结果
表9：青春痘占比面积检测结果表
表10：Visia-CR青春痘面积占比统计分析结果表
*显著性标注方法：“n.s.”表示无统计学差异，P≥0.05；P<0.05表示有显著性差异(“*”表示0.01≤P<0.05；“**”表示0.001≤P<0.01；“***”表示P<0.001)
青春痘面积占比越小，发红症状越不明显。受试者的青春痘面积占比在使用产品4周后与基础值相比有显著性下降(P<0.01)，70.0％的受试者的Visia-CR 青春痘面积占比减少，其中78.6％受试者的Visia-CR青春痘面积减少了50％。受试者在4周内青春痘占比面积变化如图9所示。
6.2皮肤颜色测试结果
表11：皮肤颜色检测结果表
表12：皮肤颜色统计分析结果表
*显著性标注方法：“n.s.”表示无统计学差异，P≥0.05；P<0.05表示有显著性差异(“*”表示0.01≤P<0.05；“**”表示0.001≤P<0.01；“***”表示P<0.001)
皮肤颜色数值越小，发红症状越不明显。在使用产品4周后，受试者的皮肤颜色与基础值相比没有显著性差异。
6.3毛孔面积/AOI面积(mm2)试验结果
表13：毛孔面积/AOI面积(mm2)检测结果表
表14：毛孔面积/AOI面积(mm2)统计分析结果表
*显著性标注方法：“n.s.”表示无统计学差异，P≥0.05；P<0.05表示有显著性差异(“*”表示0.01≤P<0.05；“**”表示0.001≤P<0.01；“***”表示P<0.001)
毛孔面积/AOI面积(mm2)越小，毛孔数越少。受试者的毛孔面积/AOI面积 (mm2)在使用产品4周后与基础值相比，有40.0％受试者毛孔面积/AOI面积(mm2) 减小，但是不具有显著性差异。
6.4皮肤角质层水分含量试验结果
表15：皮肤角质层水分含量试验结果表
表16：皮肤角质层水分含量统计分析结果表
*显著性标注方法：“n.s.”表示无统计学差异，P≥0.05；P<0.05表示有显著性差异(“*”表示0.01≤P<0.05；“**”表示0.001≤P<0.01；“***”表示P<0.001)
皮肤角质层水分含量越高，皮肤皮肤含水量越多。有35.0％的受试者使用产品4周后与基础值相比皮肤角质层含水量增加，但是不具有显著性差异。
6.5经皮水分流失试验测试
表17经皮水分流失试验测试结果
表18经皮水分流失试验统计分析结果
*显著性标注方法：“n.s.”表示无统计学差异，P≥0.05；P<0.05表示有显著性差异(“*”表示0.01≤P<0.05；“**”表示0.001≤P<0.01；“***”表示P<0.001)
皮肤经皮水分流失数值越低，皮肤屏障功能越好。受试者的经皮水分流失使用产品4周后与基础值相比有显著性下降(P<0.001)。其中，有85.0％的受试者经皮水分流失速率降低，有35.3％的受试者经皮水分流失速率降低40％以上。
6.6油脂含量检测结果
表19油脂含量试验结果
表20油脂含量统计分析结果
*显著性标注方法：“n.s.”表示无统计学差异，P≥0.05；P<0.05表示有显著性差异(“*”表示0.01≤P<0.05；“**”表示0.001≤P<0.01；“***”表示P<0.001)
油脂含量数值越小，皮肤油脂含量越少。受试者在使用产品四周后皮肤油脂含量与基础值相比有显著性下降(P<0.05),其中有80％的受试者皮肤油脂含量出现下降。
6.7皮肤酸碱度平衡
表21酸碱度检测结果
表22酸碱度统计分析结果
正常皮肤呈弱酸性，pH在4.0-5.5之间。受试者在使用产品四周后与基础值相比有55.0％的受试者皮肤酸碱度出现下降，但是不具有显著性差异。
综上，中轻度痤疮受试者在使用乳酸菌净痘精华霜4周后，青春痘占比面积显著性减少，70％的受试者的Visia-CR青春痘面积占比减少，其中78.6％受试者的Visia-CR青春痘面积减少了50％；受试者的皮肤颜色和pH与基础值相比没有显著性差异；受试者的经皮水分流失速率显著性下降，其中，有85％的受试者经皮水分流失速率降低，有35.3％的受试者经皮水分流失速率降低40％以上；受试者皮肤油脂含量与基础值相比有显著性下降,其中有80％的受试者皮肤油脂含量出现下降。另外，受试者的毛孔面积/AOI面积(mm2)、皮肤角质层含水量、皮肤酸碱度与基础值相比也得到改善。从而说明，乳酸菌净痘精华霜能有效改善轻中度痤疮，减小痤疮面积和皮肤油脂含量，降低经皮水分流水以及增加皮肤水分含量，使皮肤颜色趋于正常，毛孔变细，平衡皮肤酸碱度。也进一步说明，净痘精华霜中的唯一功效成分植物乳植杆菌VHProbi V22裂解液在改善中轻度痤疮患者皮肤上效果明显，能达到控油祛痘的功效。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一株具有治疗痤疮作用的植物乳植杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1475
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agacaggtta acacgtgcta tacatgcagt cgaacgaact ctggtattga ttggtgcttg 60
catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 120
agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 180
ggtccgagtt tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc 240
tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga gagggtaatc 300
ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360
ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 420
taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat 480
ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540
cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 600
agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 660
cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 720
aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc 840
cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 900
aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 960
tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc 1020
cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact 1140
ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg 1260
agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac 1320
atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac 1440
cttttaggaa ccagccgcct aagtagactt tccgg 1475

Claims (3)

1.一种植物乳植杆菌，其特征在于，所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)的保藏编号为CCTCC NO：M2021683。
2.权利要求1所述的植物乳植杆菌的裂解液在制备预防或治疗痤疮的护肤品中的应用。
3.一种用于预防或治疗痤疮的护肤品，其特征在于，所述的护肤品中包含有权利要求1所述的植物乳植杆菌的裂解液。
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