CN117004551A - 一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由新型的扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法,属于干细胞和再生医学领域。本发明通过使用LY294002抑制PI3K信号以促进扩展性多能干细胞向定型内胚层分化;使用TGF‑β抑制剂SB431542进一步促进扩展性多能干细胞来源的内胚层细胞向胰腺前体细胞的分化;同时采用EGF与Nicotinamide联合处理提高胰腺前体细胞分化效率,并最终分化产生胰岛β细胞。本发明为胰岛β细胞定向分化提供了一种新的种子细胞选择。
Description
技术领域
本发明属于干细胞和再生医学领域,涉及一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法。
背景技术
糖尿病是由位于胰腺中的分泌胰岛素的胰岛β细胞发生功能障碍或进行性损失引起的代谢类疾病,表现为异常的高血糖症状,通常会引发一系列并发症,包括心血管疾病、中风等,严重时会危害生命。目前针对糖尿病的治疗方法包括胰岛素注射、使用胰岛素增敏剂以及胰岛移植,能够缓解胰岛素抵抗和高血糖症状。然而,现有手段均不能逆转糖尿病的发生,而胰岛移植受限于供体的短缺以及免疫排斥反应。人类多能干细胞(Pluripotentstem cell,PSC),具有自我更新能力和多向分化潜能,能够在体外大规模生产特定类型的细胞,包括胰岛β细胞和糖尿病其他相关细胞,在糖尿病治疗方面展现出广阔的应用前景。
基于胰腺发育过程中关键性的谱系特异性基因的表达模式,通过连续补充小分子和生长因子进行模拟,人多能干细胞,包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞,能够从多能性阶段向胰腺谱系发展,最终被导向为胰岛β细胞的命运。在体外分化过程中,多能干细胞首先被诱导分化为定型内胚层细胞,随后分化产生胰腺前体细胞,进一步经过胰腺内分泌祖细胞阶段,最终产生分泌胰岛素的胰岛β细胞。然而,目前胚胎干细胞和诱导多能干细胞定向诱导为胰岛β细胞分化方案不够高效,不同细胞系之间分化差异大,分化获得的胰岛β细胞功能成熟度也较低。
2017年,Yang等人通过筛选激活OCT4远端增强子和抑制对于多能干细胞自我更新不可或缺的TGF-β信号的小分子组合,建立了具一类新型的、有胚胎和胚外双向发育潜力的扩展性多能干细胞(Extended pluripotent stem cell,EPSC)。2020年Zheng等人进一步建立了成分明确的扩展性多能干细胞构建以及培养体系。扩展性多能干细胞具有与其他多能性状态细胞不同的分子特征,具有更广阔的发育潜能,为细胞替代治疗提供了一种新的细胞来源,在再生医学上展现出巨大的应用前景。扩展性多能干细胞能否作为胰岛β细胞分化的种子细胞来源是未知的,需要进一步探索。
发明内容
基于上述问题,本发明的目的在于提供一种扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞及胰岛细胞的培养基组合和方法,将扩展性多能干细胞EPSC依次向定型内胚层,胰腺前体细胞以及胰岛β细胞进行诱导分化。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的培养基组合,包含下述培养基中的至少一种:
(1)诱导人扩展多能干细胞向定型内胚层细胞(Definitive Endoderm,DE)分化的定型内胚层第一阶段培养基、定型内胚层第二阶段培养基。所述的定型内胚层第一阶段培养基中添加了LY294002,其浓度优选为2.5-10μM。
(2)诱导定型内胚层细胞向原始肠管细胞(Primitive Gut Tube,PGT)分化的原始肠管细胞培养基。所述的原始肠管细胞培养基中添加了SB431542,其浓度优选为2.5-10μM。
(3)诱导原始肠管细胞向胰腺前体细胞第一阶段(Pancreatic Progenitor1,PP1)分化的胰腺前体细胞第一阶段(PP1)培养基。
(4)诱导胰腺前体细胞第一阶段(PP1)向胰腺前体细胞第二阶段(PancreaticProgenitor2,PP2)分化的胰腺前体细胞第二阶段(PP2)培养基。所述的胰腺前体细胞第二阶段培养基中添加了表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)和烟酰胺(Nicotinamide),表皮生长因子和烟酰胺的浓度分别优选为25-100ng/mL、5-20mM。
(5)诱导胰腺前体细胞向胰腺内分泌祖细胞(Endocrine Progenitor,EP)分化的胰腺内分泌祖细胞分化培养基。
(6)诱导胰腺内分泌祖细胞(EP)向不成熟胰岛β细胞分化的不成熟胰岛β细胞阶段1培养基、不成熟胰岛β细胞阶段2培养基。
