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CN117019248A - 一种微孔芯片与单细胞分析方法 - Google Patents

一种微孔芯片与单细胞分析方法 Download PDF

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CN117019248A
CN117019248A CN202311038737.8A CN202311038737A CN117019248A CN 117019248 A CN117019248 A CN 117019248A CN 202311038737 A CN202311038737 A CN 202311038737A CN 117019248 A CN117019248 A CN 117019248A
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CN
China
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single cell
microbeads
nucleic acid
chip
known base
Prior art date
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Pending
Application number
CN202311038737.8A
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English (en)
Inventor
刘炯
董灵
梁骞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Yuezhen Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Yuezhen Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Hangzhou Yuezhen Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Yuezhen Biotechnology Co ltd
Priority to CN202311038737.8A priority Critical patent/CN117019248A/zh
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
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Abstract

本发明公开了一种微孔芯片以及单细胞分析方法。微孔芯片上具有若干个双通穿透型微孔，微孔内用于加载待测样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠。单细胞分析方法，包括如下步骤：S1、将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠混合后加载到微孔芯片的微孔内；S2、对S1中的微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增，构建单细胞测序文库。本发明的微孔芯片以及单细胞分析方法能够应用于高通量单细胞多组学测序，能够一次性批量获得数十多万至上百万个单细胞的全长转录组、表观基因组、蛋白组等特异性组学信息。

Description

一种微孔芯片与单细胞分析方法
技术领域
本申请涉及基因测序技术领域，特别是涉及一种微孔芯片与单细胞分析方法。
背景技术
单细胞测序主要是依靠微流控或微孔系统，将单个细胞锁定到单独的反应空间，随后进行二代测序文库的构建，实现一次实验能得到几千到上万的细胞。以10×的微流控平台为例，当细胞投入量超过推荐上样量时，会出现一个液滴内同时存在两个甚至两个以上细胞的情况，导致同一液滴内的多个细胞无法在后续分析中被区分开来。基于此，为了控制每个液滴内只有一个细胞，必须严格控制细胞的上样浓度，但是这样又会造成大部分液滴内没有细胞，形成“空载”，大大降低了实验通量以及细胞利用率。同时以微流控为基础的测序平台细胞并不是平行进行实验的，批次效应问题比较显著，且存在设备昂贵、不易携带、测序成本高等缺点。
现有技术中，微孔单细胞测序方法的原理一般都是利用重力沉降捕获单个细胞与单个微珠到微孔内，微孔重力沉降的泊松分布特性使细胞的检测效率受到限制。部分数字PCR系统所采用的双通微孔阵列芯片基于毛细作用的液体吸收特性，能够规避重力沉降和泊松分布带来的低效性问题，但数字PCR系统使用的双通微孔阵列芯片的厚度与材料均不宜于直接应用到单细胞组学方法中，并且均匀的液体毛细作用会让微孔中含有多个微珠或多个细胞，无法直接进行单细胞分辨率组学数据的解析。
发明内容
基于此，有必要提供一种微孔芯片与单细胞分析方法。本发明的单细胞分析方法能够应用于高通量单细胞多组学测序，能够一次性批量获得数十多万至上百万个单细胞的全长转录组、表观基因组、蛋白组等特异性组学信息。本发明的单细胞分析方法能适用于新鲜、冷冻或包埋组织，不受细胞活性与状态的限制。
本申请一实施例提供了一种微孔芯片。
一种微孔芯片，所述微孔芯片上具有若干个双通穿透型微孔，所述微孔内用于加载待测样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠。
在其中一些实施例中，所述微孔芯片还满足下述条件中的至少一种：
(1)所述微孔的形状包括圆形、椭圆形、多边形中的一种或几种；
