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CN117230082A - 调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用 - Google Patents

调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用 Download PDF

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CN117230082A
CN117230082A CN202311150371.3A CN202311150371A CN117230082A CN 117230082 A CN117230082 A CN 117230082A CN 202311150371 A CN202311150371 A CN 202311150371A CN 117230082 A CN117230082 A CN 117230082A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ghfkf1
gene
flowering time
regulating
plants
Prior art date
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Pending
Application number
CN202311150371.3A
Other languages
English (en)
Inventor
王寒涛
杨淼茜
魏恒玲
付小康
马亮
喻树迅
芦建华
康萌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
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Abstract

本发明涉及基因工程和植物育种技术领域，尤其涉及一种调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用。本发明所述调控植物开花时间的方法包括如下步骤：调节植物中GhFKF1基因活性。本发明研究表明：植物中GhFKF1基因的活性直接影响植物开花时间。当GhFKF1基因高表达时，植株开花时间提前。进而，可通过对植物中GhFKF1基因活性的调节，实现对植物开花时间的调控。

Description

调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用
技术领域
本发明涉及基因工程和植物育种技术领域，尤其涉及一种调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用。
背景技术
棉花是我国最重要的经济作物之一。早熟棉生育周期短，生长发育快，利用其适宜晚春播、初夏播和夏播的特性，可以和冬季作物如冬小麦、油麦菜等实现粮棉轮作，通过优化作物种植指数，有效提高土地复种指数，提高棉花的产量。棉花早熟性调控机理是加速早熟棉遗传改良的重要基础。棉花的早熟性除受到基因的调控外，还存在环境的影响，研究表明，在苗期、蕾期、开花期、铃期、吐絮期、第一果枝节位、霜前花率等的遗传相关性大于环境相关性，可以作为棉花早熟性的指标(田菁华，1983；喻树迅等,1990)。因此，鉴定棉花开花相关基因，阐明其调控机制，并创制早熟棉优异种质资源，对于早熟棉品种的培育及产业化具有重要的意义。
对于植物而言，光不仅是光合作用的能源，还是调节生长和发育的关键环境因子。植物通过光受体感知日长，光照质量和光照强度来调节开花时间。在植物体内存在光的感受器，如红光/远红光受体光敏色素(Phytochromes)(如PhyA和PhyB)和两种蓝光受体：隐花色素(如CRY1和CRY2)和向光素(如phot1和phot2)。另外研究发现拟南芥中F-box蛋白(FLAVIN-BINDINGKELCHREPEAT F-BOX1)具有一个与向光素高度类似的，能够吸收蓝光的LOV(Light，Oxygen，orVoltage)结构域，被证明作为蓝光受体在植物体内发挥作用。
FKF1蛋白在光周期开花途径中起着重要的作用。在长日照条件下FKF1突变体与野生型相比表现出明显的晚花表型，说明FKF1蛋白在调控植物开花过程中起正调控作用，在拟南芥中，转录因子CO对FT基因表达的调控对于光周期开花至关重要。长日照条件下，CO能够直接结合到FT基因的启动子促进其表达，从而促进开花。在光周期开花途径中，FKF1在转录和翻译后水平上均能够正调节CO。FKF1还能通过其LOV结构域与CO蛋白直接结合，维持其在傍晚的稳定性，从而促进FT基因的表达。最近研究表明，FKF1还能与赤霉素信号转导途径中的关键负调控因子DELLA蛋白相互作用，促进DELLA蛋白的降解去促进开花。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种调控植物开花时间的方法，包括如下步骤：调节植物中GhFKF1基因活性。