(7)诱导不成熟的胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化的成熟胰岛β细胞分化培养基。
进一步地,一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的培养基组合,包含下述培养基中的至少一种:
(1)诱导人扩展多能干细胞向定型内胚层细胞(Definitive Endoderm,DE)分化的定型内胚层第一阶段培养基、定型内胚层第二阶段培养基。
所述的定型内胚层第一阶段培养基的组成为:将IMDM和F12培养基按体积比1:1混合作为基础培养基,添加以下浓度的成分:2g/L牛血清白蛋白(BSA)、1%(体积比)的不含维生素A的B27、100ng/mL Activin A、2.5μM CHIR99021、5μM LY294002,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍,如2g/L BSA上下浮动2倍为1-4g/L BSA、1% B27上下浮动2倍为0.5-2% B27。
所述的定型内胚层第二阶段培养基的组成为:将IMDM和F12培养基1:1混合作为基础培养基,添加以下浓度的成分:2g/L牛血清白蛋白、1%(体积比)的不含维生素A的B27、100ng/mL Activin A,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍。
(2)诱导定型内胚层细胞向原始肠管细胞(Primitive Gut Tube,PGT)分化的原始肠管细胞培养基。
所述的原始肠管细胞培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:5g/LBSA、1.5g/L碳酸氢钠(NaHCO3)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(GlutaMAX)、10mM葡萄糖、0.25mM的维生素C、50ng/mL角质细胞生长因子(Keratinocyte GrowthFactor,KGF)、1-2μM WNT信号通路抑制剂、5μM SB431542,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍。
(3)诱导原始肠管细胞向胰腺前体细胞第一阶段(Pancreatic Progenitor 1,PP1)分化的胰腺前体细胞第一阶段(PP1)培养基。
所述的胰腺前体细胞第一阶段培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/L BSA、2.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、10mM葡萄糖、1%(体积比)的胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂(ITS-X)、0.25mM的维生素C、50ng/mL KGF、0.25μMSANT1、100nM TTNPB、500nM Phorbol 12,13-dibutyrate(PDBu)、200nM LDN193189、1-2μMWNT信号通路抑制剂,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍。
(4)诱导胰腺前体细胞第一阶段(PP1)向胰腺前体细胞第二阶段(PancreaticProgenitor2,PP2)分化的胰腺前体细胞第二阶段(PP2)培养基。
所述的胰腺前体细胞第二阶段培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/LBSA、2.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、10mM葡萄糖、1%(体积比)ITS-X、0.25mM的维生素C、2ng/mL KGF、0.25μM SANT1、10nM TTNPB、250nM PDBu、400nMLDN193189、1-2μM WNT信号通路抑制剂、50ng/mL表皮生长因子(Epidermal GrowthFactor,EGF)、10mM烟酰胺(Nicotinamide),所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍。
(5)诱导胰腺前体细胞向胰腺内分泌祖细胞(Endocrine Progenitor,EP)分化的胰腺内分泌祖细胞分化培养基。
