CN117264069B - 一种促进皮肤组织再生的工程化外泌体的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种促进皮肤组织再生的工程化外泌体的制备方法及其应用，具体的还提供特异性的开发了抑制MMP‑9的单克隆抗体，所述抗体通过抑制高糖环境中MMP‑9的过表达，来促进了所述细胞的增殖。将所述的单抗与外泌体负载后，能够更好的提高药物的活性。

Description

一种促进皮肤组织再生的工程化外泌体的制备方法及其应用

技术领域

本申请涉及生物领域，具体的涉及一种促进皮肤组织再生的工程化外泌体的制备方法及其应用。

背景技术

皮肤创口的愈合是一个动态连续的生理过程，需要各种细胞类型及其衍生分子的精细协调以恢复受损组织。典型的伤口修复过程根据其细胞事件、生化反应的不同可以分为一系列重叠阶段，包括止血期、炎症期、增殖期和重塑期。止血在皮肤损伤后立即发生，血小板与胶原蛋白的相互作用导致血小板的活化和聚集，在凝血酶激活的纤维蛋白网作用下最终转化为稳定的凝块。炎症阶段的主要任务是清除组织碎片和病原体，为新组织的产生提供伤口床。免疫细胞的活动在该阶段中起着核心作用，通过直接的活动和旁分泌进一步控制出血并阻止感染。增殖期的开始伴随着炎症期的缓解和免疫细胞的凋亡。这个阶段是伤口实际闭合的阶段，主要包括再上皮化、血管重建和细胞外基质的生成，完成伤口的填充和覆盖。在伤口的重塑阶段，细胞增殖受到抑制，炎症进一步消退，大量胶原蛋白沉积，形成的细胞外基质及胶原纤维被重塑和重新排列，新组织的柔韧性和强度得到提高，最终形成瘢痕组织。愈合过程出现缺陷会导致慢性伤口或者增生性瘢痕。高龄、感染、静脉疾病、糖尿病是慢性伤口发生发展的常见原因。干细胞外泌体基于其亲本细胞强大的免疫调节能力、自我更新能力、多向分化潜力及免疫原性低和来源广泛等诸多优点，仍是目前主流的研究方向，其制备技术、相关机制研究均较为成熟。

外泌体是内体衍生的直径范围为40-100nm的盘状双层膜结构小囊泡，几乎能被所有细胞分泌并广泛分布于上清液和体液中。外泌体携带与亲本细胞相似的一系列生物活性物质，可与受体结合参与信号传导并改变细胞功能，或通过靶细胞的摄取直接调节细胞状态，介导长距离或短距离细胞间的通讯。微小RNA被证明可以在外泌体中选择性富集并调节靶细胞的基因表达。进一步的研究发现外泌体中存在的信使RNA、核糖体RNA、长链非编码RNA和可变的一些DNA也参与对受体细胞的调节。四跨膜蛋白富集在外泌体膜中，主要包括CD63、CD81、CD83和CD9，在调节膜结构、协助细胞通讯方面发挥重要作用。近年来，外泌体也被证明可以运输白三烯、脂肪酸和前列腺素等生物活性脂质。

外泌体生物相容性高、免疫原性低，这使得外泌体在运送核酸序列和化疗药物等方面具有巨大的潜力。但是有研究表明天然外泌体大部分在体内的生物半衰期较短(<6h)，而且天然外泌体内容物成分受限于亲本细胞，并不负载药物分子，治疗效果有限。因此，科学家们通过生物工程技术改造天然外泌体，增强其药物递送、靶向以及减缓聚集、蛋白质吸附和肾脏清除等能力，工程化外泌体的研究应运而生。工程化外泌体主要是指天然外泌体经过生物工程技术处理后，具有增强的载药效率、靶向性以及抵抗机体清除率等特点的一类被改造修饰的外泌体。通常这类外泌体的大小和形状不会发生明显变化，但是根据不同的研究目的，其膜负载物或内容物会有明显区别。