(2)所述微孔的孔径为10μm～1mm，优选地，所述微孔的孔径为20μm～100μm；
(3)所述微孔芯片整体上呈圆形、梯形或者矩形；
(4)所述微孔芯片的材质包括玻璃纤维、高分子聚合物、硅片中的任意一种；
(5)所述微孔芯片配套加载的微珠包括：聚合物微珠、磁性微珠、水凝胶微珠以及可降解聚合物微珠的任意一种；
(6)所述微孔芯片的外表面进行疏水处理，所述微孔的内壁进行亲水处理。
本申请一实施例还提供了一种单细胞分析方法。
一种单细胞分析方法，使用所述微孔芯片，包括如下步骤：
S1、将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠混合后加载到微孔芯片的微孔内；
S2、对S1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增，构建单细胞测序文库。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，还包括如下步骤：使用固定液对单细胞悬液或单细胞核悬液中的单细胞或细胞核进行固定处理。
在其中一些实施例中，所述固定液包括醛类固定液、醇类固定液、酸类固定液中的一种或几种。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，所述微孔芯片上的不同的所述微孔内加载有不同的待测样本。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子与单细胞或单细胞核杂交结合时，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为RNA或者DNA，对应地，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子包括核酸；
或者，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为蛋白，对应地，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子包括修饰在抗体上的核酸。
在其中一些实施例中，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为RNA或蛋白时，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子为已知碱基序列的单链寡核苷酸；单细胞或单细胞核内的原位标记对象为DNA时，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子为已知碱基序列的转座酶接头序列。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子上包括条件性可断裂位点，其中，所述条件性可断裂位点包括：dU碱基修饰、二硫键修饰、光敏断裂photocleavable linker以及限制性内切酶识别序列中的任意一种；
和/或，所述微珠与已知碱基序列核酸分子直接偶联的方式包括：基于羧基氨基的缩合酰化反应、基于biotin生物素及链霉亲和素的交联反应、酯键连接、二硫键连接、偶极相互作用中的任意一种。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠加载到微孔芯片的微孔内时，包括如下步骤：将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠通过毛细作用随着微孔芯片表面液体吸附到所述微孔中，其中，每个所述微孔内能够容纳多个微珠。
在其中一些实施例中，步骤S1中，待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液通过如下步骤获得：将待测样本的细胞系经过裂解液进行裂解反应，裂解预定时间后终止裂解，获得待测样本的单细胞核。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，对S1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增时，扩增方法包括多步PCR扩增法与多步连接酶连接法中的任意一种。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，扩增方法包括split-pool分段式PCR杂交延伸扩增和split-pool分段式连接酶连接延伸。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠加载到芯片之后，通过自然蒸发或者抽真空蒸发方式促进微孔芯片表面液体的蒸发。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，对S1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增时，包括如下步骤：对微孔芯片采用密封油进行封闭，通过恒温加热使单细胞或单细胞核内的原位标记对象释放出来，以与所述微珠上的已知碱基序列核酸分子杂交反应。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，扩增方法包括指数PCR扩增与线性PCR扩增的任意一种。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的所述单细胞测序文库包括单细胞转录组数据和/或染色质可及性基因组数据。
在其中一些实施例中，所述的单细胞分析方法还包括如下步骤：S3、对所述单细胞测序文库进行测序。
上述的微孔芯片能够应用于高通量单细胞多组学测序中，可提供高通量平行的单细胞测序，对设备要求简单、操作流程简便、易于携带。
