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CN117304277B - 一种o型口蹄疫病毒vp4蛋白t细胞表位多肽及其应用 - Google Patents

一种o型口蹄疫病毒vp4蛋白t细胞表位多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽及其应用，为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑2的所示；或将SEQ ID NO.1‑2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.1‑2衍生的且保持SEQ ID NO.1‑2所示的蛋白功能的氨基酸序列。本发明通过设计O型口蹄疫病毒的重叠肽段，利用酶联免疫斑点技术检测，筛选出功能性T细胞抗原表位多肽，利用IFN‑γ胞内细胞因子染色，进一步筛选确认能够有效诱导T淋巴细胞分泌IFN‑γ的肽段，可用于制备O型口蹄疫病毒多表位疫苗。

Description

一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽及其应用
技术领域
本发明涉及抗原表位多肽技术领域，尤其涉及一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽。
背景技术
口蹄疫(FootandmouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDvirus,FMDV)引起的一种急性传染病。该病感染偶蹄目动物，包括猪、牛、羊等常见家畜，感染动物口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱，给畜牧业带来严重经济损失。FMDV分为七个血清型，分别为A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，其中O型FMDV仍在我国流行。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口疮病毒属(Aphthovirus)，在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，编码四种结构蛋白(VP4、VP2、VP4和VP4)，病毒外壳为对称的20面体。
目前，临床上使用的FMDV疫苗以灭活疫苗为主，该类疫苗主要诱导体液免疫，诱导细胞免疫的能力较差。T细胞表位能够被T细胞受体识别，从而刺激特异性T细胞的活化，产生抗病毒免疫。目前，O型FMDVT细胞的表位尚不完全清晰，为此，提出一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽及其应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决背景技术提出的问题，而提出的一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽，其为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2的所示。
在另一方面，一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽的编码基因。
在另一方面，一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽编码基因的生物材料，所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。
在另一方面，一种药物，含有一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽。
在另一方面，一种多肽疫苗，含有所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4的T细胞的抗原表位多肽，所述多肽疫苗还含有佐剂，所述佐剂包括壳聚糖、载体蛋白。
在另一方面，一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽或其编码基因或所述的生物材料在提高机体产生细胞数量或提高机体分泌IFN-γ细胞数量中的应用，以及在制备预防口蹄疫病毒感染的疫苗,药物,试剂或试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽，具备以下有益效果：
本发明通过设计O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4的重叠肽段，利用酶联免疫斑点技术检测，筛选出功能性T细胞抗原表位多肽，利用IFN-γ胞内细胞因子染色，进一步筛选确认能够有效诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ的肽段，可用于制备O型口蹄疫病毒多表位疫苗。
附图说明
图1为ELISPOT筛选O型FMDV结构蛋白VP4功能性抗原表位肽结果图。横坐标为刺激物名称，其中PC为阳性对照，NC为阴性对照。
纵坐标为斑点数；
图2为ELISPOT筛选出的105号肽进行验证结果图；
图3为ELISPOT筛选出的106号肽进行验证结果图；
图4为105、106号肽段IFN-γ胞内细胞因子染色验证实验阴性对照结果图；
图5为105、106号肽段IFN-γ胞内细胞因子染色验证实验阳性对照结果图；
图6是对图2-图5的定量分析结果示意图；
图7为为ELISPOT对105和106号肽的重叠序列105-106进行验证的结果图；其中横坐标为刺激物名称，其中PC为阳性对照，NC为阴性对照，纵坐标为斑点数；
图8为105-106号肽段IFN-γ胞内细胞因子染色验证实验阳性对照结果图；
图9为105-106号肽段IFN-γ胞内细胞因子染色验证实验阴性对照结果图；
图10为对105和106号肽的重叠序列流式结果示意图；
图11是对图8-图10的定量分析结果示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
步骤1.蛋白肽库的合成
