CN101717723B

CN101717723B - 一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵工艺

Info

Publication number: CN101717723B
Application number: CN 200910241894
Authority: CN
Inventors: 李春; 武占省; 赵雅峰; 陶晶; 李艳菊
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2009-12-14
Filing date: 2009-12-14
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2029-12-14
Also published as: CN101717723A

Abstract

本技术方案涉及一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，属于微生物工程领域。方案选取对三株不同类型枯草芽孢杆菌，采用混合发酵方法，分别对三株菌株各自进行斜面培养、摇瓶培养，再按照一定比例混合接种，进行混菌的种子罐培养与发酵罐培养。对发酵时的培养基选择、pH值、温度、通气量及三株菌的接种量比例进行了优化。与传统的单菌株发酵方法相比，本技术方案发酵方法简化、效率提高、生产成本降低，发酵液中有效活菌数≥10¹²cfu/ml。

Description

一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵工艺

技术领域

本技术方案涉及一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，属于微生物工程领域。

背景技术

国内外生物防治和产品开发的重要发展趋势是由单一菌剂发酵向混菌发酵方向发展，利用不同微生物的功能机制，通过多种菌株的协同作用，提高菌株的生物量和功能特性、简化生产方法、减少发酵批次、提高发酵效率及缩短发酵周期，为生物农药及生物菌肥的工业化生产及其推广应用提供了广阔的前景。

对于多菌种共同培养、协同发酵研究，早在1925年Sack在考察细菌代谢时就描述了亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.)和生丝微菌(Hyphomicroblum sp.)两种菌在硅胶培养基中培养，不同的组合关系可以形成不同的产物，为以后菌株的组合培养提供了理论依据。中国农业大学的王素英对88株未纯化的细菌分组混合进行连续培养，共筛选出12个具有防病作用的组合，并通过实验证明微生物的协同作用与其产生物质的功能之间存在一定的关系。

用于防治植物病害的主要芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。国内外使用芽孢杆菌防治的植物病害种类非常广泛，主要有乳苹果红癌病(Nectria sp.)、小麦全蚀病(Gaeumanomycesgr aminis)、赤霉病(Giberella sp.)、作物纹枯病(Rhizoctonia solani)、苗木根腐病、瘁倒病(R.solani，Fusarium sp.，Phytophihora sp.，Pythium sp.)等土传病害和各类果实腐烂病害(Monilinia fructicola Penicillium sp.，Altemaria alternata，Botrytiscinerea)及部分林木枝干病害。

目前，我国生物防治产品的数量和品种较少，防治效果较差或不稳定。因此急需扩大生物防治产品的种质资源，开发生防菌的廉价发酵方法，利用各功能菌的协同增效作用，通过混菌发酵来实现高效菌剂的生产和植物病害的防治。

发明内容

本技术方案的目的是为了解决上述问题而提供一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，本技术方案是利用具有广谱抑菌活性的3株枯草芽孢杆菌株，进行混菌发酵方法的开发。所述3株枯草芽孢杆菌菌种购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分别为保藏号为CGMCC NO.0954的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B9601-Y2、保藏号为CGMCCNo.1019的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NCD-2和保藏号为CGMCC No.2099的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BAB-1。根据发酵产品的菌体生物量和抑菌活性大小，筛选种子活化培养基、一级和二级种子培养基、种子罐和发酵罐培养基并确定方法参数。

本技术方案的目的是通过下述技术方案实现的。

一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法包括如下步骤：

步骤一、种子活化

将三种发酵菌株：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B9601-Y2、Bacillus subtilis NCD-2和Bacillus subtilis BAB-1分开培养，分别划线于种子活化培养基试管斜面上，在28～30℃培养箱中培养24～48h，得到供三种生产用的斜面菌种；

步骤二、一级种子液制备

将步骤一中所述的三种斜面菌种分开培养，用接种环分别挑取所述斜面菌种单菌落，接种于装有一级种子培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养，一级种子培养基的装液量为三角瓶体积的20～30％，在28～30℃下180～200r/min振荡培养18～24h，得到所述三种发酵菌株的一级种子液；

步骤三、二级种子液制备

将所述三种一级种子液分开培养，分别按照二级培养基2～5％(v/v)的接种量，接入装有二级种子培养基的三角瓶，二级种子培养基的装液量为三角瓶体积的20～30％，于28～30℃、180～200r/min振荡培养18～24h，得到所述三种发酵菌株的二级种子液；