上述单细胞分析方法中，通过在单细胞或单细胞核的原位标记对象上引入第一段细胞身份标签，将至少一个微珠和至少一个单细胞或单细胞核加载到微孔芯片，并使其通过毛细作用被均匀快速吸入到微孔芯片的微孔内，将微珠上的第二段细胞身份标签结合到单细胞或单细胞核的核酸中，进行核酸聚合与扩增反应。在微珠与单细胞或单细胞核加载到微孔芯片之后，可以通过自然蒸发、抽真空蒸发等方式促进微孔芯片表面液体的蒸发，从而添加新的反应试剂实现便捷的微孔内的多轮反应，同时使微孔间的反应隔间更加独立，减少分子污染。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
为了更完整地理解本申请及其有益效果，下面将结合附图来进行说明。其中，在下面的描述中相同的附图标号表示相同部分。
图1为本发明一实施例中实验的流程示意图；
图2为本发明一实施例中使用单细胞核悬液进行转录组实验的流程示意图；
图3为本发明一实施例中使用单细胞核悬液进行表观组实验的流程示意图；
图4为本发明一实施例中微珠和细胞核经过毛细作用被捕获在芯片微孔内的分布示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
在本发明的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本申请实施例提供一种微孔芯片以及单细胞分析方法，以解决传统技术中的单细胞测序实验通量低、细胞利用率低的问题；以及批次效应问题显著，不易携带、测序成本高的问题中的至少一种问题。本申请的单细胞分析方法能够用于高通量单细胞多组学测序，如用于单细胞转录组测序、染色质可及性测序用途，在测序时适用于新鲜、冷冻或包埋组织，不受细胞活性与状态的限制，能够一次性批量的获得数十万甚至上百万个单细胞的全长转录组、表观基因组、蛋白组等特异性组学信息。
一种微孔芯片，所述微孔芯片上具有若干个双通穿透型微孔。所述微孔内用于加载待测样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠。
在其中一些实施例中，所述微孔的形状包括圆形、椭圆形、多边形中的一种或几种。
在其中一些实施例中，所述微孔的孔径为10μm～1mm。优选地，所述微孔的孔径为20μm～100μm。更近一步优选地，所述微孔的孔径为40μm～60μm。具体地，可以根据单细胞或单细胞核、分子大小，以及微孔芯片表面微孔间距工艺调整或修饰的需要，选择不同的微孔形状或尺寸。
在其中一些实施例中，所述微孔芯片整体上呈圆形、梯形或者矩形。在使用时，可以利用对应的微孔芯片来进行大规模超高通量单细胞或单细胞核分析。
在其中一些实施例中，所述微孔芯片的材质包括玻璃纤维、高分子聚合物、硅片中的任意一种。具体地，可根据微孔芯片尺寸和厚度对应的双通刻蚀工艺需求，选择不同的材质进行微孔芯片制备。
在其中一些实施例中，所述微孔芯片配套加载的微珠包括聚合物微珠、磁性微珠、水凝胶微珠以及可降解聚合物微珠的任意一种。具体地，可以根据需求将核酸分子交联连接在微珠表面或者聚合在微珠的内部，微珠直径尺寸可以根据微孔尺寸适应性变动。
在其中一些实施例中，所述微孔芯片的外表面进行疏水处理，所述微孔的内壁进行亲水处理。
上述的微孔芯片能够应用于高通量单细胞多组学测序中，可提供高通量平行的单细胞测序，对设备要求简单、操作流程简便、易于携带。
本申请一实施例还提供了一种单细胞分析方法。
一种单细胞分析方法，使用所述微孔芯片，包括如下步骤：
S1、将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠混合后加载到微孔芯片的微孔内；
S2、对S1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增，构建单细胞测序文库。
在其中一些实施例中，步骤S1中，将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠混合时，具体包括如下步骤：参见图1所示，在多孔板的不同孔中加入不同的已知碱基序列的核酸分子或蛋白，同一个孔内具有相同的已知碱基序列的核酸分子或蛋白，可以实现在单细胞或者单细胞核内部原位标记对象进行RNA反转录或者表观基因组打断的同时，给单细胞或者单细胞核连接上已知碱基序列核酸分子作为第一段细胞身份标签，便于在后续分析过程中快速准确确定来自不同样本的单细胞或者单细胞核。其中，多孔板可以是96孔板。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，还包括如下步骤：使用固定液对单细胞悬液或单细胞核悬液中的单细胞或细胞核进行固定处理。需要说明的是，在染色质可及性测序中，可以不对细胞核进行固定处理。
在其中一些实施例中，所述固定液包括醛类固定液、醇类固定液、酸类固定液中的一种或几种。
在其中一些实施例中，醛类固定液包括如多聚甲醛。
在其中一些实施例中，醇类固定液包括乙醇。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，所述微孔芯片上的不同的所述微孔内加载有不同的待测样本。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子与单细胞或单细胞核杂交结合时，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为RNA或者DNA，对应地，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子包括核酸。例如，微珠表面已知碱基序列的核酸分子携带oligo-dT可以与处理后的单细胞或单细胞核中的RNA杂交结合；微珠表面已知碱基序列的核酸分子携带的固定杂交序列可以与处理后的单细胞或单细胞核中的DNA杂交结合。
