CN102757484B - 一种hcv多表位肽疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HCV多表位肽疫苗及其应用，包括以下多表位多肽：其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示；或者其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.2所示。多肽VAL-44 HCV可以诱导出特异性的T细胞免疫应答，包括CD4⁺T细胞和CD8+T细胞，T细胞经过特异性抗原刺激以后可以迅速产生IFN-γ和IL-2，该HCV多肽疫苗可以刺激10例中的3例慢性丙型肝炎病毒感染者PBMC分泌IFN-γ，该HCV多表位多肽可能是较理想的HCV预防/治疗性候选疫苗。

Description

一种HCV多表位肽疫苗及其应用

技术领域

本发明属于HCV疫苗技术领域，涉及一种HCV多表位肽疫苗及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)，为黄病毒属的单股正链嗜肝RNA病毒，是引发慢性肝病的主要病原体，全球约有1.7亿感染者，发病人数以每年三百万速度递增。慢性HCV感染与肝硬化和肝癌直接相关，严重影响患者生活质量。由于HCV标准治疗方案费用高昂，疗效不理想使得发展中国家大多数HCV感染患者难以承受。因此研发HCV疫苗成为降低HCV所引发的肝硬化，肝癌发生率最为有效的策略之一。

HCV基因组分别编码核心蛋白C，包膜蛋白E1、E2，p7和6种非结构蛋白(NS2、NS3，NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但由于HCV病毒RNA聚合酶缺乏校对功能，病毒变异率高，尤其是位于包膜糖蛋白E2的中和抗原位点存在高变区，传统的以产生保护性抗体为主的疫苗研发面临重重困难。

研究表明，急性病患体内多特异性CTL可以使病情逐渐转归、自愈。慢性HCV病人T细胞应答虽然具有多克隆以及多特异性，但强度远不如急性病人的免疫应答强烈，相对较弱的抗HCV免疫应答导致病毒难以被清除。与此同时，肝内大量的HCV特异性CD8⁺T细胞分泌γ干扰素的水平受到抑制，因此，慢性HCV感染时CD8⁺T细胞功能障碍是造成免疫系统不能控制HCV复制，导致疾病慢性化的主要原因。

近10年来，对HCV感染发病机制、保护性免疫应答和病毒持续感染机制的认识取得了较大进展。中和抗体以及CD4⁺和CD8⁺T细胞所引发强烈的T细胞免疫应答已被证明与HCV的清除相关，这将是研制丙型肝炎疫苗的希望所在。

大量证据表明，HCV非结构蛋白介导的持续性、强烈的、多特异性的Th1型细胞免疫应答水平直接关系到病毒是否能被清除以及疾病的预后。由于大多数慢性患者HCV亚型的差异，成功的疫苗应该诱导产生强烈的多特异性免疫应答，包括CD4⁺及CD8⁺T细胞免疫应答。因此，HCV表位疫苗更倾向于选取保守区域。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种HCV多表位肽疫苗及其应用，将HCV多表位肽连接可以诱导出特异性的T细胞免疫应答，包括CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，T细胞经过特异性抗原刺激以后可迅速产生IFN-γ和IL-2。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种丙型肝炎病毒的多表位多肽，包括以下多表位多肽：

其氨基酸残基序列如SEQ.ID.NO.1所示；

或者其氨基酸残基序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的丙型肝炎病毒的多表位多肽在制备针对丙型肝炎病毒的预防性/治疗性疫苗的应用。

所述的丙型肝炎病毒的多表位多肽在制备抗丙型肝炎病毒的药物的应用。

所述的药物为刺激CD4⁺T、CD8⁺T淋巴细胞增殖的药物。

所述的药物为刺激分泌IFN-γ和IL-2的细胞增殖的药物。

所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的细胞免疫应答的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的丙型肝炎病毒的多表位多肽，筛选出的2个HCV保守CTL表位，进一步为了使所设计的疫苗可以刺激CD4⁺和CD8⁺T细胞，引发强烈的T细胞免疫应答，特将2个CTL表位辅以一个Th表位进行串联。在保证各自独立性的基础上，该多表位多肽表现出了强的免疫原性，表现出了良好的免疫效果包括：

