CN111235307A - 一种发酵型红枣酒复合菌种制备及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
发明克服了现有技术存在的不足，提供了一种发酵型红枣酒复合菌种制备及其使用方法，制备适用于发酵型红枣酒的复合菌种，解决甲醇超标、残糖高、酸度高、风味单一等问题，并保持发酵型红枣酒产品丰富的营养价值，采用的技术方案为：一种发酵型红枣酒复合菌种制备及其使用方法，包括以下步骤：样品采集；自然发酵；菌种分离；鉴定；筛选；选择出符合条件的6种单一菌株，分别标号为H5、H7、H23、H56、H137、H258，将6种菌株按平均比例混合；发酵；得到红枣酒，且检测结果为：酒精度10％体积百分比，甲醇含量0.3～0.4g/L，总糖2～3g/L，挥发酸0.8～1.0g/L，异戊酸降低20％，酯类香气成分增加5种。
Description
技术领域
本发明一种发酵型红枣酒复合菌种制备及其使用方法，属于发酵酒制作工艺技术领域。
背景技术
我国拥有世界上95％以上的枣树资源和红枣加工产品，古今诸多文献记载，红枣具有丰富的营养价值和药用保健功能，是我国传统的“药食同源”果实类产品，几千年来，以红枣为主要原料的加工产品种类丰富，特色明显。发酵型红枣酒是以红枣为主要原料，通过添加菌种发酵而成的具有一定营养保健作用的低酒精度饮品，具有独特的红枣气味和发酵香气。
目前，传统发酵型红枣酒的制作方法如下：A.红枣提汁：按照红枣：水＝1：4比例加水，温度70℃～90℃，时间4小时；B.酶解：加果胶酶酶解增加出汁率；C.发酵：添加活性干酵母进行1-2次发酵；D.陈酿：18℃～20℃下储存6个月以上。其中，发酵使用的菌种基本上为商品化的通用型果酒用活性干酵母，原始菌种取自于其它水果品种，再经扩大培养后喷雾干燥制备而得。
由于使用的发酵菌种来自于其它水果，在以红枣汁为发酵底物的环境中，产生如下的缺陷：降解过多的果胶类物质，导致甲醇生成量较高，可达到0.8～1.0g/L，超出国家标准规定1倍以上；碳源利用率较低，残糖含量高，很难降到6g/L以下；产品风味单一，异戊醇等高级醇香气较突出，酯类香气中乙酸乙酯含量较高，气味较冲；酸度较高，适口性较差。
发明内容
本发明克服了现有技术存在的不足，提供了一种发酵型红枣酒复合菌种制备及其使用方法，制备适用于发酵型红枣酒的复合菌种，解决甲醇超标、残糖高、酸度高、风味单一等问题，并保持发酵型红枣酒产品丰富的营养价值。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种发酵型红枣酒复合菌种制备及其使用方法，包括以下步骤：
第一步：样品采集；
采集红枣样品，放入保鲜袋中；
第二步：自然发酵；
将采集的红枣样品放入发酵罐中，按重量比红枣：水＝1:1加入蒸馏水，放置25℃～30℃环境中自然发酵，分别于发酵开始计第2、5、8天进行发酵液提取；
第三步：菌种分离；
发酵液经梯度稀释后，稀释倍数为10-2,10-3,10-4，取0.2ml涂布于YEPD平板培养基，于28℃培养2～3d，选择具有典型酵母菌落特征的单菌落进一步划线分离，经镜检为纯种后分别移种单菌落于YEPD斜面上，于4℃冰箱中备用；
第四步：鉴定；
提取酵母菌的DNA进行酵母基因组PCR扩增，引物设计：26sF，5-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3序列；26sR，5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3序列，
取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序，用NCBIBlast程序将拼接后的序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，得到测序鉴定结果为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、季也蒙毕赤酵母属(Meyerozyma guilliermondii)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)和盔状毕赤酵母(Pichia galeiformis)；
第五步：筛选；
采用杜氏管发酵法进行一次筛选，对第三步分离出的单一菌株进行产气效果筛选，筛选指标为24小时内产气和48h内产气泡大小；采用枣汁发酵法进行二次筛选，筛选指标优先顺序为酒精度大于10％体积百分比≧甲醇小于0.4g/L≧残糖小于4g/L≧风味独特，选择出符合条件的6种单一菌株，分别标号为H5、H7、H23、H56、H137、H258，将6种菌株按平均比例混合；
第六步：发酵；
将混合菌种活化后分两次添加到灭菌后的红枣汁中，每次添加比例为红枣汁重量的1％，间隔时间为48小时，在22℃～28℃条件下发酵7天；
第七步：结果检测；
