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CN117106030A - 一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位及其应用 - Google Patents

一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位及其应用 Download PDF

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CN117106030A
CN117106030A CN202311253934.1A CN202311253934A CN117106030A CN 117106030 A CN117106030 A CN 117106030A CN 202311253934 A CN202311253934 A CN 202311253934A CN 117106030 A CN117106030 A CN 117106030A
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CN
China
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zearalenone
zen
antigen
epitope
phage
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Application number
CN202311253934.1A
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刘星
孙志昶
贺贞云
李娇
刘新苗
谢晓霞
王哲铭
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Hainan University
Original Assignee
Hainan University
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Publication date
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
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Abstract

本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位及其应用。本发明所述抗原模拟表位具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，可以代替价格昂贵且毒性强的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测。利用本发明所述抗原模拟表位作为免疫学检测的标准品，不仅能够减少国内对于价格高昂的小分子物质标准品ZEN进口的依赖，同时能够降低ZEN对于人体的毒性伤害，对于提升我国小分子物质免疫检测试剂的稳定性和可持续具有积极的意义。

Description

一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位及其应用
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位及其应用。
背景技术
真菌毒素是某些真菌在食品和饲料中代谢产生的次级代谢产物，对人类和动物都有严重的危害。至今已经检测出来的毒素已经超过了300种，其中玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是最常见的毒素之一。ZEN已被证实对人类和动物健康造成潜在威胁，ZEN具有很强雌激素样作用能够产生生殖毒性，同时还具有免疫毒性、肝毒性、遗传毒性、潜在致癌性。因此建立安全无毒的有效方法来检测需检测ZEN的残留至关重要。
目前，用于检测ZEN的方法有高效液相色谱法、气相色谱、薄层层析法、高效液相色谱-质谱联用法及免疫学检测方法等。其中免疫学检测方法为应用最为广泛的检测方法，原因在于，其灵敏度高，特异性强且操作简单易于使用。然而，在免疫学检测方法中，必须使用ZEN标准品来制备竞争抗原或者固相包被抗原，但是ZEN具有极强的致癌性对检测人员的健康和环境造成极大的威胁，且其昂贵的价格也成为玉米赤霉烯酮免疫学检测方法推广的重大阻碍。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位及其应用，所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位能够与抗ZEN单克隆抗体特异性结合，并表现出与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，可以代替毒性强且价格昂贵的ZEN标准品。
本发明提供了一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位，所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了编码上述技术方案所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的核苷酸。
优选的，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的玉米赤霉烯酮模拟抗原表位、所述的核苷酸或含有上述技术方案所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的噬菌体在制备检测玉米赤霉烯酮的试剂中的应用。
优选的，所述试剂包括免疫学检测试剂。
优选的，所述试剂包括固相抗原或竞争性抗原，所述固相抗原或竞争性抗原为所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位。
优选的，以所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位作为所述免疫学检测试剂中的抗原标准品。
本发明还提供了一种玉米赤霉烯酮的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述技术方案所述的玉米赤霉烯酮模拟抗原表位。
优选的，所述检测试剂盒包括玉米赤霉烯酮免疫学检测试剂盒。
有益效果：
