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CN117327673A - 一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体 - Google Patents

一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体 Download PDF

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CN117327673A CN202311336226.4A CN202311336226A CN117327673A CN 117327673 A CN117327673 A CN 117327673A CN 202311336226 A CN202311336226 A CN 202311336226A CN 117327673 A CN117327673 A CN 117327673A
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Abstract

本发明根据尿酸氧化酶的进化趋势，通过分析多种哺乳动物尿酸氧化酶的保守序列，构建突变体库，筛选得到高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体MU，再对突变体MU进行定点突变，进一步筛选出更高活性的突变E208D和R249Q。本发明提供了一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、5或7任一所示。所述突变体的酶比活性相比于野生型尿酸氧化酶具有显著提高，例如酶比活性比野生型犬源尿酸氧化酶提高至少25％，且具有更高的热稳定性。

Description

一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体涉及一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体。
背景技术
高尿酸血症和痛风是严重危害人类健康的重大疾病。现有治疗药物仅能从消炎止痛和抑制尿酸生成等方面控制此类疾病的发作及继续发展，均无法达到根治之目的。尿酸氧化酶类药物可将微溶性尿酸水解为易溶性尿囊素，已用于肿瘤放化疗和代谢紊乱引起的高尿酸血症及痛风的治疗。目前国内无任何尿酸氧化酶类药物上市，国际上已上市的尿酸氧化酶类药物有2002年美国FDA批准的啤酒酵母重组黄曲霉源尿酸氧化酶(Rasburicase)和2010年FDA批准的聚乙二醇(PEG)修饰大肠杆菌重组类猪源尿酸氧化酶(Pegloticase)。前者因与推测出的人源尿酸氧化酶的同源性低(<40％)，多次给药后受试者体内极易产生抗体，仅能用于急性高尿酸血症的短期治疗；后者为PEG修饰长效生物蛋白药物，两周注射一次，具有快速消融痛风石的独特功效，被誉为潜在的顽固性痛风的突破性治疗药物(Pelgoticase 2019年销售额3.4亿美元)，但存在免疫原性高和长期注射有效率低等缺陷。
哺乳动物源尿酸氧化酶因其高同源性(与人源尿酸氧化酶同源性>90％)，是开发长效尿酸氧化酶药物的重要来源。然而，哺乳动物尿酸氧化酶活性偏低，低活性意味着高剂量，注射剂量过高(8.0mg/dose)是导致Pelgoticase(PEG修饰类猪源重组尿酸氧化酶)免疫原性过高的重要因素之一。构建高比活哺乳动物源尿酸氧化酶，降低注射剂量，是开发低免疫原性尿酸氧化酶的重要手段。同时，PEG修饰尿酸氧化酶类药物注射周期为2周左右，提高尿酸氧化酶蛋白稳定性，延长体内代谢速率，亦可降低初始注射剂量，进一步降低哺乳动物尿酸氧化酶类药物的潜在免疫原性。开发高活性、高稳定性哺乳动物来源尿酸氧化酶是开发高安全性、低免疫原性长效尿酸氧化酶药物的重要手段。
专利(WO2019/010369)公开了具有提高的胰酶稳定性和/或活性的重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸氧化酶；专利(WO2021/068925)公开了一种改进的微球菌属(Arthrobacter globiformis)尿酸氧化酶，酶活性和热稳定性均较原始结构有所提高。上述专利尿酸氧化酶蛋白均属于微生物来源，非哺乳动物来源，在人体应用时可能存在与黄曲霉源尿酸氧化酶(Rasburicase)类似的免疫原性过高的风险。专利(WO 2011/050599)公布了人源化重组尿酸氧化酶及其突变体，专利(CN104630168A)公布了人猪嵌合尿酸氧化酶结构，上述两个专利均主要通过嵌合提高人源化程度，未涉及高活性及高稳定性尿酸氧化酶筛选。现有技术公开的方法未有涉及在哺乳动物尿酸氧化酶结构基础上进一步提高酶活性及稳定性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶(也可简称为尿酸酶)突变体，所述突变体的酶比活性相比于野生型尿酸氧化酶具有显著提高(例如酶比活性比野生型犬源尿酸氧化酶提高约为28.9％)。
本发明提供了一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者与SEQ ID NO：1相比包含突变E208D和/或R249Q。