所述的胰腺内分泌祖细胞分化培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/LBSA、1.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、20mM葡萄糖、1%(体积比)ITS-X、0.25mM的维生素C、0.25μM SANT1、5nM TTNPB、200nM LDN193189、10μMALK5Inhibitor II、10μg/mL肝素钠、1μM三碘甲状腺原氨酸(T3)、10μM硫酸锌,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍。
(6)诱导胰腺内分泌祖细胞(EP)向不成熟胰岛β细胞分化的不成熟胰岛β细胞阶段1培养基、不成熟胰岛β细胞阶段2培养基。
所述的不成熟胰岛β细胞阶段1培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/LBSA、1.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、20mM葡萄糖、1%(体积比)ITS-X、0.05mM维生素C、200nM LDN193189、10μM ALK5 Inhibitor II、1μM T3、10μM硫酸锌、100nM Yo-01027,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍。
所述的不成熟胰岛β细胞阶段2培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/L BSA、1.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、20mM葡萄糖、1%(体积比)ITS-X、0.05mM维生素C、200nM LDN193189、10μM ALK5 Inhibitor II、10μg/mL肝素钠、1μMT3、10μM硫酸锌,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍。
(7)诱导不成熟的胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化的成熟胰岛β细胞分化培养基。
所述的成熟胰岛β细胞分化培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/L BSA、1.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、20mM葡萄糖、1%(体积比)ITS-X、0.05mM的维生素C、10μM ALK5 Inhibitor II、10μg/mL肝素钠、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM硫酸锌、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Cys)、2μM R428、10μM Trolox,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍。
所述的由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的培养基组合中,所述的WNT信号通路抑制剂选自XAV-939、IWR-endo-1、IWP2中的至少一种,其中,XAV-939的使用浓度优选为2μM,IWR-endo-1的使用浓度优选为1-2μM,IWP2的使用浓度优选为1.25μM。
一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞的培养基组合,包含上述(1)-(4)所述的培养基中的至少一种。
一种由胰腺前体细胞定向分化为胰岛β细胞的培养基组合,包含上述(5)-(7)所述的培养基中的至少一种。
上述由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的培养基组合或由胰腺前体细胞定向分化为胰岛β细胞的培养基组合在制备胰岛β细胞中的应用。
上述由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞的培养基组合在制备胰腺前体细胞中的应用。
一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法,包括以下分化阶段(图1):
阶段1,人扩展多能干细胞分化为定型内胚层细胞
在Activin A、CHIR99021及LY294002的作用下,人扩展多能干细胞首先被诱导分化为定型内胚层(Definitive Endoderm,DE)细胞,分化过程为3-4天,每天更换培养基,通过检测定型内胚层标志基因CXCR4、FOXA2、SOX17对其分化效率进行评估。
阶段2,定型内胚层细胞分化为原始肠管细胞
