CN103601809B

CN103601809B - 一种hcv多表位肽与截短型ns3、dc活化分子eda重组蛋白疫苗及其应用

Info

Publication number: CN103601809B
Application number: CN201310324897.9A
Authority: CN
Inventors: 黄小军; 吕欣; 尹文; 雷迎峰; 张瑞国; 杨敬; 姚敏; 贾战生; 兰海云; 张建敏; 曲萍
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2033-07-30
Also published as: CN103601809A

Abstract

本发明公开了一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白及其应用，该重组蛋白疫苗包括以下EDA，ΔNS3以及3个HCVmulti‑epitopes：其核苷酸序列如SEQ.ID. NO.1所示。HCV EDA‑ΔNS3‑VAL‑44蛋白可以诱导出特异性的体液免疫应答以及T细胞免疫应答，T细胞经过特异性抗原刺激以后可以迅速产生IFN‑γ并产生高效的CTL，该种HCV多表位肽及其与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗可能是较理想的HCV预防/治疗性候选疫苗。

Description

一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗及其应用

技术领域

本发明属于HCV疫苗技术领域，涉及一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒( hepatitis C virus, HCV)，为黄病毒属的单股正链嗜肝RNA病毒，是引发慢性肝病的主要病原体，全球约有1.7亿感染者，发病人数以每年三百万速度递增。慢性HCV感染与肝硬化和肝癌直接相关，严重影响患者生活质量。由于HCV标准治疗方案费用高昂，疗效不理想使得发展中国家大多数HCV感染患者难以承受。因此研发HCV疫苗成为降低HCV所引发的肝硬化，肝癌发生率最为有效的策略之一。

HCV基因组分别编码核心蛋白C，包膜蛋白E1、E2，p7和6种非结构蛋白(NS2、NS3，NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但由于HCV病毒RNA聚合酶缺乏校对功能，病毒变异率高，尤其是位于包膜糖蛋白E2的中和抗原位点存在高变区，传统的以产生保护性抗体为主的疫苗研发面临重重困难。

研究表明，急性病患体内多特异性CTL可以使病情逐渐转归、自愈。慢性HCV病人T细胞应答虽然具有多克隆以及多特异性，但强度远不如急性病人的免疫应答强烈，相对较弱的抗HCV免疫应答导致病毒难以被清除。与此同时，肝内大量的HCV特异性CD8⁺T细胞分泌γ干扰素的水平受到抑制，因此，慢性HCV感染时CD8⁺T细胞功能障碍是造成免疫系统不能控制HCV复制，导致疾病慢性化的主要原因。

近10年来，对HCV感染发病机制、保护性免疫应答和病毒持续感染机制的认识取得了较大进展。中和抗体以及CD4⁺和CD8⁺T细胞所引发强烈的T细胞免疫应答已被证明与HCV的清除相关，这将是研制丙型肝炎疫苗的希望所在。

大量证据表明，HCV非结构蛋白介导的持续性、强烈的、多特异性的Th1型细胞免疫应答水平直接关系到病毒是否能被清除以及疾病的预后。由于大多数慢性患者HCV亚型的差异，成功的疫苗应该诱导产生强烈的多特异性免疫应答，包括CD4⁺及CD8⁺T细胞免疫应答。因此，HCV表位疫苗更倾向于选取保守区域。

本研究前期将筛选出的HCV 2个CTL表位：NS5A(1991-1999) VLSDFKVWL以及NS4B(1793-1801) SMMAFSAAL，加入一个通用Th表位KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL进行了不同的组合，包括是否含有Th表位，共合成了8条不同排列组合方式的多肽，经过小鼠体内试验，合成肽与HLA-A*0201相对亲和力和稳定性检测以及与HCV病人PBMC相作用3部分实验初步确定了VLSDFKVWLKKKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLKKSMMAF

SAAL（简称VAL-44）这种排列组合方式效果最优，将这种HCV多肽疫苗皮下免疫HHD-2小鼠后，可以引起脾细胞增殖，CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比增高以及以Th1型反应为主的细胞免疫应答，但总体来说，免疫效果尚不十分理想，为了克服肽疫苗免疫源性较弱的缺陷，我们最终选择了纤连蛋白外部结构域A（Fibronectin Extra Domain A，EDA），联合截短的NS3插入到3个多表位的上游，构建起EDA-ΔNS3-VAL-44原核表达载体，经过诱导蛋白表达，纯化得到EDA-ΔNS3-VAL-44目的蛋白，辅以能够活化Toll样受体3的免疫佐剂poly(I:C)（Yu-sheng Cheng and Feng Xu. Anticancer function of polyinosinic-polycytidylic acid. Cancer Biology & Therapy.2010;10:1219-1223）对小鼠进行免疫。

纤连蛋白外部结构域A（Fibronectin Extra Domain A，EDA）是一种DC活化因子，主要起着募集DC并激发其成熟的作用；EDA通过与Toll样受体4相互作用产生共刺激因子，使DC迁移至淋巴结，辅助DC发挥较强的摄取加工抗原的作用，并诱导DC成熟，从而激活抗病毒以及抗肿瘤的T细胞应答（Mansilla C, Gorraiz M, Martinez M, Casares N,Arribillaga L, Rudilla F, et al. Immunization against hepatitis C virus witha fusion protein containing the extra domain A from fibronectin and thehepatitis C virus NS3 protein. Journal of Hepatology. 2009;51:520-7.）。由于DC细胞的成熟是效应T细胞启动的必要环节，目前多种活化DC的分子成为疫苗研发的热点。近几年，相继有将抗原与不同促DC成熟刺激物混合的免疫策略，并发现在这些刺激物的作用下可以激发更为显著的免疫应答（Liu QH, Bohlen H, Titzer S, Christensen O, DiehlV, Hescheler J, et al. Expression and a role of functionally coupled P2Yreceptors in human dendritic cells. FEBS Lett. 1999;445:402-8.和Schwarz K,Storni T, Manolova V, Didierlaurent A, Sirard JC, Rothlisberger P, et al.Role of Toll-like receptors in costimulating cytotoxic T cell responses. EurJ Immunol. 2003;33:1465-70.和Resta R, Yamashita Y, Thompson LF. Ecto-enzymeand signaling functions of lymphocyte CD73. Immunol Rev. 1998;161:95-109.）。

HCV NS3蛋白编码基因全长共1893个核苷酸。截短的NS3是编码丝氨酸蛋白酶区域，该区域在多聚蛋白前体的加工和成熟方面起着非常重要的作用。针对NS3的CD4⁺T细胞免疫应答能够有效刺激IFN-γ的生成，增强对IFN-α治疗的敏感性，与HCV感染的自限性和良好转归密切相关。有研究发现，14例HCV感染患者中的8例自限性患者均具有NS3特异性免疫应答，而65例发展为慢性丙型肝炎的患者中仅有5例具有NS3特异性免疫应答，提示抗NS3免疫应答与病毒的清除相关（Diepolder HM, Zachoval R, Hoffmann RM, Wierenga EA,Santantonio T, Jung MC, et al. Possible mechanism involving T-lymphocyteresponse to non-structural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis Cvirus infection. Lancet. 1995;346:1006-7.）。目前已证实，ΔNS3上集中了多个T细胞表位（如NS3 1073-1081，HCV NS3 1038-1047，NS3 1100-1107等），因此它也是HCV疫苗研发中备受重视的主要靶点抗原之一。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗及其应用，该重组HCV蛋白疫苗可以诱导出特异性的体液免疫应答，以及特异性细胞免疫应答，包括特异性CTL发生，T细胞经过特异性抗原刺激以后可迅速产生IFN-γ。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗，其特征在于：包括以下纤连蛋白外部结构域A，ΔNS3以及VAL-44：其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗在制备针对丙型肝炎病毒的预防性/治疗性疫苗的应用。

所述的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗的构建在制备抗丙型肝炎病毒的药物中的应用。

所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的体液免疫应答的药物。

所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的细胞免疫应答的药物。

所述的药物为刺激分泌IFN-γ的细胞增殖的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗，采用前期经体内、外试验筛选出的3个HCV多表位最优的排列组合方式，为了使所设计的疫苗可以使靶抗原被树突状细胞所递呈，引发强烈的体液、细胞免疫应答，特在3个多表位上游引入EDA以及经截短的NS3。经体内试验表明该蛋白疫苗具有强的免疫原性，表现出了良好的免疫效果包括：

