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CN117304283A - 一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用 - Google Patents

一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用 Download PDF

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CN117304283A
CN117304283A CN202210710799.8A CN202210710799A CN117304283A CN 117304283 A CN117304283 A CN 117304283A CN 202210710799 A CN202210710799 A CN 202210710799A CN 117304283 A CN117304283 A CN 117304283A
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CN
China
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valine
gene
mrec
strain
pkd46
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Pending
Application number
CN202210710799.8A
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张学礼
郭恒华
刘萍萍
张冬竹
唐金磊
刘树蓬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Bayannur Huaheng Biotechnology Co ltd
Hefei Huaheng Biological Engineering Co ltd
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Anhui Huaheng Biotechnology Co Ltd
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Priority to PCT/CN2022/143630 priority patent/WO2023246071A1/zh
Priority to EP22947806.0A priority patent/EP4534549A1/en
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Abstract

本发明提供了一种mreC突变体及其在L‑缬氨酸发酵生产中的应用，该mreC突变体为将野生型mreC氨基酸序列第150位的脯氨酸突变为亮氨酸后所得的蛋白质；通过在微生物基因组中引入mreC的点突变，即野生型mreC基因的编码区核苷酸序列的第450位位置上C突变为T，可以显著提高缬氨酸工程菌株的生产能力和生物量，并通过L‑缬氨酸厌氧发酵途径中相关酶基因的敲除和导入，获得L‑缬氨酸生产过程中适宜的碳代谢流和还原力平衡控制，通过多基因的调控，协调配合形成适宜L‑缬氨酸发酵的代谢途径，实现了在微生物中L‑缬氨酸的高水平合成。

Description

一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用，特别涉及一种mreC突变体及其核酸分子在构建L-缬氨酸工程菌和L-缬氨酸发酵生产中的应用。
背景技术
L-缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一，也是哺乳动物的必需氨基酸和生糖氨基酸之一。L-缬氨酸在饲料、食品和医药、化妆品、抗生素和除草剂等领域有着重要的应用。尤其是在饲料领域，2018年，中国饲料工业协会起草的T/CFIAS 001-2018《仔猪、生长育肥猪配合饲料》团体标准中专门增设了L-缬氨酸的最低限量；2017-2019年期间L-缬氨酸呈现年均复合增长率接近100％的增长趋势；因此未来L-缬氨酸在饲料领域的应用和需求量必将越来越大，市场潜力无限。L-缬氨酸还可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等，因此在食品和医药领域也具有广泛的应用。随着L-缬氨酸由传统饲料添加剂向食品、医药、化妆品等高附加值行业的迅猛发展，在国家政策的引导下，L- 缬氨酸的市场需求量势必会引来突破性增长，L-缬氨酸将成为猪禽日粮中下一个限制性氨基酸。据中国生物发酵产业协会数据显示，2019年全球缬氨酸需求量约3.25万吨，未来增长率达24％，市场潜力巨大。
随着合成生物学和代谢工程的快速发展，以可再生资源为原料，通过微生物发酵实现绿色、环保、高效生产大宗化学品、精细化工品和天然产物等化合物的技术越来越受到重视，并逐渐成为替代石油基化学品的重要力量，呈蓬勃发展之势。目前，L-缬氨酸主要通过发酵法生产获得。目前L-缬氨酸发酵生产多是通过好氧或者两步法发酵实现的，能耗大且转化率低。相较于好氧发酵，厌氧工艺在生产过程中不需要通空气，且产品的转化率通常接近理论最大值，具有低能耗、高转化率的优点，成为近年来的研究热点。野生型菌株厌氧发酵合成L-缬氨酸，胞内大量反馈抑制等调控网络极大地限制了其生产能力，导致L-缬氨酸产量极低。
针对上述技术弊端，现有技术中有针对缬氨酸厌氧发酵过程进行菌株改造，包括对代谢通路中相关酶基因的导入、敲除等以解决辅因子不平衡问题，进而实现厌氧条件下重组菌株高效生产L-缬氨酸，但上述改造的重组菌株在未经驯化的情况下，其发酵生产 L-缬氨酸能力仍有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用。本发明通过在微生物基因组引入可显著改善工程菌株生长和缬氨酸产量的基因组突变，可以显著提高缬氨酸工程菌株的生产能力和生物量。
第一方面，本发明提供了一种mreC突变体，其为由SEQ ID No.:3所示氨基酸序列组成的蛋白质。
进一步地，所述mreC突变体为SEQ ID No.:2所示的EcolC_0457杆状决定蛋白氨基酸序列第150位的脯氨酸突变为亮氨酸后所得的蛋白质。
第二方面，本发明提供了编码上述mreC突变体的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子为(a1)-(a2)中任一种所述的DNA分子：
(a1)编码区是SEQ ID No.:4所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列是SEQ ID No.:4所示的DNA分子。
其中，SEQ ID No.:4所示DNA分子为SEQ.IDNo.:1所示野生型mreC基因的编码区核苷酸序列的第450位引入点突变，将C突变为T。
第三方面，本发明提供了一种生物材料，其为下述(b1)-(b3)中任一种：
(b1)含有上述核酸分子的基因表达盒；
(b2)含有上述核酸分子的重组载体；
(b3)含有上述核酸分子的重组微生物。
进一步地，所述重组载体可为向表达载体或克隆载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。
进一步地，所述重组微生物可为含有上述重组载体的微生物；所述微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。更进一步地，所述细菌可为大肠杆菌。
本发明还提供了下述(c1)-(c2)中任一种应用：
(c1)上述mreC突变体或核酸分子或生物材料在构建L-缬氨酸工程菌的应用；
(c2)上述mreC突变体或核酸分子或生物材料在L-缬氨酸生产中的应用。
本发明还提供了一种L-缬氨酸工程菌的构建方法，包括下述步骤：向微生物中导入上述核酸分子。
其中，微生物为现有技术中任何具有生产L-缬氨酸性能且产L-缬氨酸途径中涉及杆状决定蛋白mreC的微生物；大肠杆菌因遗传背景清晰、基因操作工具方便、底物利用广泛、易培养，并且生长快速等优点，已经成为代谢工程改造中最主要的模式菌株之一，并实现了利用工程菌株生产L-丙氨酸、D-乳酸和丁二酸等化合物的产业化，故优选为大肠杆菌，所述大肠杆菌可以是野生型的，也可以是不影响生产L-缬氨酸目的的任何突变类型的；大肠杆菌MG1655被认为是生物安全的微生物菌株，故更优选为大肠杆菌 MG1655。
在厌氧发酵时，葡萄糖的代谢主要是通过糖酵解途径，1mol葡萄糖代谢生产2mol丙酮酸的同时，会生成2molATP和2molNADH，导致厌氧条件下改造的大肠杆菌中出现氧化还原力供给不平衡的问题，即NADH过剩，而NADPH供给不足。
为解决厌氧发酵时还原力平衡问题，以实现在厌氧条件下高效生产L-缬氨酸，本发明还对上述重组微生物进行下述(d1)-(d2)任一种改造：
(d1)向上述重组微生物中导入NADH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶基因KARI和NADH依赖型亮氨酸脱氢酶基因leuDH，使得酶活性增强；
(d2)向上述重组微生物中导入NADPH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶基因ilvC、和导入NADH依赖型亮氨酸脱氢酶基因leuDH、和激活转氢酶PntAB的活性、和激活NAD 激酶YfjB的活性，使得酶活性增强。
所述“导入”可以以本领域已知的任何合适方式，例如以质粒形式，或者整合入基因组中的形式存在于所述微生物中。
在一个实施方式中，所述整合入基因组中的酶编码基因置于合适的调控元件控制下整合入微生物的基因组中。
在一个实施方式中，将包含酶编码基因和调控元件序列的质粒导入所述微生物中。
所述“激活”可以通过本领域已知的任何方式，例如将待激活的酶编码基因置于合适的调控元件控制下，以使得所述酶基因的表达增强。
调控元件可通过已知的基因工程方法插入目标基因的上游。所述方法包括但不限于以基因重组的方式，例如以同源重组的方式调控元件的序列插入目标基因编码序列上游，以增强目标基因表达的强度。
所述调控元件可选自M1-93人工调控元件、M1-37人工调控元件、M1-46人工调控元件或RBS5人工调控元件。
在一个实施例中，M1-93人工调控元件调控乙酰乳酸合成酶基因ilvBN、乙酰乳酸合成酶基因ilvGM、亮氨酸脱氢酶编码基因leuDH、二羟酸脱水酶编码基因ilvD、转氢酶编码基因pntAB。