本发明研究表明：植物中GhFKF1基因的活性直接影响植物开花时间。当GhFKF1基因高表达时，植株开花时间提前。进而，可通过对植物中GhFKF1基因活性的调节，实现对植物开花时间的调控。
优选地，调节植物中GhFKF1基因活性的方式包括敲除GhFKF1基因、沉默GhFKF1基因、降低GhFKF1基因表达、导入GhFKF1基因、提升GhFKF1基因表达中的至少一种。
更优选地，调节植物中GhFKF1基因活性的方式为导入GhFKF1基因和/或提升GhFKF1基因表达，以促进植物开花，将植物开花时间提前。
优选地，所述GhFKF1基因表达后的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述GhFKF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述植物优选包括农作物植物。
更优选地，本发明所述植物为棉花或拟南芥。
第二方面，本发明提供了一种培育开花时间发生变异的植物品种的方法，包括如下步骤：调节植物中GhFKF1基因活性。
基于GhFKF1在调控植物开花时间方面的有效应用，本发明同样可以通过调节植物中GhFKF1基因活性，进而培育开花时间发生变异的植物品种。
第三方面，本发明提供了靶向编辑GhFKF1基因的生物材料在调控植物开花时间，或者培育开花时间发生变异的植物品种中的应用。
优选地，所述生物材料包括具有GhFKF1基因表达功能的表达载体和/或工程菌。
第四方面，本发明还提供了用于调控植物开花时间的生物材料，所述生物材料为具有GhFKF1基因表达功能的表达载体或工程菌。
有益效果：
本发明提供了一种调控植物开花时间的方法及其生物材料与应用。本发明所述调控植物开花时间的方法包括如下步骤：调节植物中GhFKF1基因活性。本发明研究表明：植物中GhFKF1基因的活性直接影响植物开花时间。当GhFKF1基因高表达时，植株开花时间提前。进而，可通过对植物中GhFKF1基因活性的调节，实现对植物开花时间的调控
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为本发明实施例1中GhFKF1在早晚熟材料中的表达量统计结果。
图2为本发明实施例1中GhFKF1在不同棉花组织中的表达量统计结果。
图3为本发明实施例1中GhFKF1亚细胞共定位结果。
图4为本发明实施例1中过表达拟南芥中GhFKF1的相对表达量荧光定量验证结果。
图5为本发明实施例1中过表达GhFKF1促进拟南芥提早开花的表型观察结果。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例从陆地棉中克隆出GhFKF1基因，该基因通过构建过表达载体，在拟南芥中异源表达得到的过表达转基因株系相比于野生型开花提前，说明GhFKF1基因在棉花开花期方面起到了重要的调控作用。
具体试验内容如下：
1、试验材料
1.1棉花材料
本实验选取的棉花材料为陆地棉早熟品种中棉所50和晚熟品种国欣棉11，其中中棉所50和国欣棉11在开花时间和生育期存在着极显著差异(表1)，种植于中国农业科学院棉花研究所试验田(河南省安阳市白璧镇)，管理措施为正常大田管理。取样方式为三个棉花品种一叶期到五叶期的幼芽，至于液氮中，在提取样品RNA之前放置-80℃留存。
表1中棉所50和国欣棉11性状显著性检验
性状 中50 国欣棉11 差异
生育期(天) 108 124 15**
开花期(天) 62 70 8**
1.2试剂和耗材
限制性内切酶，修饰酶、PCR反应体系相关酶、同源重组酶、胶回收试剂盒、克隆试剂盒、质粒小提试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司，荧光定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。
其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，卡那霉素等索莱宝生物有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α和农杆菌感受态购自擎科生物公司。
培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55度时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；1/2MS固体培养基：1/2MS22g/L，琼脂粉(agarpowder)8g/L，蔗糖(sucrose)30g/L。
主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)，高速离心机(HettichMIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、电热恒温培养箱(上海森信)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱、人工气候室。
2、试验方法和结果
2.1基因克隆和序列分析
从CottonFGD(http://www.cottonfgd.org/)上获得GhFKF1(GH_D12G1711)基因的CDS序列和编码的氨基酸序列，其开放阅读框为1884bp，编码627个氨基酸，我们将该基因命名为GhFKF1，并对其功能进行研究。