步骤四、种子罐培养

将所述三种二级种子液共同混合培养，分别按照菌液体积比例的量接种到种子罐中，总接种量是种子罐培养基体积的3～10％(v/v)，好氧培养一段时间后，得到三级种子液；

步骤五、发酵罐培养

将所述三级种子液，按照发酵罐培养基的3～10％(v/v)的接种量接种到发酵罐中，好氧培养一段时间后，得到发酵产物。

所述供生产用的斜面菌种在冰箱内保存最多不超过一周；二级种子液经显微镜观察菌形正常，无杂菌污染，培养液含活菌数≥10⁹cfu/ml，方可作为合格的二级种子应用；所述的种子活化培养基为：牛肉膏3～5g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠3～5g/L，葡萄糖5～10g/L，琼脂10～15g，pH 7.0～7.2；所述的一级和二级种子培养基为：葡萄糖20～40g/L，蛋白胨6～10g/L，酵母浸膏6～10g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0～7.2；所述的种子罐和发酵罐培养基为：豆饼粉3～20g/L，牛肉膏2～5g/L，酵母浸膏3～5g/L，尿素5～10g/L，玉米粉3～20g/L，蜂蜜5～10g/L，麸皮5～10g/L，氯化钠0.5～3g/L，碳酸钠1～2g/L，磷酸氢二钾1～2g/L，硫酸镁0.5～3g/L，添加0.05～0.2％(w/v)消泡剂；三种单一菌株Bacillus subtilis B9601-Y2、Bacillus subtilis NCD-2和Bacillus subtilis BAB-1混合发酵的接种配比为Bacillus subtilis B9601-Y2、Bacillus subtilis NCD-2和Bacillus subtilis BAB-1等于2～4∶1～2∶2～4；培养基的灭菌条件为：0.1～0.15MPa蒸汽灭菌30～50min，灭菌温度118～121℃；种子罐和发酵罐混菌发酵的控制条件为：培养基的装液量为罐容积的70％～80％，培养基灭菌后pH调节为6.0～9.0，培养温度30～32℃、通气量3～10L/min、罐压80kPa、搅拌转速200～250r/min条件下，发酵时间为16～48h；在发酵培养基中可以加入微量诱导物，包括但不限于壳聚糖、甘氨酸和天冬氨酸中的一种或一种以上的复配，以促进芽孢杆菌产生抗菌物质；本技术方案中采用的混菌发酵方法制备的发酵液中有益微生物的有效菌体含量为≥10¹²cfu/ml。

有益效果

本技术方案的一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，利用各菌种之间的协同促生关系，增强了菌种的适应能力，大大提高了菌种的生长量和抑菌效果，发酵获得的产物中

具体实施方式

为了充分说明本技术方案的特性以及实施本技术方案的方式，下面给出实施例。

实施例1～3中发酵液抑菌活性的测定采用琼脂孔扩散对峙法，以250L发酵罐为例。

实施例1

步骤一、种子活化

将于种管保存的三种发酵菌株：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B9601-Y2、Bacillus subtilis NCD-2和Bacillus subtilis BAB-1分别划线于种子活化培养基试管斜面上，在28℃培养箱中培养24h，得到供生产用的斜面菌种；

种子活化培养基为：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂15g，pH 7.0～7.2，培养基灭菌条件：0.15MPa蒸汽灭菌30min，灭菌温度121℃；

步骤二、一级种子液制备

用接种环分别挑取所述各株枯草芽孢杆菌供生产用的斜面菌种单菌落，分别接种于三个装有50ml一级种子培养基的250ml三角瓶中，在28～30℃、180～200r/min下振荡培养18h，得到一级种子液；

一级种子培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0，培养基灭菌条件：0.15MPa蒸汽灭菌30min，灭菌温度121℃；

步骤三、二级种子液制备

将所述各株枯草芽孢杆菌单一菌种的一级种子液分别按3％(v/v)的接种量接入三个装有250ml二级种子培养基的1000ml三角瓶中，在30℃下，200r/min下振荡培养20h，得到二级种子液；

二级种子培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0，培养基灭菌条件：0.15MPa蒸汽灭菌30min，灭菌温度121℃；

步骤四、种子罐培养

在作为种子罐的25L搅拌式发酵罐内加入20L种子罐培养基，培养基灭菌后冷却至30℃，pH调节为6.0，将所述各株枯草芽孢杆菌单一菌种的二级种子液，分别接种到种子罐中，接种配比为Bacillus subtilis B9601-Y2∶Bacillus subtilisNCD-2∶Bacillus subtilis BAB-1等于3∶1∶2，总接种量是种子罐培养基的5％(v/v)；种子罐混菌发酵的控制条件为30℃，通气量5L/min，罐压80kPa，搅拌转速180r/min，好氧混菌发酵培养，培养24h，得到三级种子液；