在维生素C(Vitamin C)、角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor,KGF)、WNT信号抑制剂及SB431542的作用下,定型内胚层被诱导向原始肠管(Primitive GutTube,PGT)阶段,此阶段历时1-2天,每天更换培养基。
阶段3,原始肠管细胞分化为胰腺前体细胞第一阶段
在维生素C(Vitamin C)、角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor,KGF)及WNT抑制剂的基础上进一步补充SANT1、LDN193189、高浓度的TTNPB及Phorbol 12,13-dibutyrate(PDBU),诱导胰腺前体细胞第一阶段(Pancreatic Progenitor1,PP1)分化,分化过程为3-4天,每天更换培养基,通过检测标志基因PDX1、HNF4A、FOXA2等对其分化效率进行评估。
阶段4,胰腺前体细胞第一阶段分化为胰腺前体细胞第二阶段
在阶段3的培养基的基础上降低TTNPB的浓度,并补充表皮生长因子(EpidermalGrowth Factor,EGF)与烟酰胺(Nicotinamide)诱导胰腺前体细胞第二阶段(PancreaticProgenitor2,PP2)的分化,分化过程为3-5天,每天更换培养基,通过检测标志基因PDX1、HNF4A、PTF1A等对其分化效率进行评估。
阶段5,胰腺前体细胞第二阶段分化为胰腺内分泌祖细胞
通过维生素C(Vitamin C)、ALK5 Inhibitor II、肝素钠、SANT1、LDN193189、低浓度TTNPB、三碘甲状腺原氨酸(T3)及硫酸锌(Zinc sulfate)诱导胰腺前体细胞向胰腺内分泌祖细胞(Endocrine Progenitor,EP)进行分化,分化过程为2-3天,每天更换培养基。
阶段6,胰腺内分泌祖细胞分化为不成熟的β细胞
通过维生素C(Vitamin C)、ALK5 Inhibitor II、LDN193189、低浓度TTNPB、三碘甲状腺原氨酸(T3)、硫酸锌(Zinc sulfate)、肝素钠及YO-01027诱导胰腺内分泌细胞向胰岛β细胞进行分化,此阶段命名为不成熟的β细胞阶段,历时6-14天,每天更换培养基。
阶段7,不成熟的β细胞分化为成熟的β细胞
在维生素C(Vitamin C)、ALK5 Inhibitor II、肝素钠、R428、Trolox、N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-Cys)、三碘甲状腺原氨酸(T3)及硫酸锌(Zinc sulfate)的处理下分化3-7天,每天更换培养基,诱导胰岛β细胞成熟,通过检测标志基因PDX1、NKX6-1、INS、NEUROD1、MAFA等对胰岛β细胞分化效率进行评估。
进一步地,所述的由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法,采用上述由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的培养基组合,包括如下步骤:
(1)诱导人扩展多能干细胞向定型内胚层细胞分化:人扩展多能干细胞先用定型内胚层第一阶段培养基培养20-28小时、再用定型内胚层第二阶段培养基培养2-3天,每20-28小时更换培养基,得到定型内胚层细胞。
(2)诱导定型内胚层细胞向原始肠管细胞分化:定型内胚层细胞用原始肠管细胞培养基培养1-2天,每20-28小时更换培养基,得到原始肠管细胞。
(3)诱导原始肠管细胞向胰腺前体细胞第一阶段分化:原始肠管细胞用胰腺前体细胞第一阶段培养基培养3-4天,每20-28小时更换培养基,得到胰腺前体细胞第一阶段;
(4)诱导胰腺前体细胞第一阶段向胰腺前体细胞第二阶段分化:胰腺前体细胞第一阶段用胰腺前体细胞第二阶段培养基培养3-5天,每20-28小时更换培养基,得到胰腺前体细胞;
(5)诱导胰腺前体细胞向胰腺内分泌祖细胞分化:胰腺前体细胞使用胰腺内分泌祖细胞分化培养基培养2-3天,每20-28小时更换培养基,得到胰腺内分泌祖细胞;
(6)诱导胰腺内分泌祖细胞向不成熟胰岛β细胞分化:胰腺内分泌祖细胞先用不成熟胰岛β细胞阶段1培养基培养3-7天、再用不成熟胰岛β细胞阶段2培养基培养3-7天,每20-28小时更换培养基,得到不成熟胰岛β细胞;
(7)诱导不成熟的胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化:不成熟胰岛β细胞用成熟胰岛β细胞分化培养基培养3-7天,每20-28小时更换培养基,得到熟胰岛β细胞。
所述的由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法中,各细胞的培养时间根据细胞分化情况进行缩短或延长,通过检测分化细胞的标记基因对其分化情况进行评估。
