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CN117187346A - Dna-抗原交换和扩增 - Google Patents

Dna-抗原交换和扩增 Download PDF

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CN117187346A
CN117187346A CN202311169666.5A CN202311169666A CN117187346A CN 117187346 A CN117187346 A CN 117187346A CN 202311169666 A CN202311169666 A CN 202311169666A CN 117187346 A CN117187346 A CN 117187346A
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S·汉尼可
M·玛尼瑟
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Ultivue Inc
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Abstract

描述了用于成像的方法，包括但不限于包括以下的方法：(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与(直接或间接地)连接至光学标记的抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体接触，其中所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，且其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记；(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链和/或抗原特异性结合配偶体；(5)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(6)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号；以及(7)任选地重复步骤(1)‑(7)或其任何子集。

Description

DNA-抗原交换和扩增
本申请为分案，其母案申请的申请号为201880017452.7，申请日为2018年3月30日，发明名称为“DNA-抗原交换和扩增”。
技术领域
DNA-抗原交换和扩增成像方法，能够通过将靶标与抗原、抗原特异性结合配偶体和光学标记连接来多重化靶标并提高靶标的检测灵敏度。
背景技术
产生二级抗体以结合其他抗体，通常具有物种特异性亲和力。在免疫荧光应用中使用二级抗体是很普遍的。二级抗体对于节省成本和信号扩增都是有利的。用荧光团标记二级抗体比直接标记一级抗体更具成本效益，因为可以使用一种类型的荧光标记的二级抗体对许多不同的靶标成像，条件是使用来自相同宿主物种的一级抗体在单独的样品上检测靶标。另外，由于多个荧光标记的二级抗体可以结合单个一级抗体，因此从样品产生的信号强度高于使用荧光标记的一级抗体产生的信号强度。然而，荧光标记的二级抗体的使用严重限制了进行多重化检测的能力。为了多重化多个靶标，必须在不同的宿主物种中产生每个靶标特异性一级抗体，以确保二级抗体与正确的靶标复合物结合并缔合。最常见的一级抗体宿主物种是小鼠和兔子，高质量替代性宿主物种的缺乏降低了多重化能力，这种能力实际上可以用每个样品的两个靶标的二级抗体来实现(即使用标记的抗小鼠二级抗体和标记的抗兔二级抗体来检测用小鼠抗体染色的一个靶标和用兔抗体染色的一个靶标)。
先前的方法试图克服用二级抗体进行物种特异性检测所带来的限制。已经描述了包含与抗原或半抗原连接的一级抗体的免疫试剂(WO2016127149)，用于用标记的抗抗原或抗半抗原抗体(即检测抗体)进行检测。虽然这种方法扩大了可以同时标记的靶标的数量，但是可以多重化的靶标的总数仍然受到可用于修饰检测抗体的光谱不同标记的数量的限制。此外，一旦样品被染色，来自检测抗体的信号是固定的并且不能被去除，除非应用严格的条件，而严格的条件可能损害样品。为了实现更高水平的多重化，需要一种温和的足以维持样品完整性的顺序多重化方法。
在这里，我们提出了用于高度多重化靶标检测的新方法，所述新方法实现了与标记的二级抗体相关联的相似水平的方便性和改进的扩增。这种方法称为DNA-抗原交换和扩增。DNA-抗原交换和扩增允许在单个样品上实现靶标的顺序多重化和扩增水平的动态调整。
发明内容
根据说明书，至少一种方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与(直接或间接地)连接至光学标记的抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体接触，其中所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，且其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记；(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链和/或抗原特异性结合配偶体；(5)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(6)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(7)任选地重复步骤(1)-(7)，或其任何子集(诸如(1)-(6)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
在一些实施方案中，一种方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至抗原，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的抗原；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与连接至对接链的抗原特异性结合配偶体接触，其中不同的抗原特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(4)任选地去除连接至对接链的未结合的抗原特异性结合配偶体；(5)添加成像链；其中所述成像链直接或间接地与对接链具有互补性，并且其中每个成像链(直接或间接地)连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的成像链连接至不同的光学标记；(6)任选地去除未结合的成像链；(7)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(8)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(9)任选地重复步骤(1)-(9)，或其任何子集(诸如(1)-(8)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
在一些实施方案中，一种方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至第一对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体接触，其中所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，并且其中每个抗原特异性结合配偶体连接至至少一个第二对接链；(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链和/或抗原特异性结合配偶体；(5)通过DNA扩增反应增加第二对接链链的数量，并使用光学标记标记所述第二对接链；(6)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(7)任选地熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(8)任选地重复步骤(1)-(8)，或其任何子集(诸如(1)-(7)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