GhFKF1开放阅读框序列为：
ATGTCTAAAGGAGAAGAAGTGACGCCAAGCAGTGGAAAACGGCAGCGTTTCTCGAAAGATGAAGACCACAAGCTTGAACGAAGGGAGGAAGAAGGCGACGATGAAGATGAAGGAAAGAGCGAGCTTCCTTTGAAGCCAGGGCTGTTGTATTACCCGACAATTCCGACTTCTTTCGTTGTTTCCGATGCTCTTGAACCTGATTTTCCCGTCATTTATGTCAACAAAGTCTTCGAGGTTTTCACCGGTTACCGAGCGGACGAAGTCCTTGGTCGCAACTGTCGTTTCTTACAGTATAGAGACAGACGTGCTCAAAGACGGCACCCTTTGGTTGATCCTTTTGTTGTTTCCGAGATAAGAAGATGTCTTGAGGAAGGAATTGAATTTGAAGGGGAGCTTCTGAATTTCAGGAAGGATGGCACTCCATTGGTGAACAGGTTAAAACTTGCACCTATACGTGATGATGATGGAATTGTTACACATGTTATCGGTATTCAAGTTTATTCCGAAGCAAAACTGGATCTGAACCAAGTTTCATATCCGGTTTTCAAAGAGACTTGTAAGCAGCAGTTGGATCAGTCATCTAAATGCTCTTATTTGAGTGGAAATCCACTGTTTAATCATCATCAAGAAATATGTGGGATACTCCAACTCTCTGATGAAGTCTTGGCTTATAACATTTTATCACGATTGACACCAAGGGATGTTGCTTCTATTGGATCTGTGTGCAGAAGGATACGTCAACTAACTAAAAATGAGCATGTGAGGAAGATGGTATGTCAGAATGCCTGGGGAAAGGAAGTCACTGGTACACTGGATATGATGACTAGGAAGTTGGGGTGGGGACGTCTTGCCCGAGAACTGACCACTCTCGAGGCTGTTTGTTGGAGGAAACTGACTGTTGGAGGAGCAGTAGAGCCTTCTCGTTGCAACTTCAGTGCTTGTGCCGCAGGGAACCGTCTTGTGCTTTTTGGAGGGGAGGGAGTCGACATGCAGCCAATGAACGACACATTTGTTCTCAATCTTGAAGCTGCAAATCCGGAGTGGCAACTGGTGAGTGTGGAATCATCTCCTCCTGGGCGCTGGGGCCACACTCTCTCGTGCCTGAATGGTTCATGGTTGGTGGTATTCGGAGGATGTGGAAGGCAAGGGTTGCTCAATGATGTTTTTGTTCTTGACTTGGATGCCAAGCAACCTTCATGGAGAGAAGTATCTGGTGGAACCCCCCCTCTCCCCAGATCTTGGCATAGCTCGTGTACGGTCGATGGTTCTAAGTTGGTTGTTTCTGGTGGGTGTACGGATGCTGGAGTGCTTCTAAGTGACACATACCTTCTGGATCTCACTTCTGAAAAACCAACATGGAAAGAGATTCCATCGTCATGGACACCTCCTTCTAGGTTAGGCCATTCACTTTCGGTTTACAGTCGAACTAAAATTCTTATGTTCGGAGGGTTGGCAAAGAGTGGGAACTTGCAACTGCGATCAGGTGAGGCCTACACTATTGATTTGGAGGATGAAGAACCACAGTGGAGGCAACTAGACTGTAGTGCCTTCACCAGCATCGGTAACCAAAATGCCATCATACCTCCTCCTCGACTTGATCACGTTGCAGTAAGCATGCCTTGTGGGAGGATAATTATATTTGGTGGTTCAGTCGCTGGGTTGCACTCTCCTTCTCAGCTCTTCCTTCTTGATCCTTCAGAGGAGAAACCACCATGGAGGACACTGAATGTTCCTGGGCAACCACCGAAATTTGCTTGGGGTCATGGTACGTGTGTGGTTGGAGGGACTAGGGTCATGATATTAGGCGGACAGACGGGGGAGGAATTGCTACTCAACGAACTGCACGAGTTGCGCTTAGCAAGCAGGCAGGACTTGGATTCATGA(SEQ IDNO：1)
GhFKF1编码的氨基酸序列为：