一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞的方法,包括上述方法中的步骤(1)-(4)。
一种由胰腺前体细胞定向分化为胰岛β细胞的方法,包括上述方法中的步骤(5)-(7)。
本发明通过使用LY294002抑制PI3K信号以促进扩展性多能干细胞向定型内胚层分化;使用TGF-β抑制剂SB431542进一步促进扩展性多能干细胞来源的内胚层细胞向胰腺前体细胞的分化;同时采用EGF与Nicotinamide联合处理提高胰腺前体细胞分化效率,并最终分化产生胰岛β细胞。
本发明的优点和有益效果:本发明在人扩展性多能干细胞向定型内胚层分化过程中添加LY294002后,可以直接得到较高效率的SOX17和FOXA2阳性的定型内胚层细胞;在原始肠管分化中加入SB431542可以提高胰腺前体第一阶段中PDX1的表达,并且降低多能性基因OCT4的表达;在胰腺前体第二阶段的分化中联合使用EGF和Nicotinamide可以显著提高PDX1和NKX6-1双阳性细胞的比例;根据以上的优化,利用本发明的分化方案最终可以将人扩展性多能干细胞作为种子细胞分化得到较高阳性率的成熟胰腺β细胞。
附图说明
图1为EPSC定向分化为胰岛β细胞的诱导方案示意图。
图2为实施例2中LY294002处理对EPSC向定型内胚层分化的影响。免疫荧光染色检测SOX17表达;流式细胞术检测CXCR4阳性率。
图3为实施例2中免疫荧光染色检测EPSC分化产生的定型内胚层标志物SOX17与FOXA2表达。
图4为实施例2中流式细胞术检测EPSC分化产生的定型内胚层标志物CXCR4与SOX17阳性率。
图5为实施例3中免疫荧光染色检测SB431542处理对EPSC向胰腺前体细胞分化中PDX1表达的影响及免疫荧光定量图。
图6为实施例3中实时荧光定量PCR检测SB431542处理对EPSC向胰腺前体细胞分化中PDX1、HNF4A及OCT4基因表达的影响。
图7实施例4中免疫荧光染色检测EGF与Nicotinamide处理对EPSC向胰腺前体细胞分化中PDX1与NKX6-1表达的影响。
图8为实施例4中实时荧光定量PCR检测EGF与Nicotinamide处理对EPSC向胰腺前体细胞分化中PDX1、NKX6-1及PTF1A基因表达的影响。
图9为实施例4中免疫荧光染色检测EPSC分化产生的PP2细胞标志物PDX1与NKX6-1表达。
图10为实施例4中实时荧光定量PCR检测EPSC分化产生的PP2细胞PDX1、NKX6-1及PTF1A基因表达。
图11为实施例5中免疫荧光染色检测EPSC分化产生的胰岛β细胞标志物PDX1与C-Peptide表达。
图12为实施例5中实时荧光定量PCR检测EPSC分化产生的胰岛β细胞PDX1、NKX6-1、INS、NEUROD1、ISL1及MAFA基因表达。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
本说明书中使用的术语,除非另有说明,皆应理解为本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
实施例1
扩展性多能干细胞培养及传代
1)按照下述配方配制扩展性多能干细胞培养基:KnockoutTM DMEM/F12与NeurobasalTM Medium按照体积比1:1混匀,加入5%(体积比)Knockout Serum Replacement(KSR)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(GlutaMAX)、1%(体积比)的非必需氨基酸溶液(Non-Essential Amino Acids)、1%(体积比)的不含维生素A的B27、0.5%(体积比)的N-2无血清添加剂、0.1mM 2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol),并添加2μM(S)-(+)-dimethindene maleate、1μMIWR-endo-1、1μM CHIR99021、2μM Y-27632、10ng/mL Human-LIF、2μM minocycline hydrochloride。
2)按1:30体积比将Matrigel稀释于预冷的DPBS中,并将其铺于细胞培养板中,将细胞培养板用Matrigel包被,用于培养扩展性多能干细胞。扩展性多能干细胞每三天传代。首先弃去培养液,加入DPBS清除残留培养基。随后加入适量TrypLE消化3~4分钟后弃去消化液,加入含有6%(体积比)KSR的KnockoutTM DMEM/F12溶液终止消化并将细胞重悬起来,以1000rpm离心3分钟。弃去上清,加入扩展性多能干细胞培养基重悬细胞沉淀,按照1:10-1:20比例铺在新的Matrigel包被的细胞培养板中。