在一个实施例中，M1-37人工调控元件调控NAD激酶编码基因yfjB。
在一个实施例中，M1-46人工调控元件调控NADPH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC。
在一个实施例中，RBS5人工调控元件NADH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶编码基因kari。
更进一步地，还包括对重组微生物进行以下(1)-(6)中的改造：
(1)敲除乳酸脱氢酶基因ldhA；
(2)敲除磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA；
(3)敲除醇脱氢酶基因adhE；
(4)敲除富马酸还原酶基因frd和丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB；
(5)敲除甲基乙二醛合酶基因mgsA；
(6)增强乙酰乳酸合成酶AHAS和二羟酸脱水酶ilvD的活性。
本领域技术人员能够理解，可以用现有技术已知的方式进行基因敲除，使得所述酶的活性被降低或失活。所述的敲除操作针对的是出发微生物内源性的酶基因，使得微生物的上述内源性酶活性降低或失活。
在一个实施例中，以整合入所述微生物的基因组的方法完成目标基因的导入、突变或敲除。
在一个实施例中，以同源重组的方法完成所述酶基因的导入、突变或敲除。
在一个实施例中，以两步同源重组的方法完成所述酶基因的导入、突变或敲除。
以两步同源重组的方法导入、突变或敲除目标基因包括如下步骤：
(1)DNA片段I的制备：以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4 838-4844)DNA为模板，使用扩增引物1扩增出DNA片段I，用于第一步同源重组；
(2)第一步同源重组：将pKD46质粒(Datsenko and Wanner2000,Proc NatlAcadSci U SA 97:6640-6645)转化至出发菌株，然后将DNA片段I转至带有pKD46的出发菌株；经菌落PCR验证正确的单菌落命名为重组菌1；
(3)DNA片段II的制备：以出发菌株的基因组DNA为模板，用扩增引物2扩增出D NA片段II，用于第二次同源重组。
(4)第二步同源重组：将DNA片段II转化至重组菌1，经菌落PCR验证正确的单菌落命名为重组菌2。
所述“替换”可以本领域技术人员已知的方式，例如将待插入的基因的编码序列整合到所述微生物染色体中被替换的基因编码序列位点，使得原位点基因编码序列被整合插入的基因的编码序列所取代。
进一步地，还可以通过同源重组等基因工程的方式，以另一基因的编码序列取代上述(1)-(5)中所述酶基因的编码序列，从而使得微生物的上述内源性酶活性降低或失活。替代这些内源性酶的基因可以是待增强表达的基因，如上述的ilvC基因或leuDH基因。
在一个实施方式中，以leuDH基因替换微生物内源性的frd基因来实现第(4)项的敲除；在一个实施方式中，以ilvD基因替换微生物内源性的pflB基因来实现第(4)项的敲除。
在一个实施方式中，以ilvC基因替换微生物内源性的mgsA基因来实现第(5)项的敲除。
其中，所述乙酰乳酸合成酶AHAS包括ilvBN、ilvGM和ilvIH。
优选地，所述ilvIH的活性通过解除缬氨酸对ilvH的反馈抑制得到增强；更优选地，在ilvH基因中引入突变以解除L-缬氨酸的反馈抑制。
就涉及L-缬氨酸生物合成的乙酰羟酸合成酶而言，除了同功酶Ⅱ(这里也称为AHASⅡ)，还知道有同功酶Ⅲ(这里也称为AHASⅢ)。AHASⅢ由ilvIH操纵子编码，该操纵子由编码大亚基(催化亚基)的ilvI和编码小亚基(控制亚基)的ilvH组成。AHASⅢ受 L-缬氨酸的反馈抑制。可采用已报道的方法突变ilvI基因，例如ilvH 14Gly→Asp的氨基酸取代(Vyazmensky,M.等，《生物化学》35:10339-10346(1996))和/或 ilvH 17Ser→Phe(US6737255B2)；以及ilvH612(De Felice等，《细菌学杂志》 120:1058-1067(1974))等。
在一个实施方式中，所述二羟酸脱水酶ilvD的活性通过向微生物中导入ilvD基因而增强。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的L-缬氨酸工程菌。
在一个实施方式中，所述L-缬氨酸工程菌是在基因组中引入mreC突变点(在野生型mreC基因编码区第450位引入点突变，将C变成T，相应的第150位氨基酸从脯氨酸(Proline，P)变成亮氨酸(Leucine，L))所得的重组大肠杆菌。
在一个实施方式中，所述L-缬氨酸工程菌是在基因组中引入上述mreC突变点，并导入NADH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶基因KARI和NADH依赖型亮氨酸脱氢酶基因leuDH所得的重组大肠杆菌。
在一个实施方式中，所述L-缬氨酸工程菌是在基因组中引入上述mreC突变点，并导入NADPH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶基因ilvC和NADH依赖型亮氨酸脱氢酶基因leuDH、激活转氢酶PntAB和NAD激酶YfjB的活性所得的重组大肠杆菌。
本发明还提供了上述L-缬氨酸工程菌在L-缬氨酸生产中的应用。
其中，L-缬氨酸生产为好氧发酵培养、微需氧发酵培养或厌氧发酵培养，优选为厌氧发酵培养。
本发明还提供了一种生产L-缬氨酸的方法，包括下述步骤：
(1)发酵培养上述L-缬氨酸工程菌；
(2)分离并收获L-缬氨酸。
其中，发酵培养为好氧、微需氧或厌氧发酵培养，优选为厌氧发酵培养。
在一个实施方式中，所述厌氧发酵培养包括下述步骤：
(1)种子培养：挑取平板上的克隆接种到种子培养基中，37℃，振荡培养，获得种子培养液；
(2)发酵培养：将种子培养液接种于发酵培养基，37℃，振荡培养，得到发酵液。控制发酵罐的pH在7.0。培养过程不通任何气体。
其中种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20g/L，NH4H2PO4 0.87g/L、(NH4)2HPO4 2.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl 0.15g/L。
微量元素：FeCl3·6H2O 1.5μg/L、CoCl2·6H2O 0.1μg/L、CuCl2·2H2O 0.1μg/L、ZnCl2 0.1μg/L、Na2MoO4·2H2O 0.1μg/L、MnCl2·4H2O 0.2μg/L、H3BO3 0.05μg/L。
发酵培养基和种子培养基成分相同，区别仅在于葡萄糖浓度为50g/L。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：本发明通过在微生物基因组中引入mreC的点突变，有效改善了L-缬氨酸工程菌发酵能力，提高了其发酵生产L-缬氨酸的产量，细胞生物量也显著提高。另外通过L-缬氨酸厌氧发酵途径中相关酶基因的敲除和导入，有效解决了厌氧代谢中还原力不平衡问题，获得了L-缬氨酸生产过程中适宜的碳代谢流和还原力平衡控制，通过多基因的调控，协调配合形成适宜L-缬氨酸发酵的代谢途径，实现了在微生物中一步法厌氧高水平发酵生产L-缬氨酸，且降低了生产成本，具有重大的应用价值。
附图说明
图1是L-缬氨酸的合成途径。
具体实施方式
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的试剂和材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
大肠杆菌因遗传背景清晰、基因操作工具方便、底物利用广泛、易培养，并且生长快速等优点，已经成为代谢工程改造中最主要的模式菌株之一，并实现了利用工程菌株生产L-丙氨酸、D-乳酸和丁二酸等化合物的产业化。大肠杆菌MG1655被认为是生物安全的微生物菌株，使用该菌株构建的细胞工厂生产的化合物将在医药、食品等领域具有极大的应用潜力。本发明申请人通过前期菌株驯化筛选出一批能高效生产L-缬氨酸的重组菌株，并通过对出发菌株和这批重组菌株分别进行基因组测序，发现部分重组菌株的基因组中编码EcolC_0457杆状决定蛋白的mreC基因发生了点突变。因此，在微生物基因组中引入mreC基因点突变将对L-缬氨酸生产菌株的构建及L-缬氨酸高效发酵生产具有重要意义。下述实施例中，以大肠杆菌MG1655为出发菌，提供了可以显著改善工程菌株(大肠杆菌MG1655经改造所得生产菌)生长和L-缬氨酸产量的基因组突变(mreC 的点突变)。mreC基因编码EcolC_0457杆状决定蛋白，通过在大肠杆菌MG1655经改造所得生产菌的基因组中引入该点突变，可以显著提高L-缬氨酸工程菌株的生产能力和生物量。
本研究中使用的菌株和质粒详见表1，所用引物详见表2。
表1本发明使用的菌株和质粒
表2本发明使用的引物及序列信息
实施例1：MG1655菌株中乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除
从野生型大肠杆菌MG1655菌株出发，采用两步同源重组的方法敲除乳酸脱氢酶基因ldhA，具体步骤如下：
1.1、重组菌株SvalM001的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA(Tan,et al.,Appl Environ Microbiol,2013,79:4838-4844)为模板，使用引物ldhA-cs-up/ldhA-cs-dwon扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
扩增体系为：Phusion 5X缓冲液(NewEngland Biolabs)10μl、dNTP(每种dNTP各10mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶 (2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。
扩增条件为：98℃预变性2min(1个循环)；98℃变性10s、56℃退火10s、72℃延伸2min(30个循环)；72℃延伸10min(1个循环)。
2)将DNA片段I电转至野生型大肠杆菌MG1655，获得SvalM001菌株