在一些实施例中，所述突变体还可以包含其他合适的突变，只要该突变不会大幅降低酶比活性即可。在一些实施例中，所述突变体与如SEQ ID NO：3所示的野生型犬源尿酸氧化酶相比，酶比活性提高至少25％。
在一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、5或7任一所示。
本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含本发明任一方案所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体的编码序列；优选地，所述核酸分子为DNA或RNA。
本发明还提供了一种基因表达框，所述基因表达框含有启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列，所述编码序列为本发明任一方案所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体的编码序列。
在一些实施例中，所述启动子选自乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ或T7来源的启动子系统。
在一些实施例中，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2、4或6任一所示。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明任一方案所述基因表达框。
本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明任一方案所述核酸分子、基因表达框或表达载体。
在一些实施例中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫、酵母或细菌细胞；优选肠杆菌细胞或酵母细胞。
本发明还提供了一种生产本发明任一方案所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体的方法，包括：在所述宿主细胞中表达所述突变体，并分离纯化。
本发明还提供了所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体在制备尿酸氧化酶药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
(1)本发明根据尿酸氧化酶的进化趋势，通过分析多种哺乳动物尿酸氧化酶的保守序列，构建哺乳动物动物尿酸氧化酶突变体库，筛选得到高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体MU。
(2)本发明再对突变体MU进行定点突变，进一步筛选出更高活性的突变E208D和R249Q，与最高活性的野生型犬源尿酸氧化酶相比，酶比活性提高至少25％，且具有更高的热稳定性。
附图说明
图1为不同哺乳动物尿酸氧化酶序列比对.A0A5E4C3I6:Woodchuck；P11645:Rabbit；A0A2Y9P065:Beluga whale；P16164:Pig；Q3MHG7:Bovine；A0A6J0XAT6:Odocoileusvirginianus；A0A452G3H7:Goat；W5PWL1:Sheep；P25688:Mouse；P09118:Rat；L9KW26:Tupaia；A0A1S3WDJ8:Erinaceus；P25689:Hamadryas baboon；Q8MKJ2:Aotus；A0A7J7ZXM4:Myotis；G1M4M8:Ailuropoda；A0A2U3WVK7:Walrus；A0A3P4NI51:Gulo；M3Y300:Mustelafuro；A0A2Y9IZI3:Enhydra lutris；A0A673TVJ5:Suricata；A0A485N2I1:Lynx；Q5FZI9:Canine.。
图2为哺乳动物尿酸氧化酶重组表达鉴定。M：高分子量预染蛋白marker；1：诱导前；2：诱导后。
图3为哺乳动物尿酸氧化酶突变体纯度鉴定。A：SDS-PAGE鉴定。M：中分子量预染蛋白marker；1：R291K；2：E208D；3：R249Q。B:HPLC鉴定。
图4为高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体与野生型犬源尿酸氧化酶酶活性比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围。
本发明提供了一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明人经过系统的研究发现随着进化的进行，各物种哺乳动物尿酸氧化酶存在酶活越来越低的趋势。通过与人源尿酸氧化酶同源性较高的哺乳动物尿酸氧化酶的多序列比对，选取保守性或共有性高的氨基酸序列，可能会排除单物种哺乳动物尿酸氧化酶在进化过程中积累的错义突变，获得更高活性的哺乳动物尿酸氧化酶突变体蛋白。
基于犬、猪、牛、家兔、大鼠、夜猴等哺乳动物尿酸氧化酶蛋白序列，上述野生型哺乳动物尿酸氧化酶均被发明人证实具有降解尿酸的活性，且尿酸氧化酶蛋白序列全长为300-304个氨基酸；利用Blast等软件分析，上述野生型哺乳动物尿酸氧化酶与推测出的人源尿酸氧化酶序列的一致性(Identity)应不低于85.0％。以6种以上上述哺乳动物尿酸氧化酶氨基酸序列为基础，通过多物种序列比对(Alignment)，保留其高度保守区域，在非保守可变区通过共有性分析设计1个或多个备选氨基酸构成。