参照GenBank发表的O/BY/CHA/2010株(JN998085)的结构蛋白VP4氨基酸序列，设计一系列覆盖VP4蛋白全长氨基酸序列的重叠肽段，每个肽段长度为18AA，相邻肽段间重叠12AA，一共12个肽段，由南京肽谷生物科技公司合成。合成多肽纯度≥95％，溶解在纯水中，-80℃保存。步骤2.小鼠攻毒与脾脏淋巴细胞的分离将5-8周龄的IFNAR-/-C57/BL6小鼠分为免疫组和对照组(n＝5)，免疫组小鼠以5000PFUs/0.1mL进行腹部皮下注射攻毒，对照组小鼠以相同方式注射PBS溶液。免疫7天后，将小鼠安乐死，无菌取脾脏，碾磨均匀后过70μm细胞滤网，置于装有完全培养基(rpmI1640+10％FBS+1％双抗)的50mL离心管中，1700rpm离心5分钟，弃上清。采用红细胞裂解液重悬上述细胞，常温静置5分钟后，加入3倍体积的完全培养基，于1700rpm离心5分钟，弃上清。最后用完全培养基重悬细胞并计数。步骤3.ELISPOT试验初步筛选功能性表位肽小鼠免疫后7天，分离脾脏淋巴细胞，分别用肽库的每一条多肽刺激淋巴细胞，通过ELISPOT试验检测O型FMDV特异性T细胞受多肽刺激后分泌IFN-γ的水平，从而初步筛选出功能性抗原表位多肽。
96孔ELISPOT板(达科为，2210003)，每孔加入2*105脾脏淋巴细胞，再加入1中合成的单个蛋白肽刺激(终浓度为10μg/mL)，总体积100μL/孔。同时设立阳性对照孔：加入PMA(500ng/mL)+Lonomycine(10μg/mL)，设立阴性对照孔：加入纯水。每类设立3个重复孔。置于37℃,5％CO2中培养20h后进行显色操作。
(1)裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基,加入冰冷的去离子水，200μL/well，4℃冰箱放置10分钟低渗裂解细胞。
(2)洗板：甩出孔内液体，加入1×Washing Buffer工作液，260μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复六次，每一次在吸水纸上扣干。
(3)检测抗体孵育：将1×Biotinylated Antibody工作液加入各实验孔，100μL/well。37℃孵育1小时。
(4)洗板：加入1×Washing Buffer工作液，260μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复六次，每一次在吸水纸上扣干。
(5)酶联亲和素孵育：将1×Streptavidin-HRP工作液加入各实验孔，100μL/well37℃孵育1小时。
(6)洗板：甩出孔内液体，加入1×Washing Buffer工作液，260μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，重复五次，每一次在吸水纸上扣干，洗涤完成后揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤膜底面及底座，用吸水纸小心吸干底座及膜底残留的水迹，合上底座，加入1×Washing Buffer工作液，260μL/well，停留1分钟后弃去孔内液体，彻底扣干孔内液体。
(7)显色：将现配的AEC显色液加入各实验孔，100μL/well。室温避光静置5-30分钟，根据斑点生成情况选择终止显色时间。若室温低于20℃，建议在37℃温箱做显色，每隔5-10分钟检查一次。
(8)终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤各实验孔正反面及底座3-5遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。
(9)ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。结果显示，肽段105、106能有效刺激免疫组小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，显著高于不加刺激物的阴性对照孔细胞(图1)。同时，不能刺激对照组小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，初步表明肽段105、106诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ是O型FMDV特异性T细胞激活的结果；功能性抗原表位肽氨基酸序列如表1所示。
表1O型FMDV结构蛋白功能性抗原表位多肽氨基酸序列
多肽名称 多肽序列 多肽所属结构蛋白
105 NQSGNTGSIINNYYMQQY VP4
106 GSIINNYYMQQYQNSMDT VP4
步骤4.IFN-γ胞内细胞因子染色试验
为进一步验证功能性抗原表位多肽所对应的T细胞表型，本试验将ELISPOT筛选获得的2功能性抗原表位多肽(105、106、)分别刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞，进行IFN-γ胞内细胞因子染色试验。
96孔板中每孔加入1×106个脾脏淋巴细胞，再分别加入单个肽刺激(终浓度为10μg/mL)，同时设立阳性对照：PMA(500ng/mL)+Lonomycine(10μg/mL)，
阴性对照：加入纯水。置于37℃，5％CO2中培养1h后，每孔加入Brefeldin A(MCE，2030421)，终浓度10μg/mL，37℃，5％CO2中继续培养5h。
孵育完成后，将上述细胞转入EP管中，1500rpm5min离心收集细胞。加入0.5mL流式缓冲液(Biosharp，BL1136A)清洗细胞一次，1500rpm5min离心收集细胞。随后进行细胞表明染色：
1.加入Fc抗体进行孵育
1)每管加入25μL Fc Block(1：50)重悬，置于冰上20min。
2.加入CD8a、CD4、CD3e进行染色
1)每管加入25μL Abs Mix(1：100)，置于冰上30min。
2)将Zombie Aqua Dye用PBS以1：500稀释，每100ul染色106细胞(即加入100ul染色)。室温避光静置15-30min。加入0.5mL流式缓冲液清洗细胞一次，离心，弃上清。
3.利用Fixation/Permeabilization Concentrate(Thermo，GAS003)试剂对细胞进行固定和透膜。
1.加入100ulA液(固定剂)，室温下避光孵育15分钟。
2.用0.5mL流式缓冲液洗涤，1500rpm5min。
3.加入100ulB液(破膜剂)和适量体积的胞内抗体或相应同型对照.(mouse IFNγAbs)1：50。
4.涡旋1-2秒，室温下避光孵育20分钟.