本发明实施例中涉及细胞培养的条件均为37℃、5% CO2;所使用的细胞培养板均经Matrigel包被。
实施例2
LY294002促进扩展性多能干细胞向定型内胚层分化
(1)细胞分化获得定型内胚层细胞
1)配制定型内胚层阶段培养基:基础培养基IMDM/F12(IMDM与F12 1:1混匀),加入1%B27(不含维生素A)、2g/L BSA、100ng/mL Activin A。定型内胚层分化第一天需加入2.5μM CHIR99021及5μM LY294002;分化24小时后撤去CHIR99021与LY294002,使用Activin A继续分化2~3天。其中,图2中对照组(Control)未添加LY294002。
2)细胞接种及分化:将培养板上的扩展性多能干细胞消化并计数,以每孔0.8~1×105细胞铺于1%(体积比)Matrigel包被的24孔板,摇匀后置于培养箱中。接种细胞汇合度达到80~90%时,更换为相应的定型内胚层培养基进行分化,每天更换新鲜的培养基,培养3天后即可检测定型内胚层的分化效率。
(2)免疫荧光检测定型内胚层阶段SOX17和FOXA2的表达水平
将待检测细胞弃去培养基,加入DPBS洗2~3次去除残留培养基,加入4%多聚甲醛,室温固定15~20分钟;弃去固定液,DPBS洗2~3次,每次3~5分钟;配制封闭液,封闭液的配方为:DPBS中加入10%驴血清及0.3% TritonX-100,加入封闭液,室温封闭1h;加入封闭液配制的一抗孵育液,室温孵育1~2小时或4℃孵育过夜;弃去一抗孵育液,DPBS洗2~3次,每次3~5分钟。加入封闭液配制的二抗孵育液,室温避光孵育1~2小时;弃去二抗孵育液,DPBS洗2~3次,每次3~5分钟;加入DAPI(1:5000使用),室温避光孵育5~10分钟;弃去DAPI,DPBS洗2~3次后,加入DPBS,置于荧光显微镜下观察拍照记录数据,使用ImageJ或Photoshop对荧光图像进行分析处理。本研究用到的抗体如下:Rabbit anti-FOXA2(ET1703-76,1:200,华安生物);Goat anti-SOX17(AF1924,1:200,R&D);Donkey-anti-goat-FITC(705-095-003,1:200,Jackson immunoResearch);Donkey-anti-rabbit-TRITC(711-025-152,1:200,Jackson immunoResearch)。
(3)流式细胞术检测定型内胚层阶段CXCR4和SOX17的表达水平
将待检测细胞弃去培养基,加入DPBS洗2~3次去除残留培养基。使用TrypLE将细胞消化为单细胞,加入含2% FBS的DPBS终止消化,并轻轻吹打收集细胞悬液于1.5mL EP管中;将含细胞悬液的1.5mL EP管置于4℃离心机中,3000rpm离心3~4分钟;弃去上清,加入含2% FBS的DPBS轻轻重悬细胞沉淀。重复此步骤1~2次;抗体CD184-APC或同型对照抗体按照1:200加入含2% FBS的DPBS中配制流式抗体孵育液;加入200μL抗体孵育液轻轻重悬细胞沉淀,置于4℃避光孵育30分钟;加入含2% FBS的DPBS终止孵育,置于4℃离心机,3000rpm离心3~4分钟;弃去上清,则加入含2% FBS的DPBS轻轻重悬细胞沉淀。重复此步骤1~2次;若只做CXCR4的单染,则加入200μL DPBS溶液重悬细胞沉淀,上机检测;若同时检测SOX17,则按照BD PharmingenTM Transcription Factor Buffer Set试剂盒,配制1×Perm/Wash Buffer和1×Fix/Perm工作液(后者需避光且现配现用);加入1×Fix/Perm工作液轻轻重悬细胞沉淀,置于4℃避光孵育50~60分钟;加入含2% FBS的DPBS终止孵育,置于4℃离心机,3000rpm离心3~4分钟。弃去上清,加入含2% FBS的DPBS轻轻重悬细胞沉淀。重复此步骤1~2次;使用1×Perm/Wash Buffer中配制一抗孵育液,加入200μL一抗孵育液轻轻重悬细胞沉淀,置于4℃孵育1小时;加入含2% FBS的DPBS终止孵育,置于4℃离心机,3000rpm离心3~4分钟。弃去上清,加入含2% FBS的DPBS轻轻重悬细胞沉淀;重复此步骤1~2次;加入200μL DPBS溶液重悬细胞沉淀,上机检测。本研究用到的抗体如下:Anti-humanCD184-APC(555976,1:200,BD);SOX17-Alexa488(562205,1:200,BD)。
(4)培养3天后定型内胚层细胞的检测结果
图2免疫荧光染色显示LY294002处理能够产生更多的SOX17阳性细胞,流式分析也表明LY294002处理能够明显提高CXCR4阳性的定型内胚层细胞比例。
图3所示免疫荧光染色检测SOX17及FOXA2表达情况以评估定型内胚层分化效果;图4所示流式细胞术检测CXCR4或SOX17以评估分化效率,显示定型内胚层效率能够稳定达到80%以上。