更具体的，多物种间可变区氨基酸序列差异较大时，首先选择保守性或共有性最高的1-2个氨基酸，如在第52位，犬、猪、家兔、夜猴、人为丝氨酸，牛为天冬酰胺，大鼠为精氨酸，丝氨酸共有性明显高于其他两个氨基酸，则在第52位选择为共有性最高的丝氨酸；如在291位，犬源、牛源、猪源为精氨酸，家兔、大鼠、夜猴、人为赖氨酸，精氨酸和赖氨酸共有性未有明显差异，则在第291位分别选择精氨酸和赖氨酸，构建两个备选突变体序列。以此类推，在序列有差异性的氨基酸位置选择共有性最高的1个或多个氨基酸，并以此构建哺乳动物尿酸氧化酶突变体库。获得多物种哺乳动物尿酸氧化酶保守性或共有性最高的MU蛋白氨基酸序列，即为如SEQ ID NO：1所示的高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体。
为了进一步提高活性和热稳定性，本发明还SEQ ID NO：1所示的突变体采用包括但不局限于利用全基因合成的方式，合成上述氨基酸序列对应的DNA序列，并通过定点突变的方式，构建不同的哺乳动物尿酸氧化酶突变体DNA序列。定点突变的方法可用本领域技术人员熟知的DNA重组、PCR等各种技术获得，包括但不局限于两轮交错延伸PCR法以及Strantagene的quick change中描述的定点突变方法。
进一步地，在如SEQ ID NO：1所示的基础上，突变E208D、R249Q，可以提高酶比活性和热稳定性，因而本发明还提供了高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体，所述突变体与SEQID NO：1相比包含突变E208D和/或R249Q。所述E208D是指SEQ ID NO：1的第208位的谷氨酸突变为天冬氨酸；R249Q是指SEQ ID NO：1的第249位的精氨酸突变为谷氨酰胺。
在一些实施例中，所述突变体还可以包含其他合适的突变，只要该突变不会大幅降低酶比活性即可。在一些实施例中，所述突变体与如SEQ ID NO：3所示的野生型犬源尿酸氧化酶相比，酶比活性提高至少25％。
在一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、5或7任一所示，此时突变体的序列如SEQ ID NO：1所示，或者包含单突变E208D或R249Q。
根据所述高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体，氨基酸序列可以合成对应的DNA序列或mRNA序列，用于产生尿酸氧化酶突变体。本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明任一方案所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体的序列；优选地，所述核酸分子为DNA或RNA。核酸分子为DNA时，通过DNA的翻译表达，合成所述尿酸氧化酶突变体，用于蛋白生产；RNA可以为mRNA，用于在细胞中瞬时表达。
本发明还提供了一种基因表达框，所述基因表达框含有启动子和和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列，所述编码序列编码本发明任一方案所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体的序列。
在一些实施例中，所述启动子选自乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ或T7来源的启动子系统。
通过氨基酸与核苷酸的对应关系，以及密码子优化，本领域技术人员可以获得不同的核苷酸序列。在一些实施例中，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2、4或6任一所示。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明任一方案所述基因表达框。所述表达载体优选为质粒载体，通过细胞转导可以在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌或其他细胞中表达。
因而，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明任一方案所述核酸分子、基因表达框或表达载体。
在一些实施例中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫、酵母或细菌细胞；优选肠杆菌细胞或酵母细胞。
本发明还提供了一种生产本发明任一方案所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体的方法，包括：在所述宿主细胞中表达所述突变体，并分离纯化。