在其中一些实施例中，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为蛋白，对应地，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子包括修饰在抗体上的核酸。
在其中一些实施例中，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为RNA或蛋白时，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子为已知碱基序列的单链寡核苷酸。单细胞或单细胞核内的原位标记对象为DNA时，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子为已知碱基序列的转座酶接头序列。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子上包括条件性可断裂位点，其中，所述条件性可断裂位点包括：dU碱基修饰、二硫键修饰、光敏断裂photocleavable linker以及限制性内切酶识别序列中的任意一种；具体地，可根据需要选择不同的断裂方式，便于核酸分子释放到微孔中进行反应。
在其中一些实施例中，所述微珠与已知碱基序列核酸分子直接偶联的方式包括：基于羧基氨基的缩合酰化反应、基于biotin生物素及链霉亲和素的交联反应、酯键连接、二硫键连接、偶极相互作用中的任意一种。具体地，可根据需要选择不同的偶联方式，便于核酸分子释放到微孔中进行反应。
例如，在其中一个具体实施例中，微珠表面包含羧基修饰，已知碱基序列的核酸分子包含氨基修饰，条件性可断裂位点包括dU碱基修饰。通过酰化反应使已知碱基序列的核酸分子连接到微珠表面，并通过dU碱基的切割使核酸分子释放到微孔液体环境中进行反应。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S1中，将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠加载到微孔芯片的微孔内时，包括如下步骤：待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠通过毛细作用随着微孔芯片表面液体吸附到所述微孔中，而非重力沉降与泊松分布。其中，每个所述微孔内能够容纳多个微珠。
在其中一些实施例中，步骤S1中，待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液通过如下步骤获得：将待测样本的细胞系经过裂解液进行裂解反应，裂解预定时间后终止裂解，获得待测样本的单细胞核。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，对S1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增时，扩增方法包括多步PCR扩增法与多步连接酶连接法中的任意一种。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，扩增方法包括split-pool分段式PCR杂交延伸扩增和split-pool分段式连接酶连接延伸。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠加载到芯片之后，通过自然蒸发或者抽真空蒸发方式促进微孔芯片表面液体的蒸发。从而添加新的反应试剂实现便捷的微孔内的多轮反应，同时使微孔间的反应隔间更加独立，减少分子污染。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，对S1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增时，包括如下步骤：对微孔芯片采用密封油进行封闭，通过恒温加热使单细胞或单细胞核内的原位标记对象释放出来，以与所述微珠上的已知碱基序列核酸分子杂交反应。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤S2中，扩增方法包括指数PCR扩增与线性PCR扩增的任意一种。
在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的所述单细胞测序文库包括单细胞转录组数据和/或染色质可及性基因组数据。
在其中一些实施例中，所述的单细胞分析方法还包括如下步骤：S3、对所述单细胞测序文库进行测序。
在其中一些实施例中，步骤S1中，对于转录组测序文库构建时，已知碱基序列的核酸分子为寡核苷酸序列，其可以随机的跟核酸的任意区域进行杂交配对，随后进行无偏差的核酸全长区域的反转录反应；用于转录组测序文库的微珠连接的核酸分子的引物序列包括四个部分：文库接头序列、由三段96种固定序列组合形成的细胞标签、分子标签(UMI，独特分子标识码)和Poly(dT)序列。其中文库接头序列用于后续的上机测序；细胞核上带寡核苷酸细胞标签序列(第一段细胞身份标签)和微珠上的三段96种固定序列组合形成的细胞标签(第二段细胞身份标签)共同组合用以识别不同的细胞；UMI是由随机碱基组成的一段序列，每个DNA分子都含有一个独特的UMI，用以识别混合测序时区分不同的DNA分子；Poly(dT)序列则是用于捕获含有polyA尾的cDNA分子。