外泌体与药物室温共孵育是一种常用的载药方法。疏水修饰的小干扰RNA在共孵育时有效地装载到外泌体中，携带针对Huntingtin mRNA的小干扰RNA的外泌体能被原代小鼠皮质神经元有效地内化，并促进Huntingtin mRNA和蛋白的剂量依赖性沉默，携带小干扰RNA的外泌体进入大脑的广泛分布和有效性有望推动亨廷顿病和其他神经退行性疾病治疗方法的发展。将PTX与另一种抗癌药物吲哚青绿(ICG)共同孵育，获得了双载药的外泌体[(EV/(ICG/PTX)]，EV/(ICG/PTX)表现出了比游离药物或者单载药外泌体更优越的抗癌效果。虽然这种方法简单，但外泌体自身的体积和其表面小的膜孔尺寸限制了药物进入，通常导致载药效率低下。此外，利用超声、电穿孔及冻融等物理方法，破坏外泌体的膜完整性，可以使药物分子更容易进入外泌体，达到工程化外泌体的目的。例如，利用超声技术将铁死亡诱导剂和孟加拉玫瑰负载到外泌体(Er/Rb@ExosCD47)内，体外体内实验均证明Er/Rb@ExosCD47能促进肿瘤细胞的铁死亡，发挥抗肿瘤作用。

目前，使用外泌体负载药物获得工程化外泌体用于促进皮肤组织再生的研究还较少，有待于进一步的开发。

发明内容

本发明提供一种促进皮肤组织再生的工程化外泌体。

本发明的干细胞外泌体通过化学点击的方式连接单克隆抗体mAb从而实现靶向协同的治疗效果。

MMP-9能影响角质形成细胞迁移和上皮再生，在糖尿病损伤组织中表达增高，大量研究表明，过量的MMP-9是糖尿病皮肤创面愈合不良的预测因素。因此，本发明在此基础上，开发了特异性针对MMP-9的单克隆抗体，通过该抗体来抑制MMP-9的表达进而促进糖尿病患者皮肤损伤的修复。

具体的，本发明提供一种MMP-9的单克隆抗体MMP-9-3，其轻链可变区如SEQ IDNO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示，该抗体具有较好的亲和特性。

在一些实施方案中，所述抗MMP-9抗体部分包含a)VH可变区和b)VL可变区，并且VL可变区包含：SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:1具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VH可变区包含：SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:2具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。

在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分是嵌合的或人源化的。在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双体抗体(Diabody)、三体抗体(Tribody)和四体抗体(Tetrabody)。在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分包括Fc片段。在一些实施方案中，所述抗体部分是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体部分具有选自以下的同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变区可以分别称为“V_H”和“V_L”。两条链中的可变区通常包含三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链(LC)CDR，包括：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDR，包括：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界，可以由Kabat、Chothia或Al-Lazikani的公约(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia1989；Kabat 1987；Kabat 1991)界定或确认。重链或轻链的三个CDR插入在称为框架区(FRs)的侧向延伸之间，与CDR相比所述框架区的保守性更高，并且形成一个支架以支撑高变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。根据重链恒定区的氨基酸序列将抗体分类。抗体的五个主要类别或同种型分别是：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们的特征在于α、δ、ε、γ和μ重链的存在。几种主要的抗体类别分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(Ig4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。

在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分与所述MMP-9的K_D为约1x10^-10M至约1x10^-8M(例如，约9×10^-10至1×10^-9，约1×10^-9 至2×10^-9，约2×10^-10至5×10^-9，或约5×10^-10至1×10^-8)。