获得本发明所述哺乳动物尿酸氧化酶突变体蛋白可以从宿主细胞内部或外部(如培养基)分离得到，且纯化为高纯度的均一蛋白。此种蛋白分离纯化的方法不限于任何特定方法，例如柱层析法、过滤法、超滤法、盐析法、等电点沉淀法、透析法等。对于层析，例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶排阻层析、反相层析等都可以应用。这些层析可用液相层析如快速蛋白质液相层析系统来操作。利用通用的蛋白检测方法检测蛋白纯度和浓度，例如HPLC法、SDS-聚丙烯酰胺电泳法、等电点电泳法、BCA法、Lowry法、凯氏定氮法等。利用尿酸底物降解法检测尿酸氧化酶比活性，例如基于底物尿酸在293nm特征吸收峰，利用紫外分光光度计法或高效液相色谱法检测尿酸消耗速率，并计算单位体积尿酸氧化酶活性。通过单体体积尿酸氧化酶活性与单位体积尿酸氧化酶蛋白浓度推算尿酸氧化酶蛋白比活性。通过25-37℃热稳定性检测等方法检测尿酸氧化酶热稳定性。更优的，通过37℃热稳定性检测等方法检测尿酸氧化酶热稳定性。
本发明还提供了所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体在制备尿酸氧化酶药物中的应用。所述尿酸氧化酶药物可以用于治疗高尿酸血症及痛风。
实施例1多物种哺乳动物尿酸氧化酶生物信息学分析及初始突变体设计
基于人源尿酸氧化酶假基因(GenBank:AB074326.2)序列翻译成氨基酸序列，将33位和187位无义突变(nonsense mutantion)分别替换为夜猴源尿酸氧化酶的精氨酸和精氨酸。将该蛋白质序列进行Blast分析，获得一致性(Identity)不低于85％的哺乳动物尿酸氧化酶氨基酸序列。将上述哺乳动物尿酸氧化酶氨基酸序列利用Clustal Omega等软件进行多序列Alignment分析(如图1所示)，获得多物种哺乳动物尿酸氧化酶保守性或共有性最高的MU蛋白氨基酸序列如下：
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO：1)
根据上述氨基酸序列，按照大肠杆菌和酵母菌偏爱密码子进行DNA设计，并委托相应公司进行全基因合成，其DNA序列对应为：
CATATGGCCCATTATCATAATGATTATAAAAAAAATGATGAAGTTGAATTTGTTCGTACCGGTTATGGTAAAGATATGGTTAAAGTTCTGCATATTCAGCGTGATGGTAAATATCATTCTATTAAAGAAGTTGCCACCTCTGTTCAGCTGACCCTGTCTTCTAAAAAAGATTATCTGCATGGTGATAATTCTGATATTATTCCAACCGATACCATTAAAAATACCGTTCATGTTCTGGCCAAATTTAAAGGTATTAAATCTATTGAAACCTTTGCCATGAATATTTGTGAACATTTTCTGTCTTCTTTTAATCATGTTATTCGTGCCCAGGTTTATGTTGAAGAAGTTCCATGGAAACGTTTTGAAAAAAATGGTGTTAAACATGTTCATGCCTTTATTCATACCCCAACCGGTACCCATTTTTGTGAAGTTGAACAGCTGCGTTCTGGTCCACCAGTTATTCATTCTGGTATTAAAGATCTGAAAGTTCTGAAAACCACCCAGTCTGGTTTTGAAGGTTTTATTAAAGATCAGTTTACCACCCTGCCAGAAGTTAAAGATCGTTGTTTTGCCACCCAGGTTTATTGTAAATGGCGTTATCATCAGGGTCGTGATGTTGATTTTGAAGCCACCTGGGATACCGTTCGTGATATTGTTCTGGAAAAATTTGCCGGTCCTTATGATAAAGGTGAATATTCTCCATCTGTTCAGAAAACCCTGTATGATATTCAGGTTCTGTCTCTGTCTCGTGTTCCAGAAATTGAAGATATGGAAATTTCTCTGCCAAATATTCATTATTTTAATATTGATATGTCTAAAATGGGTCTGATTAATAAAGAAGAAGTTCTGCTGCCACTGGATAATCCTTATGGTAAAATTACCGGTACCGTTAAACGTAAACTGAGCTCTCGTCTGTGATAAGGATCC(SEQ ID NO：2)。
将全基因合成的重组质粒扩增后，用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切，回收目的片段，用T4DNA连接酶与同样经NdeⅠ和BamHⅠ酶切回收的质粒pET-3C(Invitrogen)连接，利用如《Current Protocols in Molecular Biology》中所述的标准方法将连接混合物转入大肠杆菌克隆宿主菌TOP10。
在含有氨苄青霉素的LB平板上进行转化反应，过夜生长转化体后，挑取转化后单克隆菌落以制备质粒用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-3C-MU，经DNA测序后确定阳性重组质粒中MU序列与理论序列完全一致。
实施例2多物种哺乳动物尿酸氧化酶重组表达
将上述测序正确的MU重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌并进行表达。使用大肠杆菌BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)或BL21 Star(DE3)plysS、表达MU蛋白。这些菌株仅是许多适用于表达嵌合蛋白中的一些，它们可以分别通过商业渠道自Novagen，Invitrogen及Stratagen获得。利用转化体在含有氨苄青霉素的LB平板上的生长能力可将其鉴别出来。