在其中一些实施例中，步骤S1中，对于表观组测序文库构建时，已知碱基序列的核酸分子使用含有细胞身份标签序列的转座酶接头序列，进行染色质开放区域的打断；用于表观组测序文库的微珠连接的引物序列包括四个部分：文库接头序列、由三段96种固定序列组合形成的细胞标签、UMI和转座酶接头序列1。其中文库接头序列用于后续的上机测序；细胞核上带寡核苷酸细胞标签序列(第一段细胞身份标签)和微珠上的细胞身份标签序列(第二段细胞身份标签)共同组合用以识别不同的细胞；UMI用以识别混合测序时区分不同的DNA分子；转座酶接头序列1则是用于捕获转座酶打断的DNA序列。
在其中一些实施例中，步骤S1中，将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠混合时，采取“分散-合并-分散”的split-pool策略实现多段核酸标记的微珠制备，具体包括如下步骤：
设计已知碱基序列的核酸分子，将已知碱基序列的核酸分子分成三段，相邻两段之间设置有PCR杂交接头序列，其中5’端开始的第一段包括氨基修饰、固定文库接头序列和部分细胞身份标签序列。对于转录组测序文库构建时而言，3’端含有部分细胞标签序列、分子标签序列、多聚T尾；对于表观组测序文库构建而言，3’端含有部分细胞标签序列、分子标签序列、转座酶接头序列2。其中所有序列中属于细胞标签序列部分均设计预定数量X种序列，每种独立放置；第一段序列5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基。将等量的羧基修饰微珠分别与X种第一段序列耦联，然后收集获得X种带修饰的微珠，混合均匀后，再均分为X等份，与X种第二段序列混合后进行PCR序列延伸，然后再均分为X等份，与X种第三段序列混合后进行PCR序列延伸，然后变性解链获得具有X3种单链寡核苷酸修饰的微珠，即X3种微珠。
实施例1
本实施例提供了一种单细胞分析方法，使用上述的微孔芯片。
一种单细胞分析方法，包括如下步骤。
(1)样品准备：按照图1所示方法流程，使用人293T细胞系和鼠3T3细胞系，进行单细胞转录组测序文库构建，文库结构构建主要流程如图2所示。
将消化下来的人293T细胞系和鼠3T3细胞系分别用1×PBS溶液清洗一遍，再分别用1mL含有0.1％ IGEPAL CA-630的RSBT洗液的裂解液重悬，置于冰上裂解3min，加入5mLRSBT洗液终止裂解反应，获得人293T细胞核与鼠3T3细胞核。其中，RSBT洗液包括pH值7.5的10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.1％ Tween-20以及1％ RNA酶抑制剂。
采取“分散-合并-分散”的split-pool策略实现多段核酸标记的微珠的制备，具体包括如下步骤：设计已知碱基序列的核酸分子，将已知碱基序列的核酸分子(作为第二段细胞身份标签)分成三段，相邻两段之间设置有PCR杂交接头序列，其中5’端开始的第一段包括氨基修饰、固定文库接头序列(图2中表示为：文库接头序列2)和部分细胞身份标签序列(图2中表示为：细胞标签2)。对于转录组测序文库构建时而言，3’端含有部分细胞标签序列、分子标签序列、多聚T尾，参见图2所示；对于表观组测序文库构建而言，3’端含有部分细胞标签序列、分子标签序列、转座酶接头序列2，参见图3所示。其中所有序列中属于细胞标签序列部分均设计96种序列，每种独立放置；第一段序列5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基。将等量的羧基修饰微珠分别与96种第一段序列耦联，然后收集获得96种带修饰的微珠，混合均匀后，再均分为96等份，与96种第二段序列混合后进行PCR序列延伸，然后再均分为96等份，与96种第三段序列混合后进行PCR序列延伸，然后变性解链获得具有884736种单链寡核苷酸修饰的微珠，即884736种含有已知碱基序列的核酸分子的微珠。
(2)反转录：利用4％ PFA对步骤(1)制备得到的人293T细胞核与鼠3T3细胞核分别进行固定，固定后分别用PBST重悬，随后分别加入含反转录酶、反转录反应缓冲液、dNTPs、反转录随机引物、RNA酶抑制剂、10％TritonX-10、50％ PEG8000的反转录试剂，混合均匀后，均分到96孔板中进行反转录反应。反转录反应结束后，96孔中分别加入10μL 40mMEDTA、37℃孵育15min以终止反转录反应，随后用3×SSC洗涤3次，PBS洗涤1次。
(3)外切：向步骤(2)洗涤后的反转录反应后的反应产物中加入含有EXO I外切酶、外切酶反应缓冲液、RNA酶抑制剂的外切酶试剂，置于37℃反应30min进行外切以清除多余的随机引物，随后用3×SSC洗涤3次，PBS洗涤1次。
(4)连接捕获接头：向步骤(3)洗涤后的外切产物中加入含有末端转移酶、末端转移酶反应缓冲液、RNA酶抑制剂、dATP的反应体系中，置于37℃反应30min，反应结束后用PBST洗涤3次。
(5)扩增反应：选择六边形双通型的微孔芯片，微孔芯片的厚度为800μm，微孔芯片的对角线长度为60μm，微孔芯片上的微孔间距为15μm。取步骤(4)制备得到的5μL混合好的293T细胞核与鼠3T3细胞核(约400万/mL)重悬于约3万分子标记的微珠中，再加入1μL P7接头引物和5μL 2×高保真聚合酶，混匀后加载到微孔芯片上，微珠和细胞核的捕获分布如图4所示，微孔芯片内细胞核和微珠落孔率大于70％。随后在第一次加样后的微孔芯片的反面均匀加入含有恒温聚合酶、RNA酶H、USER酶和高保真聚合酶的扩增体系，将微孔芯片竖直放置在离心管中，加入密封油封住微孔使各个微孔形成单独的反应空间，再将微孔芯片置于PCR热循环仪内进行预扩增反应，参见图1所示。
(6)收集液体、纯化：步骤(5)预扩增反应完毕后，通过多次离心将微孔芯片中的液体和微珠充分收集下来，收集的液体和微珠置于磁力架上，吸取上清液转移至新的反应管中。用移液器量取上清液总体积V1，随后加入DNA Clean Beads纯化磁珠，纯化磁珠加入量为1.5倍V1，进行纯化获得cDNA溶液。