实施例3
SB431542促进扩展性多能干细胞向PDX1阳性胰腺前体细胞分化
(1)细胞分化获得胰腺前体第一阶段细胞
1)配制分化培养基:定型内胚层细胞首先经过原始肠管阶段(PGT),然后向PDX1阳性的胰腺前体细胞第一阶段(PP1)进行分化。各阶段培养基成分如表1、表2所示。其中,图5与图6中对照组在PGT阶段未添加SB431542。
表1原始肠管阶段(PGT)阶段培养基配方表
表2胰腺前体细胞第一阶段(PP1)阶段培养基配方表
2)分化步骤:当定型内胚层阶段CXCR4阳性率达到80%以上时,可进行后续胰腺前体细胞阶段分化。首先弃去定型内胚层阶段培养基,DPBS洗1~2次,更换为PGT培养基,分化1-2天;随后更换为PP1培养基分化3~4天,通过PP1阶段标志物PDX1检测分化情况。分化期间每天更换新鲜培养基。
(2)免疫荧光检测PP1阶段PDX1的表达水平
免疫荧光的具体实验流程如实施例2所述;本研究中用的抗体如下:Goat anti-PDX1(AF2419,1:100,RD);Donkey-anti-goat-FITC(705-095-003,1:200,JacksonimmunoResearch)。
(3)实时荧光定量反转录PCR检测PP1阶段PDX1、HNF4A及OCT4相对表达量
1)细胞总RNA提取
使用组织细胞RNA小量抽提试剂盒(R4111-03,Magen)提取细胞总RNA。将待检测细胞弃去培养基,加入DPBS洗2~3次去除残留培养基,加入适量裂解液Buffer RL打散细胞沉淀;使用移液器反复吸打样品以打断DNA,将gDNA Filter Mini Column装在收集管中,并将细胞裂解液转移至其中,14000×g离心2分钟;收集滤液,向其中加入等倍体积的70%乙醇,用移液器吸打数次混匀;将HiPure RNA Mini Column装在收集管中,并将混匀后的滤液转移至其中,12000×g离心1分钟;弃去滤液,加入500μL Buffer RW1至柱子中,12000×g离心1分钟;弃去滤液,加入500μL Buffer RW2(已加无水乙醇)至柱子中,12000×g离心1分钟;弃去滤液,加入500μL Buffer RW2(已加无水乙醇)至柱子中,12000×g离心1分钟;弃去滤液,将柱子装入收集管中,12000×g离心2分钟;弃去收集管,将柱子装入1.5mL EP管中。向柱子滤膜中央加入20~100μL RNase-free water,静置2分钟,随后以12000×g离心1分钟;弃去柱子,使用核酸蛋白微量分析仪进行RNA质量及浓度检测。随后将RNA保存于-80℃冰箱中。
2)反转录制备cDNA
使用ABScriptⅢRT Master Mix for qPCR((RK20428,ABclonal))进行反转录制备cDNA。配制反转录反应体系:按照20μL体系进行反转录,加入1μg RNA、5×ABScriptⅢRTMaster Mix和RNase-free water,并进行混匀,使用普通Bio-rad的PCR仪进行反转录,反应条件为:55℃15分钟,85℃5分钟,12℃Hold,之后-20℃条件保存。
3)实时荧光定量PCR检测基因表达
使用SYBR Green qPCR Master Mix(B21203,Biomake)进行实时荧光定量PCR。按照以下配制反应体系:384孔板按照10μL每孔体系进行实时荧光定量PCR,加入0.5μL cDNA(对应为50ng RNA)、0.5μL上游引物(浓度为5μM)、0.5μL下游引物(浓度为5μM)、5μLSYBRGreen qPCR Master Mix,并补充RNase-free water。每个样品设置两个平行复孔;将384孔板贴上覆膜,置于微孔板离心机内离心2分钟进行混匀,放入荧光定量PCR仪进行反应;荧光定量PCR仪程序设置如下:95℃5分钟预变性,PCR扩增按照95℃15秒,60℃30秒重复39个循环,熔解曲线设置为95℃15秒,65℃15秒;反应完毕后导出数据至Excel中进行数据分析。实验结果使用△△CT方法对比管家基因GAPDH进行分析。本研究中用到的引物序列如下:
GAPDH正向引物:AATGAAGGGGTCATTGATGG,
GAPDH反向引物:AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA;
PDX1正向引物:TTAGGATGTGGACGTAATTCCTGTT,
PDX1反向引物:GGCCACTGTGCTTGTCTTCA;
NKX6-1正向引物:AGACCCACTTTTTCCGGACA,
NKX6-1反向引物:CCAACGAATAGGCCAAACGA;
OCT4正向引物:CAAAGCAGAAACCCTCGTGC,
OCT4反向引物:TCTCACTCGGTTCTCGATACTG。