使含有MU重组质粒的大肠杆菌表达重组菌在含有50ug/ml的氨苄青霉素的液体LB培养基中培养过夜，将上述培养液接种大型的培养物，接种比例为1：100。待这些细胞生长至600nm处光密度为一定值后，加入IPTG使其终浓度为0.5mM诱导表达目标蛋白，继续培养细胞3个小时。随后通过离心收获细胞，用50mM Tris缓冲液洗涤沉淀，离心放置-20度保存，并进行SDS-PAGE检测，表达出的蛋白条带在35kDa附近(如图2所示)。
实施例3多物种哺乳动物尿酸氧化酶突变体库设计
以MU蛋白DNA序列为原始模板，根据共有性高低，分别设计突变位点，举例如下：Q109H(突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸，数字按人源尿酸酶304位氨基酸进行排序)、L146M、S148N、E208D、T213A、S246T、R249Q、V250L。
具体的，以MU为基础进行单个点突变，构建突变体库，并按照实例3、4、5方法进行重组表达、制备及酶比活性检测，筛选出酶比活性有提高的有益突变，排除有害突变，筛选酶比活性最优的哺乳动物尿酸酶突变体。本发明人前期经过系统的研究发现，野生型犬源尿酸酶蛋白酶蛋白(SEQ ID NO：3)比活性较高，故将本发明尿酸酶突变体与重组野生型犬源尿酸酶蛋白(命名为wCU)进行比对研究。野生型犬源尿酸酶氨基酸序列如下：
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSV
QLTLSSKKDYVYGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSF
NHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHNPTGTHFCEVEQMRSGPPVIH
SGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATKVYCKWRYHQGRDVD
FEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVHSLSRVPEMEDMEIS
LPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGRITGTAKRKLASKL(SEQ ID NO：3)。
用交错延伸PCR法突变制备含有目标突变的DNA。下面以制备Q109H为例进行说明：
引物编号 DNA序列
引物1(SEQ ID NO：8) 5'CACGACATATGGCCCATTATCATA3'
引物2(SEQ ID NO：9) 5'GGATCCTTATCACAGACGAGAGCT3'
引物3(SEQ ID NO：10) 5'CGTGCCCACGTTTATGTTGAAGAA3'
引物4(SEQ ID NO：11) 5'ATAAACGTGGGCACGAATAACATG3'
制备MUQ109H：第一阶段PCR:模板序列为实例1中全基因合成序列(SEQ ID NO：2)，引物为表中引物1和引物3，PCR反应体系和方法均采用PCR反应试剂盒，按商家的说明书设置。PCR反应条件为：94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，第一个循环94℃变性10min，最后一个循环72℃延伸10min。按上述PCR条件扩增得到产物MUQ109H-a片段；第二阶段PCR：模板序列同第一阶段PCR，引物为引物2和引物4，按上述PCR条件扩增得到MUQ109H-b片段；第三阶段PCR：模板为MUQ109H-a片段和MUQ109H-b片段的1：1混合溶液，引物为引物1和引物2，按上述PCR条件扩增得到产物MUQ109H。将含突变序列的DNA序列用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切，连接、转化、筛选、表达方法同实例2。
实施例4哺乳动物尿酸酶突变体表达纯化
取50g菌体沉淀加入500ml破菌液，破菌液pH为8.3，含有25mM Tris-HCl，5mMEDTA，0.1mg/ml溶菌酶中，37℃搅拌60至80分钟，然后加入1mM MgCl2·6H2O、1μg·mL-1核酸酶搅拌过夜；4℃，8500r·min-1离心20min，收集破菌沉淀。取破菌沉淀，按100g湿菌：1L洗涤液(25mM Tris-HCl、5mM EDTA、1.5％TritonX-100、pH 8.3)悬浮沉淀，均散后，30℃搅拌2h；8500r·min-1、4℃离心15min，取沉淀按上述相同洗涤液重复洗涤一次，离心收集沉淀。取TritonX-100洗涤沉淀，按100g湿菌：1L洗涤液(PBS、0.34μg·mL-1核酸酶)悬浮沉淀，均散后，30℃搅拌2h，8500r·min-1、4℃离心15min，离心收集沉淀。取PBS和核酸酶洗涤沉淀，仍按100克湿菌：1升洗涤液(PBS)悬浮沉淀，均质机均质后，30℃搅拌2h，8500r·min-1、4℃离心15min，取沉淀按上述相同洗涤液重复洗涤一次，离心收集沉淀。取破菌洗涤后的沉淀，按10g沉淀：3L溶解缓冲液(0.1M Na2CO3-NaHCO3、pH 10.3)溶解，均质机均质后，室温搅拌过夜。