在一些实施方案中，一种方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至抗原，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的抗原；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与连接至对接链的抗原特异性结合配偶体接触，其中不同的抗原特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(4)任选地去除连接至对接链的未结合的抗原特异性结合配偶体；(5)通过DNA扩增反应增加对接链的数量，并使用光学标记标记所述对接链；(6)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(7)任选地熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(8)任选地重复步骤(1)-(8)，或其任何子集(诸如(1)-(7)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
在一些实施方案中，一种组合物包含：(1)第一结合配偶体-寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含与包含对接结构域的寡核苷酸连接的结合配偶体；(2)抗原结合的寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含与包含成像结构域的寡核苷酸连接的抗原，其中(2)的成像结构域与(1)的对接结构域互补；以及(3)标记的抗原特异性结合配偶体，所述标记的抗原特异性结合配偶体包含与抗原特异性结合配偶体连接的光学标记，其中(3)的抗原特异性结合配偶体特异性地结合(2)中的抗原。
另外的目的和优点将部分地在下面的说明书中阐述，并且部分地根据说明书将显而易见，或者可以通过实践来学习。借助于所附权利要求中特别指出的元件和组合，将实现和获得这些目的和优点。
应当理解，前述一般性描述和以下具体描述都只是示例性和说明性的，并不是对权利要求的限制。
包含在本说明书中并构成本说明书一部分的附图示出了一个(几个)实施方案，并与说明书一起用于解释本文所述的原理。
附图说明
图1A-图1F提供了DNA-抗原扩增和交换的方案。图1A示出，附接至对接链(103)的靶标特异性结合配偶体(102)结合样品中的靶标(101)。添加包含抗原(105)的成像链(104)以结合对接链。将附接至光学标记(107)的抗原特异性结合配偶体(106)添加到样品中以结合在靶标上复合的抗原。在此阶段，可以对样品成像以检测信号并鉴定靶标。最后，可以进行交换反应(108)以去除信号。图1B示出了经由层叠方法的DNA-抗原扩增方案，其中附接至对接链(103)的靶标特异性结合配偶体(102)结合样品中的靶标(101)。添加包含抗原(105)的成像链(104)以结合对接链。将抗原特异性结合配偶体(106)添加到样品中以结合在靶标上复合的抗原。将附接至光学标记(107)的抗抗原特异性结合配偶体(109)添加到样品中，以通过层叠复合物结合靶标。在此阶段，可以对样品成像以检测信号并鉴定靶标。最后，可以任选地进行交换反应(未示出)以去除信号。图1C示出，附接至抗原(105)的靶标特异性结合配偶体(102)结合样品中的靶标(101)。将附接至对接链(103)的抗原特异性结合配偶体(106)添加到样品中以结合在靶标上复合的抗原。添加包含光学标记(107)的成像链(104)以结合对接链。在此阶段，可以对样品成像以检测信号并鉴定靶标。最后，可以任选地进行交换反应(未示出)以去除信号。图1D示出，附接至抗原(105)的靶标特异性结合配偶体(102)结合样品中的靶标(101)。将附接至对接链(103)的抗原特异性结合配偶体(106)添加到样品中以结合在靶标上复合的抗原。任选地，通过DNA扩增反应(110)诸如滚环扩增来增加与靶标复合的对接链的数量。添加包含光学标记(107)的成像链(104)以结合对接链。在此阶段，可以对样品成像以检测信号并鉴定靶标。最后，可以任选地进行交换反应(108)以去除信号。图1E示出，附接至对接链(103)的靶标特异性结合配偶体(102)结合样品中的靶标(101)。添加包含抗原(105)的成像链(104)以结合对接链。将附接至对接链(103)的抗原特异性结合配偶体(106)添加到样品中以结合在靶标上复合的抗原。任选地，通过DNA扩增反应(110)诸如滚环扩增来增加与靶标复合的对接链的数量。添加包含光学标记(107)的成像链(104)以结合对接链。在此阶段，可以对样品成像以检测信号并鉴定靶标。最后，可以任选地进行交换反应(108)以去除信号。图1F示出，附接至对接链(103)的靶标特异性结合配偶体(102)结合样品中的靶标(101)。添加包含抗原(105)的成像链(104)以结合对接链。将抗原特异性结合配偶体(106)添加到样品中以结合在靶标上复合的抗原。将附接至对接链(103)的抗抗原特异性结合配偶体(109)添加到样品中，以通过层叠复合物结合靶标。任选地，通过DNA扩增反应(110)(产物未示出)来增加与靶标复合的对接链的数量。可以添加包含光学标记(107)的成像链(104)以结合与靶标复合的对接链。在此阶段，可以对样品成像以检测信号并鉴定靶标。最后，可以任选地进行交换反应(108)以去除信号。虽然图1F显示为图1E的变体，但它也可以用与抗原直接缀合的一级抗体进行(诸如图1D)，而非用与对接链缀合的一级抗体进行(诸如图1E)。
图2A-图2D示出了显示使用生物素化的成像链和染料标记的链霉抗生物素蛋白对扁桃体组织进行2重测定的DNA抗原交换结果的数据。图2A示出了制备样品的空白图像。图2B示出了添加成像链I1-bio和SA-Cy5后样品中Ki67的图像。图2C示出了去除I1-bio和SA-Cy5的交换步骤后的样品图像。图2D示出了添加成像链I2-bio和SA-Cy5后样品中细胞角蛋白的图像。
图3A-图3B示出了使用用HRP标记的成像链和染料标记的抗HRP抗体进行的DNA抗原交换的扩增(图3A)与用荧光团标记的成像链的非扩增图像(图3B)的比较。两幅图像的亮度等级设置为0-3000。
图4示出了显示FFPE扁桃体组织中细胞角蛋白靶标上DNA-抗原扩增的数据。使用抗原缀合的一级抗体和DNA缀合的抗抗原抗体对细胞角蛋白染色；使用滚环扩增来增加与DNA缀合的抗抗原抗体缔合的对接链的数量；并在对样品成像之前使荧光标记的成像链结合。
本申请中使用了以下参考标号：'
具体实施方式
I.使用DNA-抗原交换扩增进行多重化成像
本申请涉及用于用一个或多个特异性结合配偶体测试一个或多个靶标的存在的方法和组合物。可以通过一系列结合相互作用将组分复合在一起以将靶标与检测元件连接。
交换成像是一种实现高多重化能力的方法，借此可以同时或顺序地在同一样品中对大量靶标成像。交换成像依赖于引入可检测部分的能力，所述可检测部分(例如通过分子复合物)特异性地结合样品中的一个或多个靶标，其中不同的靶标类型与不同的可检测部分结合；然后其次依赖于从样品中去除可检测部分的能力。然后可以通过引入附接至一个或多个可检测标记的抗原特异性结合配偶体来检测样品中与靶标特异性结合剂结合的靶标，所述靶标特异性结合剂附接至与抗原结合成像链附接的对接链。然后可以任选地去除所得信号。在一个实例中，通过破坏对接链与成像链之间的结合亲和力来去除信号。
信号扩增通常对低丰度靶标有利，或者当成像设备的灵敏度低时有利。信号扩增涵盖增加特异性地结合靶标的可检测元件的数量的概念。在一个非限制性实例中，信号扩增源于增加与靶标缔合的荧光团的数量。信号扩增方法可以与DNA-抗原交换方法结合，以产生更大的测定灵敏度、动态范围和更大的内容生成。在这里，我们讨论了涵盖DNA-抗原交换和信号扩增的实施方案。
在一些实施方案中，DNA-抗原交换方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与(直接或间接地)连接至光学标记的抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体接触，(a)其中所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，且(b)其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记；(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链和/或抗原特异性结合配偶体；(5)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(6)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(7)任选地重复步骤(1)-(7)，或其任何子集(诸如(1)-(6)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
任选地去除/熄灭来自光学标记的信号，意指导致信号终止的任何步骤。这可以包括从对接链中去除抗原结合成像链，使成像链和/或对接链裂解或降解，使标记光漂白或以其他方式熄灭其信号，或将标记从其所附接的部分中去除。这样的信号终止步骤可以完全消除来自光学标记的信号，或者基本上可以减少来自光学标记的信号，信号减少至少99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％或50％。