可以诱发机体产生特异性体液免疫应答；

可以诱导出特异性的T细胞免疫应答；

经过特异性抗原刺激以后可以迅速产生IFN-γ；

该HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗疫苗可能是较理想的HCV预防/治疗性候选疫苗。

附图说明

图1为pET32a载体的示意图；

图2为重组质粒pET32a-EDA-ΔNS3-VAL-44酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳后的成像图；

图3 为HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白原核表达的可溶性分析图；

图4 为HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白的纯化结果图；

图5 为Western blot法鉴定HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白结果图；

图6 HCV疫苗免疫程序示意图；

图7 为ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体效价结果；

图8为各组免疫小鼠CTL活性检测比较；

图9 为ELISPOT法检测小鼠脾细胞分泌 IFN-γ 情况；

图10 为ELISPOT法检测小鼠脾细胞分泌 IFN-γ 情况统计图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

在HCV的表位中筛选的3个表位串联，并在其上游插入EDA以及截短的NS3，通过构建的原核表达载体对大肠杆菌BL21进行转化、诱导，纯化出HCV EDA-ΔNS3-VAL-44目的蛋白作为疫苗进行免疫，以达到针对HCV的免疫效果，从而达到预防/治疗性丙型肝炎的目的，这些免疫效果包括：引发包括体液免疫应答，引发分泌IFN-γ细胞因子为主的细胞免疫应答及特异性的CTL反应。

1、鉴于上述目的，首先进行一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗的构建。

具体的基因为：

该目的基因由三部分组成，包括EDA，ΔNS3以及3个HCV多表位。3个多表位按照：NS5A(1991-1999)-KK-Th表位-KK- NS4B(1793-1801)顺序排列。为了使所构建的蛋白疫苗靶向递呈至树突状细胞，特在上游插入EDA，所选择截短的NS3是编码丝氨酸蛋白酶的序列。

NO.1：HCV EDA-ΔNS3-VAL-44核苷酸序列

AACATTGATCGCCCTAAAGGACTGGCATTCACTGATGTGGATGTCGATTCCATCAAAATTGCTTGGGAAAGCCCACAGGGGCAAGTTTCCAGGTACAGGGTGACCTACTCGAGCCCTGAGGATGGAATCCGGGAGCTTTTCCCTGCACCTGATGGTGAAGACGACACTGCAGAGCTGCAGGGCCTCAGGCCGGGGTCTGAGTACACAGTCAGTGTGGTTGCCTTGCACGATGATATGGAGAGCCAGCCCCTGATTGGAATCCAGTCCACAGCGCCCATCACGGCTTACTCCCAACAGACGCGGGGCTTGCTTGGTTGTATCATCACCAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAAGTCGAGGGGGAGGTTCAAGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGCGTCAACGGCGTGTGTTGGACCGTCTATCATGGCGCTGGCTCAAAGACCTTAGCCGGCCCAAAAGGCCCAATTACCCAAATGTACACTAATGTAGATCAGGACCTCGTCGGCTGGCCGGCGCCCTCTGGGGCGCGTTCCTTGACACCATGCACTTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGATATGCCGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGTGACAGTAGGGGGAGTCTACTCTCCCCCAGGCCTGTCTCCTACTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGCCCACTGCTCTGCCCTTCGGGGCACGCTGCGGGTATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGAGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTCGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACCATGCGGTCTCCGGTCTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTGCTGTCTGACTTCAAAGTCTGGCTCAAGAAAAAGTTTCCAGGCGGAGGGCAGATCGTGGGTGGCGTCTACCTGCTCCCCAGGAGAGGACCTCGGCTGAAAAAGAGCATGATGGCCTTCTCCGCCGCTCTC

NO.2：EDA的核苷酸序列

AACATTGATCGCCCTAAAGGACTGGCATTCACTGATGTGGATGTCGATTCCATCAAAATTGCTTGGGAAAGCCCACAGGGGCAAGTTTCCAGGTACAGGGTGACCTACTCGAGCCCTGAGGATGGAATCCGGGAGCTTTTCCCTGCACCTGATGGTGAAGACGACACTGCAGAGCTGCAGGGCCTCAGGCCGGGGTCTGAGTACACAGTCAGTGTGGTTGCCTTGCACGATGATATGGAGAGCCAGCCCCTGATTGGAATCCAGTCCACA