(7)测序文库扩增：将步骤(6)获得的cDNA溶液加入到含有标签引物的P5、P7接头引物以及高保真聚合酶的扩增体系中进行扩增，获得带有index的测序文库，随后利用DNAClean Beads纯化磁珠纯化，获得测序文库，使用Qubit 3.0荧光剂测定文库浓度，置于-20℃保存。
(8)对步骤(7)得到的测序文库进行测序。
实施例2
本实施例提供了一种单细胞分析方法，使用上述的微孔芯片。
一种单细胞分析方法，包括如下步骤。
(1)样品、试剂准备：按照图1所示方法流程，使用人293T细胞系和鼠3T3细胞系，进行单细胞染色质可及性表观基因组测序文库构建，文库结构构建主要流程如图2所示。
将含有转座酶包埋识别固定序列(图3中表示为：文库接头序列1)和细胞身份标签序列(作为第一段细胞身份标签，图3中表示为：细胞标签1，其包括384种组合)的引物置于PCR仪中95℃2min并以0.1℃/秒降温速度降至25℃，用无酶水稀释成后分装至多个96孔板中，再加入含有Tn5转座酶、耦联缓冲液以及稀释缓冲液的混合试剂，充分混匀，30℃孵育1h，形成引物工作液中，孵育后于-20℃冰箱保存，备用。
将消化下来的人293T细胞系和鼠3T3细胞系分别用1×PBS溶液清洗一遍，再分别用1mL含有0.1％ IGEPAL CA-630的RSBT洗液的裂解液重悬，置于冰上裂解3min，分别加入5mL RSBT洗液终止裂解反应，获得人293T细胞核与鼠3T3细胞核，备用。其中，RSBT洗液包括pH值7.5的10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.1％ Tween-20以及1％ RNA酶抑制剂。
(2)转座酶切反应：将混合好的人293T细胞核与鼠3T3细胞核平均分配至96孔板中，随后向96孔板的每个孔中加入包含步骤(1)中-20℃保存的引物工作液、2×酶切反应液、1％洋地黄皂苷、10％ Tween-20和1×PBS的酶切体系，充分混匀后置于55℃恒温反应半小时，反应完成后取出96孔板，置于冰上5min终止酶切反应，用排枪收集96孔板的细胞，500g/5min离心，随后用RSBT洗液洗两遍。其中，RSBT洗液包括pH值7.5的10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.1％ Tween-20以及1％ RNA酶抑制剂。
(3)释放酶切片段：选择六边形双通型的微孔芯片，微孔芯片的厚度为800μm，对角线长度为60μm，微孔芯片的微孔间距为15μm。取5μL步骤(2)洗涤后的细胞核(约400万/mL)重悬于约3万分子标记的磁珠中，再加入7μL50mM EDTA和5μL 2×高保真聚合酶，混匀后加载到微孔芯片上，使微孔芯片内细胞核和微珠落孔率大于70％，将微孔芯片竖直放置在离心管中，扣紧管盖，随后将离心管置于50℃恒温反应30min，释放酶切打断的基因组片段，将微孔芯片置于PCR热循环仪内进行扩增反应。
(4)片段释放及扩增反应：取3-4万分子标记的微珠，用1×PBS清洗两遍后置于冰上备用。将步骤(3)酶切后的细胞密度调整至500万/mL后，取4μL酶切后的细胞重悬于清洗后的微珠中形成混合体系，取14μL配置好的混合体系吹匀，用枪头迅速均匀地加载到微孔芯片上，用枪头轻刮表面待液体完全吸收，用真空泵轻轻抽取微孔芯片表面的液体，使微孔芯片的微孔表面液体呈凹液面，将微孔芯片至于离心管中扣紧管盖后置于50℃恒温反应30min，释放酶切打断的基因组片段。将离心管内的微孔芯片取出，在微孔芯片第一次加样的反面均匀加入扩增试剂，用枪头轻刮表面待液体完全吸收，将微孔芯片竖直放置在新的离心管中，加入密封油封住微孔使各个微孔形成单独的反应空间，再将微孔芯片置于PCR热循环仪内进行预扩增反应，参见图1所示。
(5)收集液体、纯化：步骤(4)预扩增反应完毕后，通过多次离心将微孔芯片中的液体和微珠充分收集下来，收集的液体和微珠置于磁力架上，吸取上清液转移至新的反应管中，用移液器量取上清液总体积V2，随后加入DNA Clean Beads纯化磁珠，纯化磁珠加入量为1.5倍V2，进行纯化获得cDNA溶液。
(6)测序文库扩增：将步骤(5)获得的cDNA溶液加入到含有标签引物的P5、P7接头引物以及高保真聚合酶的扩增体系中进行扩增反应，获得带有index的测序文库，随后利用DNAClean Beads纯化磁珠纯化，获得测序文库，使用Qubit 3.0荧光剂测定文库浓度，置于-20℃保存。
(7)对步骤(6)得到的测序文库进行测序。
综上所述，本发明的单细胞分析方法中，通过在单细胞或单细胞核的原位标记对象上引入第一段细胞身份标签，将至少一个微珠和至少一个单细胞或单细胞核加载到微孔芯片，并使其通过毛细作用被均匀快速吸入到微孔芯片的微孔内，将微珠上的第二段细胞身份标签结合到单细胞或单细胞核的核酸中，进行核酸聚合与扩增反应。本发明利用单细胞或单细胞核原位标记和微孔芯片的毛细作用快速高效的对大量单细胞进行捕获隔离，随后对单细胞的遗传信息进行一步法的扩增，构建测序文库，再进行测序，实现在单细胞水平高通量的检测多组学的遗传信息。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一种微孔芯片，其特征在于，所述微孔芯片上具有若干个双通穿透型微孔，所述微孔内用于加载待测样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠。
2.根据权利要求1所述的微孔芯片，其特征在于，所述微孔芯片还满足下述条件中的至少一种：
(1)所述微孔的形状包括圆形、椭圆形、多边形中的一种或几种；
(2)所述微孔的孔径为10μm～1mm，优选地，所述微孔的孔径为20μm～100μm；
(3)所述微孔芯片整体上呈圆形、椭圆形、梯形或者矩形；