在一些方法中，抗原特异性结合配偶体和抗原结合成像链在本文的方法中逐步添加。即，所述DNA-抗原交换方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与抗原结合成像链接触，所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性；(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链；(5)使所述样品与标记的抗原特异性结合配偶体接触，其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记；(6)任选地去除未结合的抗原特异性结合配偶体；(7)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(8)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(9)任选地重复步骤(1)-(9)，或其任何子集(诸如(1)-(8)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
在一些其他实施方案中，将抗原特异性结合配偶体和抗原结合成像链预混合，然后将它们包括在本文的方法中。即，所述DNA-抗原交换方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与标记的抗原特异性结合配偶体接触，其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记，并且其中所述标记的抗原特异性结合配偶体与抗原结合成像链结合，所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性；(4)任选地去除未结合的标记的抗原特异性结合配偶体和抗原结合成像链；(5)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(6)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(7)任选地重复步骤(1)-(7)，或其任何子集(诸如(1)-(6)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
在于至少段落[0021]中陈述且参考该段落的标号的一些实施方案中，步骤(3)和(4)一起包括：(a)首选使样品与抗原结合成像链接触；(b)其次任选地去除未结合的抗原结合成像链；(c)第三使样品与标记的抗原特异性结合配偶体接触；以及(d)第四任选地去除未结合的抗原特异性结合配偶体。
在于至少段落[0021]中陈述且参考该段落的标号的一些实施方案中，步骤(3)包括使样品与抗原特异性结合配偶体接触，其中抗原特异性结合配偶体与抗原结合成像链结合。关于结合，申请人意图包括共价结合和非共价结合两者。
在于至少段落[0026]中陈述的一些实施方案中，步骤(3)和(4)一起包括：(a)通过使样品与抗原结合成像链接触来增加可观察信号，所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性；(b)任选地去除未结合的抗原结合成像链；(c)使样品与标记的抗原特异性结合配偶体接触，其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记；以及(d)任选地去除未结合的抗原特异性结合配偶体。
在一些实施方案中，所述方法包括去除未与对接链结合的抗原结合成像链。在一些实施方案中，所述方法包括去除未与抗原结合成像链结合的抗原特异性结合配偶体。
II.DNA-抗原扩增
动态调整信号扩增水平的能力在实验工作流、样品制备和测定开发中实现了更大的灵活性。靶标表达水平可能因样品而异。因此，能够在实验进行中调整信号扩增水平是有益的。首先可以制备样品和图像而不进行任何扩增。在成像时，如果发现信号低，则可能希望将未扩增的检测试剂更换为扩增的检测试剂。或者，可以在进行任何成像之前对样品使用扩增。
在一个实施方案中，DNA-抗原扩增可用于在功能上表征测定试剂。例如，可以应用DNA-抗原扩增来验证或质量检查抗体-DNA缀合物的产生。
在一个实施方案中，采用DNA-抗原扩增来检测样品中的多个靶标。在另一个实施方案中，使用来自相同宿主物种的靶标特异性结合配偶体来结合样品中的多个靶标。在一个非限制性实例中，来源于相同宿主物种的多个一级抗体与多个靶标结合并用DNA-抗原扩增进行检测。
A.DNA-抗原扩增用于动态信号调整
本文所述的实施方案可以在初始成像步骤之后使用，其中使用者确定信号是否足够强或是否需要扩增。在初始成像步骤中，可以使样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，所述靶标特异性结合配偶体连接至对接链，其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链。作为“预览”或初始成像步骤，然后使样品与标记的成像链(其直接或间接地与对接链具有互补性)接触，对样品成像，并去除结合的标记的成像链。该初始“预览”成像步骤将不使用抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体，除非使用者确定使用标记的成像链的初始成像步骤未产生足够的信号。如果需要扩增，使用者可以使用抗原结合成像链和标记的抗原特异性结合配偶体转换成扩增模式。本申请将该功能称为“动态信号调整”，因为抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体可用于在交换成像方法的工作流期间进行扩增。
因此，在一些实施方案中，DNA-抗原扩增方法包括(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链；(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体；(3)使所述样品与标记的成像链接触，所述标记的成像链直接或间接地与对接链具有互补性；(4)任选地去除未结合的标记的成像链；(5)对所述样品成像以检测结合的标记的成像链；(6)去除结合的标记的成像链；(7)通过使所述样品与抗原结合成像链接触来增加可观察信号，所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性；(8)任选地去除未结合的抗原结合成像链；(9)使所述样品与标记的抗原特异性结合配偶体接触，其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记；(10)任选地去除未结合的抗原特异性结合配偶体；(11)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体；(12)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)；以及(13)任选地重复步骤(1)-(13)，或其任何子集(诸如(1)-(12)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
在于至少段落[0021]中陈述并参考该段落的标号的一些实施方案中，在步骤(2)和(3)之间该方法包括：(a)使样品与标记的成像链接触，所述标记的成像链直接或间接地与对接链具有互补性；(b)任选地去除未结合的标记的成像链；(c)对样品成像以检测结合的标记的成像链；以及(d)去除结合的标记成像链。
B.DNA-抗原扩增组合物
在一个实施方案中，描述了一种组合物，所述组合物包含：(a)第一结合配偶体-寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含与包含对接结构域的寡核苷酸连接的结合配偶体；(b)抗原结合的寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含与包含成像结构域的寡核苷酸连接的抗原，其中(b)的成像结构域与(a)的对接结构域互补；以及(c)标记的抗原特异性结合配偶体，所述标记的抗原特异性结合配偶体包含与抗原特异性结合配偶体连接的光学标记，其中(c)的抗原特异性结合配偶体对(b)中的抗原具有特异性。
C.采用二级结合配偶体进行扩增
在一些实施方案中，引入连接至光学标记的二级结合配偶体，其中二级结合配偶体直接或间接地特异性地结合抗原特异性结合配偶体。这允许层叠另外的连接至光学标记的结合配偶体以获得更强的信号。当二级结合配偶体直接结合时，二级结合配偶体因此可以是抗-抗原特异性结合配偶体。
在一些实施方案中，二级结合配偶体和抗原结合成像链的抗原各自包含相同的抗原。这意味着二级结合配偶体的至少部分和抗原是相同的，即使二级结合配偶体与光学标记结合并且抗原与成像链结合。在其他实施方案中，二级结合配偶体和抗原结合成像链的抗原可以包含不同的抗原，换句话说，在该实施方案中，二级结合配偶体可以不包含抗原结合成像链的抗原。
在一些实施方案中，抗原和二级结合配偶体各自包含生物素。在一些实施方案中，抗原特异性结合配偶体包含链霉抗生物素蛋白。
