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CN117074685A - 细胞因子作为生物标志物在制备孤立性冠脉炎诊断产品中的应用 - Google Patents

细胞因子作为生物标志物在制备孤立性冠脉炎诊断产品中的应用 Download PDF

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CN117074685A CN202310377539.8A CN202310377539A CN117074685A CN 117074685 A CN117074685 A CN 117074685A CN 202310377539 A CN202310377539 A CN 202310377539A CN 117074685 A CN117074685 A CN 117074685A
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Abstract

本发明提供了细胞因子作为生物标志物在制备诊断孤立性冠脉炎的产品中的应用。其中，细胞因子为如下至少一个：CD3、CD4、CD45RA及CCR7。将上述细胞因子应用于孤立性冠脉炎诊断，可以更为及时准确地确诊孤立性冠脉炎患者，并及时对其提供有针对性的治疗方案。

Description

细胞因子作为生物标志物在制备孤立性冠脉炎诊断产品中的 应用
技术领域
本发明涉及免疫诊断技术领域，具体而言，涉及一种细胞因子作为生物标志物在制备孤立性冠脉炎诊断产品中的应用。
背景技术
孤立性冠状动脉炎是一类除外其他部位外周动脉狭窄，非动脉粥样硬化斑块所致的冠状动脉狭窄。1952年Von Albertini医生曾首次提出孤立性冠状动脉炎这个概念，是一种病因尚未明确的罕见疾病，其特征是血管炎症仅累及冠脉，表现为全身仅冠状动脉管壁有炎性细胞浸润，并伴有管腔结构的反应性损伤。由于认识不足，临床实践中孤立性冠脉炎一般是按冠状动脉粥样硬化性心脏病/急性冠脉综合征给予对症治疗，一部分患者有机会接受冠脉介入治疗，但不论是最新一代的药物球囊扩张还是最新一代的药物洗脱支架植入治疗均效果极差，患者术后短期内(约2-6个月)反复突发心血管事件(包括死亡、心肌梗死、缺血驱动的再次血运重建)。目前尚无针对孤立性冠脉炎进行诊断的特异性生物标志物。
目前孤立性冠脉炎的诊断主要根据病史，若患者1年内因心梗或缺血驱动反复住院，现有冠心病标准治疗手段无法阻止冠脉狭窄或闭塞，且通过临床症状及影像学评估，排除冠脉痉挛、斑块破裂、血栓形成、冠脉夹层等，排除其他部位大中血管受累，则临床疑诊孤立性冠脉炎。最终的确诊需要经验性激素免疫抑制剂治疗病情稳定1年以上，没有再发生心梗或缺血驱动的住院，这部分治疗有效患者可确诊为孤立性冠脉炎。从诊断流程上看由于缺乏有效的标志物或影像学特征，孤立性冠脉炎需要一段漫长的排查及确诊时间，多数患者的病情得不到及时的诊断及治疗。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种细胞因子作为生物标志物在制备孤立性冠脉炎诊断产品中的应用，以解决现有技术中难以及时准确的孤立性冠脉炎诊断的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了细胞因子作为生物标志物在制备诊断孤立性冠脉炎的产品中的应用，细胞因子为如下至少一个：CD3、CD4、CD45RA及CCR7。
进一步地，应用包括利用检测试剂检测细胞因子的含量；优选地，细胞因子的含量的检测方法包括：ELISPOT技术或免疫印迹实验；优选地，检测试剂为细胞因子的抗体、RNA探针或DNA探针；优选地，抗体设置在固相载体上；优选地，固相载体包括酶标板、膜载体或微球；优选地，膜载体选自硝酸纤维素膜、PDVF膜或尼龙膜；优选地，抗体为单克隆抗体；优选地，产品包括试剂盒或电子预测装置。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于诊断孤立性冠脉炎的试剂盒，试剂盒包括检测细胞因子的含量的检测试剂。
进一步地，试剂盒还包括CD3抗原肽、CD4抗原肽、CD45RA抗原肽或CCR7抗原肽中的一种或多种；优选地，试剂盒还包括CD3抗原肽、CD4抗原肽、CD45RA抗原肽及CCR7抗原肽；优选地，试剂盒进一步还包括：人淋巴细胞分离液、无血清细胞培养液、生物素-IFN-γ抗体、HRP-链霉亲和素、AEC稀释液、AEC底物液、无菌10×PBS、胎牛血清、植物凝集素工作液及阴性孔补充液；优选地，试剂盒还包括：PVDF膜条板、无菌PCR管及无菌EP管；其中，PVDF膜条板为已包被抗体的PVDF膜条板，抗体选自特异性识别如下至少一种抗原肽的抗体：CD3抗原肽、CD4抗原肽、CD45RA抗原肽及CCR7抗原肽；优选地，PVDF膜条板为可拆条板，更优选地，每块PVDF膜条板有10-11排，每排有10-11个孔；优选地，各抗原肽以液体形式存在；优选地，液体为各抗原肽的DMSO溶液或DMF溶液；优选地，液体中进一步包括甘油和PMSF；优选地，按体积分数计，甘油的含量为30-35％；优选地，按体积分数计，PMSF的含量为1-2％。
进一步地，植物凝集素工作液包括植物凝集素及溶解植物凝集素的无菌1×PBS组成，阴性孔补充液包括无血清细胞培养液及DMSO溶液或DMF溶液。
根据本发明的另一方面，提供了一种诊断孤立性冠脉炎的电子装置，电子装置包括：诊断模块，被设置为根据细胞因子含量的检测结果进行孤立性冠脉炎诊断；其中，细胞因子为如下至少一个：CD3、CD4、CD45RA或CCR7。
进一步地，电子装置还包括：获取模块，被设置为获取生物样品；检测模块，被设置为对生物样品中的细胞因子的含量进行检测，从而获得生物样品中的细胞因子含量；优选地，生物样品为血浆样品。
进一步地，生物样品的获取模块为获取培养后的外周单个核细胞；优选地，检测模块为ELISPOT检测模块，ELISPOT检测模块被设置为对在PVDF膜条板上培养后的外周单个核细胞中的细胞因子的含量进行ELISPOT检测，获得细胞因子含量；优选地，获取模块包括：样品处理模块，样品处理模块被设置为对血浆样品中的外周单个核细胞进行分离，得到外周单个核细胞悬液；细胞培养模块，细胞培养模块被设置为在PVDF膜条板上对外周单个核细胞悬液进行细胞培养，获得外周单个核细胞；优选地，样品处理模块和细胞培养模块处于无菌环境中。
