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CN117343847A - 一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料和方法 - Google Patents

一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料和方法 Download PDF

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CN117343847A CN202311313982.5A CN202311313982A CN117343847A CN 117343847 A CN117343847 A CN 117343847A CN 202311313982 A CN202311313982 A CN 202311313982A CN 117343847 A CN117343847 A CN 117343847A
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李超汉
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朱丽华
曹碧婷
吕铎
顾卫红
宋荣浩
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Abstract

本发明提供了一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料和方法，属于微生物发酵技术领域。本发明的发酵料的发酵基质包括稻壳、麦麸皮和油菜饼中的一种或几种，采用本发明的发酵基质可以实现拟康宁木霉产孢，尤其以稻壳为发酵基质可以实现拟康宁木霉较好的产孢。本发明还在发酵料中进一步添加了葡萄糖、乳糖和硫酸铵作为碳氮源营养物质，能够有效提高拟康宁木霉的产孢量。本发明还提供了一种拟康宁木霉的固体发酵的方法。本发明的方法能够有效提高拟康宁木霉的产孢量。

Description

一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料和方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料和方法。
背景技术
木霉是一种常见的生防菌(植物益生菌)，具有促进植物生长的效果，并且对多种植物病害，特别是土传病害具有良好的防效。木霉属有200多个种，种间和种内差异巨大，目前常见的用于生防菌剂的木霉多为哈茨木霉、绿色木霉等，对拟康宁木霉研究较少，缺乏拟康宁木霉用于实际生产的发酵方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料和方法，填补了拟康宁木霉产孢发酵的空白。
本发明提供了一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料，包括以下重量份的组分：
发酵基质50～150份、葡萄糖1～5份、乳糖0.5～1份、硫酸铵2.5～7.5份和水70～150份；所述发酵基质包括稻壳、麦麸皮和油菜饼中的一种或几种。
优选的，所述固体发酵发酵料包括以下重量份的组分：发酵基质100份、葡萄糖2.6份、乳糖0.75份、硫酸铵5份和水80份。
优选的，所述发酵料的含水量为40％～60％。
本发明还提供了一种拟康宁木霉的固体发酵的方法，包括以下步骤：
将拟康宁木霉的孢子液接种于上述方案所述的发酵料，于光照条件下进行浅盘发酵。
优选的，所述孢子液中拟康宁木霉孢子浓度为1×106～1×108cfu/ml。
优选的，在所述接种后平均每克发酵基质的孢子量不低于1×105cfu。
优选的，所述浅盘发酵的温度为20～25℃；所述浅盘发酵的时间≥9d。
优选的，所述发酵料承装于浅盘中；在将拟康宁木霉的孢子液接种于上述方案所述的发酵料后以及进行浅盘发酵前，还包括采用保鲜膜将所述浅盘覆盖。
优选的，所述光照包括自然光照或日光灯全光照。
优选的，所述拟康宁木霉包括拟康宁木霉T-51。