在一些实施方案中，二级结合配偶体间接结合抗原特异性结合配偶体。例如，如果抗原是生物素并且抗原特异性结合配偶体是链霉抗生物素蛋白，则如果使用采用通过接头缀合的两个生物素部分的构建体，则二级结合配偶体也可以是链霉抗生物素蛋白。当需要甚至更强的信号时，该实施方案可能具有优势，因为有可能将标记的更多拷贝缀合至链霉抗生物素蛋白而不是生物素。因此，采用两个生物素部分的构建体可以用作使二级结合配偶体与抗原特异性结合配偶体特异性结合的桥。
在一些实施方案中，抗原特异性结合配偶体和二级结合配偶体均包含抗体或其抗原结合片段。
在一些情况下，抗原特异性结合配偶体是抗原的一级抗体或其抗原结合片段，且二级结合配偶体是二级抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，多个抗原特异性结合配偶体与单个抗原结合。在一些实施方案中，抗原特异性结合配偶体包含多克隆抗体。在一些实施方案中，使用多种类型的抗原特异性结合配偶体。例如，多种类型的抗原特异性结合配偶体可包括多于一种针对抗原上不同表位的单克隆抗体。
在一些实施方案中，可以采用多层扩增，使得多个二级抗体彼此层叠。例如，第一二级抗体可结合抗原，而第二二级抗体(即三级抗体)可结合第一二级抗体，依此类推。第三二级抗体(即四级抗体)可结合第二二级抗体，依此类推。所采用的层数取决于所需的扩增和其他因素，如下所述。
当采用二级结合配偶体进行扩增时，一些层叠复合物能够通过洗涤步骤去除。其他层叠复合物可能无法通过洗涤步骤去除。可去除的那些层叠复合物可用于交换成像与扩增。不可去除的那些层叠复合物可用于扩增以及用于交换成像反应中的最后成像步骤。
III.组分
A.靶标
在某些实施方案中，靶标特异性结合配偶体对细胞标记物具有特异性。细胞标记物可包括：4-1BB、AFP、ALK1、淀粉样蛋白A、淀粉样蛋白P、雄激素受体、膜联蛋白A1、ASMA、BCA225、BCL-1、BCL-2、BCL-6、BerEP4、β-联蛋白、β-HCG、BG-8、BOB-1、CA19-9、CA125、降钙素、钙调结合蛋白、钙调理蛋白-1、钙网膜蛋白、CAM 5.2、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD38、CD42b、CD43、CD45 LCA、CD45RO、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、CD99、CD117、CD138、CD163、CDX2、CEA、嗜铬粒蛋白A、CMV、c-kit、c-MET、c-MYC、IV型胶原、补体3c(C3c)、COX-2、CXCR5、CK1、CK5、CK6、CK7、CK8、CK14、CK18、CK17、CK19、CK20、CK903、CK AE1、CK AE1/AE3、D2-40、肌间线蛋白、DOG-1、E-钙粘蛋白、EGFR、EMA、ER、ERCC1、因子VIII-RA、因子XIIIa、成束蛋白、FoxP1、FoxP3、半乳糖凝集素-3、GATA-3、GCDFP-15、GCET1、GFAP、血型糖蛋白A、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、颗粒酶B、HBME-1、幽门螺杆菌、血红蛋白A、Hep Par 1、HER2、HHV-8、HMB-45、HSV 1/11、ICOS、IFNγ、IgA、IgD、IgG、IgM、IL17、IL4、抑制素、iNOS、κIg轻链、Ki67、LAG-3、λIg轻链、溶菌酶、乳腺珠蛋白A、MART-1/Melan A、肥大细胞类胰蛋白酶、MLH1、MOC-31、MPO、MSA、MSH2、MSH6、MUC1、MUC2、MUM1、MyoD1、肌细胞生成素、肌红蛋白、天冬氨酸蛋白酶A、巢蛋白、NSE、Oct-2、OX40、OX40L、p16、p21、p27、p40、p53、p63、p504s、PAX-5、PAX-8、PD-1、PD-L1、PHH3、PIN-4、PLAP、PMS2、耶氏肺孢子虫(卡氏肺孢子虫)、PR、PSA、PSAP、RCC、5-100、SMA、SMM、Smoothelin、SOX10、SOX11、表面活性物质载脂蛋白A、突触素、TAG 72、TdT、血栓调节蛋白、甲状腺球蛋白、TIA-1、TIM3、TRAcP、TTF-1、酪氨酸酶、Uroplakin、VEGFR-2、绒毛蛋白、波形蛋白和WT-1。在其他实施方案中，靶标特异性结合配偶体对来自不同物种的免疫球蛋白具有特异性。
B.靶标特异性结合配偶体
靶标特异性结合配偶体是指可用于检测靶标分子的抗体和抗体样分子。抗体是指可以特异性地识别靶标分子的来自任何物种的任何免疫球蛋白。抗体样分子是指(A类)抗体的任何工程化变异或片段诸如Fab、Fab'、F(ab')2、单重链、双体等(抗体的抗原结合片段)；(B类)靶标分子的任何已知的结合配偶体和这种结合配偶体的工程化变体；(C类)通过定向进化进行工程化的靶标分子的任何结合配偶体(例如肽和适体)；和(D类)选择性地与靶标形成一个或多个共价键的任何分子(例如感兴趣酶的自杀底物)。在整个说明书中对特定类型的抗体的提及包括全长抗体和任何抗体样分子，所述抗体样分子包括抗体的任何工程化变异或片段诸如Fab、Fab'、F(ab')2、单重链、双体等(抗体的抗原结合片段)。因此，例如在表2中，当靶标识别部分提及抗体时，它还包括那些抗体的抗原结合片段。
靶标特异性结合配偶体可以提供于液体介质或缓冲溶液中。可以在单个步骤或多个步骤中，诸如在先前的成像步骤之后，使不同靶标的靶标特异性结合配偶体与样品接触。
表2提供了靶标和对应的靶标识别部分的代表性列表。
表3提供了另外的靶标的列表。这些靶标的抗体和其他已知的结合配偶体可用作靶标识别部分。
C.对接链
在一些实施方案中，对接部分或对接链是核酸、蛋白质、肽或化学化合物。已知许多蛋白质和蛋白质结构域与其他蛋白质、结构域或肽相互作用。一些最知名的结构域包括SH2、SH3和WD40结构域。在许多情况下，这些蛋白质和结构域的结合配偶体是已知的，并且可以被工程化为具有所需的亲和力。例如，生物素和抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白以足够的特异性相互作用。许多其他化学化合物，诸如地高辛、荧光素、他克莫司和雷帕霉素也具有众所周知的结合配偶体。
在一些实施方案中，对接链包含核酸。在一些实施方案中，核酸是单链核酸诸如单链DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物(也称为非天然核酸)可包括改变的磷酸骨架、改变的戊糖和/或改变的核碱基。核酸类似物可包括但不限于2'-O-甲基核糖核酸、2'-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁核酸、乙二醇核酸和苏糖核酸。
在一些实施方案中，对接链与成像链共价附接，而在其他实施方案中非共价附接。
在一些实施方案中，对接链包含单链核酸，并且可以长约5至20个核酸、约8至15个核酸或长约10至12个核酸。在一些实施方案中，对接链长约5个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、18个或20个核酸。
对接链可以是独立元件，或者它可以是靶标识别部分的一部分。例如，如果靶标识别部分是抗体，则抗体的Fc结构域的一部分可以是对接链，并且可以使用结合Fc结构域的肽或蛋白质，诸如蛋白质A或蛋白质G。
对接链可以提供于液体介质或缓冲溶液中。
D.成像链
成像链可以是与对接链互补(即，能够特异性地结合对接链)并且(直接或间接地)连接至抗原的任何分子。在一些实施方案中，对接链可以是核酸链、蛋白质、肽或化学化合物。在这种情况下，可观察部分或标记可以缀合至成像部分，所述成像部分可以是与对接链互补的核酸链。换句话说，成像链特异性地结合对接链。在这种情况下，标记可以缀合至成像部分，所述成像部分可以长约5至20个核酸、约8至15个核酸或长约10至12个核酸。在一些实施方案中，成像部分长约5个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、18个或20个核酸。
在一些实施方案中，成像部分与对接链之间的互补部分可以长约5至20个核酸、约8至15个核酸或长约10至12个核酸核酸长。在一些实施方案中，成像部分与对接链之间的互补部分可以长约5个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、18个或20个核酸。
在一些实施方案中，核酸成像链包含单链核酸诸如单链DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物(也称为非天然核酸)可包括改变的磷酸骨架、改变的戊糖和/或改变的核碱基。核酸类似物可包括但不限于2'-O-甲基核糖核酸、2'-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁核酸、乙二醇核酸和苏糖核酸。
在一些实施方案中，作为上文0部分中讨论的对接链选项的配偶体，成像部分是蛋白质、肽或化学化合物。