进一步地，样品处理模块包括：稀释模块，稀释模块被设置为对血浆样品进行稀释；细胞分离模块，细胞分离模块被设置为利用人淋巴细胞分离液对稀释后的血浆样品进行离心分离，获得外周单个核细胞层；洗涤模块，洗涤模块被设置为取离心后的外周单个核细胞层进行洗涤，离心获得外周单个核细胞；重悬模块，重悬模块被设置为对洗涤后获得的外周单个核细胞进行重悬，并调整细胞浓度，得到外周单个核细胞悬液。
进一步地，细胞培养模块包括：活化模块，活化模块被设置为活化PVDF膜条板；PBMC细胞培养模块，PBMC细胞培养模块被设置为在活化后的PVDF膜条板上对外周单个核细胞悬液进行细胞培养。
进一步地，ELISPOT检测模块包括：细胞裂解模块，细胞裂解模块被设置为对PVDF膜条板上细胞培养后的细胞进行裂解；抗原抗体反应模块，抗原抗体反应模块被设置为对PVDF膜条板上各孔中裂解后的细胞进行抗原抗体反应；计数模块，计数模块被设置为对进行抗原抗体反应后的PVDF膜条板上各孔进行显色反应，后进行斑点计数，获得细胞因子含量。
应用本发明的技术方案，通过飞行质谱流式细胞术筛选得到可作为孤立性冠脉炎诊断的生物标志物的细胞因子——CD3、CD4、CD45RA或CCR7。其中的一种或多种细胞因子作为生物标志物进行诊断可以增强孤立性冠脉炎诊断结果的准确性。因而将上述细胞因子应用于孤立性冠脉炎诊断，能够更为准确地确诊孤立性冠脉炎患者，并及时对其提供有针对性的治疗方案。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例1中的T细胞亚群的聚类分析热图；
图2示出了实施例1中的T细胞亚群比例差异的箱线图；
图3示出了实施例2中的受试者工作特征曲线示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
1.急性冠脉综合征：急性冠状动脉综合征是一组由急性心肌缺血引起的临床综合征，其发病的病理基础包括动脉粥样硬化和非动脉粥样硬化所致的冠状动脉管腔狭窄或闭塞。
2.冠脉炎：孤立性冠状动脉炎是一类除外其他部位外周动脉狭窄，非动脉粥样硬化斑块所致的冠状动脉狭窄，其特征是血管炎症仅累及冠脉，表现为全身仅冠状动脉管壁有炎性细胞浸润，并伴有管腔结构的反应性损伤。
3.冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)：冠状动脉粥样硬化性心脏病指冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病，简称冠心病。
如背景技术所提到的，现有技术中难以对孤立性冠状动脉炎进行及时准确诊断。目前仅能通过排除法，在排除了急性冠脉综合征与冠心病患病的可能后，才能诊断为孤立性冠状动脉炎并进行治疗观察。由于缺乏有效的诊断手段，孤立性冠脉炎需要一段漫长的排查及确诊时间，多数患者的病情得不到及时的诊断及治疗。因而，本申请发明人通过对现有技术中孤立性冠脉炎的报道进行综合分析发现：尽管有报道认为其与免疫炎症反应相关，但受限于检查手段，目前并没有明确的免疫炎症相关的指标辅以临床诊治。比如，最初孤立性冠状动脉炎的诊断均来自于猝死患者尸检的病理结果，病理检查提示血管壁增厚、内膜增生、纤维化，并可见大量淋巴细胞浸润，免疫组化提示大量T淋巴细胞浸润血管壁。
在此分析基础上，发明人尝试从免疫炎症的角度寻找可用于临床辅助诊断的生物标志物。具体地，通过结合飞行质谱和流式细胞术筛选得到了一系列可以在孤立性冠脉炎患者中作为生物标志物进行诊断的细胞因子，并证实能够为孤立性冠状动脉炎的诊断提供有力的数据支持，进而有利于为孤立性冠脉炎患者提供及时治疗。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种细胞因子作为生物标志物在制备诊断孤立性冠脉炎的产品中的应用，细胞因子为如下至少一个：CD3、CD4、CD45RA及CCR7。
本申请发明人通过结合飞行质谱和流式细胞术，筛选出了一系列在孤立性冠脉炎患者中特异性高表达的细胞因子。在各类T细胞亚群中，原始CD4+T细胞在正常健康人群中的比例是29.8％，在冠脉炎人群的中比例是12.2％，在冠心病人群中的比例是18.4％，且结果具有统计学意义，而中央记忆型T细胞在正常健康人群中的比例是33.4％，在冠脉炎人群的中比例是40.3％，在冠心病人群中的比例是37.6％，中央记忆型T细胞聚类在冠脉炎人群的比例略高于冠心病和正常对照，具有统计学差异趋势。原始CD4+T细胞的免疫学特征是CD3+、CD4+、CD45RA+、CCR7+；中央记忆型T细胞的免疫学特征是CD3+、CD4+、CD45RA-、CCR7+，上述细胞因子表达值均>0，因而，CD3、CD4、CD45RA、CCR7四种免疫细胞标记能够作为生物标志物对孤立性冠脉炎进行诊断。
上述应用包括利用检测试剂检测细胞因子的含量。任何可以利用检测试剂对细胞因子的含量进行检测的检测方法均适用于本申请，在一种优选的实施例中，细胞因子的含量的检测方法包括：ELISPOT技术或免疫印迹实验。其中，ELISPOT技术为利用酶联免疫分析技术在单细胞水平上以斑点计数对细胞因子进行定量检测；免疫印迹实验是以膜上条带深浅对目的蛋白进行定性或定量的检测。可以依据进行检测的实际情况选择合适的检测方法。
任何可以对细胞因子的含量进行检测的检测试剂均适用于本申请，比如，对该细胞因子从mRNA到蛋白层面上的检测试剂均可。在一种优选的实施例中，检测试剂为细胞因子的抗体，利用抗原抗体反应可以对细胞因子进行准确的检测。任何可以对抗体进行负载的物体均适用与本申请，在一种优选的实施例中，抗体设置在固相载体上；在一种优选的实施例中，固相载体包括酶标板、膜载体或微球。任何可以对负载抗体进行检测的膜载体均适用于本申请，在一种优选的实施例中，膜载体选自硝酸纤维素膜、PDVF膜或尼龙膜。可以通过对具体不同的待检测物或检测条件，对检测试剂或其载体进行相应适合的选择。任何种类的抗体均适用于本申请，在一种优选的实施例中，抗体为单克隆抗体，该种抗体接受单一的抗原决定簇刺激而产生，可以通过不同检测物的种类对该抗体进行相应的选择。任何可以对细胞因子的含量进行检测的产品均适用于本申请，在一种优选的实施例中，产品包括试剂盒或电子预测装置，可以针对检测目的或条件选择合适的产品进行检测。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种用于诊断孤立性冠脉炎的试剂盒，该试剂盒包括检测细胞因子的含量的检测试剂。通过试剂盒能够对待检测样品中的细胞因子含量进行系统便捷的检测。