本发明提供了一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料，本发明的发酵料的发酵基质包括稻壳、麦麸皮和油菜饼中的一种或几种，采用本发明的发酵基质可以实现拟康宁木霉产孢，尤其以稻壳为发酵基质可以实现拟康宁木霉较好的产孢。本发明还在发酵料中进一步添加了葡萄糖、乳糖和硫酸铵作为碳氮源营养物质，能够有效提高拟康宁木霉的产孢量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为在不同发酵基质上拟康宁木霉的产孢量；
图2为以稻壳为基质添加不同比例水分和不同发酵时长的拟康宁木霉的产孢量；
图3为以稻壳为基质时不同孢子初始接种量下拟康宁木霉的产孢量；
图4为响应面法对水分、发酵时长、接种浓度的优化，其中，A:H20为水分比例，B：Time为发酵时长，C：Conce为Log10(初始接种量)，T-51为Log10(拟康宁木霉产孢量)；
图5为在稻壳基质中单独添加不同比例葡萄糖、乳糖或硫酸铵的拟康宁木霉的产孢量；
图6为响应面法对葡萄糖、乳糖和硫酸铵的优化；其中，A:P为葡萄糖，B:R为乳糖，C:L为硫酸铵，T-51为Log10(拟康宁木霉产孢量)。
具体实施方式
本发明提供了一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料，包括以下重量份的组分：发酵基质50～150份、葡萄糖1～5份、乳糖0.5～1份、硫酸铵2.5～7.5份和水70～150份；所述发酵基质包括稻壳、麦麸皮和油菜饼中的一种或几种。
在本发明中，所述发酵料优选的由以下重量份的组分组成：发酵基质50～150份、葡萄糖1～5份、乳糖0.5～1份、硫酸铵2.5～7.5份和水70～150份。
在本发明中，以重量份计，所述发酵料包括发酵基质50～150份，优选为80～120份，更优选为100份，这一用量既能保证发酵，又能避免发酵基质浪费；所述发酵基质优选为稻壳。采用本发明的发酵基质可以实现拟康宁木霉产孢，尤其以稻壳为发酵基质可以实现拟康宁木霉较好的产孢。
在本发明中，以重量份计，所述发酵料包括葡萄糖1～5份，优选为2.6份。
在本发明中，以重量份计，所述发酵料包括乳糖0.5～1份，优选为0.75份。
在本发明中，以重量份计，所述发酵料包括硫酸铵2.5～7.5份，优选为5份。
本发明还在发酵料中进一步添加了葡萄糖、乳糖和硫酸铵作为碳氮源营养物质，能够有效提高拟康宁木霉的产孢量。
在本发明中，以重量份计，所述发酵料包括水70～150份，优选为80～100份。在本发明中，所述发酵料的含水量优选为40％～60％，更优选为42％～43％。发酵料的水分过少湿度不足影响发酵，水分过多影响透气性也影响发酵效果，本发明的发酵料中水的添加量有利于拟康宁木霉产孢。
在本发明的一个实施例中，所述固体发酵发酵料由以下重量份的组分组成：发酵基质100份、葡萄糖2.6份、乳糖0.75份、硫酸铵5份和水80份。
在本发明中，所述发酵料的制备方法优选的包括以下步骤：
将葡萄糖、乳糖、硫酸铵和水混合，得到混合液；
将所述混合液和发酵基质混合，得到发酵料。
在将所述混合液和发酵基质混合后，本发明优选的还包括对发酵后的物料进行灭菌。
本发明还提供了一种拟康宁木霉的固体发酵的方法，包括以下步骤：
将拟康宁木霉的孢子液接种于上述方案所述的发酵料，于光照条件下进行浅盘发酵。
本发明对所述拟康宁木霉具体的株系没有特殊限制，在本发明具体实施过程中，所述拟康宁木霉为拟康宁木霉T-51，T-51购自于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M2015729。
在本发明中，所述孢子液中拟康宁木霉孢子浓度优选为1×106～1×108cfu/ml，更优选为1×107cfu/ml。在本发明中，以所述发酵料中发酵基质的质量为100g计，所述孢子液的接种量优选为5～20ml，更优选为10～15ml，以接种后平均每克发酵基质的孢子量不低于1×105cfu为准。
在本发明中，所述浅盘发酵的温度优选为20～25℃；所述浅盘发酵的时间优选的≥9d，更优选为11d。