NO.3：ΔNS3的核苷酸序列

GCGCCCATCACGGCTTACTCCCAACAGACGCGGGGCTTGCTTGGTTGTATCATCACCAGCCTCACAGGCCGGGACAAGAACCAAGTCGAGGGGGAGGTTCAAGTGGTTTCCACCGCAACACAATCTTTCCTGGCGACCTGCGTCAACGGCGTGTGTTGGACCGTCTATCATGGCGCTGGCTCAAAGACCTTAGCCGGCCCAAAAGGCCCAATTACCCAAATGTACACTAATGTAGATCAGGACCTCGTCGGCTGGCCGGCGCCCTCTGGGGCGCGTTCCTTGACACCATGCACTTGCGGCAGCTCGGACCTTTACTTGGTCACGAGATATGCCGATGTCATTCCGGTGCGCCGGCGGGGTGACAGTAGGGGGAGTCTACTCTCCCCCAGGCCTGTCTCCTACTTGAAGGGCTCTTCGGGTGGCCCACTGCTCTGCCCTTCGGGGCACGCTGCGGGTATCTTCCGGGCTGCTGTGTGCACCCGAGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTCGTACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACCATGCGGTCTCCGGTCTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCC

NO.4 ：3个多表位核苷酸序列

GTGCTGTCTGACTTCAAAGTCTGGCTCAAGAAAAAGTTTCCAGGCGGAGGGCAGATCGTGGGTGGCGTCTACCTGCTCCCCAGGAGAGGACCTCGGCTGAAAAAGAGCATGATGGCCTTCTCCGCCGCTCTC

将编码纤连蛋白外部结构域A，截短的NS3以及所前期筛选的3个HCV表位的基因上下游分别插入EcoRI和Sal I两个酶切位点，目的基因序列经化学合成后与原核载体pET-32a（+）载体（见图1）连接。重组pET-32a（+）/HCV EDA-ΔNS3-VAL-44由南京金斯瑞生物科技有限公司构建并提供。

将含有目的基因的菌划线接种于含Amp抗性的LB平板上，37℃培养。次日挑取单菌落于含Amp抗性LB液体培养基中培养，采用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA。提取的质粒用EcoRI和Sal I于37℃水浴进行3h双酶切。

酶切产物取10μl在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察并保存结果。阳性克隆应该切出大约978 bp的条带（见图2），而载体的大小为5900 bp。图中1~2为pET32a-EDA-ΔNS3-VAL-44经EcoRI和Sal I双酶切后的结果图，3是pET32a空载体对照，M是DNA marker。筛选出的含978 bp的阳性重组质粒送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司，用T7引物进行DNA测序加以确认。

2、诱导表达目的蛋白。以热休克法转化大肠杆菌BL21感受态细胞：取10μl 阳性重组质粒加入 100 μl 感受态 DH5α 中轻柔混匀在冰上放置 30min，快速移至 42℃水浴，热休克 90s，勿摇动离心管，迅速冰浴 2min。加入 800μl 预温至 37℃的 LB 培养基37℃，160 rpm/min 缓摇 40min 左右使细菌复苏，并表达抗生素抗性基因。离心 2,500g×5min，吸去 700 μl 上清，保留 100 μl 用于重悬沉淀。将细菌悬液分别涂于LB（Amp+）平板上，待液体完全吸收后，倒置平皿，于 37℃培养 12~16h，观察菌落。

挑选4个阳性克隆分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养18h，分别取50uL加到5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养2~3h， 0.5M IPTG诱导4h，取1mL诱导表达菌液以及未诱导的菌液离心，回收菌体沉淀。将诱导前后的样本重悬到去离子水中，加入2×SDS上样缓冲液，100℃沸水浴5min，12，000rpm离心10min，取10μl上清进行SDS-PAGE，电泳条件为150V恒压。凝胶用考马斯亮蓝染色液染色2h，脱色液脱色1~3h，观察目的蛋白表达条带以及表达产物的表达形式。