8500r·min-1，4℃离心15min，收集离心上清。向上清中补入终浓度为10％饱和度的(NH4)2SO4，4℃静置过夜，8500r·min-1，4℃离心15min，收集离心沉淀；溶解缓冲液溶解，室温搅拌过夜，8500r·min-1，4℃离心15min，收集离心上清。上清进行DEAE琼脂糖阴离子交换层析柱(GE)纯化，目标蛋白全部挂柱后，用线性梯度为0至0.2M的NaCl(pH为10.3，0.1M的Na2CO3-NaHCO3)进行洗脱，目标蛋白在0.1M NaCl时被洗脱；将上述洗脱组分DEAE琼脂糖阴离子交换层析柱(GE)浓缩，用含有0.2M NaCl的(H为10.3，0.1M的Na2CO3-NaHCO3)洗脱液洗脱目标蛋白。此时进行SDS-PAGE和HPLC检测纯度，均可达到95％以上(如图3所示)。
实施例5哺乳动物尿酸酶突变体蛋白活性检测
在37℃、pH8.6时，每分钟转化1μmol尿酸为尿囊素的酶量定义为一个国际单位(IU)。尿酸在293nm处有特征吸收峰，当其被尿酸酶降解后，产物在此波长范围内无吸收峰，定时检测293nm处吸光度的变化来确定尿酸的减少量，然后利用尿酸的摩尔消光系数(1.23×104M-1·CM-1)算出尿酸浓度，根据尿酸浓度的变化可计算尿酸酶活性。将紫外分光光度计调至293nm，待机器稳定后，用0.1M四硼酸钠溶液作为空白调零，取3ml 0.1mM尿酸溶液反应溶解加入石英比色杯中，补入10ul尿酸酶突变体蛋白，每30秒进行一次读数，测量2min内OD293变化值。根据公式C＝A/Kb(C为溶液尿酸浓度，A为293nm吸光值，K为摩尔消光系数-1.23×104M-1·CM-1，b为比色杯的内径)，计算不同时间点OD293对应的尿酸浓度；根据△M＝△CV(△M为尿酸减少的摩尔数，△C为尿酸浓度变化，C为反应液体积)计算减少的尿酸物质的量；根据U＝△M/TV1(U为每毫升血浆含有的尿酸酶活性单位，T为反应分钟，V1为加入反应体系的尿酸酶突变体蛋白体积)计算尿酸酶活性。其中，MU、MUE208D(SEQ ID NO：5)、MUR249Q(SEQ ID NO：7)比活性分别比野生型犬源尿酸酶高约为29.8％、28.9％、34.3％(如图4所示)。
实施例6哺乳动物尿酸酶突变体热稳定性检测
将尿酸酶突变体蛋白用缓冲液(0.1M Na2CO3-NaHCO3、pH 10.3)稀释至1mg/ml，放置于37℃恒温箱中，分别于0h、0.5h、1h后取出部分样品，按实例5方法测定尿酸酶活性，比较酶活保留率。
结果显示，三个尿酸酶突变体的热稳定性都优于野生型犬源尿酸酶，且MUE208D热稳定性最好。
实施例涉及的其他序列
MUE208D核苷酸序列：
CATATGGCCCATTATCATAATGATTATAAAAAAAATGATGAAGTTGAATTTGTTCGTACCGGTTATGGTAAAGATATGGTTAAAGTTCTGCATATTCAGCGTGATGGTAAATATCATTCTATTAAAGAAGTTGCCACCTCTGTTCAGCTGACCCTGTCTTCTAAAAAAGATTATCTGCATGGTGATAATTCTGATATTATTCCAACCGATACCATTAAAAATACCGTTCATGTTCTGGCCAAATTTAAAGGTATTAAATCTATTGAAACCTTTGCCATGAATATTTGTGAACATTTTCTGTCTTCTTTTAATCATGTTATTCGTGCCCAGGTTTATGTTGAAGAAGTTCCATGGAAACGTTTTGAAAAAAATGGTGTTAAACATGTTCATGCCTTTATTCATACCCCAACCGGTACCCATTTTTGTGAAGTTGAACAGCTGCGTTCTGGTCCACCAGTTATTCATTCTGGTATTAAAGATCTGAAAGTTCTGAAAACCACCCAGTCTGGTTTTGAAGGTTTTATTAAAGATCAGTTTACCACCCTGCCAGAAGTTAAAGATCGTTGTTTTGCCACCCAGGTTTATTGTAAATGGCGTTATCATCAGGGTCGTGATGTTGATTTTGATCCACCTGGGATACCGTTCGTGATATTGTTCTGGAAAAATTTGCCGGTCCTTATGATAAAGGTGAATATTCTCCATCTGTTCAGAAAACCCTGTATGATATTCAGGTTCTGTCTCTGTCTCGTGTTCCAGAAATTGAAGATATGGAAATTTCTCTGCCAAATATTCATTATTTTAATATTGATATGTCTAAAATGGGTCTGATTAATAAAGAAGAAGTTCTGCTGCCACTGGATAATCCTTATGGTAAAATTACCGGTACCGTTAAACGTAAACTGAGCTCTCGTCTGTGATAAGGATCC(SEQ ID NO：4)
对应的氨基酸序列：
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFDATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO：5)
MUR249Q核苷酸序列：