任何可以检测细胞因子的含量的试剂盒均适用于本申请，比如，检测试剂、细胞培养基溶液、细胞缓冲液、显色试剂及实验耗材。在一种优选的实施例中，该试剂盒还包括CD3抗原肽、CD4抗原肽、CD45RA抗原肽或CCR7抗原肽中的一种或多种。在一种优选的实施例中，该试剂盒还包括CD3抗原肽、CD4抗原肽、CD45RA抗原肽及CCR7抗原肽。上述抗原肽包含为任意有相应的细胞因子的抗原决定簇序列，可以刺激抗原生成，在后续的抗原抗体反应中通过对被刺激的抗原的定量检测，转化为对该待测样品中细胞因子含量的检测，以达到对细胞因子定量检测的目的，作为进行诊断的数据依据。
在一种优选的实施例中，该试剂盒进一步还包括：人淋巴细胞分离液、无血清细胞培养液、生物素-IFN-γ抗体、HRP-链霉亲和素、AEC稀释液、AEC底物液、无菌10×PBS、胎牛血清、植物凝集素工作液及阴性孔补充液。在一种优选的实施例中，该试剂盒还包括：PVDF膜条板、无菌PCR管及无菌EP管。其中，PVDF膜条板为已包被抗体的PVDF膜条板，抗体选自特异性识别如下至少一种抗原肽的抗体：CD3抗原肽、CD4抗原肽、CD45RA抗原肽及CCR7抗原肽。上述包含在试剂盒中的组成物均用于对细胞因子的检测，抗原肽被固定于PVDF膜条板上，以PVDF膜条板为反应平台进行检测。上述人淋巴细胞分离液完成对生物样品中待检测的人外周血单个核细胞(PBMC)细胞进行分离的作用；生物素-IFN-γ抗体作为一抗可以对被相应细胞因子刺激产生的抗原进行特异性识别，进而被二抗HRP-链霉亲和素识别，通过AEC稀释液、AEC底物液配置的显色液进行显色，得到可作为诊断依据的显色斑点值。植物凝集素工作液及阴性孔补充液分别作为阳性对照液与阴性对照液。
任何可以进行细胞因子的含量检测的PVDF膜条板均适用于本申请，在一种优选的实施例中，PVDF膜条板为可拆条板。在一种优选的实施例中，每块PVDF膜条板有10-11排，每排有10-11个孔。依据待测样品的需要选择合适大小的PVDF膜条板。
上述抗原肽以液体形式存在。任何以溶解抗原肽的液体均适用于本申请，在一种优选的实施例中，液体为各抗原肽的DMSO溶液或DMF溶液；在一种优选的实施例中，液体中进一步包括甘油和PMSF；任何不影响抗原肽功能的甘油与PMSF含量均适用于本申请，在一种优选的实施例中，按体积分数计，甘油的含量为30-35％；在一种优选的实施例中，按体积分数计，PMSF的含量为1-2％。DMSO与DMF是常用的稳定溶剂，甘油作为防冻剂，PMSF是一种蛋白酶抑制剂。
上述植物凝集素工作液包括植物凝集素及溶解植物凝集素的无菌1×PBS组成，阴性孔补充液包括无血清细胞培养液及DMSO溶液或DMF溶液。在后续的细胞因子检测中植物凝集素工作液作为阳性对照，阴性孔补充液作为阴性对照。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种诊断孤立性冠脉炎的电子装置，电子装置包括：诊断模块，被设置为根据细胞因子含量的检测结果进行孤立性冠脉炎诊断；其中，细胞因子为如下至少一个：CD3、CD4、CD45RA或CCR7。通过该电子装置能够患者的生物样品中的细胞因子含量进行分析，完成孤立性冠脉炎的诊断。
上述电子装置还包括：获取模块，被设置为获取生物样品；检测模块，被设置为对生物样品中的细胞因子的含量进行检测，从而获得生物样品中的细胞因子含量。在一种优选的实施例中，生物样品为血浆样品。
上述生物样品的获取模块为获取培养后的外周单个核细胞。任何能够对外周单个核细胞进行检测的模块均适用与本申请，包括但不限于流式细胞仪检测模块、免疫印记模块或ELISPOT检测模块。在一种优选的实施例中，检测模块为ELISPOT检测模块，ELISPOT检测模块被设置为对在PVDF膜条板上培养后的外周单个核细胞中的细胞因子的含量进行ELISPOT检测，获得细胞因子含量。
上述获取模块包括：样品处理模块，样品处理模块被设置为对血浆样品中的外周单个核细胞进行分离，得到外周单个核细胞悬液；细胞培养模块，细胞培养模块被设置为在PVDF膜条板上对外周单个核细胞悬液进行细胞培养，获得外周单个核细胞。其中，任何能够对外周单个核细胞悬液进行细胞培养的模块均适用于本申请，在一种优选的实施例中，细胞培养模块被设置为在PVDF膜条板上对外周单个核细胞悬液进行细胞培养。在一种优选的实施例中，样品处理模块和细胞培养模块处于无菌环境中。
上述样品处理模块包括：稀释模块，稀释模块被设置为对血浆样品进行稀释；细胞分离模块，细胞分离模块被设置为利用人淋巴细胞分离液对稀释后的血浆样品进行离心分离获得外周单个核细胞层；洗涤模块，洗涤模块被设置为取离心后的外周单个核细胞层进行洗涤，离心获得外周单个核细胞；重悬模块，重悬模块被设置为对洗涤后获得的外周单个核细胞进行重悬，并调整细胞浓度，得到外周单个核细胞悬液。该模块主要是完成对患者的生物样品中的外周单个核细胞进行分离培养，以得到细胞浓度合适的外周单个核细胞。
任何可以完成对血浆样品进行稀释的稀释模块均适用于本申请，在一种优选的实施例中，稀释模块包括：第一量取单元，被设置为分别量取3-5ml的血浆样品及3-5ml的无菌1×PBS；稀释单元，被设置为用3-5ml的无菌1×PBS对3-5ml的血浆样品进行稀释。
任何可以完成对血浆样品中不同细胞进行分离的细胞分离模块均适用于本申请，在一种优选的实施例中，细胞分离模块包括：第二量取单元，被设置为量取3-5ml的淋巴细胞分离液；细胞分离单元，被设置为在3-5ml的淋巴细胞分离液中加入6-10ml的稀释后的血浆样品，并离心分离使淋巴细胞分离液从稀释后的血浆样品中分离出，使得稀释后的血浆样品与淋巴细胞分离液呈明显上下两层，获得外周单个核细胞层。细胞分离模块中的离心条件为在25℃下，2000-2500转/分钟，离心20-25分钟。
任何可以完成对分离细胞进行洗涤的洗涤模块均适用于本申请，在一种优选的实施例中，洗涤模块包括：第三量取单元，被设置为量取10-15ml的无菌1×PBS；洗涤单元，被设置为将量取的10-15ml的无菌1×PBS中加入离心后的外周单个核细胞层中，混匀，离心获得外周单个核细胞。洗涤模块中的离心的条件为在25℃下，1500-1800转/分钟，离心10-15分钟。