刺激淋巴细胞增殖、不仅可以刺激CD4⁺T、CD8⁺T淋巴细胞的增殖，而且可以刺激较高比例的CD8⁺T淋巴细胞增殖；

可以诱导出特异性的T细胞免疫应答；

经过特异性抗原刺激以后可以迅速产生IFN-γ和IL-2；

该HCV多表位多肽疫苗可能是较理想的HCV预防/治疗性候选疫苗。

通过体外试验，所构建的多肽疫苗可以刺激10例中的3例慢性丙型肝炎病毒感染者PBMC分泌IFN-γ。

附图说明

图1为多表位多肽免疫HHD-2小鼠后淋巴细胞增殖试验检测结果；

图2为多表位多肽免疫HHD-2小鼠后经流式细胞仪检测CD4⁺T、CD8⁺T淋巴细胞结果；

图3为多表位多肽免疫HHD-2小鼠后经LDH释放法检测CTL活性结果；

图4为多表位多肽免疫HHD-2小鼠后经ELISPOT法检测细胞因子IFN-γ以及IL-2结果；

图5为多表位多肽刺激HCV患者PBMC分泌IFN-γ检测结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

在HCV的表位中筛选多个表位串联，以此作为疫苗进行免疫，以达到针对HCV的的免疫效果，从而达到预防/治疗性丙型肝炎的目的，这些免疫效果包括：引发包括CD4⁺和CD8⁺T细胞的T细胞免疫应答、引发分泌IFN-γ、IL-2细胞因子为主的Th1型细胞免疫应答。

1、鉴于上述目的，首先进行多表位的筛选及多表位多肽的串联或构建

具体的HCV多表位多肽VL-20、VAL-44的构建为：

从HCV表位肽当中筛选具有抗原性好，能够刺激免疫细胞的表位进行串联，根据HCV中的CTL表位与HLA-A2亲和力测试以及与慢性HCV病人PBMC反应情况，筛选出两个HCV CTL表位进行多表位的串联：

NS5A(1991-1999)，其氨基酸序列为：VLSDFKVWL；

NS4B(1793-1801)，其氨基酸序列为：SMMAFSAAL；

为保证各自独立性，避免产生新的接合表位，在上述两个表位之间加入KK的间隔序列，从而得到VL-20多表位多肽：NS5A-KK-NS4B，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

进一步，为了使多表位多肽既可以刺激CD4⁺T细胞，又可以刺激CD8⁺T细胞，以引发强烈的T细胞免疫应答，还在NS5A与NS4B之间插入一个Th表位，其氨基酸序列为：KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL，同样的两个表位之间加入KK的间隔序列，从而得到VL-44多表位多肽：NS5A-KK-Th表位-KK-NS4B，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

上述VL-20、VL-44多表位多肽根据其序列人工来合成，具体的委托上海强耀生物科技有限公司利用多肽合成仪合成2条多肽，纯度均在95%以上。

并用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析合成多肽的纯度及氨基酸的正确性。结果显示合成多表位纯度≥95%；多表位多肽中各氨基酸的比率与预期的一致，说明多肽合成正确。

2、以HHD-2小鼠作为免疫对象，将筛选出的多表位多肽进行免疫以观察其所能引发的免疫效果，具体的免疫方案为：

选用6-8周龄HHD-2雄性小鼠18只，分为多表位多肽VL-20，多表位多肽VAL-44以及PBS皮下给药组，每组各6只。多表位多肽或PBS与弗氏佐剂充分混匀后皮下注射小鼠，第一次用弗氏完全佐剂，之后用弗氏不完全佐剂。给药时，分别皮下注射100μl(1μg/μl于生理盐水)多肽VL-20，多肽VAL-44，PBS与佐剂1:1等体积充分乳化。间隔2周加强免疫一次，共免疫3次。

3、免疫后的免疫效果的检测

3.1脾细胞增殖的检测

多表位多肽免疫和对照组小鼠在第三次免疫后10天处死，取小鼠脾脏置钢网上研磨成单细胞悬液，红细胞裂解液，室温5min去除红细胞后，用RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为1×10⁵细胞/ml，置96孔培养板中培养，每孔200μl，同时每孔加入VL-20或VAL-44(10μg/ml)，设刀豆蛋白A(ConA)阳性对照孔、阴性对照孔，每只均设3个复孔。

置5%CO₂孵箱中37℃培养54h后，每孔加入20μl MTT(5mg/ml，溶于PBS，pH7.2，过滤除菌)，继续培养4h后终止培养，弃尽上清，每孔加入DMSO 150μl，震荡10分钟，测OD490nm值，结果用增殖刺激指数(stimulationindex，SI)=刺激组OD/未刺激组OD表示。SI>2说明具有刺激淋巴细胞增殖的作用。