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒(购买于美国耶鲁大学 CGSC大肠杆菌保藏中心，CGSC#7739)通过电转化法转化至野生型大肠杆菌MG1655 (记作pKD46-MG1655)，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌MG1655 (pKD46-MG1655)，获得重组菌株SvalM001。
电转条件为：首先准备带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(记作pKD46-MG1655) 的电转化感受态细胞(感受态细胞的制备方法参阅文献：Dower et al.，1988， NucleicAcids Res16：6127-6145)；然后将50μl pKD46-MG1655感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，冰上放置2min，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用 MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv，电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。孵育结束后，取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的 LB平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证，所用引物为 XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，正确的菌落扩增产物为3448bp的片段，挑选一个正确的单菌落，命名为SvalM001。
1.2、重组菌株SvalM002的构建
1)以野生型大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，采用同步骤1.1的扩增体系和扩增条件，用引物XZ-ldhA-up/ldhA-del-down扩增出476bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至重组菌株SvalM001，获得SvalM002菌株
将DNA片段II用于第二次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM001(记作pKD46-SvalM001)，然后将DNA片段II电转至pKD46-SvalM001，获得SvalM002菌株。
电转条件为：首先准备pKD46-SvalM001的电转化感受态细胞；然后将50μl pKD46-SvalM001感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2min，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv，电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育4h。然后将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的氯化钠的 LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24h后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down进行菌落PCR 验证，正确的菌落扩增产物为829bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为 SvalM002。
实施例2：磷酸乙酰转移酶编码基因pta和乙酸激酶编码基因ackA的敲除
从重组菌株SvalM002出发，通过两步同源重组的方法敲除磷酸乙酰转移酶编码基因pta和乙酸激酶编码基因ackA，具体步骤如下：
2.1、重组菌株SvalM003的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物ackA-cs-up/pta-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将DNA片段I电转至SvalM002菌株，获得SvalM003菌株
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM002(记作pKD46-SvalM002)，然后将DNA片段I电转至pKD46-SvalM002。
电转条件和步骤同实施例1步骤1.1中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取 200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down进行菌落PCR验证，正确的PCR产物应该3351bp，挑选一个正确的单菌落，命名为SvalM003。
2.2、重组菌株SvalM004的构建
1)以野生型大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，采用同步骤1.1的扩增体系和扩增条件，用引物XZ-ackA-up/ackA-del-down扩增出371bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至菌株SvalM003，获得SvalM004菌株
将DNA片段II用于第二次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至菌株SvalM003(记作pKD46-SvalM003)，然后将DNA片段II电转至pKD46-SvalM003，获得SvalM004菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育4h。然后将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24h后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为732bp 的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM004。
实施例3：乙酰乳酸合成酶基因ilvBN的调控
使用人工调控元件M1-93通过两步同源重组的方法调控乙酰乳酸合成酶基因ilvBN 的表达，具体步骤如下：
3.1、重组菌株SvalM005的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物ilvB pro-catup/ilvB pro-catdown扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将DNA片段I电转至SvalM004菌株，获得SvalM005菌株
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM004(记作pKD46-SvalM004)，然后将DNA片段I电转至pKD46-SvalM004。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取 200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物ilvB pro-YZup/ilvB pro-YZdown进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为2996bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM005。
3.2、重组菌株SvalM006的构建
1)以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2012,93:2455-2462)的基因组DNA 为模板，用引物ilvB pro-up/ilvB pro-down扩增出188bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至菌株SvalM005，获得SvalM006菌株
将DNA片段II用于第二次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至菌株SvalM005(记作pKD46-SvalM005)，然后将DNA片段II电转至pKD46-SvalM005，获得SvalM006菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育4h。然后将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装 50ml培养基)，培养24h后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。使用引物ilvB pro-YZup/ilvB pro-YZdown进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为 465bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM006。
实施例4：乙酰乳酸合成酶基因ilvGM的调控
使用人工调控元件M1-93通过两步同源重组的方法调控乙酰乳酸合成酶基因ilvGM 的表达，具体步骤如下：
4.1、重组菌株SvalM007菌株的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物ilvG pro-catup/ilvG pro-catdown扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将DNA片段I电转至SvalM006菌株，获得SvalM007菌株