种子罐培养基为：豆饼粉10g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸膏3g/L，尿素5g/L，玉米粉10g/L，蜂蜜5g/L，麸皮5g/L，氯化钠2g/L，碳酸钠1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，0.1％(w/v)消泡剂，培养基灭菌条件：0.15MPa蒸汽灭菌30min，灭菌温度121℃；

步骤五、发酵罐培养

在250L搅拌式发酵罐内加入200L发酵培养基，培养基灭菌后冷却至30℃，pH调节为7.0，按10％(v/v)接入混菌的三级种子液，发酵罐混菌发酵的控制条件为温度30℃、通气量20L/min、罐压80kPa、搅拌转速250r/min，发酵36h后，得到本技术方案所述的一种多菌株混菌生防菌剂；

发酵培养基为：豆饼粉15g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸膏3g/L，尿素5g/L，玉米粉15g/L，蜂蜜5g/L，麸皮10g/L，氯化钠1g/L，碳酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，消泡剂0.1％(w/v)，培养基灭菌条件为0.15MPa蒸汽灭菌30min，灭菌温度121℃；在发酵培养基中可以通过加入微量诱导物壳聚糖，添加量0.005g/L，来促进芽孢杆菌产生抗菌物质；发酵后期，发酵至36h，取样检测发酵液中的有益微生物的有效活菌数≥10¹²cfu/ml，抑菌效价743UI。

实施例2

步骤一、二、三同实施例1中步骤一、二、三；

步骤四、种子罐培养

在作为种子罐的25L搅拌式发酵罐内加入20L种子罐培养基，培养基灭菌后冷却至30℃，pH调节为7.0，将所述各株枯草芽孢杆菌单一菌种的二级种子液，分别接种到种子罐中，接种配比为Bacillus subtilis B9601-Y2∶Bacillus subtilisNCD-2∶Bacillus subtilis BAB-1等于2∶1∶3，总接种量是种子罐培养基的8％(v/v)；种子罐混菌发酵的控制条件为30℃，通气量10L/min，罐压80kPa，搅拌转速200r/min，好氧混菌发酵培养，培养20h，得到三级种子液；

种子罐培养基为：豆饼粉10g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸膏3g/L，尿素5g/L，玉米粉10g/L，蜂蜜5g/L，麸皮8g/L，氯化钠1g/L，碳酸钠2g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸镁0.5g/L，0.1％(w/v)消泡剂，培养基灭菌条件0.15MPa蒸汽灭菌30min，灭菌温度121℃；

步骤五、发酵罐培养

在250L搅拌式发酵罐内加入200L发酵培养基，培养基灭菌后冷却至30℃，pH调节为8.0，按8％(v/v)接入混菌的三级种子液，发酵罐混菌发酵的控制条件为温度30℃、通气量15L/min、罐压80kPa、搅拌转速250r/min，发酵40h后，得到本技术方案所述的一种多菌株混菌生防菌剂；

发酵培养基为：豆饼粉20g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸膏3g/L，尿素5g/L，玉米粉15g/L，蜂蜜10g/L，麸皮5g/L，氯化钠2g/L，碳酸钠1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，消泡剂0.1％(w/v)，培养基灭菌条件为0.15MPa蒸汽灭菌30min，灭菌温度121℃；在发酵培养基中可以通过加入微量诱导物甘氨酸，添加量0.005g/L，来促进芽孢杆菌产生抗菌物质；发酵后期，发酵至40h，取样检测发酵液中的有益微生物的有效活菌数≥10¹²cfu/ml，抑菌效价780UI。

实施例3

步骤一、二、三同实施例1中步骤一、二、三；

步骤四、种子罐培养

在作为种子罐的25L搅拌式发酵罐内加入20L种子罐培养基，培养基灭菌后冷却至30℃，pH调节为8.0，将所述各株枯草芽孢杆菌单一菌种的二级种子液，分别接种到种子罐中，接种配比为Bacillus subtilis B9601-Y2∶Bacillus subtilisNCD-2∶Bacillus subtilis BAB-1等于3∶1∶4，总接种量是种子罐培养基的10％(v/v)；种子罐混菌发酵的控制条件为30℃，通气量8L/min，罐压80kPa，搅拌转速200r/min，好氧混菌发酵培养，培养18h，得到三级种子液；