MSKGEEVTPSSGKRQRFSKDEDHKLERREEEGDDEDEGKSELPLKPGLLYYPTIPTSFVVSDALEPDFPVIYVNKVFEVFTGYRADEVLGRNCRFLQYRDRRAQRRHPLVDPFVVSEIRRCLEEGIEFEGELLNFRKDGTPLVNRLKLAPIRDDDGIVTHVIGIQVYSEAKLDLNQVSYPVFKETCKQQLDQSSKCSYLSGNPLFNHHQEICGILQLSDEVLAYNILSRLTPRDVASIGSVCRRIRQLTKNEHVRKMVCQNAWGKEVTGTLDMMTRKLGWGRLARELTTLEAVCWRKLTVGGAVEPSRCNFSACAAGNRLVLFGGEGVDMQPMNDTFVLNLEAANPEWQLVSVESSPPGRWGHTLSCLNGSWLVVFGGCGRQGLLNDVFVLDLDAKQPSWREVSGGTPPLPRSWHSSCTVDGSKLVVSGGCTDAGVLLSDTYLLDLTSEKPTWKEIPSSWTPPSRLGHSLSVYSRTKILMFGGLAKSGNLQLRSGEAYTIDLEDEEPQWRQLDCSAFTSIGNQNAIIPPPRLDHVAVSMPCGRIIIFGGSVAGLHSPSQLFLLDPSEEKPPWRTLNVPGQPPKFAWGHGTCVVGGTRVMILGGQTGEELLLNELHELRLASRQDLDS(SEQ ID NO：2)
2.2模式分析
研究表明，棉花花芽分化与早熟性状密切相关，是棉花由营养生长过渡到生殖生长的标志。直接影响开花时间。本发明选取早熟品种中棉所50和晚熟品种国欣11，提取了一叶期到五叶期的花芽RNA，采用qRT-PCR技术对GhFKF1表达量进行检测，发现该基因在早熟品种中50一叶期到五叶期的表达量均显著高于晚熟品种国欣11。
为进一步探究GhFKF1在不同组织中的表达模式，选取棉花品种中50的8个不同组织对基因表达水平进行分析，结果显示GhFKF1基因在雄蕊中表达量最高。GhFKF1的表达量检测具体步骤如下：
2.2.1取样、磨样
选取中棉所50和国欣11的一叶期到五叶期的顶芽置于液氮中，使用研钵和研杵将其研磨至粉末，取大约1g样品于1.5ML离心管中。
2.2.2提取
RNA提取利用试剂盒FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit(诺维赞，中国南京)进行，具体步骤如下：
(1)实验在常温下进行，在加有植物组织的离心管中立即加入600μl Buffer PSL(多酚多糖植物)，剧烈涡旋振荡30sec，使样本与裂解液充分混合均匀，12,000rpm(134,00×g)离心5min，立即进行后续操作。
(2)取上清约500μl至FastPure gDNA-Filter Columns III(FastPure gDNA-Filter Columns III已放入收集管中)中，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃掉FastPure gDNA-Filter Columns III，收集滤液。
(3)向收集管中加入0.5倍滤液体积的无水乙醇(约250μl，根据上清实际情况调整)，振荡混匀15sec。将上述混合液转移至FastPure RNA Columns V(FastPure RNAColumns V已放入收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃滤液。
(4)向FastPure RNA Columns V中加入700μl Buffer RWA，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃滤液。
(5)向FastPure RNA Columns V中加入500μl Buffer RWB(使用前请检查是否已加入48ml无水乙醇，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃滤液。
(6)重复步骤6。
(7)将FastPure RNA Columns V放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2min。
(8)将FastPure RNA ColumnsV转移至新的RNase-free Collection Tubes1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央悬空滴加30-100μl的RNase-free ddH2O，12,000rpm(13,400×g)离心1min。
洗脱体积建议不少于30μl，体积过小会影响核酸回收效率。
以下步骤都可以帮助提高RNA产物浓度：RNase-free ddH2O于65℃预热；滴加RNase-free ddH2O后室温静置5min；将第一次洗脱液重新加入吸附柱进行洗脱。
(9)提取的RNA可直接用于下游实验或-85～-65℃保存。
2.2.3反转录cDNA的合成
反转录cDNA的合成利用试剂盒II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)(诺维赞，中国南京)进行，可以分为基因组gDNA的去除和RNA的反转录两部分，反应在冰上进行，反应步骤如下：
(1)基因组gDNA的去除，反应体系配置见表2。
表2反应体系配置
试剂 用量
RNase-free ddH2O to16μl
4×gDNA wiper Mix 4μl
模板RNA 1pg-1μg
用移液器轻轻吹打混匀。42℃2min。
(2)配制逆转录反应体系，见表3。
表3逆转录反应体系
试剂 用量
第一步的反应液 16μl
5×HiScript II qRT SuperMix II 4.0μl