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM006(记作pKD46-SvalM006)，然后将DNA片段I电转至pKD46-SvalM006。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取 200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物ilvG pro-YZup/ilvG p-YZdown进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为2993bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM007。
4.2、重组菌株SvalM008的构建
1)以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2012,93:2455-2462)的基因组DNA 为模板，用引物ilvG pro-up/ilvG pro-down扩增出188bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至菌株SvalM007，获得SvalM008菌株
将DNA片段II用于第二次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至菌株SvalM007(记作pKD46-SvalM007)，然后将DNA片段II电转至pKD46-SvalM007，获得SvalM008菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育4h。然后将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装 50ml培养基)，培养24h后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。使用引物ilvG pro-YZup/ilvG p-YZdown进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为 462bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM008。
实施例5：乙酰乳酸合成酶基因ilvH的突变
通过两步同源重组的方法在ilvH基因中引入突变解除L-缬氨酸的反馈抑制，具体步骤如下：
5.1、重组菌株SvalM009的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物ilvH*-cat-up/ilvH*-cat-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将DNA片段I电转至SvalM008菌株，获得SvalM009菌株
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM008(记作pKD46-SvalM008)，然后将DNA片段I电转至pKD46-SvalM008。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取 200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物ilvH*-mutYZ-up/ilvH*-mut-down 进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为3165bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM009。
5.2、重组菌株SvalM010的构建
1)以野生型大肠杆菌MG1655的DNA为模板，用引物ilvH*-mut-up/ilvH*-mut-down扩增出467bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至菌株SvalM009，获得SvalM010菌株
将DNA片段II用于第二次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至菌株SvalM009(记作pKD46-SvalM009)，然后将DNA片段II电转至pKD46-SvalM009，获得SvalM010菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育4h。然后将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装 50ml培养基)，培养24h后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。使用引物ilvH*-mutYZ-up/ilvH*-mut-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为 619bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM010。
实施例6：NADH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶编码基因kari在醇脱氢酶基因adhE位点的整合
乙酰羟基酸还原异构酶编码基因kari是根据文献报道(Brinkmann-Chen,S.,Cahn,J. K.B.&Arnold,F.H.Uncovering rare NADH-preferring ketol-acidreductoisomerases. Metab Eng 26,17-22,doi:10.1016/j.ymben.2014.08.003(2014).)的来自Thermacetogenium phaeum菌株的kari序列并经过密码子优化后通过全基因合成获得，合成时在kari基因前加上RBS5人工调控元件用于启动kari基因的表达，插入pUC57载体，构建获得质粒pUC57-RBS5-kari(南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成和载体构建)。将RBS5 人工调控元件和kari基因一起通过两步同源重组的方法整合到SvalM010菌株中醇脱氢酶编码基因adhE位点。具体步骤如下：
6.1、重组菌株SvalM011的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物adhE-cs-up/adhE-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将DNA片段I电转至SvalM010菌株，获得SvalM011菌株
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM010(记作pKD46-SvalM0010)，然后将DNA片段I电转至pKD46-SvalM010。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取 200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物XZ-adhE-up/XZ-adhE-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为3167bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM011。
6.2、重组菌株SvalM012的构建
1)以pUC57-RBS5-kari质粒DNA为模板，用引物adhE-RBS5-up/adhE-kari-down 扩增出1188bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至菌株SvalM011，获得SvalM012菌株
将DNA片段II用于第二次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至菌株SvalM011(记作pKD46-SvalM011)，然后将DNA片段II电转至pKD46-SvalM011，获得SvalM012菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育4h。然后将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装 50ml培养基)，培养24h后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。使用引物XZ-adhE-up/XZ-adhE-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为1636bp 的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM012。
实施例7：二羟酸脱水酶编码基因ilvD的整合
从SvalM012出发，通过两步同源重组的方法将来自大肠杆菌的二羟酸脱水酶编码基因ilvD和控制ilvD表达的启动子RBSL4一起整合到丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB 位点并替换掉pflB基因，即在整合ilvD的同时敲除pflB基因。具体步骤如下：
7.1、重组菌株SvalM013的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物pflB-CS-up/pflB-CS-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将DNA片段I电转至SvalM012菌株，获得SvalM013菌株
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM012(记作pKD46-SvalM0012)，然后将DNA片段I电转至pKD46-SvalM012。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取 200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物XZ-pflB-up600/XZ-pflB-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为3675bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM013。
7.2、重组菌株SvalM014的构建