本发明提供了一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位，所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明所述抗原模拟表位具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，可以代替价格昂贵且毒性强的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测。利用本发明所述抗原模拟表位作为免疫学检测的标准品，不仅能够减少国内对于价格高昂的小分子物质标准品ZEN进口的依赖，同时能够降低ZEN对于人体的毒性伤害，对于提升我国小分子物质免疫检测试剂的稳定性和可持续具有积极的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中间接phage ELISA鉴定阳性噬菌体克隆；
图2为实施例1中间接竞争phage ELISA鉴定特异性噬菌体克隆；
图3为实施例4中噬菌体克隆LL10间接竞争ELISA抑制曲线；
图4为实施例4中噬菌体克隆LL23间接竞争ELISA抑制曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位，所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸具体为：HTEHDSYWNALF；所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸具体为：KNQSINVLGGPF。
本发明还提供了编码上述技术方案所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的核苷酸。其中编码SEQ ID NO.1所述氨基酸的核苷酸优选如SEQ ID NO.3所示，具体为5’-CATACTGAGCATGATTCGTATTGGAATGCTTTGTTT-3’，编码SEQ IDNO.2所述氨基酸的核苷酸优选如SEQ IDNO.4所示，具体为5’-AAAAATTAGAGCATCAACGTATTGGGAGGCCCTTTC-3’。
本发明所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位优选采用固相亲和淘选法以玉米赤霉烯酮单克隆抗体(ZEN-mAb)为靶标，对随机十二肽库进行筛选，鉴定能与ZEN-mAb特异性结合的噬菌体，并经过四轮淘选获得。本发明对所述ZEN抗原模拟表位的制备方法没有特殊限定，利用本领域的常规方法制备获得的具有上述氨基酸序列的玉米赤霉烯酮模拟抗原表位，均属于本发明的保护范围，如噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式均能够进行所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的大量制备。
本发明所述抗原模拟表位具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，可以代替价格昂贵且毒性强的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测。
基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述的玉米赤霉烯酮模拟抗原表位、所述的核苷酸、含有上述技术方案所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的噬菌体在制备检测玉米赤霉烯酮的试剂中的应用。本发明优选将所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位化学合成后用于免疫学检测分析，或将展示有所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的噬菌体粒子直接用于分析检测，或将所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位从噬菌体上切下来代替ZEN标准品来进行免疫学检测分析。
本发明所述试剂优选包括免疫学检测试剂；所述试剂优选包括固相抗原或竞争性抗原，所述固相抗原或竞争性抗原为所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位；所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位更优选为所述免疫学检测试剂中的抗原标准品。
本发明还提供了一种玉米赤霉烯酮的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述技术方案所述的玉米赤霉烯酮模拟抗原表位。本发明所述检测试剂盒优选包括玉米赤霉烯酮免疫学检测试剂盒，更优选为ELISA检测试剂盒。本发明所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位优选为所述玉米赤霉烯酮免疫学检测试剂盒中的抗原标准品。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
玉米赤霉烯酮模拟表位的淘选
本实施例采用固相亲和淘选法，以玉米赤霉烯酮单克隆抗体(ZEN-mAb，南昌大学赠予)为靶标，对随机十二肽库进行筛选，鉴定能与ZEN-mAb特异性结合的噬菌体，淘选过程共进行四轮。
1.1ZEN模拟表位的第一轮生物淘选
包被：将ZEN-mAb溶液用10mM PBS(pH值7.4)稀释至浓度为100μg/mL，采用微孔筛选法进行噬菌体库的淘选，每孔准确吸取100μL加入酶标孔中；反复旋转酶标板，使得靶分子溶液在孔中流动，使每个孔表面完全的被含有靶分子溶液的包被液湿润(小心不要使溶液溅出)，4℃孵育12h；
封闭：倒掉包被液，每孔加入400μL 10mM PBS(pH值7.4)吹打洗涤，结束后立即在无菌吸水纸上用力拍打，直至无明显可见的水珠时停止，重复洗涤3次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS封闭液并摇晃平板充分混匀，37℃封闭1h；
文库孵育：弃封闭液，甩去酶标孔中的封闭液，并立即将酶标板在干燥无菌的吸水纸上用力拍打，充分除去酶标板中残留的少许封闭液，使用同样的400μLPBS洗涤3次。用PBS稀释噬菌体库，使其文库投入量为2.0×1011pfu，室温条件下充分混匀且缓慢摇晃2h，使其充分结合；
吸出未结合的噬菌体，倒置板在干净的无菌吸水纸上，拍甩除去残余溶液，用0.1％PBST(PBS+0.1％[v/v]Tween-20)反复洗涤5次，并更换新的吸水纸；
洗脱：加入非特异性缓冲液100μL 0.1M Gly-HCl(pH值2.2，含1mg/mL BSA)洗脱液洗脱与靶分子特异性结合的噬菌体，室温轻摇振荡洗脱，洗脱时间10min；将该洗脱液转移至一无菌离心管中，迅速用15μL 1M Tris-HCl(pH值8.0)中和缓冲液中和；取10～15μL做滴度测定，剩余的全部用来扩增；
1.2噬菌体的扩增和纯化