在本发明中，所述发酵料优选的承装于浅盘中，更优选的平铺于浅盘中；所述发酵料的平铺厚度优选为2cm；所述浅盘优选为不锈钢浅盘；所述浅盘在使用前经过灭菌处理，本发明对所述灭菌处理的方式没有特殊限制，采用干热、紫外、高压的灭菌方法均可；在将拟康宁木霉的孢子液接种于上述方案所述的发酵料后以及进行浅盘发酵前，优选的还包括采用保鲜膜将所述浅盘覆盖，以避免污染。
在本发明中，所述光照优选的包括自然光照或日光灯全光照。
本发明的方法能够有效提高拟康宁木霉的产孢量。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料和方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、菌株：拟康宁木霉T-51
2、发酵方式：浅盘发酵，使用灭菌的不锈钢浅盘36cm*27cm*4cm。
3、发酵料：稻壳100g、葡萄糖2.6g、乳糖0.75g、硫酸铵5g、上述三种试剂溶于80ml水后，添加到稻壳中，混匀，灭菌。
4、发酵方法：将灭菌后的发酵料均匀平铺在无菌的不锈钢浅盘中。在PDA培养基上生长10天的菌落上加水洗下孢子，配制T-51的孢子液，用无菌水调节孢子浓度为106cfu/ml。在浅盘中均匀加入10ml孢子液(在浅盘中均匀加入孢子液后再拌匀)。用透明的保鲜膜将浅盘覆盖密封，放在20℃，光照下静置发酵11天。
在此条件下达到产孢量为7.83×109cfu/ml。
试验例1发酵基质筛选
在发酵基质筛选中所用的发酵基质包括稻壳，麦麸皮，玉米粉，油菜饼，小麦粒和稻草碎。称取20g发酵基质，加入10ml蒸馏水，搅拌均匀，121℃高压灭菌20min。取一个在PDA培养基上培养10天的已产孢的T-51平板，用5ml无菌水洗下孢子，用血球计数板统计孢子浓度，然后用无菌水配制成1×107cfu/ml的T-51分生孢子悬浮液。在发酵料中加入1ml上述配制好的T-51孢子液混匀。在20℃光照下培养10天。称取1g发酵料，加100ml水洗下孢子，适当稀释后用血球计数板统计产孢量。
试验结果参见图1，由试验结果可知，拟康宁木霉在稻壳上可以较好的产孢，达到9.07×106个孢子/g，麦麸皮和油菜饼可以产孢，在玉米粉、小麦粒和稻草碎上，在此发酵条件下极少产孢或不产孢。
试验例2水分含量、发酵时长和接种量
选用稻壳作为发酵基质。在单一稻壳基质上进行了水分、发酵时长和接种量的筛选。以10g稻壳为基质，首先进行了水分含量和发酵时长的优化，试验设计了25％、50％、75％和100％四个不同水分含量(v/w，ml/g，比如25％就是2.5ml水加在10g稻壳里，100％就是10ml水加在10g稻壳里)，设计7天，9天和11天三个不同的发酵时长。发酵条件和产孢量统计方式同前。结果参见图2，图2表明在75％水分含量，接种量为1×106，发酵11天，可以达到产孢量1.88×108个孢子/g。
另外，又对T-51孢子液接种量进行了优化，以10g稻壳为基质，设计了1×106、1×107、1×108、2×108四种不同的接种浓度，每次接种1ml。其中水分含量为75％，发酵时长为9天，统计产孢量。结果参见图3，图3表明1×106接种量获得的产孢量最大。
以水分含量50％～200％，发酵时长7～11天，接种量浓度(Log10)6～8为参数，使用软件Design-Expert12设计响应面试验，以最高产孢量为目的计算对应的水分、发酵时长和接种量如表1和图4所示，并预测出最高产孢量为2×108个孢子/g。
表1对水分、时间和接种浓度的筛选
水分(v/w) 79.54％
时间(day) 11
接种浓度cfu/ml 1×106
预测产孢量(Log10cfu/g) 8.3
预测产孢量cfu/g 2×108
试验例3营养物质添加比例筛选
以10g稻壳为发酵基质，添加水分为7.954ml，接种浓度为106cfu/ml，接种1ml，发酵11天，再进一步添加葡萄糖、乳糖和硫酸铵作为碳氮源营养物质。以10g稻壳作为基质，三种物质分别以0.1％、0.5％、1％、5％、10％五种不同浓度(w/w，g/g)添加，发酵条件同前，11天后统计产孢量。结果参见图5，图5表明分别在葡萄糖1％，乳糖0.5％和硫酸铵1％的添加量下产孢量最大。