1)以大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，用引物 ilvD-RBSL4-up/ilvD-pflB-down扩增出1922bp的片段1。以M1-93(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物RBSL4-pflB-up/ RBSL4-ilvD-down扩增出159bp的DNA片段2。使用同实施例1中所述PCR方法，分别加入20ng片段1和片段2，用引物RBSL4-pflB-up/ilvD-pflB-down进行融合PCR，获得2040bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至菌株SvalM013，获得SvalM014菌株
将DNA片段II用于第二次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至菌株SvalM013(记作pKD46-SvalM013)，然后将DNA片段II电转至pKD46-SvalM013，获得SvalM014菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育4h。然后将菌液转移至含有10％蔗糖的没有氯化钠的氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装 50ml培养基)，培养24h后在含有6％蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。使用引物XZ-pflB-up600/XZ-pflB-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为 2996bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM014。
实施例8：亮氨酸脱氢酶编码基因leuDH的克隆与整合
亮氨酸脱氢酶基因leuDH是根据文献报道(Ohshima,T.et.al,Properties ofcrystalline leucine dehydrogenase from Bacillus sphaericus.The Journal ofbiological chemistry253, 5719-5725(1978))的来自Lysinibacillus sphaericus IFO3525菌株的leuDH序列并经过密码子优化后通过全基因合成获得，合成时在leuDH基因前加上M1-93人工调控元件用于启动leuDH基因的表达，插入pUC57载体，构建获得质粒pUC57-M1-93-leuDH(南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成和载体构建)。将M1-93人工调控元件和leuDH 基因一起通过两步同源重组的方法整合到SvalM014菌株中富马酸还原酶编码基因frd 位点并替换掉frd基因，即在整合leuDH的同时敲除frd基因。具体步骤包括：
8.1、重组菌株SvalM015的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物frd-cs-up/frd-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将DNA片段I电转至SvalM014菌株，获得SvalM015菌株
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM014(记作pKD46-SvalM0014)，然后将DNA片段I电转至pKD46-SvalM014。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1中第2)步的电转条件。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取 200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物XZ-frd-up/XZ-frd-down进行菌落 PCR验证，正确的菌落扩增产物为3493bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM015。
8.2、重组菌株SvalM016的构建
1)以pUC57-M1-93-leuDH质粒DNA为模板，用引物frd-M93-up/frd-leuDH-down 扩增出1283bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至菌株SvalM015，获得SvalM016菌株
将DNA片段II用于第二次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至菌株SvalM013(记作pKD46-SvalM013)，然后将DNA片段II电转至pKD46-SvalM013，获得SvalM014菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2的第2)步。使用引物 XZ-pflB-up600/XZ-pflB-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为2057bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM016。
实施例9：甲基乙二醛合酶编码基因mgsA的敲除和NADPH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC在甲基乙二醛合酶编码基因mgsA位点的整合
从SvalM016出发，通过两步同源重组的方法进行甲基乙二醛合酶编码基因mgsA的敲除和NADPH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶编码基因ilvC在甲基乙二醛合酶编码基因mgsA位点的整合。具体步骤包括：
9.1、重组菌株SvalM017的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物mgsA-cs-up/mgsA-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将DNA片段I电转至SvalM016菌株，获得SvalM017菌株
将DNA片段I用于第一次同源重组：首先将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM016(记作pKD46-SvalM0016)，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌SvalM016(pKD46-SvalM016)。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1的第2)步。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物XZ-mgsA-up/XZ-mgsA-down进行菌落PCR 验证，正确的菌落扩增产物为3646bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为 SvalM017。
9.2、重组菌株SvalM018的构建
1)以野生型大肠杆菌MG1655的DNA为模板，用引物XZ-mgsA-up/mgsA-del-down 扩增出566bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至带有pKD46的菌株SvalM017(记作pKD46-SvalM017)，获得SvalM018菌株。电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2的第2)步，使用引物 XZ-mgsA-up/XZ-mgsA-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为1027bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM018。
9.3、重组菌株SvalM019的构建
1)以野生型大肠杆菌MG1655的DNA为模板，用引物ilvC-M46-up/ilvC-mgsA-down扩增出1547bp的片段1。以M1-46(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93:2455-2462)的基因组DNA为模板，使用引物M46-mgsA-up/M46-ilvC-down扩增出160bp的片段2。使用同实施例1中所述PCR方法，分别加入20ng片段1和片段 2，用引物M46-mgsA-up/ilvC-mgsA-down进行融合PCR，获得1664bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将DNA片段II电转至带有pKD46的菌株SvalM017，获得SvalM019菌株。电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2的第2)步，使用引物XZ-mgsA-up/XZ-mgsA-down 进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为2591bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM019。
实施例10：转氢酶基因pntAB的调控
从SvalM019出发，使用人工调控元件调控pntAB基因的表达从而激活转氢酶PntAB的活性合。具体步骤包括：
10.1、重组菌株SvalM020的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物pntAB-cs-up/pntAB-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM019(记作pKD46-SvalM0019)，将 DNA片段I电转至菌株pKD46-SvalM0019，获得SvalM020菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1的第2)步。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物pntAB-YZ-up/pntAB-YZ-down进行菌落 PCR验证，正确的菌落扩增产物为3459bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM020。