将淘选洗脱物加入到5mLE.coli ER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37℃剧烈摇动培养4.5h；其中E.coli ER2738，Ph.D.-12TM噬菌体展示肽库试剂盒(Ph.D.-12TMPhage Display Peptide Library Kit)，购买于New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)。
将培养物转入一新离心管中，在4℃条件下10000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。
将上清液80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％(w/v)PEG-8000，2.5MNaCl)。让噬菌体在4℃沉淀过夜。
4℃10000rpm离心沉淀15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。
沉淀物重悬于1mL TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀。
上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60min。4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用移液枪除去残余上清。
沉淀物重悬于200μL TBS，0.02％NaN3中。离心1min，沉淀残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。
1.3噬菌体洗脱与扩增产物的滴度测定
接种E.coli ER2738单菌落于5mL LB培养基中，摇床培养至对数中期(OD600约0.5)。
细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3mL等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。
37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
在LB液体培养基中准备10倍系列稀释的噬菌体。稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。
当菌体培养物达对数中期，分成200μL等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
每根试管加入10μL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育5min。
将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
待平板冷却5min后，倒置于37℃培养过夜。
检查平板，计数有约102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
1.4ZEN模拟表位第二至第四轮淘选
计数板上蓝斑数确定滴度，用这个值来计算相应于2×1011pfu的加入量。在测定第一轮扩增的噬菌体滴度之后，即可进行第二、三和四轮淘选。为了提高所筛选ZEN模拟表位的特异性与严格性，与第一轮淘选不同的为ZEN-mAb的包被浓度依次降低，分别为50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL；孵育结合时间依次减少分别为1.5h、1h、0.5h，洗涤缓冲液PBST中Tween-20的含量依次分别为0.25％、0.5％和0.5％。第三轮和第四轮淘选采用竞争洗脱的方式，即第三轮洗脱时加入100μL 10ng/mL ZEN标准品，37℃竞争洗脱1h后吸出即为第三轮洗脱物，第四轮洗脱时加入100μL 0.1ng/mL ZEN标准品(购买自青岛普瑞邦生物工程有限公司)，37℃竞争洗脱40min后吸出即为第四轮洗脱物，第四轮的洗脱物不再进行噬菌体的扩增，直接进行滴度测定。其余步骤都与第一轮淘选相同。
1.5噬菌斑的扩增和纯化
将E.coli ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，均分1mL到每个培养管中。每个要鉴定的噬菌体克隆一管。
用灭菌牙签挑一蓝色噬菌斑到上述1mL的培养管中。从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。
37℃摇床培养4.5～5h。
培养物转入微量离心管中，4℃，10000rpm离心30s。上清转入新管中再离心。用移液枪将80％的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，为待大量扩增的噬菌体保存液，用于阳性噬菌体的鉴定。
对于每一个要鉴定的噬菌体克隆，1:100接种过夜培养的E.coli ER2738菌液于20mL的LB液体培养基中，37℃，220rpm震荡培养至对数生长期。
将5μL噬菌体贮液加入处于对数生长期的LB液体培养基中，37℃，220rpm继续培养4.5-5h。培养物转至新鲜离心管，4℃，10000rpm离心10min。将上清液的80％转入另一离心管，加入1/6上清液体积的PEG/NaCl，使噬菌体4℃条件下沉降过夜。
次日，4℃，10000rpm离心15min。弃掉上清液，短暂离心后再次弃掉上清。用1mLTBS重悬沉淀，重悬液转移到微量离心管中，4℃，10000rpm离心5min，沉淀残余细胞。
将上清液转移到另一微量离心管，并加入1/6上清液体积的PEG/NaCl，冰上孵育60min后，4℃，10000rpm离心10min，弃掉上清，再次短暂离心后弃去残余上清。用200μL TBS重悬沉淀，4℃保存。
1.6间接Phage-ELISA鉴定阳性噬菌体克隆
包被：以ZEN-mAb为包被原，用PBS将其稀释至2μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜；
封闭：弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 10mM PBS(pH值7.4)配制的3％(w/v)脱脂牛奶，37℃封闭1h；
孵育噬菌体：弃封闭液，PBST洗涤4次，每孔加入100μL噬菌体上清，37℃孵育1h；
孵育二抗：PBST洗涤5次，加1：5000稀释的辣根过物氧化酶HRP标记的抗M13噬菌体二抗，100μL/孔，37℃孵育1h；
终止及显色：PBST洗涤6次，加入100μL/孔TMB显色液，室温避光显色10min，加入50μL/孔的2M H2SO4终止液终止反应，测定OD450。
1.7间接竞争ELISA确定噬菌体克隆的特异性
ZEN-mAb包被、封闭方法如前所述。