任何可以完成对洗涤后细胞进行重悬的重悬模块均适用于本申请，在一种优选的实施例中，重悬模块包括：第四量取单元，被设置为量取800-900ml的无血清细胞培养液；重悬单元，被设置为在外周单个核细胞中加入800-900ml的无血清细胞培养液，进行重悬，得到重悬细胞；浓度调整单元，被设置为对重悬细胞中的细胞浓度进行调整，得到外周单个核细胞悬液。任何可以进行后续细胞因子检测的细胞浓度均适用于本申请，在一种优选的实施例中，调整细胞浓度至2×106个/ml，利用该浓度下的细胞进行检测可以得到更为准确清晰的结果。
上述细胞培养模块包括：活化模块，活化模块被设置为活化PVDF膜条板；PBMC细胞培养模块，PBMC细胞培养模块被设置为在活化好的PVDF膜条板上进行外周单个核细胞悬液的细胞培养。任何可以对PVDF膜条板完成活化的操作均适用于本申请，在一种优选的实施例中，活化模块还包括：向PVDF膜条板的每个孔中加入200μL无血清细胞培养液，8-10分钟后弃去无血清细胞培养液，完成活化。
任何可以对PBMC细胞进行培养的PBMC细胞培养模块均适用于本申请，在一种优选的实施例中，PBMC细胞培养模块包括：加入PBMC细胞单元，被设置为量取100-150μL外周单个核细胞悬液加入活化好的PVDF膜条板的孔中；加入抗原肽单元，被设置为将抗原肽加入PVDF膜条板中被分为实验组的带有外周单个核细胞悬液的孔中。除实验组外，PVDF膜条板的孔中还包括对照组。在该过程中抗原肽通过包被在PVDF膜条板上的抗体固定于PVDF膜条板的对应孔中，并对加入的外周单个核细胞进行免疫刺激，使其分泌可与生物素-IFN-γ检测抗体进行抗原抗体反应的物质。
任何可以进行细胞因子检测的外周单个核细胞悬液中的细胞密度均适用于本申请，在一种优选的实施例中，加入PBMC细胞单元中加入的外周单个核细胞悬液中的细胞密度为1×105-2×105个/ml。优选为2×105个/ml，在该种浓度下的外周单个核细胞悬液对能够得到更为准确清晰的检测结果。
在一种优选的实施例中，加入抗原肽单元中的实验组为4个孔，分别加入20μL的CD3抗原肽、CD4抗原肽、CD45RA抗原肽、CCR7抗原肽；对照组为2个孔，其中一个为阴性对照孔，加入20μL的阴性孔补充液，另一个为阳性对照孔，加入20μL的植物凝集素工作液；
任何可以进行外周单个核细胞细胞培养的培养条件均适用于本申请，在一种优选的实施例中，PBMC细胞培养模块中的细胞培养条件为在37℃、5％CO2环境下，培养20-22小时。通过改变具体的培养条件以达到对外周单个核细胞细胞培养最适的培养条件。
上述ELISPOT检测模块包括：细胞裂解模块，细胞裂解模块被设置为对PVDF膜条板上细胞培养后的细胞进行裂解；抗原抗体反应模块，抗原抗体反应模块被设置为对PVDF膜条板上各孔中裂解后的细胞进行抗原抗体反应；计数模块，计数模块被设置为对进行抗原抗体反应后的PVDF膜条板上各孔进行显色反应，后进行斑点计数。该模块所进行的ELISPOT检测为对细胞因子单个细胞水平的定量的检测，以得到可以诊断孤立性冠脉炎的实验数据。
任何能够对培养后细胞进行裂解的细胞裂解模块均适用于本申请，在一种优选的实施例中，细胞裂解模块包括：去除细胞悬液单元，被设置为去除细胞培养后的PVDF膜条板中的细胞悬液；细胞裂解单元，被设置为量取200μL去离子水加入实验组与对照组的孔中，于4℃放置10分钟后，去除去离子水；洗板单元，被设置为对完成细胞裂解后的PVDF膜条板进行5-6次洗板。
任何能够对细胞因子进行检测的抗原抗体反应模块均适用于本申请，在一种优选的实施例中，抗原抗体反应模块还包括：一抗孵育单元，被设置为量取100μL生物素-IFN-γ检测抗体工作液加入细胞裂解后的PVDF膜条板的每个孔中加入，于20-25℃、避光条件下，孵育2小时；一抗洗板单元，被设置为在一抗孵育完成后，去除生物素-IFN-γ检测抗体工作液，进行5-6次洗板；二抗孵育单元，被设置为量取100μL HRP-链霉亲和素工作液加入完成洗板后的每个孔中，于20-25℃、避光条件下，孵育1小时；二抗洗板单元，被设置为在二抗孵育完成后，去除HRP-链霉亲和素工作液，进行5-6次洗板。在进行抗原抗体反应的过程中，对抗体孵育量与孵育时间的控制对于后续的检测结构有一定的影响，需要准确把握确定。
在细胞裂解模块和抗原抗体反应模块中任何能够对PVDF膜条板进行清洗的洗板操作均适用于本申请，在一种优选的实施例中，上述涉及洗板单元中的洗板具体被设置为量取200μL 1×PBS加入PVDF膜条板的每个孔中，放置1分钟后，去除1×PBS。对PVDF膜条板进行适当的清洗可以使其后续进行显色反应的结果更为准确清晰。
任何可以进行细胞因子检测的生物素-IFN-γ检测抗体工作液均适用于本申请，在一种优选的实施例中，生物素-IFN-γ检测抗体工作液由10％的胎牛血清的无菌1×PBS与生物素-IFN-γ抗体组成，现用现配；在一种优选的实施例中，10％的胎牛血清的无菌1×PBS稀释生物素-IFN-γ抗体的稀释比例为1:250。加入胎牛血清可以增强其中抗体进行抗原抗体反应的结合能力。
任何可以进行细胞因子检测的HRP-链霉亲和素工作液均适用于本申请，在一种优选的实施例中，HRP-链霉亲和素工作液由10％的胎牛血清的无菌1×PBS与HRP-链霉亲和素组成，现用现配；在一种优选的实施例中，10％的胎牛血清的无菌1×PBS稀释HRP-链霉亲和素的稀释比例为1:100。该试剂作为二抗识别一抗的生物素，HRP可以与AEC显色液进行反应达到对细胞因子含量进行定量检测的目的。
任何可以对显色结果进行计数的计数模块均适用于本申请，在一种优选的实施例中，计数模块还包括：显色模块，被设置为量取100μL AEC显色液加入抗原抗体反应后的PVDF膜条板孔中，于20-25℃、避光条件下，静置25分钟；停止显色单元，被设置为去除PVDF膜条板中的AEC显色液，用去离子水洗涤PVDF膜条板3-5次，并置于室温避光处；计数单元，被设置为待PVDF膜条板晾干后进行斑点计数。
任何可以进行显色的AEC显色液均适用于本申请，在一种优选的实施例中，AEC显色液由AEC底物液与AEC稀释液按照1:50的比例混合后得到，现用现配，于20-25℃、避光保存。
任何可以对显色结果进行计数的方法均适用于本申请，在一种优选的实施例中，计数模块中的计数单元中的计数具体被设置为利用正置光学显微镜的低倍镜或酶联免疫斑点分析仪对完成显色反应的PVDF膜条板进行斑点计数，获得细胞因子含量。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1利用飞行质谱流式细胞术筛选可作为免疫诊断标志物的细胞因子