在一些实施方案中，对接链可诸如通过中间部分间接结合成像部分。例如，当对接链和成像部分是核酸时，可以使用包含核酸的中间部分，只要中间部分具有与对接链互补的第一区域和与成像部分互补的第二区域即可。在该实施方案中，对接链不必与成像部分互补。中间部分可以仅用于桥接功能，或者它也可以用于扩增功能。
成像链可以提供于液体介质或缓冲溶液中。
E.中间链
在一些情况下，对接链通过中间部分(或中间链)结合成像链。例如，当对接部分和成像部分包含核酸时，可以使用包含核酸的中间链，只要中间链具有与对接链互补的第一区域和与成像链互补的第二区域即可。在此类实施方案中，对接链不必与成像部分互补。
在一些实施方案中，将中间链添加到包含直接或间接地连接至对接链的靶标特异性结合配偶体的样品中作为第一步，并且添加成像链作为第二步。在另一个实施方案中，不以分立的步骤添加中间链和成像链。在一些情况下，将中间链和成像链杂交在一起，然后在单个步骤中添加。
在一些实施方案中，中间链包含核酸。在一些实施方案中，核酸是单链核酸诸如单链DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物(也称为非天然核酸)可包括改变的磷酸骨架、改变的戊糖和/或改变的核碱基。核酸类似物可包括但不限于2'-O-甲基核糖核酸、2'-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁核酸、乙二醇核酸和苏糖核酸。
在一些实施方案中，中间链包含单链核酸，并且可以长约5至30个核酸、约8至15个核酸或长约10至12个核酸。在一些实施方案中，中间链长约5个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、18个、20个、25个或30个核酸。
中间链可以提供于液体介质或缓冲溶液中。
F.抗原
抗原可包括半抗原、小分子、蛋白质或免疫原性分子。例如，抗原可包括但不限于地高辛、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)、白蛋白、牛血清白蛋白、匙孔虫戚血蓝蛋白、似鲍罗螺(Concholepas concholepas)血蓝蛋白、卵清蛋白、碱性磷酸酶、蛋白质C或它们的衍生物。抗原可包括分子诸如硝基苯基、二硝基苯基、三硝基苯基、洋地黄毒苷、5-溴脱氧尿苷、3-硝基酪氨酸、苄基鸟嘌呤、苄基胞嘧啶、三聚氰胺、小分子药物和任何其他类似的化学标签。抗原可包括Myc标签、FLAG标签、SNAP标签、CLIP标签、HA标签、S标签、Streptag、His标签或V5标签。抗原可以是抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等)、抗体片段(Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、pFc'、单链可变片段(scFv)、di-scFv、单结构域抗体(sdAb)、纳米抗体)。抗原可包括在本申请中作为靶标列出的任何细胞标记物，例如表3中列出的那些蛋白质。
抗原可以是核酸或适体，包括但不限于非天然核酸和寡聚物。抗原可以是聚合物(例如氨基酸寡聚物、肽、纤维素、果胶、聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、环糊精、尼龙、特氟隆、聚苯乙烯、PVC、聚丙烯)或分子印迹(MIP)。抗原可以是有机荧光团(例如Alexa Fluor染料、Atto染料、荧光素(FITC))、荧光或化学发光蛋白质(例如GFP、RFP、YFP、mCherry、藻红蛋白)。抗原可以是错误折叠或变性的蛋白质。抗原可以是纳米颗粒或涂覆的纳米颗粒。抗原可以通过化学合成产生、是天然存在的、是重组表达的或是遗传工程化的。
抗原可以是线性的、环状的、支链的、聚合的或树枝状的。抗原可以具有一个或多个表位，并且可以结合一个或多个抗原特异性结合配偶体。一个或多个不同种类的抗原结合配偶体可以结合同一抗原的不同表位。
G.抗原特异性结合配偶体
抗原特异性结合配偶体可以指可用于检测抗原的抗体和抗体样分子。抗体是指可以特异性地识别靶标分子或抗原的来自任何物种的任何免疫球蛋白。抗体样分子是指(A类)抗体的任何工程化变异或片段诸如Fab、Fab'、F(ab')2、单重链、双体等(抗体的抗原结合片段)；(B类)抗原分子的任何已知的结合配偶体和这种结合配偶体的工程化变体；(C类)通过定向进化进行工程化的抗原分子的任何结合配偶体(例如肽和适体)；和(D类)选择性地与抗原形成一个或多个共价键的任何分子(例如感兴趣酶的自杀底物)。
抗原特异性结合配偶体还可以是对抗原具有高亲和力的蛋白质。例如，在使用生物素作为抗原的情况下，可以使用链霉抗生物素蛋白作为结合配偶体。如果抗原是金属离子，则抗原特异性结合配偶体可以是螯合剂，诸如EDTA、乙二胺、聚组氨酸、血红素、卟啉、冠醚、穴状配体或另一种多齿配体。
抗原特异性结合配偶体可以与抗原形成共价缔合或非共价缔合。
可以在单个步骤或多个步骤中，诸如在先前的成像步骤之后，使对应于不同靶标的抗原特异性结合配偶体与样品接触。
抗原结合成像链的抗原和抗原特异性结合配偶体在表4中成对描述。
H.核酸扩增方法
可以通过扩增本文描述的对接菌株来使用另外的核酸扩增方法。因此，本文的方法和构建体可受益于抗原：抗原特异性结合配偶体扩增，但它们也可受益于核酸扩增。
在核酸扩增方法中，使用扩增链(在一些情况下为环状DNA模板)扩增(直接或间接地)与靶标识别部分结合的寡核苷酸(诸如对接链)，然后通过DNA聚合酶延伸对接链以产生扩增链的反向互补序列的连环化重复序列(即扩增的链或滚环扩增(RCA)产物)。
核酸扩增诸如RCA的使用在图1D-图1F中示出。事实上，对接链可以用作聚合或树枝状化反应的引物分子。这种聚合反应的一个实例是RCA，其中RCA的引物(直接或间接地，例如参见图1D和图1E)连接至靶标识别分子并转化为长的重复单链DNA。荧光分子可以通过荧光标记的核苷酸直接掺入RCA产物中，或者作为被设计来与RCA产物杂交的荧光标记的寡核苷酸的一部分与RCA产物结合。这种聚合或树枝状化反应的其他实例包括基于支链DNA支点的链置换(branched DNA toehold-based strand displacement)(Schweller等人PMCID:PMC3517005)、杂交链式反应(HCR)(Dirks等人,2014,PMID:15492210、24712299)和类似的基于DNA发夹的树枝状化反应(Yin等人,2008,PMID 18202654)(这里我们称之为HDR)。可以使用其他基于发夹的连环化方法。
可以使用RCA、HCR或HDR从连接至抗体的引物分子产生聚合产物或树枝状产物。在一些实施方案中，产物可含有许多(例如大于2个、5个、10个、15个、20个、25个、50个、100个等)拷贝的单链DNA结构域，其可用作对接链，因此被用作成像链的寡核苷酸识别。此类DNA结构域可能足够长(例如长7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个或更多个核苷酸，或能够在成像条件下结合其互补链，Kd<1nM)。对于RCA，这是定期实现的。对于HCR和HDR，如果需要，可以在底物发夹的环或尾部包括不参与链置换级联但构成成像链结合位点的一部分或全部的DNA结构域。在一些实施方案中，信号扩增涉及将靶标识别分子(共价或非共价地)连接至用作聚合或树枝状化反应的引物分子的对接链。
1.滚环扩增
在滚环扩增中，用作RCA引物的对接链(直接或间接地)连接至靶标识别分子，并转化为长的重复单链DNA。荧光分子可以通过荧光标记的核苷酸直接掺入RCA产物中，或者作为被设计来与RCA产物杂交的荧光标记的寡核苷酸的一部分与RCA产物结合。
在一些实施方案中，成像链可以与RCA反应期间(直接或间接地)连接至靶标识别部分的RCA产物(例如扩增链的反向互补序列的连环化重复序列)杂交。因此，在一些实施方案中，使用滚环扩增发生扩增，同时存在与扩增链具有互补性的标记的成像链。例如，可以使样品与缀合至靶标识别部分的寡核苷酸对接链接触，所述寡核苷酸对接链或者与扩增链预杂交，或者扩增链可以在后面的步骤中杂交。然后，可以在一个步骤中添加用于RCA反应的所有其他组分，包括蛋白质(例如DNA聚合酶，任选为BSA)、核苷酸、缓冲溶液、盐和成像链。在一些实施例中，使用者可能希望阻止成像链被扩增。这可以通过几种方法实现，这些方法包括但不限于采用在3'末端具有修饰的3'-修饰的成像链。例如，成像链上的3'修饰可包括标记(诸如荧光团)、修饰的碱基、终止码或终止子、3'-O-修饰、双脱氧-C、双脱氧-G、双脱氧-A、双脱氧-T、反向核苷酸、消除3'羟基存在的任何修饰、或不与扩增链互补的3'末端的单链延伸。
除HCR和RCA之外，此类聚合或树枝状化反应的其他实例包括但不限于基于DNA发夹的树枝状化反应(HDR)(Yin等人,2008,PMID 18202654)和支点介导的链置换(toe-holdmediated strand displacement)。
DNA链置换是一种用于DNA复合物的等温和动态交换的方法。可以基于对DNA杂交相互作用和热力学的理解来设计和有意地控制链置换，并且可以通过引入被称为“支点结构域”的工程化手柄来促进链置换。调节结合相互作用以及交换杂交配偶体的能力产生了一系列潜在的信号扩增应用。