用移液器轻轻吹打混匀，将上述混合溶液20μl在PCR仪中50℃15min，85℃5sec。产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用。
2.2.4荧光定量PCR
(1)设计GhFKF1基因的特异性引物，用棉花His3基因为内参基因(表4)。
表4基因特异性引物
(2)荧光定量PCR
利用Cwbio(China)的UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒和AppliedBiosystems7500仪器完成。具体过程如下：
1)将上述的cDNA原液稀释5倍。
2)反应体系(表5)的配置(冰上操作)：
表5反应体系
试剂 用量
2×UltraSYBR Mixture 10.0μl
PCR Forward Primer(10μM) 0.4μl
PCR Reverse Primer(10μM) 0.4μl
cDNA模板(稀释后的工作液) 2.0μl
dH2O(灭菌蒸馏水) up to 20μl
将配置好的体系混匀，离心至无气泡，然后利用Applied Biosystems7500进行荧光定量PCR：按照两步法设置PCR程序：预变性：95℃2min；95℃，5s；60℃，34s(这一步收集荧光信号)，这两步设置40个循环；最后溶解曲线分析：95℃，15s；60℃，20s；95℃，15s。利用Microsoft Excel2019软件处理数据，计算基因的表达量,Origin2022软件绘图。
2.2.5GhFKF1定量结果分析
荧光定量的结果数据按照2-ΔΔCt(Livak法)计算，得到GhFKF1的相对表达量。其中，GhFKF1在早晚熟材料中的表达量参见图1。GhFKF1在不同棉花组织中的表达量参见图2。
由图1可知：GhFKF1在早熟品种一叶期到五叶期的表达量均高于晚熟品种，且呈现显著差异；由图2可知：GhFKF1在花器官中有较高表达，说明该基因与棉花早熟性有关。
2.3农杆菌介导的烟草瞬时表达和拟南芥异源表达
亚细胞定位与蛋白质的功能密切相关。在研究蛋白质时，确定它们在细胞中的位置通常是第一步。为验证亚细胞定位网站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)预测结果的准确性，构建2300-GFP-GhFKF1重组载体并在烟草中瞬时表达GhFKF1蛋白。发现GhFKF1蛋白定位在细胞核中。将GhFKF1CDS序列全长连接PBI-121载体，构建35S启动子载体。将35S::GhFKF1重组载体通过拟南芥花序侵染法侵染拟南芥，通过对后代种子进行阳性筛选和纯化加代，得到T3代纯系植株。对后代表型和表达量分析，发现过表达GhFKF1促进拟南芥早花。
2.3.1基因引物设计
根据同源重组引物设计原则，设计特异性引物，扩增GhFKF1基因编码区全长。根据该基因CDS序列，在起始密码子ATG和终止密码子处添加相应酶切位点序列，使目的基因片段与酶切后的线性化载体具有相同末端序列。35S启动子载体酶切位点选择XbaI和SacI；用于亚细胞定位的CDS序列去除终止密码子设计特异性引物，2300-GFP载体酶切位点为BamHI和SacI，所用cDNA模板为陆地棉TM-1。
35S::GhFKF1特异性引物序列如下(表6)：
表6引物序列
GhFKF1-2300-GFP特异性引物序列如下(表7)：
表7引物序列
2.3.2基因克隆PCR体系、程序与产物检测
(1)反应在冰上进行，根据试剂盒Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺维赞，南京)设计反应体系如下(表9)：
表9反应体系
试剂名称 试剂用量
ddH2O up to 50μl
2×Phanta Max Buffera 25μl
dNTP Mix(10mM each) 1μl
上游引物(10μM) 2μl
下游引物(10μM) 2μl
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl
模板DNA 2μl
(2)PCR反应程序(表10)：
表10反应程序
(3)PCR产物的检测
在PCR产物中加入5μl10×Loading Buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测条带大小是否1884bp左右。
(4)PCR产物的胶回收
采用Vazyme产物纯化试剂盒，步骤如下：
1)DNA电泳结束后，在紫外灯快速切下含有目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。称取凝胶重量(去除空管的重量)，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。
2)加入等体积的Buffer GDP。55℃水浴7-10分钟，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。
3)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes2ml收集管中，把≤700μl溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60sec。若溶胶体积大于700μl，把吸附柱置于收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60sec。
