CN117210490B - 一种调控苹果属植物自花结实的pchr基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调控苹果属植物自花结实的PCHR基因及其应用。本发明发现抑制苹果PCHR蛋白的表达可以调控苹果自花结实性，体现在影响苹果自花授粉花柱中花粉管生长，延伸和最终的坐果。在实际应用中，可以通过转基因等手段抑制苹果PCHR基因的转录水平，调控自花不结实品种自花授粉结实率显著提高，获得自花结实能力，对调控苹果自花结实性，培育苹果自花结实新品种具有重要的应用价值。

Description

一种调控苹果属植物自花结实的PCHR基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体说是一种调控苹果属植物自花结实的PCHR基因及其应用。

背景技术

苹果是我国重要的果树树种，栽植面积和产量均居世界首位。然而，大部分栽培苹果具有自花不结实现象，表现出自花授粉不能结实，必需配置授粉树依赖虫媒传粉或人工授粉才能确保产量，大大增加了苹果生产难度和成本。

课题组早期以自花不结实苹果品种‘岳帅’作父本，自花结实苹果品种‘寒富’作母本创建了自花结实性状分离的杂交子代群体。通过全基因组关联分析定位到一个‘寒富’自花结实数量性状位点，进一步分析发现了一个影响自花结实的关键基因PCHR。该基因具有结合游离钙离子，调节钙离子稳态的能力，其低表达能促进苹果自花结实。

钙离子是细胞内多种生理反应的重要信号物质，在花粉的萌发及花粉管的生长中起着重要作用。时至今日，已经明确开花植物花粉在柱头上萌发后，花粉管尖端会建立一个由高向低的钙离子浓度梯度。这种钙离子浓度差对保持花粉管的完整性、延伸性和引导性至关重要。此外，自花不结实植物自花授粉时往往会产生强烈的钙离子振荡，用以启动下游反应，调控花柱中花粉管的生长。然而，钙结合蛋白具体是如何调控钙离子信号影响苹果自花不结实的尚不清楚。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种调控苹果属植物自花结实的PCHR基因及其应用。PCHR基因具有调节苹果自花结实的作用，体现在影响苹果自花授粉花柱中花粉管生长，延伸和最终的坐果。本发明通过沉默PCHR基因，促进了不能自花结实苹果属植物的自花授粉，为剖析苹果自花结实机制提供了依据，对培育苹果自花结实新品种具有实际意义

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

苹果属植物PCHR蛋白的编码基因的抑制因子在提高苹果自花结实能力中的应用，其特征在于：

所述PCHR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：

MAFRVRNSSSLLSLVLLSLLAIASAKVFFEERFEDGWDKRWVKSDWKSDESLAGEWNYTSGKWNGDANDKGIQTSEDYRFYAISAEFPEFSNKDKTLVFQFSVKHEQKLDCGGGYIKLLSGDVDQKKFGGDTPYSIMFGPDICGYSTKKVHAILNYNNTNNLIKKDVPCETDQLTHVYTFILRPDATYSILIDNVEKQTGSLYSDWDLLPPKKIKDPEAKKPEDWDDKEYIPDPEDTKPEGYDDIPKEIVDPEAKKPEDWDDEEDGEWTAPTIPNPEYKGEWKPKKIKNPNFKGKWKAPLIDNPEFKDDPELYVYPNLKYVGIELWQVKSGTLFDNILITDEPEYAKQLAEETWGKQKDAEKAAFEEAERKQEEEAKDPVDSDAEEEDDADTDDAEDDSDAESKSDSTEESAEESEKHKC；

所述抑制因子为 SEQ ID NO.2 所示的gRNA；

SEQ ID NO.2：

CACACCTCTGGCAAGTGGAATGGAGACTCTAATGACAAAGGTATCCAGACCAGCGAAGACTACAGGTTCCATGCCATTTCGGCTGAGTTCCCTGAATTTAGTAACAAGGGAAAAACCTTAGTATTCCAGTTCTCTGTTAAGCATGAGCAGAAGCTTGACTGTGGTGGTGGATACATGAAGTTGCTTAGTGGAGACGTTGACCAAAAGAAATTCGGTGGTGACACTCCCTACAGTATCATGTTTGGACCAGACATCTGTGGC；

所述应用为：通过所述苹果PCHR蛋白的编码基因的抑制因子对所述苹果PCHR蛋白的编码基因进行转录水平抑制，以提高苹果自花结实能力。

一种提高苹果自花结实能力的方法，其特征在于，采用如SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列的gRNA，抑制苹果PCHR蛋白的编码基因转录水平，实现促进苹果自花授粉的花粉管生长、提高自花授粉受精成功率与自花授粉坐果率。