加ZEN标准品和阳性噬菌体克隆：每孔加入100ng/mL的ZEN标准品(用甲醇溶解，1×PBS(10mM，pH值7.4)稀释)50μL和PBS适当稀释的噬菌体50μL，轻微震荡混匀。37℃温育1h。
加酶标二抗：PBST洗板6次，每孔加入1：5000稀释的辣根过物氧化酶HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37℃孵育1h。
终止及显色：PBST洗涤6次，加入100μL/孔TMB显色液，室温避光显色10min，加入50μL/孔的2M H2SO4终止液终止反应，测定OD450；
淘选结果如表1所示，每一轮淘选的回收比率均有所提高。噬菌体产出量从3.2×105pfu/mL提高至3.8×107pfu/mL，回收率从1.60×10-6提高至1.90×10-4，可以看出特异性噬菌体得到有效的富集。
表1四轮亲和淘选中噬菌体的富集
从第四轮洗脱产物测定滴度的平皿上挑选出40个蓝色的噬菌斑，并用于感染E.coli ER2738进行噬菌体扩增和纯化，噬菌体克隆依次分别命名为LL1-LL40，通过Phage-ELISA对这些噬菌体克隆进行初步鉴定。如图1所示，结果表明40个噬菌体克隆中有32个能够与ZEN-mAb结合。
随后通过间接竞争phage ELISA实验进一步验证32个阳性噬菌体克隆中的特异性结合ZEN-mAb的噬菌体克隆，结果如图2所示，发现有25个噬菌体克隆与ZEN-mAb的结合均受到了100ng/mL ZEN标准品不同程度的抑制,表明这些噬菌体在体外可以被ZEN-mAb特异性识别，随后将鉴定得到的25个阳性噬菌体克隆用于DNA测序。
实施例2
ZEN抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
取实施例1中噬菌斑扩增后的100μL阳性噬菌体上清，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。根据噬菌体文库简要遗传密码表翻译出氨基酸序列并确定模拟表位的共有序列。-96gⅢ测序引物为5’-HOCCC TCATAG TTA GCG TAACG-3’(SEQ ID NO.5)，测序结果如表2所示。
表2阳性噬菌体克隆的核苷酸和氨基酸序列
表2列出了测序得到的阳性噬菌体克隆的DNA序列以及通过遗传密码表翻译后得到的插入序列。从表2中可以看出25个阳性克隆共展示了2个不同的十二肽序列。其中有18个噬菌体克隆展示的氨基酸序列为HTEHDSYWNALF，7个噬菌体克隆展示的氨基酸序列为KN*SINVLGGPF(其中在构建该文库的菌株中，琥珀终止子TAG(*)被Gln抑制，因此翻译时，应将TAG翻译为谷氨酰胺)。
实施例3
ZEN抗原模拟表位的大量制备
以噬菌体扩增的方式将展示有ZEN抗原模拟表位的噬菌体加入20mL接种有E.coliER2738的培养物(菌体处于对数前期)中，37℃220rpm振荡培养4.5h。将培养物转入另一离心管中，4℃10000rpm离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％(w/v)PEG-8000，2.5MNaCl)，4℃下静置2h以上。4℃10000rpm离心PEG/NaCl静置溶液15min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入1mL TBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。
实施例4
ZEN抗原模拟表位作为竞争抗原在ELISA中的应用
包被：以ZEN-mAb为包被原，用10mM PBS(pH值7.4)稀释至2μg/mL，100μL/孔，4℃孵育过夜；
封闭：弃包被液，PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次，每孔加入300μL10mM PBS(pH值7.4)配制的3％(w/v)脱脂牛奶，37℃封闭1h；
竞争孵育：弃封闭液，PBST洗涤4次，每孔分别投入50μL实施例3中制备得到的展示有ZEN抗原模拟表位的噬菌体(1.0×1011pfu)和一系列梯度浓度的50μLZEN标准品，37℃孵育1h。
孵育二抗：PBST洗涤5次，加1：5000稀释的辣根过物氧化酶HRP标记的抗M13噬菌体二抗，100μL/孔，37℃孵育1h；
终止及显色：PBST洗涤6次，加入100μL/孔TMB显色液，室温避光显色10min，加入50μL/孔的2M H2SO4终止液终止反应，读取OD450。
以ZEN浓度对数值为横坐标，结合率(加入ZEN孔的OD450/未加入ZEN孔的OD450×100％)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
从两个序列中随机选取模拟表位LL10和LL23建立间接竞争ELISA标准曲线，结果显示标准曲线呈S型，线性相关性较好，半数抑制浓度(Halfmaximal inhibitoryconcentration，IC50)分别为0.4ng/mL(图3)和0.2ng/mL(图4)。
由以上实施例可以得出：本发明所述抗原模拟表位具有与天然ZEN分子相似的免疫反应特性，可以代替价格昂贵且毒性强的ZEN标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于ZEN的免疫学检测。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种玉米赤霉烯酮模拟抗原表位，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示。
4.权利要求1所述的玉米赤霉烯酮模拟抗原表位、权利要求2或3所述的核苷酸或含有权利要求1所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位的噬菌体在制备检测玉米赤霉烯酮的试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括免疫学检测试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂包括固相抗原或竞争性抗原，所述固相抗原或竞争性抗原为所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，以所述玉米赤霉烯酮模拟抗原表位作为所述免疫学检测试剂中的抗原标准品。
8.一种玉米赤霉烯酮的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的玉米赤霉烯酮模拟抗原表位。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括玉米赤霉烯酮免疫学检测试剂盒。
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