4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μl Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12,000×g离心30-60sec。
5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μl Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000×g离心30-60sec。
6)重复步骤5。
7)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。12,000×g离心2min。
8)将吸附柱置于1.5ml灭菌的离心管中，加入20-30μl的灭菌水至吸附柱中央，放置2min。12,000×g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。
2.3.3GhFKF1-2300-GFP和35S::GhFKF1植物表达载体的构建
(1)PBI121质粒的双酶切及胶回收
将PBI121质粒用XbaI和SacI双酶切，电泳回收PBI121载体的大片段产物。酶切反应体系如下(表11)：
表11反应体系
试剂名称 试剂用量
XbaI 1μl
SacI/SpeI 1μl
Cut Smart 5μl
PBI121质粒 1μg
ddH2O Up to 50μl
(2)PCR胶回收产物和酶切PBI121质粒的连接
把带有接头的PCR产物和双酶切的PBI121质粒用诺唯赞同源重组酶试剂II One Step Cloning Kit进行连接，连接反应如下：
体系配置(表12)于冰上进行：
表12连接反应体系
试剂名称 试剂用量
5×CE Ⅱ Buffer 2μl
Exnase Ⅱ 1μl
PBI121双酶切载体 25～100ng
PCR片段 10～100ng
ddH2O Up to 10μl
体系完成后，吹打混匀各组分，37℃反应30min，立即冰水浴5min，连接产物转化或者-20℃保存。
(3)连接产物转化大肠杆菌
1)向连接反应体系中加入100ul大肠杆菌DH5α感受态，冰浴30min。
2)42℃水浴热激45～90s。
3)冰浴2min；加入700ul无抗性的LB液体培养基，37℃，190rpm，孵育1h。
4)离心收菌，5000rpm，1min，弃上层上清液，留约100ul混匀后涂布含卡那抗性的LB平板。
5)37℃，恒温培养过夜。
(4)阳性克隆的检测及测序
1)从转化平板上挑取白色菌落，放入含有Kan的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养8小时。
2)菌落PCR验证阳性克隆，将验证正确的单克隆送到尚亚生物科技有限公司测序，每个序列测6个重复。
(5)阳性菌液的保存
菌液PCR验证且测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-80℃保存。返还测序正确的菌液以及质粒用于转农杆菌。
(6)转化农杆菌
利用冻融法转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，具体转化过程如下：
1)-80℃农杆菌融化，冰水混合状态插入冰中。
2)100μl感受态中加入0.01～1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟，液氮5分钟，37℃5分钟，冰浴5分钟。
3)加入700ul无抗性的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3小时
4)取100-150ul菌液于含有卡那、利福平、链霉素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2-3天。
5)挑选阳性克隆，在加有抗性的LB液体培养基上28℃培养48h，菌液PCR验证条带正确的菌液甘油保存终浓度在20％左右，-80℃保存备用。
2.3.4农杆菌介导的烟草瞬时表达
烟草瞬时表达步骤如下：
(1)烟草培养：播种烟草种子若干，长日照条件下培养的烟草，培养一个月用作实验。
(2)农杆菌活化：取-80℃保存的GhFKF1-2300-GFP农杆菌菌液20μl，接种到1mlLB液体培养基(加入对应的抗生素：卡纳霉素、利福平和链霉素)中，28℃，180rpm，培养14-18h；
培养至菌液OD600值约在1.0-1.5之间(约18-20h)，5000g，离心8min，弃上清，收集菌体。
(3)重悬：用10mMMgCl2、10mMMgCl2(含200uMAS，PH＝5.6)悬浮液重悬菌体，调OD600至0.8左右。
(4)注射：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。
(5)培养：将注射完成的烟草植株黑暗培养1天，弱光培养1天，即可观察。
