CN117448182A - 一种产香酵母及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种产香酵母及其培养方法和应用，属于酵母菌技术领域。本发明提供的产香酵母为异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus M‑FY1，保藏编号为CGMCC No.28424，所述菌株能够在增加发酵产物香气成分的同时具有耐高糖能力、耐低温和耐SO₂能力，可作为产香酵母应用至果酒发酵中，能够为果酒的混菌发酵生产及开发提供新的发酵菌源。所述菌株能够增加45.46％的桑葚酒香气成分，菌株生产耐受性能较好，包括耐糖度40°Brix的耐高糖能力、耐16℃的耐低温能力和耐300mg/L SO₂的能力，具有广泛的应用前景。

Description

一种产香酵母及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及酵母菌技术领域，尤其涉及一种产香酵母及其培养方法和应用。

背景技术

果酒酿造是一个复杂的微生物学过程，酿造过程中微生物的代谢产物直接影响着酒的色泽、口感、香气以及果酒原料活性成分的保留。可以说，发酵菌剂的品质能够决定果酒的品质。实际工业生产中，发酵工艺、发酵设备等较容易调整优化，但发酵菌剂的性能受现有菌种的限制，往往不能实现优异效果。

高品质的果酒很大程度取决于其香气和口感，而香气的主要来源之一则是发酵过程中风味物质的产生，现有技术中的发酵菌剂在产香方面性能尚不能满足需求，导致生产的果酒具有酒体单薄、香气特征不明显、风格不突出等问题，影响果酒产品的品质。

中国专利CN113773975A公开了两株产香酵母，用于干白葡萄酒酿造，一株为非酿酒酵母葡萄汁有孢汉逊酵母，另一株为酿酒酵母，两株酵母以顺序接种发酵方式酿造的葡萄酒，具有更浓郁的橙花、玫瑰的花香和菠萝、苹果的果香，干白葡萄酒中的高级醇、酯类和萜烯类化合物都有显著增加，特别是促进了梨醇酯、丁内酯、橙花叔醇和肉桂酸乙酯的产生，有利于酿造出具有橙花和热带水果香气的干白葡萄酒。

实际生产中，由于发酵基料在糖度、温度等条件方面较为多变，现有的产香酵母很容易失去活性而不能发挥作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产香酵母及其培养方法和应用，能够在增加发酵产物香气成分的同时具有耐高糖能力、耐低温和耐SO₂能力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种产香酵母，所述产香酵母为异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus M-FY1，保藏编号为CGMCC No.28424。

本发明还提供了培养上述产香酵母的发酵培养基，所述发酵培养基为YPD培养基、YNB培养基、SD培养基、麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基或察氏培养基中的一种或几种。

本发明还提供了一种上述产香酵母的培养方法，包括以下步骤：

将异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus M-FY1接种至上发酵培养基中，进行培养，得到产香酵母发酵液。

优选的，所述培养的温度为20～35℃。

优选的，所述培养的转速为150～200r/min。

优选的，所述培养的时间在20h以上。

本发明还提供了通过上述培养方法得到的产香酵母发酵液。

本发明还提供了上述产香酵母或上述产香酵母发酵液在制备果酒发酵剂中的应用。

本发明还提供了一种果酒发酵剂，所述果酒发酵剂中包含上述产香酵母或上述产香酵母发酵液。

优选的，所述果酒发酵剂中还包含酿酒酵母。

本发明的有益效果：

本发明提供的异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus M-FY1，可作为产香酵母应用至果酒发酵中，能够为果酒的混菌发酵生产及开发提供新的发酵菌源。所述菌株能够增加45.46％的桑葚酒香气成分，菌株生产耐受性能较好，包括耐糖度40°Brix的耐高糖能力、耐16℃的耐低温能力和耐300mg/L SO₂的能力，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为M-FY1生长曲线图；