进一步的，本发明还提供了来自脂肪间充质干细胞的外泌体。所述外泌体通过本领域常规的方法即可制备获得。

进一步的，本发明提供了一种负载了单抗的外泌体，所述负载是通过使用乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活mAbMMP-9-3上的羧基，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以稳定中间体。最后将mAbMMP-9-3活化的羧基与Exo的氨基结合，得到mAbMMP-9-3-Exo。该封装方法是基于“Surface-modifed engineered exosomesattenuated cerebral ischemia/reperfusion injury by targeting the delivery ofquercetin towards impaired neurons”公开的方法来制备的，是本领域较为成熟的外泌体负载单抗的方法。

进一步的，本发明还提供了负载了单抗的外泌体或所述单抗在制备用于促进高糖环境下皮肤损伤后再生的药物组合物中的用途。

本发明针对高糖环境中皮肤细胞高表达MMP-9的公知常识，特异性的开发了抑制MMP-9的单克隆抗体，所述抗体通过抑制高糖环境中MMP-9的过表达，来促进了所述细胞的增殖。将所述的单抗与外泌体负载后，能够更好的提高药物的活性。

附图说明

图1 MMP-9单克隆抗体的特异性鉴定结果图

图2 MMP-9单克隆抗体对HSF细胞增殖的结果图

图3 mAbMMP-9-3-Exo负载结果鉴定图

实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

实施例1 MMP-9单克隆抗体的制备

将MMP-9重组蛋白（货号KM040526，KEMOBio）与MF59佐剂1 :1等体积混合，对BALB/c小鼠进行皮下免疫，免疫间隔为3周，每次免疫剂量为40 μg/只，共免疫3次。第3次免疫后2周检测小鼠血清抗体效价。选取血清抗体效价最高的1只小鼠，融合前以同样剂量冲击免疫1次。融合当天，无菌摘除小鼠脾脏制备脾细胞悬液，按8:1的比例与SP2/0细胞混合，PEG1500法融合。用HAT、HT培养基培养并筛选融合细胞，通过3次有限稀释亚克隆阳性杂交瘤细胞，最终获得5株阳性反应最强的抗MMP-9蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为MMP-9-1、MMP-9-2、MMP-9-3、MMP-9-4、MMP-9-5。

将筛选得到的杂交瘤细胞扩大培养。BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡0.5 mL/只，78d后腹腔接种杂交瘤细胞悬液，每只3×10⁶个细胞。10 d后，收集腹水，Protein A亲和纯化，获得纯化的单克隆抗体，调整蛋白浓度为1mg/mL备用。

实施例2 MMP-9单克隆抗体的特异性鉴定

将 MMP-9重组蛋白分别与BSA无关蛋白包被于同一96孔板中，其中，重组MMP-9蛋白抗原包被质量浓度为1mg/L，酶标IgG-HRP最佳工作浓度为1:8000；待检单抗稀释度为1:1000；包被液为0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）；抗原吸附方式为37℃2h后转4℃过夜；抗体在37℃温育1h即可反应完全；洗涤液为0.5M PBST（0.05％ Tween-20）；最佳终止液为2M硫酸。用间接ELISA法测定5株单抗的特异性，结果如图1所示。

图1的5株单抗与不同蛋白酶联免疫吸附实验结果显示5株均能特异性识别MMP-9目的蛋白，而与BSA蛋白的反应性较低，表现出良好的特异性。特别是MMP-9-3单克隆抗体具有最强的OD值，具有最好的结合特性。