种子罐培养基为：豆饼粉10g/L，牛肉膏4g/L，酵母浸膏4g/L，尿素8g/L，玉米粉15g/L，蜂蜜5g/L，麸皮10g/L，氯化钠1.5g/L，碳酸钠1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，0.05％(w/v)消泡剂，培养基灭菌条件0.15MPa蒸汽灭菌30min，灭菌温度121℃；

步骤五、发酵罐培养

在250L搅拌式发酵罐内加入200L发酵培养基，培养基灭菌后冷却至30℃，pH调节为7.0，按10％(v/v)接入混菌的三级种子液，发酵罐混菌发酵的控制条件为温度32℃、通气量20L/min、罐压80kPa、搅拌转速250r/min，发酵44h后，得到本技术方案所述的一种多菌株混菌生防菌剂；

发酵培养基为：豆饼粉15g/L，牛肉膏5g/L，酵母浸膏4g/L，尿素5g/L，玉米粉20g/L，蜂蜜5g/L，麸皮10g/L，氯化钠1g/L，碳酸钠1.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，消泡剂0.1％(w/v)，培养基灭菌条件为0.15MPa蒸汽灭菌30min，灭菌温度121℃；在发酵培养基中可以通过加入微量诱导物天冬氨酸，添加量0.008g/L，来促进芽孢杆菌产生抗菌物质；发酵后期，发酵至44h，取样检测发酵液中的有益微生物的有效活菌数≥10¹²cfu/ml，抑菌效价803UI。

实施例4

为了考察混菌发酵液和单一菌株的发酵液对加工番茄防病促生效能的研究，以本技术方案实施例1～3制备的混菌发酵液、相同工艺条件下制备的单一菌株Bacillus subtilis B9601-Y2、Bacillus subtilis NCD-2和Bacillus subtilis BAB-1的发酵液分别浸泡加工番茄种子12h，晾干备用。通过考察番茄种子的出苗率，株高、鲜重、干重、发病率等指标，并计算病情指数和防病效果，定期浇水，种子出苗后15d调查出苗率和发病情况，25d后将番茄苗连根取出并冲洗干净后测植株鲜重和干重。结果由表1可知，Bacillus subtilis B9601-Y2、Bacillus subtilisNCD-2和Bacillus subtilis BAB-1与混菌发酵液都能提高番茄种子的发芽率，促进加工番茄苗期的生长，降低番茄苗期立枯丝核菌的发病率，具有促生和防病双重功能。混菌发酵液的促生防病功能尤其显著，明显高于三株单一菌液浸种后的效果。其出苗率和平均株高、干重鲜重均高于单株菌液处理的效果，防病性能方面表现良好，发病率低，防效高。

表1加工番茄苗期立枯病防效测定与促生效果

注：将培养好的立枯丝核菌与灭菌土以1∶8(V/V)的比例充分混匀后装入营养钵中，然后将处理好备用的加工番茄种子均匀播入所述拌有立枯丝核菌的营养钵中，每钵20粒种子，每处理五个重复，并设空白对照：CK：灭菌培养液浸种，土壤接种丝核菌)

实施例5

为了考察混菌发酵液和单一菌株的发酵液对棉花小区抗病防病促生效能试验研究，以本技术方案实施例1～3制备的混菌发酵液、相同工艺条件下制备的单一菌株Bacillus subtilis B9601-Y2、Bacillus subtilis NCD-2和Bacillus subtilisBAB-1的发酵液分别浸泡棉花种子12h，晾干备用。通过考察棉花种子的出苗率、发病率等指标，并计算病情指数和防病效果。结果由表2可知，在田间条件下混菌发酵液对棉花出苗率和苗期的防病功能尤其显著，明显高于三株单一菌液浸种后的效果。

表2棉花苗期立枯病防效测定与促生效果

注：将培养好的立枯丝核菌与灭菌土以1∶8(V/V)的比例充分混匀后装入营养钵中，然后将处理好备用的棉花种子均匀播入所述拌有立枯丝核菌的营养钵中，每钵20粒种子，每处理五个重复，并设空白对照：CK：灭菌培养液浸种，土壤接种丝核菌)