1.血浆采集：受检者用EDTA抗凝管采清晨空腹静脉血3ml，离心1200rpm 10分钟，取上清2/3，再次4℃离心1200rpm 5分钟，取上清于-80℃保存。其中，受检者样品包括三类人群：正常健康人群、冠脉炎人群及冠心病人群，来自于2020年1月至2020年12月从中国医学科学院阜外医院收集正常健康人群7例、冠脉炎患者18例及冠心病患者外周抗凝血12例。
2.飞行质谱流式细胞术
2.1人外周血单个核细胞分离技术
(1)在生物安全柜中取出新抽取的EDTA抗凝全血，加入等体积PBS溶液，用巴氏德吸管混合均匀；
(2)在无菌离心管中加入适当体积的人外周血淋巴细胞分离液，具体加入分离液体积视经PB溶液稀释后的血液体积而定，一般情况下若是稀释后的血液体积<3ml，则分离液需要加入3ml，若是稀释后的血液体积>3ml，则分离液加入等体积即可，需注意分离液和稀释后血液体积总和不得超过离心管容积的三分之二，否则容易影响分离液的分离效果；
(3)用巴氏德吸管抽吸稀释后的血液，倾斜离心管，试稀释后的血液延管壁缓慢滑入液面，最终稀释后的血液平铺于人外周血淋巴细胞分离液的上方，操作过程中需保持两液面之间界限清晰，可以形成非常明显的分层界面，操作时间尽量节约时间，时间过长可造成红细胞成团沉降于分离液中，虽然属于正常现象，但是可能会对后续实验造成一定影响；
(4)于室温下离心，转速400g，时间30min，注意调节离心开始时转子升速×4，离心结束后转子降速×0，以保证离心各液面分界稳定；
(5)离心结束后离心管内液体将出现十分明显的分层现象：离心管底部是外周血中的红细胞与粒细胞，呈暗红色，中间一层为透明的分离液层，最上面为被稀释后的呈淡红色的血浆层，分离液层与稀释后血浆层之间有一白膜层，即为单个核细胞层；
(6)先将离心管中的稀释后血浆层尽可能吸除，然后倾斜离心管，吸取白膜层到新的一次性无菌15ml离心管中，向其中加入10ml PBS溶液，室温下离心，转速300g，时间10min，弃上清；
(7)向离心管中加入5ml PBS溶液重悬细胞，室温下离心，转速300g，时间10min，弃上清；
(8)向离心管中加入5ml PBS溶液重悬细胞，室温下离心，转速300g，时间10min，弃上清，细胞重悬后吸取20ul细胞悬液，加入count star计数板，细胞计数仪计算单个核细胞密度，选取l×l06个外周血单个核细胞备用，剩余细胞-80℃冰箱冷冻24小时后转入液氮中保存，方便进行后续实验。
2.2细胞冻存及细胞复苏
(1)细胞冻存：吸取需要保存的外周血单个核细胞加入一次性无菌15ml离心管中，加入适当体积PBS溶液，吹吸混匀后室温下离心，转速300g，时间min，弃上清。根据细胞计数仪测得的细胞数量，按照每个冻存管冻存1×106到3×106个单个核细胞配制冻存液(每个细胞冻存管l mL冻存液，冻存液组成为10％DMSO和90％FBS)，用配置好的冻存液重悬单个核细胞团块，细胞悬液移入冻存管中，每个细胞冻存管细胞悬液体积为l mL，拧紧冻存管管盖，封口膜缠绕封口处，放入梯度降温盒中，-80℃冰箱冷冻24小时后转入液氮中保存；
(2)细胞复苏：提前打开37℃水浴锅，待其温度升至37℃稳定后从液氮罐中取出细胞冻存管，用无菌手套包住细胞冻存管，在37℃水温中使冻存的单个核细胞迅速融化，将融化完全的单个核细胞悬液加入一次型无菌15mL离心管中，再向离心管内加入2mL完全培养基，室温下离心，转速800rpm，时间8min，弃上清，加入适量完全培养基重悬单个核细胞，培养箱中温育20min，细胞稳定活性状态后进行后续实验操作。
2.3质谱流式金属耦联抗体质量检测
(1)抗体标记检测过程：主要包括金属及polymer聚合物的预混、抗体还原、金属连接polymer纯化、还原抗体纯化、纯化抗体及金属连接polymer螯合、金属螯合抗体回收、金属抗体回收率测算，而后通过Helios质谱流式细胞仪进行抗体标记检测。
(2)抗体测试：采集外周血分离单个核细胞后质谱流式前细胞染色，分别设置空白管和梯度染色管，样本编码标记后上机检测。
2.4质谱流式细胞染色
(1)质谱流式染色(第一天进行胞外染色)
1)备好需要用的移液枪、枪头、无菌离心管、流式管等，检查各实验仪器无故障后，从-20℃冰箱中取出194Pt染液，置于室温中使其融化，在制冰机中取冰放于冰盒内，从4℃冰箱取出FACS Buffer、Blocking Solution、各种质谱流式金属耦联抗体、Ir染液等试剂，置于冰上保存，提前打开离心机，温度调至4℃，转速为400g，时间为5min；
2)每个待检测样本选取3×106个单个核细胞移入15mL无菌离心管中，准备用于实验；
3)用PBS溶液将l mM浓度的194Pt染液稀释成终浓度为0.25μM的194Pt染液(用于在质谱流式检测中鉴定细胞死活状态)，每个待检测样本加入100μl的稀释后194Pt染液，置于冰上染色5min后向每个待检测样本加入l mL FACS Buffer离心，调整离心温度为4℃，转速为400g，时间为5min，弃上清后每个待检测样本再加入l mL FACS Buffer重悬细胞后离心，离心温度为4℃，转速为400g，时间为5min，弃上清；
4)按照每个待检测样本4μl Blocking Solution和50μl FACS Buffer配制Blockmix染液(用于在质谱流式检测中阻断非特异性结合)，向每个待检测样本加入50μ1的Block mix染液，重悬细胞后，置于冰上孵育20min，孵育时间结束后不必去除Block mix封闭液，可直接加入Surface Antibody mix染液；
5)将质谱流式检测所需的41种金属耦联细胞表面标记抗体与FACS Buffer配制成Surface Antibody mix染液(按照每个待检测样本抗体混合染液体积为55μl，包括41种抗体每种1.1μl共45.1μl和9.9μl FACS Buffer)，向每个待检测样本加入50μl SurfaceAntibody mix染液，将细胞悬液吹打混匀，置于冰上孵育30min；
6)孵育结束后向每个待检测样本加入l ml FACS Buffer离心，离心温度为4℃，转速为400g，时间为5min，弃上清；再向每个待检测样本加入l ml FACS Buffer重悬细胞，离心温度为4℃，转速为400g，时间为5min，弃上清；最后向每个待检测样本加入l ml FACSBuffer重悬细胞，离心温度为4℃，转速为400g，时间为5min，弃上清，用Fix and PermBuffer将500μM浓度的Ir染液配制为250nM浓度的Ir DNA标记染液(标记DNA的目的是为了在质谱流式上机过程中分辨细胞，计算细胞数量)，向每个待检测样本中加入200μl的250nM浓度的Ir DNA标记染液，重悬细胞，4℃冰箱孵育过夜。