含pET-32a-EDA-ΔNS3-VAL-44质粒的重组菌经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析在相对分子量约为55kD处有明显的特异性蛋白表达条带，其大小与预测的目的蛋白的大小相符。表达的目的蛋白大多以可溶形式存在于上清中（图3），图3 为HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白原核表达的可溶性分析图。图中1是未经IPTG诱导的蛋白表达；M是低分子量蛋白marker；2是经IPTG诱导的全细菌裂解物，3是经IPTG诱导的裂解上清，4是经IPTG诱导的裂解沉淀。

3、采用活性条件进行亲和层析法纯化蛋白。经 Ni-NTA 亲和色谱柱上样洗脱，对洗脱液进行 SDS-PAGE 分析的结果表明获得了纯化的HCV EDA-ΔNS3-VAL-44融合蛋白（图4）。图4 为HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白的纯化结果图。其中M是低分子量蛋白marker，1~4均是纯化出的蛋白。用BCA法测得蛋白浓度为1.55mg/ml。

SDS-PAGE分离HCV EDA-ΔNS3-VAL-44重组蛋白，电转移至NC膜上。将膜浸在封闭液中（PBST溶解的5%脱脂奶粉）4℃过夜。用PBST洗膜三次，每次15min。1:1000稀释的抗His标签兔单克隆抗体作为一抗，共同孵育lh， PBST洗膜三次。将膜与1:10000稀释的红外标记的抗兔IgG共孵育lh， PBST洗膜三次，Odyssey红外激光成像系统扫描，结果在相对分子质量约为55 kD处呈现特异性染色条带，表明其为HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白（图5），其中M是低分子量蛋白marker，1是以BSA作为的对照，2是纯化出的蛋白。

4、以HHD-2小鼠作为免疫对象，将原核表达的HCV蛋白疫苗进行免疫以观察其所能引发的免疫效果，具体的免疫方案为：

选用6-8周龄HHD-2小鼠18只，雌雄不拘，分为EDA-ΔNS3， EDA-ΔNS3-VAL-44以及PBS皮下给药组，每组各6只。第一次用弗氏完全佐剂，之后用弗氏不完全佐剂。给药时，纯化的蛋白100 μg /只，poly(I:C) 50 μg /只以及PBS与弗氏佐剂1:1等体积充分乳化。融合蛋白或PBS与弗氏佐剂充分混匀后皮下注射小鼠，间隔2周加强免疫一次，共免疫3次。第2周、第4周、第6周通过尾静脉取血，分离血清检测抗体产生情况，第6周处死小鼠，检测细胞免疫应答水平（图6）。

5、免疫后的免疫效果的检测

5.1体液免疫水平检测通过ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体效价。将纯化的HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白稀释至10μg/ml，4℃包被过夜；洗涤3次，加入3%BSA 100μl/孔，37℃孵育1 h。PBS洗涤3次后，加入1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800稀释的免疫小鼠血清， 37℃孵育1 hrs；洗涤后实验孔加入1:20000稀释的HRP-抗鼠二抗， 37℃孵育1 h；洗涤后OPD显色，室温静置15 min后加入2M H₂SO₄终止反应，测定各孔的A492值。以正常小鼠血清为阴性对照，试验组/对照组≥2.1时判定为阳性。ELISA滴度表示为最后稀释度的对数。

各组融合蛋白免疫小鼠的抗体效价均随着免疫时间及次数的增加而逐渐升高。其中融合蛋白EDA-ΔNS3-VAL-44免疫组抗体效价在首次免疫后第四周达到最高，为1：12800，并在随后的二周内持续保持这一水平，与PBS免疫组相比有统计学意义（P<0.05）。此外，EDA-ΔNS3蛋白组最高抗体效价达到了1：6400（图7），与PBS对照组相比具有显著差异。

5.2 细胞免疫水平检测

5.2.1 CTL杀伤性

用LDH（乳酸脱氢酶）细胞杀伤检测试剂盒（具体操作流程按照说明书）检测CTL活性。最后一次免疫后13天处死小鼠，取脾细胞，用HCV EDA-ΔNS3-

VAL-44蛋白(10μg/ml)刺激5天的T淋巴细胞作为效应细胞，用转染了HCV EDA-ΔNS3-VAL-44重组质粒的C1R.AAD细胞（是将HMYC1R细胞转染了人HLA-A2.1的αl和α2结构域基因和鼠H-2Dd的α3结构域基因的重组细胞，在CTL杀伤实验中，适合用作评价HLA-A2分子限制性表位的靶细胞）在CTL杀伤实验中做靶细胞。设培养液背景孔、体积校正孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、效应细胞自然释放孔、LDH阳性对照孔以及实验孔（按效靶比分别为50.0:1, 25.0:1, 12.5:1 以及 6.25:1比例将靶细胞、效应细胞加载至96孔细胞培养板中，每孔总体积为100μl）。