发酵48小时后，发酵液中活菌数为106CFU/mL,发酵96小时后，发酵液中活菌数为107CFU/m L；发酵结束后取上层澄清红枣酒进行检测，结果为：酒精度10％体积百分比，甲醇含量0.3～0.4g/L，总糖2～3g/L，挥发酸0.8～1.0g/L，异戊酸降低20％，酯类香气成分增加5种。
本发明与现有技术相比具有的有益效果是：使用本发明分离复配的菌种并采用相应的使用方法制作的红枣发酵酒，相比普通菌种具有明显的效果，具体为：酒精度可达10％以上，提高了20％；残糖含量4g/L以下，降低了40％；甲醇含量小于0.4g/L，降低了50％；挥发酸含量小于1.0g/L，降低了20％；异戊酸含量降低约20％；酯类香气成分数量增加5种。采用本发明提供的复合菌种酿制的发酵型红枣酒，具有典型的红枣发酵香气，醇正柔和，香气优雅，色泽饱满，安全且具有一定的营养价值。
具体实施方式
本发明从山西省临县具有近千年木枣生长历史的枣园中，采集红枣样品，经自然发酵后，自发酵液中分离出酵母菌株，经基因测序等现代分子生物学鉴定后，再通过三次筛选，选择表现良好的菌株，复配成复合酵母菌种，最后，添加到红枣汁中，制作出符合要求的发酵型红枣酒，其制备工艺流程如下：
样品采集→自然发酵→菌株分离→鉴定→筛选→发酵→结果检测。
本发明的关键点如下：
1、选择近千年枣树生长历史的枣园采集样品，此地的酵母菌种经过大自然长期的优胜劣汰，保留下来的菌种具有极强的生命力，加大了分离出优秀菌种的可能性，试验的结果也证实了本发明选用的复合菌种活力强、特性突出，具有优秀的保存价值。
2、本发明采用采用真菌ITS测序方法将红枣野生酵母菌鉴定到属和种，明确了菌株的总体特性，并通过大量的筛选试验，了解不同菌株的独特性能，可根据需要，采用不同的复配方式，得到不同功能的发酵产品，进一步可尝试用于其它果酒的发酵。
3、本发明依据复合菌种的特性，采用两次添加的使用方法，更能够发挥出不同菌株各自的优势，特别是非酿酒酵母的存活数量可大大增加，存活时间也可明显延长。
下面结合具体实施例，对本发明进行详细的阐述。
本发明
1、样品采集：在山西临县林家坪乡千年枣树园内，选择不同的枣树，采集树上悬挂和树下落果各5份红枣样品(各100g左右)，放入塑料保鲜袋中密封保存。
2、自然发酵：将采集的红枣样品各取20g，放入试验室用玻璃发酵罐中(2L)，按重量比红枣：水＝1:1加入蒸馏水，放置生物培养箱(上海博讯SPX-100B-Z)中在23℃～30℃条件下自然发酵，分别于发酵开始(有微小气泡产生)计第2、5、8天进行发酵液样品提取。
3、菌种分离：发酵液样品经梯度稀释后，稀释倍数为10-2,10-3,10-4，取0.2ml涂布于YEPD平板培养基中，放置生物培养箱中(上海博讯SPX-100B-Z)于28℃培养2～3d，选择具有典型酵母菌落特征的单菌落进一步划线分离，经镜检为纯种后分别移种单菌落于YEPD斜面上，于4℃冰箱中备用。
4、鉴定：提取酵母菌的DNA进行酵母基因组PCR扩增，其中，引物设计：26s F，5-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3序列；26s R，5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3序列。
PCR扩增反应体系：将1.0ul基因组DNA(20ng/ul)，5.0ul 10×Buffer(含2.5m MMg2+)，1.0ul Taq聚合酶(5u/μL)，1.0ul d NTP(10m M)，1.5ul 27F引物(10u M)，1.5ul1492R引物(10u M)，39.0ul dd H2O，配成总体积50.0ul的溶液，轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底,在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如下：预变性95℃，5min，变性95℃，30s，退火58℃，30s，延伸72℃，1min30s，终延伸72℃，7min，循环数35次。反应完成后，取3ul PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序，用NCBIBlast程序将拼接后的序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息。测序鉴定结果为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、季也蒙毕赤酵母属(Meyerozyma guilliermondii)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)和盔状毕赤酵母(Pichia galeiformis)。