(2)质谱流式染色(第二天进行胞内染色、上机)
1)备好需要用的移液枪、枪头、无菌离心管、流式管等，检查各实验仪器无故障后，从-20℃冰箱中取出Barcode mix染液，置于室温中使其融化，在制冰机中取冰放于冰盒内，从4℃冰箱取出10×Permeabilization Buffer、FACS Buffer，Fixation/Permeabilization Diluem，ixation/Permeabilization Concentrate、FoxP3质谱流式金属耦联细胞膜内标记抗体等试剂，置于冰上保存，提前打开离心机，温度调至4℃，转速为400g，时间为5min；
2)使用dd H20将10×Permeabilization Buffer稀释为1×PermeabilizationBuffer，配制FoxP3预固定液(每个待检测样本中加入100μl FoxP3预固定液，其中包括75μl的Fixation/Permea bilization Diluem试剂和25μl的Fixation/Permeabilization Concentrate试剂)；
3)向每个待检测标本中加入l mL 1×Permeabilization Buffer离心，离心温度为4℃，转速为800g，时间为5min，弃上清，再向每个待检测标本中加入l mL 1×Permeabilization Buffer重悬细胞后离心，离心温度为4℃，转速为800g，时间为5min，弃上清后向每个待检测样本中加入100μl FoxP3预固定液，重悬细胞，室温下孵育30min后向每个待检测标本中加入l mL 1×Permeabilization Buffer离心，离心温度为4℃，转速为800g，时间为5min，弃上清，再向每个待检测标本中加入l mL 1×PermeabilizationBuffer重悬细胞后离心，离心温度为4℃，转速为800g，时间为5min，弃上清；
4)将质谱流式检测所需的金属耦联细胞膜内标记抗体与FACS Buffer配制成Intracelluar Antibody mix染液(按照每个待检测样本抗体混合染液体积为105μl，包括1种抗体每种1.1μl共1.1μl和103.9μl FACS Buffer)，向每个待检测样本加入100μlIntracelluar Antibody mix染液，将细胞悬液吹打混匀，置于冰上孵育30min；
5)孵育结束后向每个待检测样本加入l mL FACS Buffer离心，离心温度为4℃，转速为800g，时间为5min，弃上清(如果需要多个待检测样本同时上机进行质谱流式检测，则需要提前配置Bareode mix染液以标记不同待检测样本，方便后期分析)，再向每个待检测样本加入l mL ddH20重悬细胞并转移至5ml流式管中，向原无菌离心管加入lml ddH20清洗离心管壁并转移至5ml流式管中；
6)待检测样本流式管离心，离心温度为4℃，转速为800g，时间为5min，弃上清，向每个待检测样本管加入l mL ddH20重悬细胞，吸取20μl细胞悬液，加入countstar计数板，细胞计数仪计算待检测样本细胞数量，准备质谱流式细胞仪上机。
2.5质谱流式细胞仪上机检测
(1)提前打开质谱流式细胞仪预热，进入开机程序；
(2)进行仪器调试及质量标准控制；
(3)质谱流式质控通过后，每个待检测样本各取1×106个细胞混合，并加入校准小球；
(4)设置检测通道名称(检测抗体名称以及相应耦联金属名称)、根据临床病历信息给数据分类命名、设置收集速度(300-500evens/s)及总收集细胞数(一般设置为3×105个)，上机收集原始数据，进行后续分析。
3.对质谱流式结果进行聚类分析
(1)原始数据预处理及质量控制：对数据进行标准化预处理，并去除批次等噪音影响，得到单个、活的、免疫细胞的有效数据进行下一步分析；
(2)聚类分析：选择上机方案中指定的信号标记，采用xshift聚类算法进行分析；当单个文件细胞数量过大时，对数据采用随机降采样的方法以减少细胞数并同时不加入人为操作偏差。通过高性能的聚类算法获得对样本的免疫细胞亚群的分类(cluster)；
(3)聚类结果统计学分析及可视化展示：采用基于t分布随机领域嵌入(t.distributed stochastic neighbor embedding，t.SNE)的降维可视化方法对所获得的聚类结果进行可视化，并获得可视化随机网络嵌入(visual stochastic networkembedding，viSNE)、热图(heatmap)(如图1所示)等可视化展示；同时，对各样本中每个亚群的百分比(Frequency)进行差异性分析，根据病人临床信息，对样本进行分组，采用双边t检验的方法确认不同组别之差异性表达的特征免疫亚群。
对免疫细胞进行聚类分析之后，再进一步对主要T细胞亚群(原始CD4+T细胞、CD4+中央记忆型T细胞、CD4+效应型记忆T细胞、CD4+效应T细胞、原始CD8+T细胞、CD8+中央记忆型T细胞、CD8+效应型记忆T细胞、CD8+效应T细胞、γδT细胞、双阴性T细胞、双阳性T细胞、自然杀伤T细胞)进行合并分类(图1)，细胞因子所在金属离子通道信息见表1。
根据免疫根据不同类别的患者为基于t检验P值小于0.05的差异免疫细胞比例，筛选出原始CD4+T细胞和中央记忆型T细胞在冠脉炎人群、冠心病人群、健康对照人群中存在差异(图2)。原始CD4+T细胞在正常健康人群中的比例是29.8％，在冠脉炎人群的中比例是12.2％，在冠心病人群中的比例是18.4％。根据t检验提示，原始CD4+T细胞聚类在冠脉炎人群的比例显著低于冠心病和正常对照，结果具有统计学意义(正常vs.冠脉炎P值<0.001,冠心病vs.冠脉炎P值＝0.041)。CD4+中央记忆型T细胞在正常健康人群中的比例是33.4％，在冠脉炎人群的中比例是40.3％，在冠心病人群中的比例是37.6％，中央记忆型T细胞聚类在冠脉炎人群的比例略高于冠心病和正常对照，具有统计学差异趋势。上述结果提示，根据原始CD4+T细胞和CD4+中央记忆型T细胞可以特异性得识别冠脉炎患者。
进一步根据细胞因子聚类热图(图1)，原始CD4+T细胞的免疫学特征是CD3+、CD4+、CD45RA+、CCR7+；CD4+中央记忆型T细胞的免疫学特征是CD3+、CD4+、CD45RA-、CCR7+；上述细胞因子表达值均>0。因此，上述CD3、CD4、CD45RA、CCR7四种免疫细胞标记可以特异性得识别冠脉炎患者。