试验过程如下：按上述将细胞或培养液加入96孔板中，37℃，5％CO₂孵箱中培养4h，培养结束后，吹打每孔1 min，吸取每孔上清50μl，转移到新的96孔板 (每孔加入50μl检测试剂)，室温反应1h。测定每孔OD490 nm的吸光度(A)值，计算每个效／靶比时杀伤百分比。

检测结果如图8所示，其中横坐标为HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白，EDA-ΔNS3蛋白以及PBS免疫的不同组别不同效／靶比，（分别为50.0:1, 25.0:1, 12.5:1 以及 6.25:1），纵坐标为杀伤活性（%），结果显示，不同效靶条件下，HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白以及EDA-ΔNS3蛋白免疫组对于C1R.AAD靶细胞的杀伤效率明显高于PBS免疫组，其杀伤能力与效应细胞数量成正比。当效／靶比为50.0:1时HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白免疫组的杀伤率达到最高，为54%，显著高于相同效／靶比的EDA-ΔNS3蛋白免疫组和PBS免疫组（p < 0.01）。从而证实了所构建的HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白在免疫后可以在HHD-2小鼠体内诱发特异性细胞免疫应答。

5.2.2 ELISPOT法检测分泌IFN-γ的细胞数量

使用ELISPOT试剂盒检测分泌IFN-γ的细胞。96孔滤膜板中加入PBS洗板，10%完全RPMI-1640培养液200μl/孔，1h封闭。脾细胞（1×10⁶/孔）加入10μg/mlHCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白或ConA 4μg/ml（阳性对照）每只设3个复孔。培养24h，取出后PBST洗涤缓冲液洗板，加入1:2500稀释的生物素标记的抗IFN-γ，室温孵育2h。PBST（0.05％吐温20）洗涤5次，加入1:1000稀释的链霉亲和素-HRP孵育1h。加入底物溶液（TMB），直至斑点清晰可见，去离子水冲洗，阴干。使用自动酶联免疫斑点读数仪计数。10⁶个脾细胞中斑点数目大于30为阳性。

检测结果如图9所示，其中横坐标为HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白，HCVEDA-ΔNS3蛋白以及PBS免疫的不同组别，纵坐标为分泌IFN-γ的细胞均数，结果显示，HCV EDA-ΔNS3-VAL-44蛋白免疫后引发的分泌IFN-γ细胞显著高于HCV EDA-ΔNS3蛋白免疫组 (p <0.01)，HCVEDA-ΔNS3-VAL-44蛋白免疫组、EDA-ΔNS3蛋白免疫组分泌IFN-γ平均细胞数分别为334个/10⁶，以及179个/10⁶，而PBS免疫组仅有3.66个/10⁶（图9、图10）。

综合以上结果，所构建HCV EDA-ΔNS3-VAL-44表现出了良好的免疫效果：能够显著促进机体产生髙滴度的体液免疫应答，而且可以在HHD-2小鼠体内诱发特异性细胞免疫应答，引发IFN-γ的分泌以及特异性CTL的产生，该HCV多表位重组蛋白是较理想的HCV预防/治疗性候选疫苗，可以作为针对丙型肝炎病毒疫苗或抗HCV病毒药物的制备。所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的体液免疫应答的药物。所述的药物为诱发针对丙型肝炎病毒的细胞免疫应答的药物。所述的药物为刺激分泌IFN-γ的细胞增殖的药物。