检测结果如图1所示，其中横坐标为VL-20，VAL-44以及PBS免疫的不同组别，纵坐标为SI，结果显示多肽VL-20免疫组SI与PBS组相比，虽有统计学意义，但其数值＜2，无实际意义。多肽VAL-44免疫组的SI最高，且>2为3.25±0.14，与VL-20免疫组以及PBS组相比，具有统计学差异(p<0.05)，说明所构建的多表位多肽VAL-44在免疫后能够显著促进淋巴细胞的增殖。

3.2免疫小鼠CD4⁺T、CD8⁺T淋巴细胞亚群的检测

免疫程序结束后，常规无菌取脾脏，将小鼠脾脏置钢网上研磨成单细胞悬液，加入5ml红细胞裂解液，室温5min去除红细胞后，调整细胞浓度为1×10⁶／ml，取lml细胞悬液于EP管中，无钙镁离子的PBS洗涤2次，加入FITC-CD8或PE-CD4单抗，室温避光孵育30min，PBS洗涤后加入固定液，流式细胞仪检测CD4⁺T、CD8⁺T细胞亚群百分比。

检测结果如图2所示，其中横坐标为VL-20，VAL-44以及PBS免疫的不同组别，纵坐标为具体CD4⁺T、CD8⁺T细胞亚群百分比，结果显示多肽VAL-44由于包含了2个CTL表位和一个Th表位可以引起CD4⁺T、CD8⁺T淋巴细胞增殖，CD4⁺T、CD8⁺T淋巴细胞百分比分别为36.8%和10.93%，高于多肽VL-20以及PBS免疫组，并有统计学差异(p<0.05)。

此外，还计算了CD4⁺/CD8⁺比值，PBS组为4.36，而多肽VAL-44，多肽VL-20分别为3.36，4.05，说明多肽VAL-44不仅可以刺激CD4⁺T、CD8⁺T淋巴细胞的增殖，而且可以刺激较高比例的CD8⁺T淋巴细胞增殖。

3.3CTL杀伤性

用LDH（乳酸脱氢酶）细胞杀伤检测试剂盒（具体操作流程按照说明书）检测CTL活性。最后一次免疫后10天处死小鼠，取脾细胞，用VAL-44、VL-20(10μg/ml)刺激5天的T淋巴细胞作为效应细胞，用负载VAL-44、VL-20（终浓度10μg/ml)的C1R.AAD细胞（该细胞系是一种常被使用的重组细胞，转染了HLA-A2的αl和α2结构域基因和鼠H-2Db的α3结构域基因，在CTL杀伤实验中，适合用作评价HLA-A2分子限制性表位的靶细胞）做靶细胞。设培养液背景孔、体积校正孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、效应细胞自然释放孔、LDH阳性对照孔以及实验孔（按效靶比分别为50.0:1,25.0:1,12.5:1以及6.25:1比例将靶细胞、效应细胞加载至96孔细胞培养板中，每孔总体积为100μl）。

试验过程如下：按上述将细胞或培养液加入96孔板中，37℃，5％CO2孵箱中培养4h，培养结束后，吹打每孔1min，吸取每孔上清50μl，转移到新的96孔板(每孔加入50μl检测试剂)，室温反应1h。测定每孔490nm的吸光度(A)值，计算每个效／靶比时杀伤百分比。

检测结果如图3所示，其中横坐标为VL-20，VAL-44以及PBS免疫的不同组别不同效／靶比，（分别为50.0:1,25.0:1,12.5:1以及6.25:1），纵坐标为杀伤活性（%），结果显示，当效／靶比为50.0:1时VAL-44免疫组的杀伤率达到最高，为44%，显著高于相同效／靶比的VL-20免疫组和PBS免疫组（p<0.05）。从而证实了所构建的多表位多肽VAL-44在免疫后可以在HHD-2小鼠体内诱发特异性细胞免疫应答。