实施例4、5中：

立枯病分级标准：

0级根茎健全，须根无病斑；

1级根茎部有零星病斑，但不连片，须根上无病斑；

2级根茎部病斑连片，但小于根部周长的1/4，须根略有发病；

3级根茎部病斑大于根部周长的1/4，但小于1/2，须根病斑较多，但不成片；

4级根茎部病斑大于周长的1/2，但小于3/4，须根病斑成片，部分须根脱落；

5级根茎部均有病斑包围，根部腐烂，须根近无。

防效计算公式：

出苗率(％)＝(出苗数/播种数)×100

病情指数(％)＝(∑(各级发病数×发病级数)/调查总数×最高发病级数)×100

相对防效(％)＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100

本技术方案包括但不限于以上实施例，凡是在本技术方案的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本技术方案的保护范围之内。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，其特征在于：选取三株不同类型枯草芽孢杆菌：保藏号为CGMCC NO.0954的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B9601-Y2、保藏号为CGMCC No.1019的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NCD-2和保藏号为CGMCC No.2099枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BAB-1，采用混合发酵工艺，通过对所述三株菌株的适宜培养基选择，混菌发酵工艺参数：pH值、温度、通气量及三株菌的接种量比例的控制，能够稳定的获得枯草芽孢杆菌组合的发酵液，其中有益微生物的有效活菌数≥10¹²cfu/ml。

2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，其特征在于：发酵工艺包括以下步骤：

步骤一、种子活化

将三种发酵菌株：Bacillus subtilis B9601-Y2、Bacillus subtilis NCD-2和Bacillus subtilisBAB-1分开培养，分别划线于种子活化培养基试管斜面上，在28~30℃培养箱中培养24~48h，得到供三种生产用的斜面菌种；

步骤二、一级种子液制备

将步骤一中所述的三种斜面菌种分开培养，用接种环分别挑取所述斜面菌种单菌落，接种于装有一级种子培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养，一级种子培养基的装液量为三角瓶体积的20~30%，在28~30℃下180~200r/min振荡培养18~24h，得到所述三种发酵菌株的一级种子液；

步骤三、二级种子液制备

将所述三种一级种子液分开培养，分别按照二级培养基2~5%的接种量，所述百分比为体积体积比，接入装有二级种子培养基的三角瓶，二级种子培养基的装液量为三角瓶体积的20~30%，于28~30℃、180~200r/min振荡培养18~24h，得到所述三种发酵菌株的二级种子液；

步骤四、种子罐培养

将所述三种二级种子液共同混合培养，分别按照菌液体积比例的量接种到种子罐中，总接种量是种子罐培养基体积的3~10%，所述百分比为体积体积比，好氧培养一段时间后，得到三级种子液；

步骤五、发酵罐培养

将所述三级种子液，按照发酵罐培养基的3~10%的接种量接种到发酵罐中，所述百分比为体积体积比，好氧培养一段时间后，得到发酵产物。

3.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，其特征在于：所述供生产用的斜面菌种在冰箱内保存最多不超过一周。

4.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，其特征在于：二级种子液经显微镜观察菌形正常，无杂菌污染，培养液含活菌数≥10¹²cfu/ml，方可作为合格的二级种子应用。

5.根据权利要求1或2所述的一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，其特征在于：培养基配方：

（1）其中所述的种子活化培养基为：牛肉膏3~5g/L，蛋白胨3~5g/L，氯化钠3~5g/L，葡萄糖5~10g/L，琼脂10~15g，pH7.0~7.2；

（2）其中所述的一级和二级种子培养基为：葡萄糖20~40g/L，蛋白胨6~10g/L，酵母浸膏6~10g/L，氯化钠5g/L，pH7.0~7.2；

（3）其中所述的种子罐和发酵罐培养基为：豆饼粉3~20g/L，牛肉膏2~5g/L，酵母浸膏3~5gL，尿素5~10g/L,玉米粉3~20gL，蜂蜜5~10gL，麸皮5~10g/L，氯化钠0.5~3g/L，碳酸钠1~2g/L，磷酸氢二钾1~2g/L，硫酸镁0.5~3g/L，添加0.05~0.2%消泡剂，所述百分比为质量体积比。

6.根据权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，其特征在于：所述的三种单一菌株Bacillus subtilis B9601-Y2、Bacillus subtilis NCD-2和Bacillus subtilis BAB-1混合发酵的接种配比为2~4:1~2:2~4。

7.根据权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，其特征在于：培养基的灭菌条件均为0.1~0.15MPa蒸汽灭菌30~50min，灭菌温度118~121℃。

8.根据权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，其特征在于：种子罐和发酵罐混菌发酵的条件控制，培养基的装液量为罐容积的70%~80%，所述百分比为体积体积比，培养基灭菌后pH调节为6.0~9.0，培养温度30~35℃、通气量3~20L/min、罐压80KPa、搅拌转速200~250r/min条件下，发酵时间为16~48h。

9.根据权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌的混菌协同发酵方法，其特征在：在发酵培养基中加入微量诱导物，包括壳聚糖、甘氨酸和天冬氨酸中的一种或一种以上的复配。