本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识或常用手段，这里不一一叙述。

SEQUENCE LISTING

<110> 11

<120> 疫苗

<130> 11

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 978

<212> DNA

<213> Hepatitis C virus

<400> 1

aacattgatc gccctaaagg actggcattc actgatgtgg atgtcgattc catcaaaatt 60

gcttgggaaa gcccacaggg gcaagtttcc aggtacaggg tgacctactc gagccctgag 120

gatggaatcc gggagctttt ccctgcacct gatggtgaag acgacactgc agagctgcag 180

ggcctcaggc cggggtctga gtacacagtc agtgtggttg ccttgcacga tgatatggag 240

agccagcccc tgattggaat ccagtccaca gcgcccatca cggcttactc ccaacagacg 300

cggggcttgc ttggttgtat catcaccagc ctcacaggcc gggacaagaa ccaagtcgag 360

ggggaggttc aagtggtttc caccgcaaca caatctttcc tggcgacctg cgtcaacggc 420

gtgtgttgga ccgtctatca tggcgctggc tcaaagacct tagccggccc aaaaggccca 480

attacccaaa tgtacactaa tgtagatcag gacctcgtcg gctggccggc gccctctggg 540

gcgcgttcct tgacaccatg cacttgcggc agctcggacc tttacttggt cacgagatat 600

gccgatgtca ttccggtgcg ccggcggggt gacagtaggg ggagtctact ctcccccagg 660

cctgtctcct acttgaaggg ctcttcgggt ggcccactgc tctgcccttc ggggcacgct 720

gcgggtatct tccgggctgc tgtgtgcacc cgaggggttg cgaaggcggt ggacttcgta 780

cccgttgagt ctatggaaac taccatgcgg tctccggtct tcacagacaa ctcatccccc 840

ccggccgtgc tgtctgactt caaagtctgg ctcaagaaaa agtttccagg cggagggcag 900

atcgtgggtg gcgtctacct gctccccagg agaggacctc ggctgaaaaa gagcatgatg 960

gccttctccg ccgctctc 978

<110> fmmu

<120> 111

<130> 111

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 270

<212> DNA

<213> Hepatitis C virus

<400> 1

aacattgatc gccctaaagg actggcattc actgatgtgg atgtcgattc catcaaaatt 60

gcttgggaaa gcccacaggg gcaagtttcc aggtacaggg tgacctactc gagccctgag 120

gatggaatcc gggagctttt ccctgcacct gatggtgaag acgacactgc agagctgcag 180

ggcctcaggc cggggtctga gtacacagtc agtgtggttg ccttgcacga tgatatggag 240

agccagcccc tgattggaat ccagtccaca 270

<110> fmmu

<120> 111

<130> 1111

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 576

<212> DNA

<213> Hepatitis C virus

<400> 1

gcgcccatca cggcttactc ccaacagacg cggggcttgc ttggttgtat catcaccagc 60

ctcacaggcc gggacaagaa ccaagtcgag ggggaggttc aagtggtttc caccgcaaca 120

caatctttcc tggcgacctg cgtcaacggc gtgtgttgga ccgtctatca tggcgctggc 180

tcaaagacct tagccggccc aaaaggccca attacccaaa tgtacactaa tgtagatcag 240

gacctcgtcg gctggccggc gccctctggg gcgcgttcct tgacaccatg cacttgcggc 300

agctcggacc tttacttggt cacgagatat gccgatgtca ttccggtgcg ccggcggggt 360

gacagtaggg ggagtctact ctcccccagg cctgtctcct acttgaaggg ctcttcgggt 420

ggcccactgc tctgcccttc ggggcacgct gcgggtatct tccgggctgc tgtgtgcacc 480

cgaggggttg cgaaggcggt ggacttcgta cccgttgagt ctatggaaac taccatgcgg 540

tctccggtct tcacagacaa ctcatccccc ccggcc 576

<110> fmmu

<120> 111

<130> 11111

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 132

<212> DNA

<213> Hepatitis C virus

<400> 1

gtgctgtctg acttcaaagt ctggctcaag aaaaagtttc caggcggagg gcagatcgtg 60

ggtggcgtct acctgctccc caggagagga cctcggctga aaaagagcat gatggccttc 120

tccgccgctc tc 132

Claims

1.一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗，其特征在于：包括以下纤连蛋白外部结构域A，ΔNS3以及VAL-44：其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，EDA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，ΔNS3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，3个多表位核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

2.权利要求1所述的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗在制备针对丙型肝炎病毒的预防性/治疗性疫苗的应用。

3.权利要求1所述的一种HCV多表位肽与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白疫苗在制备抗丙型肝炎病毒的药物中的应用。