图2为ITS电泳胶图；

图3为发酵过程中桑椹汁发酵液失重情况统计图；

图4为发酵过程中桑椹汁发酵液可溶性固形物消耗情况统计图；

图5为M-FY1高糖耐受性检测结果统计图；

图6为M-FY1温度耐受性检测结果统计图；

图7为M-FY1 SO₂耐受性检测结果统计图。

生物保藏说明

异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus M-FY1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏日期为2023年09月14日，保藏编号为CGMCC No.28424。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将新鲜桑葚果实装入无菌塑料袋中手工粗破碎，将果浆转入发酵容器中，于16℃开始自然发酵。在果浆自然发酵过程中，每3天取1mL发酵液稀释至10^-4CFU～10^-6CFU，将上述浓度梯度的稀释液涂布于YPD培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)平板培养基上，于28℃下恒温倒置培养48小时；对照《酵母菌的特征及鉴定手册》对菌株进行初步分类鉴定挑选出菌落形态及颜色疑似酵母菌的单菌落，于28℃下在YPD平板培养基上划线纯化培养2-3代；挑取生长良好的疑似酵母菌纯培养物加入YPD液体培养基中，通过闻香法筛选出有特殊香气的酵母菌。在28℃、180rpm的条件下富集培养36小时，后于7000rpm的条件下离心收集菌体；将收集到的不同菌体分别加入200mL经200目尼龙滤布过滤后的桑葚汁中，在20℃下发酵7-12天，通过风味最终挑选出1株适于桑葚发酵的产香酵母菌株，保存并命名为M-FY1。

通过对菌株进行形态学观察以及5.8S rDNA基因序列测定及系统发育树同源性分析，最终鉴定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

菌株生长特性(生长曲线)：

在YPD液体培养基中接入2％的菌体，每隔3h测定吸光度值，以未接种的YPD做空白对照，采用紫外分光光度计法在600nm波长下测定M-FY 1的生长曲线，结果如图1所示。

分子鉴定：

(1)使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)进行DNA提取；

(2)PCR扩增：

设计真菌菌种鉴定通用引物：ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(如SEQ ID NO.1所示)，ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(如SEQ ID NO.2所示)为引物。

提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板，以擎科1×TSE101金牌mix进行扩增，扩增体系为：1×TSE101金牌mix，45μl；ITS1(10P)，2μl；ITS4(10P)，2μl；DNA模板，1μl。

按以下扩增程序扩增：

表1扩增程序

利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，扩增片段约为750bp左右，如图2所示，

M-FY1基因序列如下：

ITS1：

AGGATTAAAAATTGGCCGCGCTTATTGCGCGGCGATAAACCTTACACACATTGTCTAGTTTTTTTGAACTTTGCTTTGGGTGCATCAGCCTAGCTGCGTGCCCAAAGGTCTAAACACATTTTTTTAATGTTAAAACCTTTAACCAATAGTCATGAAAATTTTTAACAAAAATTAAAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACCCTCTGGTATTCCAGAGGGTATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTGTCAAGGGTTAACTTGAAATATTGACTTAGCAAGAGTGTACTAATAAGCAGTCTTTCTGAAATAATGTATTAGGTTCTTCCAACTCGTTATATCAGCTAGGCAGGTTTAGAAGTATTTTAGGCTCGGCTTAACAACAATAAACTAAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAAATGCCACCCCTACTT，如SEQ ID NO.3所示。

ITS4

GGAGTCAGGTGTATCCACCTGATTTGAGGTCAAACTTTTAGTTTATTGTTGTTAAGCCGAGCCTAAAATACTTCTAAACCTGCCTAGCTGATATAACGAGTTGGAAGAACCTAATACATTATTTCAGAAAGACTGCTTATTAGTACACTCTTGCTAAGTCAATATTTCAAGTTAACCCTTGACAGAGTATCACTCAATACCAAACCCGAAGGTTTGAGAGAGAAATGACGCTCAAACAGGCATACCCTCTGGAATACCAGAGGGTGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGAAAATCTGCAATTCACAATACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGTTGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAAGATTTTAATTTTTGTTAAAAATTTTCATGACTATTGGTTAAAGGTTTTAACATTAAAAAAATGTGTTTAGACCTTTGGGCACGCAGCTAGGCTGATGCACCCAAAGCAAAGTTCAAAAAAACTAGACAATGTGTGTAAGGTTTATCGCCGCGCAATTAAGCGCTGGCAATAGAATACTATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCCTACGGGAG，如SEQ ID NO.4所示。

将拼接好的序列在NCBI数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对，选择同源度最高的物种，比对结果显示M-FY1可确定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)或其同属。