实施例3 MMP-9单克隆抗体抑制MMP-9蛋白表达特性鉴定

人皮肤成纤维细胞（HSF购买自昆明细胞库编号：KCB 200537）用完全DMEM（高糖）培养液将HSF细胞浓度调至1×10⁵个/mL。加入Petri培养皿中，每个1mL，放入37℃，5%CO₂条件下培养24h。吸出液体，按实验组分别加入5种单抗终浓度为200μg/mL的MMP-9单克隆抗体，每个皿1mL，放入37℃，5%CO₂条件下继续培养24h。按下列步骤处理细胞后进行实验观察。用PBS液漂洗2～3次，洗去细胞表面的残渣及其他杂质；向Petri皿中加入PBS漂洗1遍，加入甲醛-丙酮（1∶1）混合液8min，用PBS液漂洗3次。加入稀释好的二抗（1∶100），孵育4h。用PBS液漂洗3次。加入稀释好的荧光FITC（1∶250），37℃孵育30min，用PBS液漂洗3次。用激光扫描共聚焦显微镜进行检测，检测条件为激发波长497nm，发射波长512nm。FluoviewVersion4.3软件采集分析图像，重复3次，计算各组细胞的平均荧光强度。结果如表1所示。

表1 各单抗对HSF细胞中MMP-9蛋白表达的影响

组别	MMP-9荧光强度
		无单抗对照组	1087.34±53.16
MMP-9-1	203.15±11.08
		MMP-9-2	197.92±9.48
MMP-9-3	86.31±3.27
		MMP-9-4	353.74±30.46
MMP-9-5	257.14±13.49

从表1的结果显示高糖环境下不添加单抗处理，HSF细胞MMP-9蛋白高表达，5种单抗组均可显著抑制HSF细胞MMP-9蛋白表达（P＜0.01）。这说明MMP-9-3单克隆抗体具有最强的抑制MMP-9蛋白表达的特性。

实施例4 MMP-9单克隆抗体MMP-9-3亲和力及可变区鉴定

SPR技术（GE-Biacore T200）检测MMP-9-3抗体亲和力，将抗鼠IgG二抗固定于CM5芯片上，利用BiacoreT200分别捕获MMP-9-3抗体，将MMP-9抗原作为分析物，用缓冲液分别稀释到0、7.5、15和30nM浓度梯度，利用单循环动力学检测抗体与MMP-9抗原的结合。最终数据用biacoreevaluationsoftware3.0按1:1模型进行kinetics拟合分析。结果如表2所示。

表2 MMP-9-3单克隆抗体亲和力特性分析结果

SPR	结果
		KD（M）	1.35E-10
Ka（1/（mol*s/L））	2.57E+05
		Kd（1/s）	3.48E-05

将MMP-9-3杂交瘤细胞寄送武汉百奇生物，进行可变区测序，通过数据库比对分析，鉴定获得该单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例5 MMP-9单克隆抗体对HSF细胞增殖的影响

采用CCK-8比色法，用完全DMEM（高糖）培养液将HSF细胞浓度调至1×10⁵个/mL并加入96孔板中，每孔100μL，各实验组分别加入不同剂量的单抗（0、50、100、200、500μg/mL），每孔100μL，对照组加入完全DMEM 100μL，37℃5%CO₂条件下分别培养24h。检测前4h，每孔加入CCK-8 10μL，酶标仪450nm处检测吸光度。计算相应的单抗对细胞生长的影响。结果如图2所示。

从图2可知，采用单抗处理后，随着单抗浓度的升高，相对于空白组，单抗能够在高糖环境下，抑制MMP-9蛋白的表达，进而促进细胞的增殖，具有剂量依赖性（差异显著，P<0.05）。特别是在500μg/mL单抗处理组的细胞相对增殖率达到了（140.13±2.05）%，促增殖效果明显。

实施例6 脂肪间充质干细胞外泌体的制备及负载抗体的制备

取第4代人ADSC，待细胞生长至80%融合时，更换为无外泌体完全培养基继续培养，24h后收集细胞上清液，采用密度梯度离心法提取外泌体。电镜显示提取的外泌体呈囊泡状结构，用粒径分析仪检测外泌体粒径分布在55~150nm之间。另取外泌体，Western blot 方法检测外泌体中CD9、CD63、CD81的表达， 结果显示提取的外泌体可以表达特异性表面标志物CD9、CD63和CD81。