可以顺序地进行多个靶标的扩增。或者，可以同时进行多个靶标的扩增。成像步骤可以在几轮扩增之间或在所有扩增轮次之后进行。
甚至可以组合使用多种类型的信号扩增。例如，Gusev等人报告了组合滚环扩增和基于HRP的信号扩增(PMID:11438455)。
2.非线性扩增
RCA的另一种方法涉及使用非线性扩增链或模板链，其中与靶标识别部分(直接或间接地)结合的寡核苷酸(诸如对接链)与环状DNA模板(扩增链)杂交，然后通过DNA聚合酶延伸对接链以产生扩增链的反向互补序列的连环化重复序列(即扩增的链或RCA产物)。扩增链与缀合靶标识别部分的寡核苷酸的杂交可以在缀合靶标识别部分的寡核苷酸与样品接触之前(预组装或预杂交)或之后发生。
非线性DNA模板可作为环状扩增链用于信号扩增。可以与扩增方法分开产生与对接链互补的环状寡核苷酸。例如，可以在模板DNA链上进行非原位连接以形成DNA的环状链。可以在接触样品之前，使环状链与附接至靶标特异性结合配偶体的对接链杂交。或者，可首先使用靶标特异性结合配偶体对样品染色，然后可将环状链引入样品中以与靶标特异性结合配偶体上的对接链杂交。在形成复合物(其中环状链附接至与靶标特异性结合配偶体连接的对接链)之后，可以进行滚环扩增(RCA)。该方法提供了某些优点，因为它可用于避免低效原位连接步骤所带来的问题。
在一些实施方案中，聚合酶可用于RCA。在一些情况下，标记的成像链是线性链。在一些情况下，非线性扩增链是环状链。在一些情况下，非线性扩增链是分支链。在一些情况下，非线性扩增链在连接后变成环状。
在一些实施方案中，扩增产物可包括几何形状，诸如三角形、四边形、五边形、六边形等。
I.光学标记
各种光学标记，也称为可观察部分，可用于信号传导目的。光学标记可以与抗原特异性结合配偶体结合(参见图1A)。光学标记可以与特异性地结合抗原特异性结合配偶体的二级结合配偶体结合(参见图1B)。光学标记可以与成像链结合(参见图1C、图1D和图1E)。光学标记可以与核苷酸结合并掺入核酸扩增反应中(类似于图1D和图1E，但没有成像链)。因此，光学标记可以与抗原特异性结合配偶体直接或间接地结合。
在一些实施方案中，可以采用任何可观察部分，并且在一些实施方案中，该部分是光学可观察的。该部分可以是信号吸收或信号发射。在信号发射分子中，可以使用发荧光的分子，诸如有机小分子，包括但不限于荧光团，诸如但不限于荧光素、罗丹明、花菁染料、Alexa染料、DyLight染料、Atto染料等。
在一些实施方案中，可以采用有机聚合物诸如p-点。在一些实施方案中，可观察部分可以是生物分子，包括但不限于荧光蛋白或荧光核酸(包括荧光RNA，包括Spinach及其衍生物)。在一些实施方案中，可观察部分可以是包括Q点的无机部分。在一些实施方案中，可观察部分可以是通过散射(弹性散射或非弹性散射)进行操作的部分，诸如纳米颗粒和表面增强拉曼光谱(SERS)报告子(例如4-巯基苯甲酸、2,7-巯基-4-甲基香豆素)。在一些实施方案中，可观察部分可以是化学发光/电化学发光发射体，诸如钌络合物和萤光素酶。可观察部分可以产生光学信号、电磁信号(在整个电磁光谱上)、原子/分子质量(例如可通过质谱法检测)、有形质量(例如可通过原子力显微镜检测)、电流或电压。
在一些实施方案中，具有光学标记的抗原特异性结合配偶体可具有多个标记或可观察部分。例如，如果抗原特异性结合配偶体是链霉抗生物素蛋白，则它可以携带至少5个或6个荧光团。根据所需的信号程度，较大的抗原特异性结合配偶体可用于产生额外的信号传导容量。
J.样品
本文所述的试剂和技术可用于询问多个不同的样品。在一些情况下，样品是细胞、细胞裂解物、组织、组织裂解物、体液和/或完整生物体。
实施例
实施例1.在组织中用生物素抗原和染料标记的链霉抗生物素蛋白进行DNA-抗原交换
将福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)扁桃体组织切片脱蜡并使用PT缓冲液(pH6)在Lab Vision PT模块中进行抗原修复。将组织切片在3％ BSA和0.2％ Triton-X 100中封闭1.5小时，然后在1x PBS中冲洗。将组织切片用小鼠抗细胞角蛋白和兔抗Ki67一级抗体在4C下在湿度室中染色过夜。然后将组织切片用1x PBS洗涤，并在室温下用缀合至DNA对接链(D1)的山羊抗小鼠二级抗体和缀合至不同DNA对接链(D2)的山羊抗兔抗体染色1.5小时。将组织切片再次在1x PBS中洗涤并进行DAPI染色。使用荧光显微镜在DAPI和Cy5通道中对组织切片成像以用作空白。(参见图2A)
将包含与DNA链(其包括与对接链D1互补的结构域)杂交的生物素化DNA链的成像链(I1-bio)添加到制备的组织切片中，并使其在室温下杂交25分钟。洗涤切片以去除未结合的I1-bio。然后，添加Cy5标记的链霉抗生物素蛋白(SA-Cy5)溶液，并使其在室温下孵育30分钟。将组织在含有0.1％ Tween-20的1x PBS中洗涤。洗涤后，使用10x物镜在DAPI和Cy5通道中捕获荧光图像。(参见图2B)
然后通过在室温下将10单位的USER酶施加到组织切片15分钟，用1x PBS洗涤，去除成像链I1-bio。使用荧光显微镜在Cy5通道中确认荧光信号的完全去除。(参见图2C)。
将包含与DNA链(其包括与对接链D2互补的结构域)杂交的生物素化DNA链的成像链(I2-bio)添加到制备的组织切片中，并使其在室温下杂交25分钟。洗涤切片以去除未结合的I2-bio。然后，添加Cy5标记的链霉抗生物素蛋白(SA-Cy5)溶液，并使其在室温下孵育30分钟。将组织在含有0.1％ Tween-20的1x PBS中洗涤。洗涤后，使用10x物镜在DAPI和Cy5通道中捕获荧光图像。(参见图2D)。
实施例2.用HRP抗原和染料标记的抗HRP抗体进行DNA-抗原交换
将福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)扁桃体组织切片脱蜡并使用PT缓冲液(pH6)在Lab Vision PT模块中进行抗原修复。将组织切片在3％ BSA和0.2％ Triton-X 100中封闭1.5小时，然后在1x PBS中冲洗。将组织切片用小鼠抗细胞角蛋白和兔抗Ki67一级抗体在4C下在湿度室中染色过夜。然后将组织切片用1x PBS洗涤，并在室温下用缀合至DNA对接链(D1)的山羊抗小鼠二级抗体和缀合至不同DNA对接链(D2)的山羊抗兔抗体染色1.5小时。将组织切片再次在1x PBS中洗涤并进行DAPI染色。使用荧光显微镜在DAPI和Cy5通道中对组织切片成像以用作空白。
将包含与DNA链(其包括与对接链D2互补的结构域)杂交的HRP缀合DNA链的成像链(I2-HRP)添加到制备的组织切片中，并使其在室温下杂交25分钟。洗涤切片以去除未结合的I2-HRP。然后，将组织切片用缀合至Alexa-647的山羊抗HRP抗体在室温下染色1.5小时，避光。通过在含有0.1％ Tween-20的1x PBS中洗涤来去除未结合的物质。洗涤后，使用10x物镜在DAPI和Cy5通道中捕获荧光图像。(参见图3)。
实施例3.用直接标记的抗原和DNA标记的抗抗原抗体进行DNA-抗原交换
将福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)扁桃体组织切片脱蜡并使用PT缓冲液(pH9)在Lab Vision PT模块中进行抗原修复。将组织切片在3％ BSA和0.2％ Triton-X 100中封闭1.5小时，然后在1x PBS中冲洗。将组织切片用缀合至二硝基苯基(DNP)的小鼠抗细胞角蛋白一级抗体在室温下染色1小时，然后洗涤以去除未结合的一级抗体DNP缀合物。然后将组织切片在室温下用缀合至对接链的抗DNP KLH多克隆抗体染色1.5小时。使用滚环扩增(RCA)进行对接链的扩增。在RCA反应后，添加与对接链互补且用Cy5.5荧光团标记的成像链，并使其在室温下孵育25分钟以结合样品。洗去未结合的成像链，并用荧光显微镜对样品成像(图4)。
实施例4：某些实施方案
项目A.在一些实施方案中，抗原特异性结合配偶体和抗原结合成像链在本文的方法中逐步添加。即，一种方法，所述方法包括：
(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与抗原结合成像链接触，所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，
(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链，
(5)使所述样品与标记的抗原特异性结合配偶体接触，其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记，
(6)任选地去除未结合的抗原特异性结合配偶体，
(7)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体，
(8)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)，以及