菌株发酵验证：

挑选无腐烂，无坏果的新鲜桑葚果实，按0.12g/L的添加量将果胶酶加入果浆中，在25℃的环境中酶解、静置24小时；同时加入偏重亚硫酸钾，添加量为0.08g/L。

酵母培养液：在100mL无菌YPD液体培养基中，接入1环活化后的酵母菌株，于28℃、170rpm摇床培养40h。后将酵母培养液在离心力为6000g条件下，离心10min进行离心收集菌体；菌体收集后弃上清液，并用无菌水洗涤一次，后在离心力为6000g条件下，离心10min进行二次离心收集菌体。洗涤完成后将菌体重悬于无菌水中，调整酵母培养液浓度为10⁸个/10mL。

(1)将50mL调整浓度后的酵母培养液加入500mL处理后的桑葚汁混装入发酵罐中，设置发酵温度20℃进行发酵12d。

(2)将25mL调整浓度后的酵母培养液与25mL市售商用酿酒酵母DV10以1：1的比例同时加入500mL处理后的桑葚汁混装入发酵罐中，

依上述条件，采用市售商用酿酒酵母DV10(购自法国拉曼)重复制备设置对照组。酵母活化后，使用无菌水调整其浓度为10⁸个/10mL。将50mL调整后的酵母加入500mL处理后的桑葚汁混装入发酵罐中，设置发酵温度20℃进行发酵12d。

记录发酵过程中桑椹汁发酵液失重情况，如图3所示，记录发酵过程中桑椹汁发酵液可溶性固形物消耗情况如图4所示。

对发酵完成后桑椹汁发酵液香气成分含量进行检测，结果如下表2所示：

表2香气成分含量检测结果

结果显示，本发明提供的菌株M-FY1能够增加45.46％的桑葚酒香气成分，具有显著增加果酒风味的特性。

对菌株M-FY1的性能进行测定：

方法：种子液的制备M-FY1接种于YPD液体培养基中，28℃、150r/min培养至菌液浓度10⁷～10⁸CFU/mL。

(1)高糖耐受性测定将种子液以5％的接种量分别接种到糖浓度150、200、250、300、350、400g/L的YPD液体培养基中，28℃培养24h。以不接种菌的YPD液体培养基作为空白对照，测定其OD_600nm值，重复3次，结果如图5所示。

(2)温度耐受性测定将种子液以5％的接种量接种到YPD液体培养基中，分别在不同温度16、20、24、28℃下培养24h。以不接种菌的YPD液体培养基作为空白对照，测定其OD_600nm值，重复3次，结果如图6所示。

(3)SO₂耐受性测定将种子液以5％的接种量分别接种到含有SO₂浓度60、120、180、240、300mg/L的YPD液体培养基中，28℃培养24h。以不接种菌的YPD液体培养基作为空白对照，测定其OD_600nm值，重复3次，结果如图7所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种产香酵母，其特征在于，所述产香酵母为异常威克汉姆酵母Wickerhamomycesanomalus M-FY1，保藏编号为CGMCC No.28424。

2.培养权利要求1所述的产香酵母的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基为YPD培养基、YNB培养基、SD培养基、麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基或察氏培养基中的一种或几种。

3.一种权利要求1所述的产香酵母的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus M-FY1接种至权利要求2所述的发酵培养基中，进行培养，得到产香酵母发酵液。

4.根据权利要求3所述的产香酵母的培养方法，其特征在于，所述培养的温度为20～35℃。

5.根据权利要求3所述的产香酵母的培养方法，其特征在于，所述培养的转速为150～200r/min。

6.根据权利要求3所述的产香酵母的培养方法，其特征在于，所述培养的时间在20h以上。

7.通过权利要求3～6任一项所述的培养方法得到的产香酵母发酵液。

8.权利要求1所述的产香酵母或权利要求7所述产香酵母发酵液在制备果酒发酵剂中的应用。

9.一种果酒发酵剂，其特征在于，所述果酒发酵剂中包含权利要求1所述的产香酵母或权利要求7所述产香酵母发酵液。

10.根据权利要求9所述的果酒发酵剂，其特征在于，所述果酒发酵剂中还包含酿酒酵母。