CATATGGCCCATTATCATAATGATTATAAAAAAAATGATGAAGTTGAATTTGTTCGTACCGGTTATGGTAAAGATATGGTTAAAGTTCTGCATATTCAGCGTGATGGTAAATATCATTCTATTAAAGAAGTTGCCACCTCTGTTCAGCTGACCCTGTCTTCTAAAAAAGATTATCTGCATGGTGATAATTCTGATATTATTCCAACCGATACCATTAAAAATACCGTTCATGTTCTGGCCAAATTTAAAGGTATTAAATCTATTGAAACCTTTGCCATGAATATTTGTGAACATTTTCTGTCTTCTTTTAATCATGTTATTCGTGCCCAGGTTTATGTTGAAGAAGTTCCATGGAAACGTTTTGAAAAAAATGGTGTTAAACATGTTCATGCCTTTATTCATACCCCAACCGGTACCCATTTTTGTGAAGTTGAACAGCTGCGTTCTGGTCCACCAGTTATTCATTCTGGTATTAAAGATCTGAAAGTTCTGAAAACCACCCAGTCTGGTTTTGAAGGTTTTATTAAAGATCAGTTTACCACCCTGCCAGAAGTTAAAGATCGTTGTTTTGCCACCCAGGTTTATTGTAAATGGCGTTATCATCAGGGTCGTGATGTTGATTTTGAAGCCACCTGGGATACCGTTCGTGATATTGTTCTGGAAAAATTTGCCGGTCCTTATGATAAAGGTGAATATTCTCCATCTGTTCAGAAAACCCTGTATGATATTCAGGTTCTGTCTCTGTCTCAGGTTCCAGAAATTGAAGATATGGAAATTTCTCTGCCAAATATTCATTATTTTAATATTGATATGTCTAAAATGGGTCTGATTAATAAAGAAGAAGTTCTGCTGCCACTGGATAATCCTTATGGTAAAATTACCGGTACCGTTAAACGTAAACTGAGCTCTCGTCTGTGATAAGGATCC(SEQ ID NO：6)。
对应的氨基酸序列：
MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIETFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSQVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL(SEQ ID NO：7)。
最后说明的是，以上的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者与SEQ ID NO：1相比包含突变E208D和/或R249Q。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体与如SEQ ID NO：3所示的野生型犬源尿酸氧化酶相比，酶比活性提高至少25％。
3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、5或7任一所示。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含权利要求1-3任一项所述的高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体的编码序列；优选地，所述核酸分子为DNA或RNA；更优选地，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2、4或6任一所示。
5.一种基因表达框，其特征在于，所述基因表达框含有启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列，所述编码序列为权利要求1-3任一项所述的高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体的编码序列。
6.如权利要求5所述的基因表达框，其特征在于，所述启动子选自乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ或T7来源的启动子系统；所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2、4或6任一所示。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5或6所述的基因表达框。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述核酸分子、权利要求5或6所述的基因表达框，或权利要求7所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫、酵母或细菌细胞；更优选肠杆菌细胞或酵母细胞。
9.一种生产权利要求1-3任一项所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体的方法，包括：在所述宿主细胞中表达所述突变体，并分离纯化。
10.权利要求1-3任一项所述的一种高活性哺乳动物尿酸氧化酶突变体在制备尿酸氧化酶药物中的应用。
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