10.2、重组菌株SvalM021的构建
1)以M1-93的基因组DNA为模板，用引物pntAB-P-up/pntAB-M93-down扩增出188bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM020(记作pKD46-SvalM020)，将 DNA片段II电转至菌株pKD46-SvalM020，获得SvalM021菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2的第2)步，使用引物 pntAB-YZ-up/pntAB-YZ-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为928bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM021。
实施例11：NAD激酶编码基因yfjB的调控
从SvalM021出发，使用人工调控元件调控NAD激酶基因yfjB的表达从而激活NAD激酶YfjB的活性，使转氢酶和NAD激酶一起实现辅因子供给平衡。具体步骤包括：
11.1、重组菌株SvalM022的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物yfjb-cs-up/yfjb-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM021(记作pKD46-SvalM0021)，将 DNA片段I电转至菌株pKD46-SvalM0021，获得SvalM022菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1的第2)步。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物yfjb-YZ-up/yfjb-YZ-down进行菌落PCR 验证，正确的菌落扩增产物为3542bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为 SvalM022。
11.2、重组菌株SvalM023的构建
1)以M1-37(Lu,et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2012,93:2455-2462)的基因组DNA 为模板，用引物yfjb-P-up/yfjb-M37-down扩增出188bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM022(记作pKD46-SvalM022)，将 DNA片段II电转至菌株pKD46-SvalM022，获得SvalM023菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2的第2)步，使用引物yfjb-YZ-up/ yfjb-YZ-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为1011bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM023。
实施例12：醇脱氢酶基因adhE位点的敲除
从SvalM023出发，通过两步同源重组的方法敲除醇脱氢酶基因adhE和整合在该位点的kari基因。具体步骤包括：
12.1、重组菌株SvalM024的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物adhE-cs-up/adhE-cs-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM023(记作pKD46-SvalM023)，将 DNA片段I电转至菌株pKD46-SvalM023，获得SvalM024菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1的第2)步。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物XZ-adhE-up/XZ-adhE-down进行菌落PCR 验证，正确的菌落扩增产物为3167bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为 SvalM024。
12.2、重组菌株SvalM025的构建
1)以野生型大肠杆菌MG1655的DNA为模板，用引物XZ-adhE-up/adhE-del-down 扩增出271bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM024(记作pKD46-SvalM024)，将 DNA片段II电转至pKD46-SvalM024，获得SvalM025菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2的第2)步，使用引物 XZ-adhE-up/XZ-adhE-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为548bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM025。
实施例13：基因组mreC点突变的引入
从SvalM018菌株出发，通过两步同源重组的方法在SEQ.IDNo.:1所示野生型mreC基因编码区第450位引入点突变，将C变成T(突变后核苷酸序列如SEQ ID No.:4所示)，相应的其编码的SEQ ID No.:2所示EcolC_0457杆状决定蛋白的第150位氨基酸从脯氨酸(Proline，P)变成亮氨酸(Leucine，L)(突变后氨基酸序列如SEQ ID No.:3所示)，获得菌株SvalM027。具体步骤如下：
13.1、重组菌株SvalM026的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物cat-mreC-up/SacB-mreC-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM018(记作pKD46-SvalM018)，将 DNA片段I电转至菌株pKD46-SvalM018，获得SvalM026菌株。
电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1的第2)步。电击后迅速将1ml LB液体培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2h。然后取200μl菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/ml)和氯霉素(终浓度为34μg/ml)的LB固体平板上，30℃过夜培养后，挑选单菌落，使用引物mreC-YZ490-up/mreC-YZ885-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为3994bp的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM026。
13.2、重组菌株SvalM027的构建
1)以野生型大肠杆菌MG1655的DNA为模板，用引物mreC-up/mreCmut-down扩增出552bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM026(记作pKD46-SvalM026)，将 DNA片段II电转至菌株pKD46-SvalM026，获得SvalM027菌株。
其中，电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2的第2)步，使用引物 mreC-YZ490-up/mreC-YZ885-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为1375bp 的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM027。
从SvalM025菌株出发，使用同SvalM027相同的方法在SEQ.IDNo.:1所示野生型mreC基因编码区第450位引入点突变，将C变成T(突变后核苷酸序列如SEQ ID No.:4 所示)，相应的其编码的SEQ ID No.:2所示EcolC_0457杆状决定蛋白的第150位氨基酸从脯氨酸(Proline，P)变成亮氨酸(Leucine，L)(突变后氨基酸序列如SEQ ID No.:3 所示)，获得重组菌株SvalM029。具体步骤如下：
13.3、重组菌株SvalM028的构建
1)以pXZ-CS质粒DNA为模板，采用同实施例1中步骤1.1的扩增体系和扩增条件，使用引物cat-mreC-up/SacB-mreC-down扩增出2719bp的DNA片段I，用于第一步同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM025(记作pKD46-SvalM025)，将 DNA片段I电转至菌株pKD46-SvalM025，获得SvalM028菌株。
其中，电转条件和步骤同实施例1中步骤1.1的第2)步。使用引物 mreC-YZ490-up/mreC-YZ885-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为3994bp 的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM028。
13.4、重组菌株SvalM029的构建
1)以野生型大肠杆菌MG1655的DNA为模板，用引物mreC-up/mreCmut-down扩增出552bp的DNA片段II，用于第二次同源重组。
2)将pKD46质粒通过电转化法转化至SvalM028(记作pKD46-SvalM028)，将 DNA片段II电转至菌株pKD46-SvalM028，获得SvalM029菌株。