5、筛选：采用杜氏管发酵法进行一次筛选，对步骤3分离出的单一菌株进行产气效果筛选，筛选指标为24小时内产气和48h内产气泡大小。菌株活化：放入气浴恒温振荡器(上海博讯THZ-82)中，在28℃条件下于8m1YEPD培养基中，以120r/min振荡培养20h。发酵：放置生物培养箱(上海博讯SPX-100B-Z)中，28℃条件下在YEPD培养基中培养48h，接种量：4％。
采用枣汁发酵法进行二次筛选，筛选指标优先顺序为酒精度大于10％体积百分比≧甲醇小于0.4g/L≧残糖小于4g/L≧风味独特。菌株活化：放入气浴恒温振荡器(上海博讯THZ-82)中，在28℃条件下于8m1YEPD培养基中以120r/min振荡培养20h，发酵：放置生物培养箱(上海博讯SPX-100B-Z)中，28℃在200m1L20Birx枣汁中发酵5d～35d；菌液浓度为107～108CFU/m L，接种量4％。选择出符合条件的6种单一菌株，分别标号为H5、H7、H23、H56、H137、H258，将6种菌株按平均比例混合。
6、发酵：将混合菌种活化后分两次添加到灭菌后放入玻璃发酵罐(实验室用2L)的红枣汁中(15Birx)，每次添加比例为红枣汁重量的1％，间隔时间为48小时，在22℃～28℃条件下发酵7天。
7、结果检测：发酵48小时后，发酵液中活菌数为106CFU/m L,发酵96小时后，发酵液中活菌数为107CFU/m L；发酵结束后取上层澄清红枣酒进行检测，结果为：酒精度10％体积百分比，甲醇含量0.3～0.4g/L，总糖2～3g/L，挥发酸0.8～1.0g/L，异戊酸降低约20％，酯类香气成分增加5种。
上面结合实施例对本发明作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (1)
1.一种发酵型红枣酒复合菌种制备及其使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：样品采集；
采集红枣样品，放入保鲜袋中；
第二步：自然发酵；
将采集的红枣样品放入发酵罐中，按重量比红枣：水＝1:1加入蒸馏水，放置25℃～30℃环境中自然发酵，分别于发酵开始计第2、5、8天进行发酵液提取；
第三步：菌种分离；
发酵液经梯度稀释后，稀释倍数为10-2,10-3,10-4，取0.2ml涂布于YEPD平板培养基，于28℃培养2～3d，选择具有典型酵母菌落特征的单菌落进一步划线分离，经镜检为纯种后分别移种单菌落于YEPD斜面上，于4℃冰箱中备用；
第四步：鉴定；
提取酵母菌的DNA进行酵母基因组PCR扩增，引物设计：26sF，5-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3序列；26sR，5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3序列，
取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序，用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，得到测序鉴定结果为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、季也蒙毕赤酵母属(Meyerozyma guilliermondii)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)和盔状毕赤酵母(Pichia galeiformis)；
第五步：筛选；
采用杜氏管发酵法进行一次筛选，对第三步分离出的单一菌株进行产气效果筛选，筛选指标为24小时内产气和48h内产气泡大小；采用枣汁发酵法进行二次筛选，筛选指标优先顺序为酒精度大于10％体积百分比≧甲醇小于0.4g/L≧残糖小于4g/L≧风味独特，选择出符合条件的6种单一菌株，分别标号为H5、H7、H23、H56、H137、H258，将6种菌株按平均比例混合；
第六步：发酵；
将混合菌种活化后分两次添加到灭菌后的红枣汁中，每次添加比例为红枣汁重量的1％，间隔时间为48小时，在22℃～28℃条件下发酵7天；
第七步：结果检测；
发酵48小时后，发酵液中活菌数为106CFU/mL,发酵96小时后，发酵液中活菌数为107CFU/mL；发酵结束后取上层澄清红枣酒进行检测，结果为：酒精度10％体积百分比，甲醇含量0.3～0.4g/L，总糖2～3g/L，挥发酸0.8～1.0g/L，异戊酸降低20％，酯类香气成分增加5种。
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| CN113331412A (zh) * | 2021-07-14 | 2021-09-03 | 山西农业大学山西功能食品研究院 | 一种木枣酵素发酵方法 |
| CN115960732A (zh) * | 2023-01-20 | 2023-04-14 | 昆明理工大学 | 一株盔状毕赤酵母及其微生物菌剂和应用 |
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