再进行配方优化，设置参数区间葡萄糖(P)0.5％～5％。乳糖(R)0.1～1％，硫酸铵(L)0.5～5％，按照响应面设计实验并计算，得到在同时添加葡萄糖2.6％，乳糖0.75％和硫酸铵5％时得到预测最高产孢量为7.76×109。(参见图6和表2)表2对葡萄糖、乳糖和硫酸铵添加量的筛选
试验例4
使用不锈钢浅盘，尺寸为36cm*27cm*4cm，称取100g稻壳，在79.54ml水中加入2.6g葡萄糖、0.75g乳糖和5g硫酸铵，溶解后拌入稻壳，灭菌后，平铺在灭菌后的浅盘中。均匀加入10ml浓度为1×106cfu/ml的T-51分生孢子悬浮液，以保鲜膜覆盖后，在20℃自然光照下培养11天。获得最终的产孢量为7.83×109个孢子/g，与预期吻合。(参见表3)。
表3拟康宁木霉的优化固体发酵条件及产孢量
水分(v/w) 79.54％
时间(day) 11
接种浓度cfu/ml 1×106
葡萄糖％ 2.6
乳糖％ 0.75
硫酸铵％ 5
温度 20℃
光照条件 自然光照
产孢量cfu/g 7.83×109
试验例5
根据试验例4的方法，进行T-51的浅盘固体发酵。11天后，用水洗下发酵基质中的孢子，并用纱布过滤掉杂质，获得T-51的分生孢子液。将孢子液稀释至1×107cfu/ml，孢子液最好立即使用，或在4℃保存。
田间试验：
田间试验地为西瓜重茬田，西瓜品种为‘黑津’，种植于连栋大棚中，试验时间为2023年2月～5月，地点在上海市金山区。在西瓜幼苗移栽进田间后，立刻使用该孢子液灌根处理，每株灌根500ml。两周后(缓苗期)，再使用新鲜发酵的孢子液灌根一次，浓度剂量相同。试验以清水灌根作为对照。统计后续田间西瓜枯萎病发病率。
结果参见表4，结果显示：坐果期进行枯萎病病害调查结果表明，T-51在移栽期和缓苗期灌根处理有效降低了西瓜枯萎病的发生，清水对照发病率达到29.5％，造成了严重的经济损失，而T-51孢子液灌根处理后，发病率降到7.8％，防效显著。
表4坐果期西瓜枯萎病调查结果
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种拟康宁木霉的固体发酵的发酵料，其特征在于，包括以下重量份的组分：
发酵基质50～150份、葡萄糖1～5份、乳糖0.5～1份、硫酸铵2.5～7.5份和水70～150份；所述发酵基质包括稻壳、麦麸皮和油菜饼中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的发酵料，其特征在于，所述固体发酵发酵料包括以下重量份的组分：发酵基质100份、葡萄糖2.6份、乳糖0.75份、硫酸铵5份和水80份。
3.根据权利要求1或2所述的发酵料，其特征在于，所述发酵料的含水量为40％～60％。
4.一种拟康宁木霉的固体发酵的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将拟康宁木霉的孢子液接种于权利要求1～3任意一项所述的发酵料，于光照条件下进行浅盘发酵。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述孢子液中拟康宁木霉孢子浓度为1×106～1×108cfu/ml。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述接种后平均每克发酵基质的孢子量不低于1×105cfu。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述浅盘发酵的温度为20～25℃；所述浅盘发酵的时间≥9d。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵料承装于浅盘中；在将拟康宁木霉的孢子液接种于权利要求1～3任意一项所述的发酵料后以及进行浅盘发酵前，还包括采用保鲜膜将所述浅盘覆盖。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述光照包括自然光照或日光灯全光照。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述拟康宁木霉包括拟康宁木霉T-51。
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