本发明所述的苹果属植物PCHR蛋白的编码基因的抑制因子在提高苹果自花结实能力中的应用，其有益效果为：

本发明发现苹果PCHR蛋白参与调控苹果自花授粉花柱中花粉管生长，延伸和最终的坐果，通过降低苹果PCHR蛋白的表达，可以显著提高苹果的自花结实能力，以及提高苹果的果实产量。应用至实际生产时，一方面可以在苹果花期抑制PCHR蛋白的表达，以实现闭花授粉即可坐果结实的高产效果；另一方面，也可将苹果PCHR基因突变，获得自花结实能力强的苹果品系。苹果PCHR蛋白及其编码基因，以及相应的抑制因子在提高自花不结实苹果的自花授粉坐果结实能力，以及苹果自花结实分子育种中具有巨大的应用价值。

附图说明

本发明有如下附图：

图1 为过表达PCHR基因授粉后48h（a）和72h（b）花柱中PCHR基因的表达量以及沉默PCHR基因授粉后48h（c）和72h（d）花柱中PCHR基因的表达量；其中Mock分别代表不做处理的“寒富”（a，b）和“富士”（c，d）自花授粉后的花柱，pCambia-1300 EV为注射过表达载体空载的花柱，TRV EV为注射VIGS系统TRV空载的花柱，OE PCHR为注射VIGS系统PCHR基因过表达的花柱，TRV PCHR为注射VIGS系统PCHR基因沉默的花柱。

图2 为“寒富”过表达PCHR基因（a）和“富士”沉默PCHR基因的花柱（b）自花授粉后花粉管生长情况观察；其中Mock为未处理花柱自花授粉荧光观察结果，48HAP和72HAP分别代表授粉后48小时和72小时。

图3 为过表达PCHR基因（a，b）和沉默PCHR基因（c，d）自花授粉后15天的坐果表型及坐果率统计结果，N为实际调查的总花朵数。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明所述PCHR基因优选来源于苹果‘寒富’(Malus domestica ‘Hanfu’.)，基因编码序列含有1263个核苷酸。本发明所述PCHR基因在植株中表达量降低能花粉管中钙离子稳态，抑制花粉管生长。同时所述PCHR基因也显著影响苹果自花授粉结实率。

下面将对苹果属植物自花结实的应用进行详细描述。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。若无特殊的说明，下述实施例中所用的试剂和耗材均能通过商业途径购买。

实施例1

苹果PCHR基因的克隆

取0.5g授粉后花柱，采用艾德莱公司的植物多酚多糖RNA提取试剂盒提取总RNA，然后采用艾德莱公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA。本发明还提供了一对扩增所述PCHR基因的引物，分为正向引物如SEQ ID NO .3所示：5’-ATGGCGTTTAGGGTTCGAAACAGC-3’，反向引物如SEQ ID NO .4所示：5’-TTAACACTTATGTTTCTCAGACTCCTCGG-3’。

扩增所述PCHR基因的PCR方法为：以苹果cDNA为模板，上述引物对为引物进行PCR扩增，所述PCR扩增的反应体系以10μL计，包括：1μL模板 DNA，5μL Taq mix，0 .5μL正向引物，0 .5μL反向引物，ddH₂O 3 μL；本发明所述cDNA浓度调节至100 ng/μL，正向引物和反向引物的浓度均为10μM；所述PCR扩增的程序包括：95℃ 5min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃90s，35个循环；72℃ 7min，12℃保持。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，采用ThermoFisher Scientifi公司的胶回收试剂盒进行回收纯化目的片段，回收片段连接至Takara公司的pMD19-T克隆载体，转化DH5α大肠杆菌感受态，在氨苄抗性培养基上培养，挑取单克隆，菌落PCR检测，获得带有目的片段的单克隆菌株。

实施例2

PCHR基因过表达和沉默载体的构建

本实施例中所用过表达载体为pCambia1300-eGFP，基因沉默采用VIGS技术，载体为烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）TRV病毒载体。分别以CDS全长和+456至+891片段为过表达和VIGS载体构建序列。

设计如下引物扩增CDS全长片段用于过表达载体构建:

1300-PCHR-F：5’-CGATACACCAAATCGACTCTAGAATGGCGTTTAGGGTTCGA-3’ (SEQ IDNO .5)

1300-PCHR-R：5’-GCCCTTGCTCACCATGGTACCACACTTATGTTTCTCAGACT-3’ (SEQ IDNO .6)。

设计如下引物扩增基因沉默同源序列片段用于TRV载体构建:

TRV2-PCHR-F：5’-GTTACCGAATTCTCTAGAAGCACCAAGAAAGTTCACGC-3’ (SEQ ID NO.7)。

TRV2-PCHR-R：5’-ACGCGTGAGCTCGGTACCGGGTTGTCAATCAGTGGTGC-3’ (SEQ ID NO.8)。

将扩增获得的片段，采用同源重组的方式连入XbaI/KpnI双酶切后TRV2载体中。转化DH5α大肠杆菌感受态，涂布与带有50mg/l的LB固体培养基上，37℃培养1天后挑取单克隆菌落PCR检测，获得带有目标质粒的单克隆菌株。

实施例 3

PCHR基因在调控苹果自花结实的作用

将带有目的片段的pCambia1300-eGFP-PCHR和pTRV2-PCHR质粒转入GV3101农杆菌感受态中，所用感受态均能通过商业化途径购买，转化方法详见说明书。转化完成后将菌液涂布于含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上，28℃培养2天，挑取多个单克隆进行菌落PCR检测，选择转化成功的单菌落加入50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃条件下，振荡培养2天，待菌液浑浊后用于后续注射实验。

将菌液在6000 rpm 条件下离心，使用含有的重悬液重悬菌体，静置4h后开展注射实验。实验共分为4组处理，过表达组为带有pCambia1300-eGFP-PCHR菌株，带有pCambia1300-eGFP空载菌株的为相应对照；将带有pTRV1和pTRV2-PCHR的重悬菌液以1:1比例混合作为基因沉默实验的处理组，将带有pTRV1和pTRV2空载的重悬菌液以1:1比例混合作为基因沉默实验的对照组。

于苹果花期，首先收集自花结实苹果‘寒富’（HF）与自花不结实苹果‘富士’（Fuji）花粉进行自花授粉，采集两个品种授粉后48h和72h的花柱固定于FAA固定液中，采用苯胺蓝染色法对花柱中生长的花粉管进行染色，通过紫外光显微镜观察其自花授粉花粉管的生长情况，最终统计坐果率。

同时，选择靠近大气球期的花朵，将准备好的重悬菌液注射到花柱的基部，注射完在花序旁挂上标牌做上标记，套黑色袋避光培养1天。摘掉果袋对注射后的花柱进行人工自花授粉，授粉结束后套上白色果袋。分别在授粉48h后和72h后收集部分处理后花柱立即放入液氮中，于实验室使用艾德莱公司的植物多酚多糖RNA提取试剂盒提取总RNA，经逆转录反应获得cDNA，通过实时荧光定量方法检测PCHR基因的表达变化。结果如图1所示，注射空载菌液花柱自花授粉后PCHR基因表达量与未处理花柱中差异不显著，注射带有过表达PCHR基因菌液的花柱在授粉后48h和72h均检测到更高的PCHR基因表达量，授粉后72h表达量显著高于对照。VIGS沉默PCHR基因的授粉后48h和72h花柱中PCHR基因表达量显著低于对照组，表达量约降低至空载对照的0.6倍。

同时采集相应同花序上邻近花朵的花柱固定于FAA溶液中，于实验室采用苯胺蓝染色法对花柱中生长的花粉管进行染色，并通过紫外光显微镜观察。结果如图2所示，与注射空载的对照相比，过表达PCHR基因的花柱中花粉管生长受到显著抑制，授粉后48h和72h仅能观察到极少数正常生长的花粉管。在自花不结实‘富士’花柱中注射TRV空载自花授粉72h仍观察不到良好生长的花柱，沉默PCHR基因自花授粉48h花柱中观察到正常生长的花粉管，72h后花粉管生长超过花柱的三分之一，几乎到达基部。

待自花授粉15天后拍照记录坐果状态，统计坐果率。结果如图3a, b所示：以自花结实的品种‘寒富’（HF）为试材，相较于未处理组（Mock HF×HF）和注射空载组（pCambia1300-EV）两个对照组，花柱中过表达PCHR基因自花结实率分别从52.17%和42.11%降低至19.48%。以自花不结实的品种‘富士’（Fuji）为试材，相较于未处理组（Mock Fuji×Fuji）和注射空载组（TRV EV）两个对照组，花柱中沉默PCHR基因，自花结实率分别从4.49%和3.68%提高至27.83%。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (2)

1.苹果属植物PCHR蛋白的编码基因的抑制因子在提高苹果自花结实能力中的应用，其特征在于：

所述PCHR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述抑制因子为SEQ ID NO.2所示的gRNA；

所述应用为：通过所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的苹果属植物PCHR蛋白的编码基因的抑制因子对所述苹果属植物PCHR蛋白的编码基因进行转录水平抑制，以提高苹果自花结实能力。

2.一种提高苹果自花结实能力的方法，其特征在于，采用如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的gRNA，抑制氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的苹果属植物PCHR蛋白的编码基因转录水平，实现促进苹果自花授粉的花粉管生长、提高自花授粉受精成功率与自花授粉坐果率。