(4)所述微孔芯片的材质包括玻璃纤维、高分子聚合物、硅片中的任意一种；
(5)所述微孔芯片配套加载的微珠包括：聚合物微珠、磁性微珠、水凝胶微珠以及可降解聚合物微珠的任意一种；
(6)所述微孔芯片的外表面进行疏水处理，所述微孔的内壁进行亲水处理。
3.一种单细胞分析方法，其特征在于，使用权利要求1～2任意一项所述的微孔芯片，包括如下步骤：
S1、将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠混合后加载到微孔芯片的微孔内；
S2、对S1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增，构建单细胞测序文库。
4.根据权利要求3所述的单细胞分析方法，其特征在于，步骤S1中，还包括如下步骤：使用固定液对单细胞悬液或单细胞核悬液中的单细胞或细胞核进行固定处理。
5.根据权利要求3所述的单细胞分析方法，其特征在于，步骤S1中，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子与单细胞或单细胞核杂交结合时，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为RNA或者DNA，对应地，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子包括核酸；
或者，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为蛋白，对应地，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子包括修饰在抗体上的核酸。
6.根据权利要求5所述的单细胞分析方法，其特征在于，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为RNA或蛋白时，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子为已知碱基序列的单链寡核苷酸；单细胞或单细胞核内的原位标记对象为DNA时，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子为已知碱基序列的转座酶接头序列。
7.根据权利要求3～6任意一项所述的单细胞分析方法，其特征在于，步骤S1中，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子上包括条件性可断裂位点，其中，所述条件性可断裂位点包括：dU碱基修饰、二硫键修饰、光敏断裂photocleavable linker以及限制性内切酶识别序列中的任意一种；
和/或，所述微珠与已知碱基序列核酸分子直接偶联的方式包括：基于羧基氨基的缩合酰化反应、基于biotin生物素及链霉亲和素的交联反应、酯键连接、二硫键连接、偶极相互作用中的任意一种。
8.根据权利要求3～6任意一项所述的单细胞分析方法，其特征在于，步骤S1中，将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠混合后加载到微孔芯片的微孔内时，包括如下步骤：待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠通过毛细作用随着微孔芯片表面液体吸附到各个所述微孔中，其中，每个所述微孔内能够容纳多个微珠。
9.根据权利要求3～6任意一项所述的单细胞分析方法，其特征在于，步骤S1中，待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液通过如下步骤获得：将待测样本的细胞系经过裂解液进行裂解反应，裂解预定时间后终止裂解，获得待测样本的单细胞核。
10.根据权利要求3～6任意一项所述的单细胞分析方法，其特征在于，步骤S2中，将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠加载到芯片之后，通过自然蒸发或者抽真空蒸发方式促进微孔芯片表面液体的蒸发。
11.根据权利要求3～6任意一项所述的单细胞分析方法，其特征在于，步骤S2中，对S1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增时，包括如下步骤：对微孔芯片采用密封油进行封闭，通过恒温加热使单细胞或单细胞核内的原位标记对象释放出来，以与所述微珠上的已知碱基序列核酸分子杂交反应。
12.根据权利要求3～6任意一项所述的单细胞分析方法，其特征在于，所述单细胞测序文库包括单细胞转录组数据和/或染色质可及性基因组数据。
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Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309822B1 (en) * 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
CN1407914A (zh) * 1999-12-06 2003-04-02 罗伊斯技术有限公司 用于结合靶分子的装置
US20110237445A1 (en) * 2008-10-10 2011-09-29 Picovitro Ab Genetic analysis in microwells
CN104302400A (zh) * 2012-03-16 2015-01-21 生命技术公司 用于容纳生物样品的系统和方法