表1进行质谱分析的细胞因子
实施例2通过流式细胞术得到8种细胞因子含量的诊断阈值
联合4种免疫细胞标记(CD3、CD4、CD45RA、CCR7)，基于youden指数选择受试者工作特征曲线(ROC)曲线最佳阈值点，截断点确定为具有以上4种免疫细胞标记的细胞在全血细胞中的比例为19.6％；若该人群具有以上4种免疫细胞标记的细胞比例低于19.6％为考虑诊断冠脉炎，否则为非冠脉炎。诊断效果显示曲线下面积为0.79(图3)，灵敏度70％，特异度为86％，阳性预测值为89％，阴性预测值为63％(表2)。
表2免疫细胞标记的诊断效果
冠脉炎 非冠脉炎 合计
符合诊断标准 16 7 23
不符合诊断标准 2 12 14
合计 18 19 37
实施例3利用本申请试剂盒进行免疫诊断
1.病例来源
本研究于2019年8月至2019年12月从中国医学科学院阜外医院收集冠脉炎、冠心病、正常对照患者外周抗凝血共37例。
2.实验方法
2.1试剂盒的组成
2.1.2试剂盒主要试剂与耗材的成分组成(1)人淋巴细胞分离液。
(2)无血清细胞培养液。
(3)生物素-IFN-γ检测抗体。
(4)HRP-链霉亲和素。
(5)AEC稀释液。
(6)AEC底物液。
(7)PVDF膜条板(ELISPOT板)：将包被抗体后的ELISPOT板晾干，加入干燥剂真空密封包装储存于4℃。
(8)无菌10×PBS：8g NaCl，0.2g KCL，3.63g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，定容至100mL，高压灭菌后于室温储存，使用时稀释10倍即1×PBS。
(9)胎牛血清(FBS)。
(10)PHA工作液：用500μL无菌1×PBS溶解PHA，混匀后分装保存于-20℃。
(11)阴性孔补充液：按照溶解抗原肽的平均DMSO或DMF浓度配制，用无血清培养基稀释，分装后保存于-20℃。
(12)抗原肽：用DMSO或DMF溶解后，加入30％的甘油，再按总体积1:100加入PMSF，充分混匀，分装保存于-80℃备用。
2.2操作步骤：
2.2.1人外周血单个核细胞(PBMC)分离(在超净工作台中无菌操作)
1.稀释血样：抽取患者的新鲜抗凝血3-5mL，用吸管转入15mL无菌离心管中，加入等体积(3-5mL)的无菌洗涤液(1×PBS)，吸管上下吹打混匀。
2.加分离液：取一新的无菌15mL离心管，加入与血样等体积(3-5mL)的人淋巴细胞分离液，然后用吸管将PBS稀释后的血样(6-10mL)沿管壁缓缓流下，平铺在分离液层的上面，尽量匀速缓慢加入，使血液和分离液呈明显上下两层，不要摇晃震荡试管。
3.离心：将离心管放置离心机中(水平或斜角)，平衡，2500转/分钟，离心20分钟。如果是低温离心机，可将温度设为25℃，加速度和减速度设为3。
4.吸取PBMC：离心后轻轻取出离心管，可见清晰的4个分层。从上到下，第一层为血浆层，第二层为环状乳白色PBMC细胞层，第三层为淋巴细胞分离液层，第四层为白细胞和红细胞层。用吸管吸取第二层的乳白色PBMC细胞层，转入新的15mL无菌离心管中，加入10mL的无菌洗涤液(1×PBS)，充分混匀，置离心机，1500转/分钟，室温离心10分钟。
5.细胞计数：一次性倒掉上清，加入800μL的无血清细胞培养液，重悬细胞沉淀，细胞计数，然后调整细胞浓度为2×106个/mL，每份标本只需1mL，置细胞培养箱保存备用。剩余的细胞原液也置细胞培养箱保存，以备出错后再用。
2.2.2人外周血单个核细胞(PBMC)细胞培养(在超净工作台中无菌操作)
1.活化预包被条板：本试剂盒的包装规格为11人份/110孔可拆条板，每份血样需要使用6个孔。计算当日待检标本数，按当日需要量提前从4℃冰箱拿出已包被好的PVDF膜条板，室温放置30分钟，然后每孔加200μL无血清细胞培养液活化8分钟，弃去孔内液体后使用。
2.加细胞悬液：从细胞培养箱中取出已制备好的PBMC细胞悬液(2×106个/mL)，用吸管上下吹打混匀，加入条板中：每份病人血样的PBMC加入6个孔中，100μL/孔(即：2×105个细胞/孔)，其中4个实验孔，1个阴性对照孔，1个阳性对照孔。
注意：如果病人的PBMC细胞比较少，至少要保证每个孔有1×105个细胞，参考值减半。
3.加抗原肽：每份血样检测6个孔，第1至第4孔中分别加入CD3抗原肽、CD4抗原肽、CD45RA抗原肽、CCR7抗原肽，20μL/孔，为实验孔；第5孔加入阴性孔补充液20μL，为阴性对照孔；第6孔作为阳性对照孔，加入PHA工作液20μL。
4.培养孵育：将条板加盖，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，孵育20-22小时。
2.2.3IFN-γ斑点检测
试剂准备：(在超净工作台中无菌操作)
1.稀释液(10％FBS-PBS)：取干净试管，将0.1mL的FBS加入0.9mL的1×PBS中，混匀，4℃保存备用，按当日需要量现配现用。
2.检测抗体(生物素-IFN-γ检测抗体工作液)：取干净试管，用稀释液(10％FBS-PBS)将生物素-IFN-γ检测抗体按1:250稀释，即为工作液，按当日需要量现配现用。
3.HRP-链霉亲和素工作液：取干净试管，用稀释液(10％FBS-PBS)将HRP-链霉亲和素按1:100稀释，即为工作液，按当日需要量现配现用。
4.AEC显色液：取干净试管，将AEC底物液与AEC稀释液按照1:50的比例配置显色液，室温避光保存和使用，按当日需要量临用前现配现用。
ELISPOT检测：(不需无菌操作)
1.裂解细胞：从细胞培养箱中取出ELISPOT条板，用力甩去细胞悬液，每孔加入200μL去离子水，4℃放置10分钟，用力甩弃去离子水，在吸水纸上拍干。
2.洗板：每孔加入200μL普通洗涤液(1×PBS)，静置1分钟，用力甩去液体，如此重复洗板5遍，最后一次甩去液体后在吸水纸上拍干。
3.加检测抗体：每孔加入100μL检测抗体(生物素-IFN-γ检测抗体工作液)，室温避光(20-25℃)孵育2小时。
4.洗板：甩去液体，每孔加入200μL普通洗涤液(1×PBS)，静置1分钟，用力甩去液体，如此重复洗板5遍，最后一次甩去液体后在吸水纸上拍干。
5.加HRP-链霉亲和素：每孔加入100μL HRP-链霉亲和素工作液，室温(20-25℃)避光孵育1小时。