5.用0.5mL流式缓冲液洗涤，1500rpm5min，弃上清。
6.用200ul流式缓冲液重悬细胞并及时上机分析。
结果发现肽段105和106能有效诱导8.68％(图2)、9.43％(图3)的CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ，与阴性对照(0.16％)(图4)相比差异显著(p＜0.05)，同时阳性对照激活9.77％的CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ(图5)。统计结果如图6所示。说明105和106号肽段包含CD8+T细胞表位。
步骤5.蛋白肽合成
此步骤根据上述实验结果，将105-106,重叠序列合成新的肽段，用肽段重复上述实验。
多肽名称 多肽序列 多肽所属结构蛋白
105-106 GSIINNYYMQQY VP4
步骤6.ELISPOT
ELISPOT试验进一步确认功能性表位肽
将3只小鼠免疫后7天，分离脾脏淋巴细胞，用步骤5中合成的多肽刺激淋巴细胞，通过ELISPOT试验检测O型FMDV特异性T细胞受多肽刺激后分泌IFN-γ的水平，从而进一步确认功能性抗原表位多肽。
如图7所示，肽段105、106的重叠序列105-106能有效刺激免疫组小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，显著高于不加刺激物的阴性对照孔细胞(图7)。同时，不能刺激对照组小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，初步表明肽段105-106诱导脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ是O型FMDV特异性T细胞激活的结果。
步骤7.ICS
ICS试验进一步确认功能性表位肽。
将3只小鼠免疫后7天，分离脾脏淋巴细胞，用步骤5中合成的多肽刺激淋巴细胞，通过ICS试验检测O型FMDV特异性T细胞受多肽刺激后分泌IFN-γ的水平，从而进一步确认功能性抗原表位多肽。
如图8-11所示，肽段105、106的重叠序列105-106能有效诱导4.13％的CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ(图10)，与阴性对照(0％)(图9)相比差异显著(p＜0.05)，同时阳性对照激活9.20％的CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ(图8)。统计结果如图11所示。说明105-106肽段包含CD8+T细胞表位。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽，其特征在于，其为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2的所示。
2.根据权利要求1所述一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽的编码基因。
3.一种含有权利要求1所述一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽编码基因的生物材料，所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。
4.一种药物，其特征在于，含有权利要求1所述一种O型口蹄疫病毒VP4蛋白T细胞表位多肽。
5.一种多肽疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4的T细胞的抗原表位多肽。
6.根据权利要求5所述的多肽疫苗，其特征在于，所述多肽疫苗还含有佐剂，所述佐剂包括壳聚糖、载体蛋白。
7.权利要求1所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4的T细胞的抗原表位多肽或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备预防口蹄疫病毒感染的疫苗中的应用。
8.权利要求1所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4的T细胞的抗原表位多肽或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备治疗口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
9.权利要求1所述O型口蹄疫病毒结构蛋白VP4的T细胞的抗原表位多肽或其编码基因或权利要求3所述的生物材料在制备检测口蹄疫病毒的试剂或试剂盒中的应用。
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