其中，电转条件和步骤同实施例1中步骤1.2的第2)步，使用引物 mreC-YZ490-up/mreC-YZ885-down进行菌落PCR验证，正确的菌落扩增产物为1375bp 的片段，挑选一个正确的单菌落，将其命名为SvalM029。
实施例14：重组菌株发酵生产L-缬氨酸
种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20g/L，NH4H2PO4 0.87g/L、(NH4)2HPO4 2.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl 0.15g/L。
微量元素：FeCl3·6H2O 1.5μg/L、CoCl2·6H2O 0.1μg/L、CuCl2·2H2O 0.1μg/L、ZnCl2 0.1μg/L、Na2MoO4·2H2O 0.1μg/L、MnCl2·4H2O 0.2μg/L,H3BO3 0.05μg/L。
发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别仅在于葡萄糖浓度为50g/L。
SvalM029菌株厌氧发酵生产L-缬氨酸包括以下步骤：
(1)种子培养：将LB固体平板上新鲜的克隆接种到含有4ml种子培养基的试管中，37℃，250rpm振荡培养过夜。然后按照2％(V/V)的接种量将培养物转接到含有30ml 种子培养基的250ml三角瓶中，在37℃，250rpm振荡培养12h，得到种子培养液，用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：500ml厌氧罐中发酵培养基体积为250ml，将种子培养液按照终浓度OD550＝0.1的接种量接种于发酵培养基中，37℃，150rpm，发酵72h，得到发酵液。
其中，使用的中和剂为7M氨水，使发酵罐的pH控制在7.0，培养过程中不通任何气体。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1260)高效液相色谱仪对发酵72h的发酵液组分进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Biorad)公司的Aminex HPX–87H有机酸分析柱。氨基酸测定使用Sielc氨基酸分析柱primesep 100 250×4.6mm。
采用上述同样发酵方法，分别利用SvalM018菌株、SvalM027菌株、SvalM025菌株进行厌氧发酵生产L-缬氨酸及分析检测，结果如表3所示。
表3重组菌株厌氧发酵生产缬氨酸
由表3可见，对于使用NADH依赖型KARI和NADH依赖型LeuDH相结合生产缬氨酸的工程菌(重组菌株SvalM018)，引入基因组点突变后(重组菌株SvalM027)能够使缬氨酸产量提高291％；而对于使用NADPH依赖型IlvC、NADH依赖型LeuDH、转氢酶PntAB和NAD激酶YfjB相结合生产缬氨酸的工程菌(重组菌株SvalM025)，引入基因组点突变后(重组菌株SvalM029)能够使缬氨酸产量提高325％。综上可见，在基因组中引入mreC的点突变可以有效提高缬氨酸工程菌的生产能力，同时细胞的生物量也有显著提高。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽华恒生物科技股份有限公司
中国科学院天津工业生物技术研究所
合肥华恒生物工程有限公司
巴彦淖尔华恒生物科技有限公司
<120> 一种mreC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagccaa tttttagccg tggcccgtcg ctacagattc gccttattct ggcggtgctg 60
gtggcgctcg gcattattat tgccgacagc cgcctgggga cgttcagtca aatccgtact 120
tatatggata ccgccgtcag tcctttctac tttgtttcca atgctcctcg tgaattgctg 180
gatggcgtat cgcagacgct ggcctcgcgt gaccaattag aacttgaaaa ccgggcgtta 240
cgtcaggaac tgttgctgaa aaacagtgaa ctgctgatgc ttggacaata caaacaggag 300
aacgcgcgtc tgcgcgagct gctgggttcc ccgctgcgtc aggatgagca gaaaatggtg 360
actcaggtta tctccacggt taacgatcct tatagcgatc aagttgttat cgataaaggt 420
agcgttaatg gcgtttatga aggccagccg gtcatcagcg acaaaggtgt tgttggtcag 480
gtggtggccg tcgctaaact gaccagtcgc gtgctgctga tttgtgatgc gacccacgcg 540
ctgccaatcc aggtgctgcg caacgatatc cgcgtaattg cagccggtaa cggttgtacg 600
gatgatttgc agcttgagca tctgccggcg aatacggata ttcgtgttgg tgatgtgctg 660
gtgacttccg gtctgggcgg tcgtttcccg gaaggctatc cggtcgcggt tgtctcttcc 720
gtaaaactcg atacccagcg cgcttatact gtgattcagg cgcgtccgac tgcagggctg 780
caacgtttgc gttatctgct gctgctgtgg ggggcagatc gtaacggcgc taacccgatg 840
acgccggaag aggtgcatcg tgttgctaat gaacgtctga tgcagatgat gccgcaggta 900
ttgccttcgc cagacgcgat ggggccaaag ttacctgaac cggcaacggg gatcgctcag 960
ccgactccgc agcaaccggc gacaggaaat gcagctactg cgcctgctgc gccgacacag 1020
cctgctgcta atcgctctcc acaaagggct acgccgccgc aaagtggtgc tcaaccgcct 1080
gcgcgtgcgc cgggagggca atag 1104
<210> 2
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Pro Ile Phe Ser Arg Gly Pro Ser Leu Gln Ile Arg Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Val Leu Val Ala Leu Gly Ile Ile Ile Ala Asp Ser Arg Leu
20 25 30
Gly Thr Phe Ser Gln Ile Arg Thr Tyr Met Asp Thr Ala Val Ser Pro
35 40 45
Phe Tyr Phe Val Ser Asn Ala Pro Arg Glu Leu Leu Asp Gly Val Ser
50 55 60
Gln Thr Leu Ala Ser Arg Asp Gln Leu Glu Leu Glu Asn Arg Ala Leu
65 70 75 80
Arg Gln Glu Leu Leu Leu Lys Asn Ser Glu Leu Leu Met Leu Gly Gln
85 90 95
Tyr Lys Gln Glu Asn Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Gly Ser Pro Leu
100 105 110
Arg Gln Asp Glu Gln Lys Met Val Thr Gln Val Ile Ser Thr Val Asn
115 120 125
Asp Pro Tyr Ser Asp Gln Val Val Ile Asp Lys Gly Ser Val Asn Gly
130 135 140
Val Tyr Glu Gly Gln Pro Val Ile Ser Asp Lys Gly Val Val Gly Gln
145 150 155 160
Val Val Ala Val Ala Lys Leu Thr Ser Arg Val Leu Leu Ile Cys Asp
165 170 175
Ala Thr His Ala Leu Pro Ile Gln Val Leu Arg Asn Asp Ile Arg Val
180 185 190
Ile Ala Ala Gly Asn Gly Cys Thr Asp Asp Leu Gln Leu Glu His Leu
195 200 205
Pro Ala Asn Thr Asp Ile Arg Val Gly Asp Val Leu Val Thr Ser Gly
210 215 220
Leu Gly Gly Arg Phe Pro Glu Gly Tyr Pro Val Ala Val Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Lys Leu Asp Thr Gln Arg Ala Tyr Thr Val Ile Gln Ala Arg Pro
245 250 255
Thr Ala Gly Leu Gln Arg Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Leu Trp Gly Ala
260 265 270
Asp Arg Asn Gly Ala Asn Pro Met Thr Pro Glu Glu Val His Arg Val
275 280 285
Ala Asn Glu Arg Leu Met Gln Met Met Pro Gln Val Leu Pro Ser Pro
290 295 300
Asp Ala Met Gly Pro Lys Leu Pro Glu Pro Ala Thr Gly Ile Ala Gln
305 310 315 320
Pro Thr Pro Gln Gln Pro Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Ala Pro Ala