6.洗板：甩去液体，每孔加入200μL普通洗涤液(1×PBS)，静置1分钟，用力甩去液体，如此重复洗板5遍，最后一次甩去液体后在吸水纸上拍干。
7.显色：每孔加入100μL AEC显色液(即用即配)，室温(20-25℃)避光静置25分钟。
8.终止显色：用力甩去液体，用去离子水洗涤PVDF板的正反面3-5遍，以终止显色，而后将条板置室温避光处，待自然晾干后装上板底座。
9.斑点计数：在正置光学显微镜下用低倍镜自行计数斑点。如果斑点数较多，实验者也可将晾干后的条板快递给本公司，用酶联免疫斑点分析仪进行拍照和斑点计数，获得生物样品中的细胞因子含量，以此为依据完成后续的诊断。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过飞行质谱流式细胞术筛选得到可特异性作为孤立性冠脉炎诊断的生物标志物的细胞因子——CD3、CD4、CD45RA或CCR7。利用上述细胞因子及其组合作为生物标志物进行诊断可以进一步地加强孤立性冠脉炎诊断结果的准确性。因而将上述细胞因子应用于孤立性冠脉炎诊断，可以更为及时准确地确诊孤立性冠脉炎患者，并及时对其提供有针对性的治疗方案。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.细胞因子作为生物标志物在制备诊断孤立性冠脉炎的产品中的应用，其特征在于，所述细胞因子为如下至少一个：CD3、CD4、CD45RA及CCR7。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括利用检测试剂检测所述细胞因子的含量；
优选地，所述细胞因子的含量的检测方法包括：ELISPOT技术或免疫印迹实验；
优选地，所述检测试剂为所述细胞因子的抗体、RNA探针或DNA探针；
优选地，所述抗体设置在固相载体上；
优选地，所述固相载体包括酶标板、膜载体或微球；
优选地，所述膜载体选自硝酸纤维素膜、PDVF膜或尼龙膜；
优选地，所述抗体为单克隆抗体；
优选地，所述产品包括试剂盒或电子预测装置。
3.一种用于诊断孤立性冠脉炎的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测细胞因子的含量的检测试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括CD3抗原肽、CD4抗原肽、CD45RA抗原肽或CCR7抗原肽中的一种或多种；
优选地，所述试剂盒还包括所述CD3抗原肽、所述CD4抗原肽、所述CD45RA抗原肽及所述CCR7抗原肽；
优选地，所述试剂盒进一步还包括：人淋巴细胞分离液、无血清细胞培养液、生物素-IFN-γ抗体、HRP-链霉亲和素、AEC稀释液、AEC底物液、无菌10×PBS、胎牛血清、植物凝集素工作液及阴性孔补充液；
优选地，所述试剂盒还包括：PVDF膜条板、无菌PCR管及无菌EP管；
其中，所述PVDF膜条板为已包被抗体的PVDF膜条板，所述抗体选自特异性识别如下至少一种抗原肽的抗体：所述CD3抗原肽、所述CD4抗原肽、所述CD45RA抗原肽及所述CCR7抗原肽；
优选地，所述PVDF膜条板为可拆条板，更优选地，每块所述PVDF膜条板有10-11排，每排有10-11个孔；
优选地，各抗原肽以液体形式存在；
优选地，所述液体为各所述抗原肽的DMSO溶液或DMF溶液；
优选地，所述液体中进一步包括甘油和PMSF；
优选地，按体积分数计，所述甘油的含量为30-35％；
优选地，按体积分数计，所述PMSF的含量为1-2％。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述植物凝集素工作液包括植物凝集素及溶解所述植物凝集素的无菌1×PBS组成，所述阴性孔补充液包括所述无血清细胞培养液及DMSO溶液或DMF溶液。
6.一种诊断孤立性冠脉炎的电子装置，其特征在于，所述电子装置包括：
诊断模块，被设置为根据细胞因子含量的检测结果进行孤立性冠脉炎诊断；
其中，所述细胞因子为如下至少一个：CD3、CD4、CD45RA或CCR7。
7.根据权利要求6所述的电子装置，其特征在于，所述电子装置还包括：
获取模块，被设置为获取生物样品；
检测模块，被设置为对所述生物样品中的所述细胞因子的含量进行检测，从而获得所述生物样品中的细胞因子含量；
优选地，所述生物样品为血浆样品。
8.根据权利要求7所述的电子装置，其特征在于，所述生物样品的获取模块为获取培养后的外周单个核细胞；
优选地，所述检测模块为ELISPOT检测模块，所述ELISPOT检测模块被设置为对在PVDF膜条板上培养后的所述外周单个核细胞中的所述细胞因子的含量进行ELISPOT检测，获得所述细胞因子含量；
优选地，所述获取模块包括：
样品处理模块，所述样品处理模块被设置为对所述血浆样品中的外周单个核细胞进行分离，得到外周单个核细胞悬液；
细胞培养模块，所述细胞培养模块被设置为在PVDF膜条板上对所述外周单个核细胞悬液进行细胞培养，获得所述外周单个核细胞；
优选地，所述样品处理模块和所述细胞培养模块处于无菌环境中。
9.根据权利要求8所述的电子装置，其特征在于，所述样品处理模块包括：
稀释模块，所述稀释模块被设置为对所述血浆样品进行稀释；
细胞分离模块，所述细胞分离模块被设置为利用人淋巴细胞分离液对稀释后的血浆样品进行离心分离，获得外周单个核细胞层；
洗涤模块，所述洗涤模块被设置为取离心后的所述外周单个核细胞层进行洗涤，离心获得外周单个核细胞；
重悬模块，所述重悬模块被设置为对洗涤后获得的所述外周单个核细胞进行重悬，并调整细胞浓度，得到所述外周单个核细胞悬液。
10.根据权利要求9所述的电子装置，其特征在于，所述细胞培养模块包括：
活化模块，所述活化模块被设置为活化所述PVDF膜条板；
PBMC细胞培养模块，所述PBMC细胞培养模块被设置为在活化后的所述PVDF膜条板上对所述外周单个核细胞悬液进行细胞培养。
11.根据权利要求8所述的电子装置，其特征在于，所述ELISPOT检测模块包括：
细胞裂解模块，所述细胞裂解模块被设置为对PVDF膜条板上细胞培养后的细胞进行裂解；
抗原抗体反应模块，所述抗原抗体反应模块被设置为对PVDF膜条板上各孔中裂解后的细胞进行抗原抗体反应；
计数模块，所述计数模块被设置为对进行抗原抗体反应后的PVDF膜条板上各孔进行显色反应，后进行斑点计数，获得所述细胞因子含量。
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