将上述分离的外泌体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)、二甲基亚砜(DMSO)和吐温80(85:10:5，v/v/v)的培养基中在冰水浴中连续超声振荡下孵育以封装Exo。经过离心和PBS清洗后，使用碳二亚胺方法在Exo表面修饰MMP-9-3单抗。具体的，使用乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活mAbMMP-9-3上的羧基，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以稳定中间体。最后将mAbMMP-9-3活化的羧基与Exo的氨基结合，得到mAbMMP-9-3-Exo。

mAbMMP-9-3-Exo中mAbMMP-9-3的存在通过将Exo和mAbMMP-9-3-Exo与HRP-Rabbit抗体直接孵育1小时、Western blot进行评估结果如图3所示。mAbMMP-9-3-Exo可以检测到CD63和MMP-9的2个条带，而Exo只能检测到针对CD63的条带，这充分的说明，mAbMMP-9-3成功缀合至Exo表面。

实施例7 mAbMMP-9-3-Exo对皮肤模型的功效验证

以HSF细胞为种子细胞，丝素蛋白修饰的聚酯聚酰胺无纺布为生物支架，复合制备的组织工程皮肤放入5%的CO₂培养箱中，10%胎牛血清的高糖DMEM中培养，每2天换液一次。实验设对照组：不经过UVA照射，模型组：UVA照射剂量为10J/cm²，实验组1：UVA照射后加入mAbMMP-9-3-Exo 100μg/mL；实验组2：UVA照射后加入Exo 100μg/mL；实验组3：UVA照射后加入mAbMMP-9-3 100μg/mL；阳性对照组：UVA照射后加入Isoginkgetin 100μg/mL；UVA的波长为330-380NM，照射距离为1cm。MTT被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测，用酶联免疫检测仪在一定波长下测定吸光度值（OD)，可以间接反应细胞生长及增殖活性。接种的模型在其生长的第4天接受UVA照射，第5天弃去培养板中的培养液，加入3ml无血清培养液和2mLMTT溶液（2mg/ml),37℃孵育4h。小心吸弃上清液，每孔中加入1mLDMSO，用吸管反复吹打使蓝紫色结晶充分容解于DMSO中。取150μl溶解后的溶液加入96孔细胞培养板内，用酶标仪在波长为490nm处测定吸光度值。计算细胞存活率，存活率＝1-（对照组OD值-模型组或实验组OD值）／对照组OD值。结果如表3所示。

表3 mAbMMP-9-3-Exo对皮肤模型增殖效果的影响

组别	细胞存活率（%）
		模型组	76.31±2.47
阳性对照组	89.31±3.52
		实验组1	105.35±6.48
实验组2	84.31±4.53
		实验组3	95.32±5.76

从表3可以看出，将抗体负载在外泌体上面后，可以有效的协同增加皮肤模型的损害修复效果，比单独使用外泌体或者单独使用单抗的修复效果要显著的增加。而且本发明的单抗也比阳性对照组的效果要好，这说明单抗更有利于皮肤模型的修复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制； 尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (4)

1.一种靶向MMP-9的单克隆抗体，其命名为MMP-9-3，所述抗体的轻链可变区序列如SEQID NO：1所示，其重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述靶向MMP-9的单克隆抗体在制备用于促进皮肤细胞损伤后的皮肤组织再生的药物中的应用。

3.一种促进皮肤组织再生的工程化外泌体在制备用于促进皮肤细胞损伤后的皮肤组织再生的药物中的应用；其中所述工程化外泌体是脂肪间充质干细胞外泌体负载权利要求1的靶向MMP-9的单克隆抗体获得。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述负载是通过使用乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活mAbMMP-9-3上的羧基，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以稳定中间体，最后将mAbMMP-9-3活化的羧基与Exo的氨基结合，得到mAbMMP-9-3-Exo，所述mAbMMP-9-3为权利要求1所述的靶向MMP-9的单克隆抗体，所述Exo为脂肪间充质干细胞外泌体。