(6)观察：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
注：共定位时，将marker质粒转化农杆菌，和构好的载体质粒农杆菌一起悬浮操作，在注射前按1:1比例混合，然后注射烟草叶片。
2.3.5亚细胞定位结果
激光共聚焦显微镜观察发现，GhFKF1融合蛋白的GFP信号在烟草细胞中瞬时表达后与红色细胞核锚定标记蛋白NLS-mCherry重合。GhFKF1亚细胞共定位情况如图3所示，证实GhFKF1蛋白的核定位。
2.3.6农杆菌介导的拟南芥花序侵染
(1)拟南芥培养
长日照条件(光照16h，黑暗8h)下培养的哥伦比亚野生型拟南芥，选取5周龄左右，生长健壮的株系，剪去角果，侵染的前一天浇水保证拟南芥的状态和湿度。
(2)拟南芥花序侵染
1)菌液活化：取-80℃保存的对应重组载体的农杆菌菌液20μl，接种到1mlLB液体培养基(加入对应的抗生素：卡纳霉素、利福平和链霉素)中，28℃，180rpm，培养14-18h。
2)扩摇：取活化后的对应菌液200μl加入到50mlLB液体培养基(加入对应的抗生素)；28℃，180rpm，培养至菌液OD600值约在1.2-1.6之间(约18-20h)，5000g，离心10min，弃上清，收集菌体。
3)侵染转化的介质配制：1/2MS减半、6％蔗糖、0.02％的SilwetL-77，用NaOH将pH调至5.6-5.7。
4)用转化介质悬浮上述菌体，将OD600调至0.6-0.8。
5)浸染：将拟南芥花序(主要是未开放的花苞)置于转化介质中60-90s，浸染后，将拟南芥在弱光或者避光条件下平放24h。
6)将处理后的拟南芥放置正常条件下培养，并在侵染后的一周内每天给拟南芥叶片喷水；为了提高转化效率，可在约一周后进行重复侵染。
7)待成熟后，收获拟南芥种子，即为转基因的T0代种子。
2.3.7转基因拟南芥植株的表型鉴定
(1)将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2MS上，后进行4℃春化3天，转移到人工气候试验箱中，10天左右会阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄，不再生长。
(2)将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取DNA用PCR进行检测。
检测时所用引物为(表13)：
表13检测引物序列
(3)每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。T3代株系做qRT-PCR检测,荧光定量验证的过程如下：
提取RNA，反转录成cDNA，GhFKF1荧光定量的引物为(表14)：
表14荧光定量引物序列
冰上配制qRT-PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应。荧光定量验证结果证实GhFKF1基因在转基因植株中转录水平极显著高于非转基因拟南芥(图4)。
(4)将转基因T3代植株与非转基因植株进行消毒培养于1/2MS培养基上，4℃春化两天后，10天左右拟南芥幼苗长出真叶即移到小花盆里生长，同等条件下种植栽培，表型观察发现非转基因拟南芥开花明显晚于过表达转基因拟南芥(图5)；说明过表达GhFKF1明显促进拟南芥开花和生殖生长发育。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.调控植物开花时间的方法，其特征在于，包括如下步骤：调节植物中GhFKF1基因活性。
2.根据权利要求1所述调控植物开花时间的方法，其特征在于，调节植物中GhFKF1基因活性的方式包括敲除GhFKF1基因、沉默GhFKF1基因、降低GhFKF1基因表达、导入GhFKF1基因、提升GhFKF1基因表达中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述调控植物开花时间的方法，其特征在于，所述GhFKF1基因表达后的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述调控植物开花时间的方法，其特征在于，所述GhFKF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1-4任意一项所述调控植物开花时间的方法，其特征在于，所述植物为棉花或拟南芥。
6.培育开花时间发生变异的植物品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：调节植物中GhFKF1基因活性。
7.靶向编辑GhFKF1基因的生物材料在调控植物开花时间，或者培育开花时间发生变异的植物品种中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述生物材料包括具有GhFKF1基因表达功能的表达载体和/或工程菌。
9.用于调控植物开花时间的生物材料，其特征在于，所述生物材料为具有GhFKF1基因表达功能的表达载体或工程菌。
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