(9)任选地重复步骤(1)-(9)，或其任何子集(诸如(1)-(8)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
项目B.在一些实施方案中，将抗原特异性结合配偶体和抗原结合成像链预混合，然后将它们包括在本文的方法中。即，一种方法，所述方法包括：
(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与标记的抗原特异性结合配偶体接触，其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记，并且其中所述标记的抗原特异性结合配偶体与抗原结合成像链结合，所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，
(4)任选地去除未结合的标记的抗原特异性结合配偶体和抗原结合成像链，
(5)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体，
(6)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)，以及
(7)任选地重复步骤(1)-(7)，或其任何子集(诸如(1)-(6)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
项目C.一种方法，所述方法包括：
(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与标记的成像链接触，所述标记的成像链直接或间接地与对接链具有互补性，
(4)任选地去除未结合的标记的成像链，
(5)对所述样品成像以检测结合的标记的成像链，
(6)去除结合的标记的成像链，
(7)通过使所述样品与抗原结合成像链接触来增加可观察信号，所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，
(8)任选地去除未结合的抗原结合成像链，
(9)使所述样品与标记的抗原特异性结合配偶体接触，其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记，
(10)任选地去除未结合的抗原特异性结合配偶体，
(11)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体，
(12)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)，以及
(13)任选地重复步骤(1)-(13)，或其任何子集(诸如(1)-(12)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
实施例5：另外的实施方案
以下标号的项目提供对本文实施方案的额外支持和描述。
项目1.一种方法，所述方法包括：
(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与(直接或间接地)连接至光学标记的抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体接触，
其中所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，并且
其中每个抗原特异性结合配偶体连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的抗原特异性结合配偶体连接至不同的光学标记，
(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链和/或抗原特异性结合配偶体，
(5)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体，
(6)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)，以及
(7)任选地重复步骤(1)-(8)，或其任何子集(诸如(1)-(6)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
项目2.一种方法，所述方法包括：
(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至抗原，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的抗原，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与连接至对接链的抗原特异性结合配偶体接触，其中不同的抗原特异性结合配偶体连接至不同的对接链，
(4)任选地去除连接至对接链的未结合的抗原特异性结合配偶体；
(5)添加成像链；
其中所述成像链直接或间接地与对接链具有互补性，并且
其中每个成像链(直接或间接地)连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的成像链连接至不同的光学标记，
(6)任选地去除未结合的成像链，
(7)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体，
(8)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)，以及
(9)任选地重复步骤(1)-(8)，或其任何子集(诸如(1)-(7)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
项目3.一种方法，所述方法包括：
(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至第一对接链，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的对接链，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与抗原结合成像链和抗原特异性结合配偶体接触，
其中所述抗原结合成像链直接或间接地与对接链具有互补性，并且
其中每个抗原特异性结合配偶体连接至至少一个第二对接链，
(4)任选地去除未结合的抗原结合成像链和/或抗原特异性结合配偶体，
(5)通过DNA扩增反应增加第二对接链链的数量，并使用光学标记标记所述第二对接链，
(6)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体，
(7)任选地熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)，以及
(8)任选地重复步骤(1)-(8)，或其任何子集(诸如(1)-(7)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
项目4.如项目3所述的方法，其中所述第一对接链和所述第二对接链具有不同的序列。
项目5.如项目3所述的方法，其中所述第一对接链和所述第二对接链具有相同的序列。
项目6.一种方法，所述方法包括：
(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至抗原，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的抗原，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与连接至对接链的抗原特异性结合配偶体接触，其中不同的抗原特异性结合配偶体连接至不同的对接链，
(4)任选地去除连接至对接链的未结合的抗原特异性结合配偶体；
(5)通过DNA扩增反应增加对接链的数量，并使用光学标记标记所述对接链，
(6)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体，
(7)任选地熄灭来自所述光学标记的信号(即，信号终止)，以及
(8)任选地重复步骤(1)-(8)，或其任何子集(诸如(1)-(7)或其他子集，记住一些步骤可不重复，尤其是所述信号终止步骤)。
项目7.如项目3-6中任一项所述的方法，其中使用所述DNA扩增反应中的标记核苷酸直接标记所述对接链。
项目8.如项目7所述的方法，其中所述标记的核苷酸是荧光标记的核苷酸。
项目9.如项目3-6中任一项所述的方法，其中使用结合所述对接链的标记的核酸标记所述对接链。
项目10.如项目3-9中任一项所述的方法，其中所述DNA扩增反应包括滚环扩增。
项目11.如项目3-9中任一项所述的方法，其中所述DNA扩增反应包括杂交链式反应。
项目12.如项目3-9中任一项所述的方法，其中所述DNA扩增反应包括基于发夹的连环化(包括树枝状化)反应。
项目13.如项目1、3-5或7-12中任一项所述的方法，其中步骤(3)和(4)一起包括：
a.首先使所述样品与抗原结合成像链接触，
b.其次任选地去除未结合的抗原结合成像链，
c.第三使所述样品与标记的抗原特异性结合配偶体接触，以及
d.第四任选地去除未结合的抗原特异性结合配偶体。
项目14.如项目1、3-5或7-13中任一项所述的方法，其中在步骤(2)与(3)之间，所述方法包括：