3.4、检测分泌IFN-γ和IL-2的细胞数量

使用ELISPOT试剂盒检测（分别为检测小鼠IFN-γ和IL-2ELISPOT试剂盒）分泌IFN-γ和IL-2的细胞。96孔滤膜板中加入2.5μg/ml抗鼠的IL-2（抗鼠的IFN-γ为预包被），4℃过夜，洗板，10%完全RPMI-1640培养液200μl/孔，1小时封闭。脾细胞（1×10⁶/孔）加入10μg/ml VAL-44、VL-20或ConA4μg/ml（阳性对照）每只设3个复孔。培养24小时，取出后PBST洗涤缓冲液洗板，加入1:2500稀释的生物素标记的抗IFN-γ或抗IL-2，室温孵育2小时。PBST（0.05％吐温20）洗涤5次，加入1:1000稀释的链霉亲和素-HRP孵育1小时。加入底物溶液（TMB），直至斑点清晰可见，去离子水冲洗，阴干。使用自动酶联免疫斑点读数仪计数。10⁶个脾细胞中斑点数目大于30为阳性。

检测结果如图4所示，其中横坐标为VL-20，VAL-44以及PBS免疫的不同组别，纵坐标为分泌IFN-γ或IL-2的细胞均数，结果显示，多表位多肽VAL-44免疫后引发的分泌IFN-γ或IL-2细胞均高于VL-20免疫组(p<0.05)，分泌IFN-γ和IL-2平均细胞数分别达到65个/10⁶以及57个/10⁶，说明多表位多肽VAL-44主要引发Th1型的细胞因子分泌。

4、ELISPOT检测HCV感染者外周IFN-γ的细胞

选取10例2011年唐都医院住院HCV感染患者以及2例健康志愿者抗凝外周静脉血，无菌PBS 1：l稀释，将其轻柔用滴管沿管壁缓慢注于人淋巴细胞分离液面上层，室温2000rpm／min离心25min，轻轻吸取白膜层(PBMC)，采用人IFN-γ ELISPOT试剂盒(预包被的PVDF膜96孔板)检测HCV感染者PBMC中分泌IFN-γ的细胞数目。

操作过程如下：每孔加入1×10⁶PBMC，设立阴性对照孔(加PBMC而不加多肽)多肽刺激孔(加入终浓度为10μg/ml的合成多肽)以及阳性对照孔（按照1：1000稀释的CD-32刺激PBMC）每个样品均设三个复孔。

板置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。洗涤4次。每孔加入100μl生物素化抗IFN-γ的检测抗体，37℃孵育1h。吸除孔中液体，洗涤4次。每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素，37℃孵育lh(避光)。洗涤4次。每孔加入100μl新鲜配制的ACE显色液，37℃孵育30min(避光)。去离子水冲洗，阴干。使用自动酶联免疫斑点读数仪计数。10⁶个PBMC中斑点数目大于50或试验组至少为阴性对照的2倍以上为阳性。

检测结果如图5所示，其中横坐标为3例HCV PBMC，纵坐标为分泌IFN-γ的细胞均数，结果显示，VAL-44多肽可以引发3例HCV PBMC发生较高水平的肽特异性分泌IFN-γ的细胞，斑点数分别为151个/10⁶PBMC，78以及51个斑点/10⁶。而VL-20所引发3例HCV PBMC肽特异性分泌IFN-γ的细胞的斑点数分别为54，32以及18个斑点/10⁶。

综合以上结果，所构建的两个HCV多表位多肽VL-20、VAL-44，尤其是VAL-44表现出良好的免疫效果：能够显著促进淋巴细胞的增殖、不仅可以刺激CD⁴⁺T、CD⁸⁺T淋巴细胞的增殖，而且可以刺激较高比例的CD⁸⁺T淋巴细胞增殖；可以在HHD-2小鼠体内诱发特异性细胞免疫应答；引发分泌IFN-γ和IL-2为主的Th1型细胞免疫应答，该HCV多表位多肽是较理想的HCV预防/治疗性候选疫苗。VAL-44多肽疫苗可以刺激10例中的3例慢性丙型肝炎病毒感染者PBMC分泌IFN-γ。这表明VL-20、VAL-44可以作为疫苗或抗HCV病毒药物的制备。

Claims (6)

1.一种丙型肝炎病毒的多表位多肽，其特征在于，该多表位多肽的氨基酸残基序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2.权利要求1所述的丙型肝炎病毒的多表位多肽在制备针对丙型肝炎病毒的预防性/治疗性疫苗的应用。

3.权利要求1所述的丙型肝炎病毒的多表位多肽在制备抗丙型肝炎病毒的药物的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为刺激CD4⁺T、CD8⁺T淋巴细胞增殖的药物。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为刺激分泌IFN-γ和IL-2的细胞增殖的药物。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的细胞免疫应答的药物。

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