US20160209319A1 (en) * 2015-01-15 2016-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and apparatus for in vitro single-cell identification and recovery
CN106498040A (zh) * 2016-10-12 2017-03-15 浙江大学 一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法
US20180304262A1 (en) * 2015-02-03 2018-10-25 Hitachi, Ltd. Flow cell device for single cell analysis, and single cell analysis device
US20200348308A1 (en) * 2017-10-31 2020-11-05 Encodia, Inc. Kits for analysis using nucleic acid encoding and/or label
CN112961902A (zh) * 2021-02-26 2021-06-15 浙江大学 一种对大量样本进行标记的dna条形码标记方法
CN113106150A (zh) * 2021-05-12 2021-07-13 浙江大学 一种超高通量单细胞测序方法
CN115461473A (zh) * 2020-02-20 2022-12-09 加利福尼亚大学董事会 空间分辨单细胞rna测序方法
CN116024307A (zh) * 2023-02-20 2023-04-28 北京寻因生物科技有限公司 一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法及测序方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309822B1 (en) * 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
CN1407914A (zh) * 1999-12-06 2003-04-02 罗伊斯技术有限公司 用于结合靶分子的装置
US20110237445A1 (en) * 2008-10-10 2011-09-29 Picovitro Ab Genetic analysis in microwells
CN104302400A (zh) * 2012-03-16 2015-01-21 生命技术公司 用于容纳生物样品的系统和方法
US20160209319A1 (en) * 2015-01-15 2016-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and apparatus for in vitro single-cell identification and recovery
US20180304262A1 (en) * 2015-02-03 2018-10-25 Hitachi, Ltd. Flow cell device for single cell analysis, and single cell analysis device
CN106498040A (zh) * 2016-10-12 2017-03-15 浙江大学 一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法
US20200348308A1 (en) * 2017-10-31 2020-11-05 Encodia, Inc. Kits for analysis using nucleic acid encoding and/or label
CN115461473A (zh) * 2020-02-20 2022-12-09 加利福尼亚大学董事会 空间分辨单细胞rna测序方法
CN112961902A (zh) * 2021-02-26 2021-06-15 浙江大学 一种对大量样本进行标记的dna条形码标记方法
CN113106150A (zh) * 2021-05-12 2021-07-13 浙江大学 一种超高通量单细胞测序方法
CN116024307A (zh) * 2023-02-20 2023-04-28 北京寻因生物科技有限公司 一种含组织位置信息的单细胞文库构建方法及测序方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KHODAKOV, D: "DNA capture-probe based separation of double-stranded polymerase chain reaction amplification products in poly(dimethylsiloxane) microfluidic channels", BIOMICROFLUIDICS, vol. 6, no. 2, 30 June 2012 (2012-06-30) *
陈春燕;魏娟;蒋康;刘炯;万海军: "家族性腺瘤性息肉病家系的APC基因突变分析", 医学研究生学报, vol. 35, no. 12, 30 September 2022 (2022-09-30), pages 1279 - 1282 *
马丹: "温度敏感性PNIPAAm-g-PDMS智能表面的制备、性能研究及在细胞培养中的应用", 中国博士学位论文全文数据库基础科学辑, no. 2011, 15 July 2011 (2011-07-15), pages 006 - 74 *

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