a.使所述样品与标记的成像链接触，所述标记的成像链直接或间接地与对接链具有互补性，
b.任选地去除未结合的标记的成像链，
c.对所述样品成像以检测结合的标记的成像链，以及
d.从所述对接链中去除所述结合的标记的成像链。
项目15.如项目1、3-5或7-14中任一项所述的方法，其中步骤(3)包括使所述样品与抗原特异性结合配偶体接触，其中所述抗原特异性结合配偶体与抗原结合成像链结合。
项目16.如项目1-15中任一项所述的方法，其中所述方法包括去除未与对接链结合的抗原结合成像链。
项目17.如项目1、3-5、7-12或14-16中任一项所述的方法，其中所述方法包括去除未与抗原结合成像链结合的抗原特异性结合配偶体。
项目18.如项目1-19中任一项所述的方法，其中所述靶标特异性结合配偶体包括抗体或其抗原结合片段。
项目19.如项目1-18中任一项所述的方法，其中所述靶标特异性结合配偶体包括：
a.靶标分子的已知结合配偶体或这种结合配偶体的变体，
b.通过定向进化进行工程化的所述靶标分子的任何结合配偶体(例如肽和适体)，或
c.选择性地与靶标形成至少一个共价键的任何分子(例如感兴趣酶的自杀底物)。
项目20.如项目1-19中任一项所述的方法，其中所述对接链是核酸链。
项目21.如项目1-20中任一项所述的方法，其中所述成像链是核酸链。
项目22.如项目1、3-5、7-12、14-16或18-21中任一项所述的方法，其中所述抗原结合成像链的抗原包括HRP。
项目23.如项目1-22中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性结合配偶体包括抗HRP抗体或其抗原结合片段。
项目24.如项目1、3-5、7-12、14-16、18-21或23中任一项所述的方法，其中所述抗原结合成像链的抗原包括生物素。
项目25.如项目1-24中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性结合配偶体包括链霉抗生物素蛋白。
项目26.如项目1、3-5、7-12、14-16、18-21、23或25中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性结合配偶体包括特异性地结合所述抗原结合成像链的抗原的抗体或其抗原结合片段。
项目27.如项目1、3-5、7-12、14-16、18-21、23或25中任一项所述的方法，其中所述抗原结合成像链的抗原和所述抗原特异性结合配偶体都是抗体或其抗原结合片段，并且所述抗原特异性结合配偶体抗体或其抗原结合片段结合所述抗原结合成像链的抗原抗体或其抗原结合片段。
项目28.如项目1-27中任一项所述的方法，其中所述光学标记包括信号发射分子。
项目29.如项目1-38中任一项所述的方法，其中所述光学标记包括信号吸收分子。
项目30.如项目1-29中任一项所述的方法，其中所述样品是细胞、细胞裂解物、组织、组织裂解物、体液和/或完整生物体。
项目31.如项目1-30中任一项所述的方法，其中引入连接至光学标记的二级结合配偶体，其中所述二级结合配偶体直接或间接地特异性地结合所述抗原特异性结合配偶体。
项目32.如项目1、3-5、7-12、14-16、18-21、23、25或28-31中任一项所述的方法，其中引入连接至光学标记的二级结合配偶体，其中所述二级结合配偶体直接或间接地特异性地结合所述抗原特异性结合配偶体，并且其中所述二级结合配偶体和所述抗原结合成像链的抗原各自包括相同的抗原。
项目33.如项目31-32中任一项所述的方法，其中所述抗原和所述二级结合配偶体各自包括生物素。
项目34.如项目31-33中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性结合配偶体包括链霉抗生物素蛋白。
项目35.如项目1、3-5、7-12、14-16、18-21、23、25、28-31或33-34中任一项所述的方法，其中引入连接至光学标记的二级结合配偶体，其中所述二级结合配偶体直接或间接地特异性地结合所述抗原特异性结合配偶体，并且其中所述二级结合配偶体不包含所述抗原结合成像链的抗原。
项目36.如项目31-35中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性结合配偶体和所述二级结合配偶体都包括抗体或其抗原结合片段。
项目37.如项目36所述的方法，其中所述抗原特异性结合配偶体是所述抗原的一级抗体或其抗原结合片段，并且所述二级结合配偶体是二级抗体或其抗原结合片段。
项目38.如项目1-37中任一项所述的方法，其中多个抗原特异性结合配偶体结合单个抗原。
项目39.如项目1-38中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性结合配偶体包括多克隆抗体。
项目40.如项目44-41中任一项所述的方法，其中使用多种类型的抗原特异性结合配偶体。
项目41.如项目40所述的方法，其中所述多种类型的抗原特异性结合配偶体包括多于一种针对抗原上不同表位的单克隆抗体。
项目42.一种组合物，所述组合物包含：
(1)第一结合配偶体-寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含与包含对接结构域的寡核苷酸连接的结合配偶体；
(2)抗原结合的寡核苷酸缀合物，所述缀合物包含与包含成像结构域的寡核苷酸连接的抗原，其中(2)的成像结构域与(1)的对接结构域互补；以及
(3)标记的抗原特异性结合配偶体，所述标记的抗原特异性结合配偶体包含与抗原特异性结合配偶体连接的光学标记，其中(3)的抗原特异性结合配偶体特异性地结合(2)中的抗原。
等同物
前述书面说明被认为足以使本领域技术人员能够实施这些实施方案。前述描述和实施例详述了某些实施方案并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中的详细程度如何，所述实施方案可以以多种方式实施，并且应根据所附权利要求及其任何等同物来解释。
如本文所用，术语约是指数值，包括例如整数、分数和百分比，无论是否明确指示。说明书或权利要求中的每个数字都可以被认为是由术语约修饰。术语约通常是指本领域普通技术人员认为等同于所述值(例如具有相同的功能或结果)的数值范围(例如所述范围的+/-5-10％)。当术语诸如至少和约在数值或范围列表之前时，这些术语修饰列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可以包括四舍五入到最接近的有效数字的数值。

Claims (8)

1.一种方法，所述方法包括：
(1)使待测一个或多个靶标的存在的样品与一个或多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体连接至抗原，并且其中具有不同特异性的靶标特异性结合配偶体连接至不同的抗原，
(2)任选地去除未结合的靶标特异性结合配偶体，
(3)使所述样品与连接至对接链的抗原特异性结合配偶体接触，其中不同的抗原特异性结合配偶体连接至不同的对接链，
(4)任选地去除连接至对接链的未结合的抗原特异性结合配偶体；
(5)添加成像链；
其中所述成像链直接或间接地与对接链具有互补性，并且
其中每个成像链直接或间接地连接至一个或多个光学标记，并且其中具有不同特异性的成像链连接至不同的光学标记，
(6)任选地去除未结合的成像链，
(7)对所述样品成像以检测结合的标记的抗原特异性结合配偶体，
(8)任选地去除/熄灭来自所述光学标记的信号，以及
(9)任选地重复步骤(1)-(9)或其任何子集。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述靶标特异性结合配偶体包括抗体或其抗原结合片段。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶标特异性结合配偶体包括：
a.靶标分子的已知结合配偶体或这种结合配偶体的变体，
b.通过定向进化进行工程化的所述靶标分子的任何结合配偶体，或
c.选择性地与靶标形成至少一个共价键的任何分子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述对接链是核酸链。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述成像链是核酸链。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述抗原特异性结合配偶体包括特异性地结合所述抗原结合靶标特异性结合配偶体的抗原的抗体或其抗原结合片段。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中多个抗原特异性结合配偶体结合单个抗原。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中使用多种类型的抗原特异性结合配偶体。
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