325 330 335
Ala Pro Thr Gln Pro Ala Ala Asn Arg Ser Pro Gln Arg Ala Thr Pro
340 345 350
Pro Gln Ser Gly Ala Gln Pro Pro Ala Arg Ala Pro Gly Gly Gln
355 360 365
<210> 3
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Lys Pro Ile Phe Ser Arg Gly Pro Ser Leu Gln Ile Arg Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Val Leu Val Ala Leu Gly Ile Ile Ile Ala Asp Ser Arg Leu
20 25 30
Gly Thr Phe Ser Gln Ile Arg Thr Tyr Met Asp Thr Ala Val Ser Pro
35 40 45
Phe Tyr Phe Val Ser Asn Ala Pro Arg Glu Leu Leu Asp Gly Val Ser
50 55 60
Gln Thr Leu Ala Ser Arg Asp Gln Leu Glu Leu Glu Asn Arg Ala Leu
65 70 75 80
Arg Gln Glu Leu Leu Leu Lys Asn Ser Glu Leu Leu Met Leu Gly Gln
85 90 95
Tyr Lys Gln Glu Asn Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Gly Ser Pro Leu
100 105 110
Arg Gln Asp Glu Gln Lys Met Val Thr Gln Val Ile Ser Thr Val Asn
115 120 125
Asp Pro Tyr Ser Asp Gln Val Val Ile Asp Lys Gly Ser Val Asn Gly
130 135 140
Val Tyr Glu Gly Gln Leu Val Ile Ser Asp Lys Gly Val Val Gly Gln
145 150 155 160
Val Val Ala Val Ala Lys Leu Thr Ser Arg Val Leu Leu Ile Cys Asp
165 170 175
Ala Thr His Ala Leu Pro Ile Gln Val Leu Arg Asn Asp Ile Arg Val
180 185 190
Ile Ala Ala Gly Asn Gly Cys Thr Asp Asp Leu Gln Leu Glu His Leu
195 200 205
Pro Ala Asn Thr Asp Ile Arg Val Gly Asp Val Leu Val Thr Ser Gly
210 215 220
Leu Gly Gly Arg Phe Pro Glu Gly Tyr Pro Val Ala Val Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Lys Leu Asp Thr Gln Arg Ala Tyr Thr Val Ile Gln Ala Arg Pro
245 250 255
Thr Ala Gly Leu Gln Arg Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Leu Trp Gly Ala
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Pro Thr Pro Gln Gln Pro Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Ala Pro Ala
325 330 335
Ala Pro Thr Gln Pro Ala Ala Asn Arg Ser Pro Gln Arg Ala Thr Pro
340 345 350
Pro Gln Ser Gly Ala Gln Pro Pro Ala Arg Ala Pro Gly Gly Gln
355 360 365
<210> 4
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaagccaa tttttagccg tggcccgtcg ctacagattc gccttattct ggcggtgctg 60
gtggcgctcg gcattattat tgccgacagc cgcctgggga cgttcagtca aatccgtact 120
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actcaggtta tctccacggt taacgatcct tatagcgatc aagttgttat cgataaaggt 420
agcgttaatg gcgtttatga aggccagctg gtcatcagcg acaaaggtgt tgttggtcag 480
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gatgatttgc agcttgagca tctgccggcg aatacggata ttcgtgttgg tgatgtgctg 660
gtgacttccg gtctgggcgg tcgtttcccg gaaggctatc cggtcgcggt tgtctcttcc 720
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ccgactccgc agcaaccggc gacaggaaat gcagctactg cgcctgctgc gccgacacag 1020
cctgctgcta atcgctctcc acaaagggct acgccgccgc aaagtggtgc tcaaccgcct 1080
gcgcgtgcgc cgggagggca atag 1104

Claims (14)

1.一种mreC突变体，其为由SEQ ID No.:3所示氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的mreC突变体，其特征在于，所述mreC突变体为SEQ ID No.:2所示的杆状决定蛋白氨基酸序列第150位的脯氨酸突变为亮氨酸后所得的蛋白质。
3.编码权利要求1所述mreC突变体的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为(a1)或(a2)所述的DNA分子：
(a1)编码区是SEQ ID No.:4所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列是SEQ ID No.:4所示的DNA分子；
所述SEQ ID No.:4所示的DNA分子为SEQ. IDNo.:1所示野生型mreC基因的编码区核苷酸序列的第450位位置上C突变为T。
5.一种生物材料，其为下述(b1)-(b3)中任一种：
(b1)含有权利要求3或4所述核酸分子的基因表达盒；
(b2)含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体；
(b3)含有权利要求3或4所述核酸分子的重组微生物。
6.下述(c1)-(c2)中的任一种应用：
(c1)权利要求1或2所述mreC突变体或权利要求3或4所述核酸分子或权利要求5所述生物材料在构建L-缬氨酸工程菌的应用；
(c2)权利要求1或2所述mreC突变体或权利要求3或4所述核酸分子或权利要求5所述生物材料在L-缬氨酸生产中的应用。
7.一种L-缬氨酸工程菌的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：向微生物中导入权利要求3或4所述核酸分子。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：还包括进行下述(d1)或(d2)的改造：
(d1)向权利要求7所述重组微生物中导入NADH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶基因KARI和NADH依赖型亮氨酸脱氢酶基因leuDH，使得酶活性增强；
(d2)向权利要求7所述重组微生物中导入NADPH依赖型乙酰羟基酸还原异构酶基因ilvC、和导入NADH依赖型亮氨酸脱氢酶基因leuDH、和激活转氢酶PntAB的活性、和激活NAD激酶YfjB的活性，使得酶活性增强。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：还包括对重组微生物进行以下(1)-(6)中的改造：
(1)敲除乳酸脱氢酶基因ldhA；
(2)敲除磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA；
(3) 敲除醇脱氢酶基因adhE；
(4)敲除富马酸还原酶基因frd和丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB；
(5)敲除甲基乙二醛合酶基因mgsA；
(6)增强乙酰乳酸合成酶AHAS和二羟酸脱水酶ilvD的活性。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于：所述微生物为大肠杆菌；优选地，所述微生物为大肠杆菌MG1655。
11.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于：所述AHAS包括ilvBN、ilvGM和ilvIH；
优选地，所述ilvIH的活性通过解除缬氨酸对ilvH的反馈抑制得到增强；
更优选地，所述ilvIH的活性通过突变ilvH基因得到增强。
12.利用权利要求7-11任一项所述构建方法得到的L-缬氨酸工程菌。
13.权利要求12所述的L-缬氨酸工程菌在L-缬氨酸生产中的应用。
14.一种生产L-缬氨酸的方法，包括下述步骤：
(1)发酵培养权利要求12所述的L-缬氨酸工程菌；
(2)分离并收获L-缬氨酸。
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