(4)胰腺前体细胞第一阶段培养4天的分化结果如下:
图5免疫荧光染色显示添加SB431542的处理显著增加PDX1阳性的胰腺前体细胞的产生;图6实时荧光定量PCR显示,SB431542能够显著提高PP1阶段关键基因PDX1、HNF4A的表达,并显著抑制了多能性基因OCT4的表达。
实施例4
EGF与Nicotinamide联合处理促进扩展性多能干细胞向PDX1与NKX6-1双阳性的胰腺前体细胞分化
(1)细胞分化获得胰腺前体第二阶段细胞
1)配制分化培养基:PDX1与NKX6-1双阳性的胰腺前体细胞第二阶段PP2培养基成分如表3所示。其中,图7与图8中对照组未添加EGF与Nicotinamide。
表3胰腺祖细胞第二阶段(PP2)阶段培养基配方表
2)分化步骤:弃去PP1阶段培养基,加入DPBS洗1~2次去除残留培养基,更换为PP2培养基分化3-5天,通过PP2阶段标志物PDX1和NKX6-1检测分化情况。分化期间每天更换新鲜培养基。
(2)免疫荧光检测PDX1与NKX 6-1的表达水平
免疫荧光的具体实验流程如实施例2所述。本研究中用的的抗体如下:Goat anti-PDX1(AF2419,1:100,RD);Mouse anti-NKX6-1(F55A12,1:100,DSHB);Donkey-anti-goat-FITC(705-095-003,1:200,Jackson immunoResearch);Donkey-anti-mouse-TRITC(715-025-150,1:200,Jackson immunoResearch)。
(3)实时荧光定量PCR检测PP2阶段PDX1、NKX6-1及PTF1A相对表达量
实时荧光定量PCR的实验流程如实施例3所述。本研究中用到的引物序列如下:
GAPDH正向引物:AATGAAGGGGTCATTGATGG,
GAPDH反向引物:AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA;
PDX1正向引物:TTAGGATGTGGACGTAATTCCTGTT,
PDX1反向引物:GGCCACTGTGCTTGTCTTCA;
NKX6-1正向引物:AGACCCACTTTTTCCGGACA,
NKX6-1反向引物:CCAACGAATAGGCCAAACGA;
PTF1A正向引物:CAGGACACTCTCTCTCATGGA,
PTF1A反向引物:TGGTGGTTCGTTTTCTATGTTGT。
(4)胰腺前体第二阶段分化5天的结果如下:
图7免疫荧光结果显示,EGF和Nicotinamide的处理组NKX6-1表达明显高于对照组;图8实时荧光定量PCR检测关键基因PDX1、NKX6-1表达水平也有所上调,说明EGF与Nicotinamide促进扩展性多能干细胞向胰腺前体细胞分化。
图9所示免疫荧光染色检测标志基因PDX1与NKX6-1评估PP2阶段分化情况说明该发明能够分化得到较高阳性率的胰腺前体细胞,图10所示实时荧光定量PCR检测标志基因PDX1、NKX6-1、PTF1A表达情况证明胰腺前体细胞高表达关键基因。
实施例5
扩展性多能干细胞向胰岛β细胞分化
(1)细胞分化
1)配制分化培养基:胰腺前体细胞分化至胰岛β细胞需经历胰腺内分泌祖细胞(EP)阶段、不成熟β细胞阶段(包括不成熟β细胞阶段1、不成熟β细胞阶段2)及成熟β细胞阶段,各阶段培养基成分如下表4、表5、表6、表7所示。
表4胰腺内分泌祖细胞(EP)阶段培养基配方表
表5不成熟β细胞(Immatureβ)阶段1培养基配方表
表6不成熟β细胞(Immatureβ)阶段2培养基配方表
表7成熟β细胞(Matureβ)阶段培养基配方表
2)分化步骤:弃去PP2阶段培养基,加入DPBS洗1~2次去除残留培养基,更换为PEP培养基,分化3天;随后依次更换为Immatureβ细胞阶段1培养基、Immatureβ细胞阶段2培养基分别分化3~7天,最后更换为Matureβ细胞培养基分化3~7天,通过β细胞阶段标志物C肽检测分化效率。分化期间每天更换新鲜培养基。
(2)免疫荧光检测成熟β细胞阶段PDX1及C-Peptide的表达水平
免疫荧光的具体实验流程如实施例2所述。本研究中用的的抗体如下:Goat anti-PDX1(AF2419,1:100,RD);Rat anti-C-peptide(GN-ID4,1:200,DSHB);Donkey-anti-goat-FITC(705-095-003,1:200,Jackson immunoResearch);Donkey-anti-rat-TRITC(712-025-153,1:200,Jackson immunoResearch)。
(3)实时荧光定量PCR检测成熟β细胞阶段关键基因的相对表达量
实时荧光定量PCR的实验流程如实施例3所述。本研究中用到的引物序列如下:
GAPDH正向引物:AATGAAGGGGTCATTGATGG,
GAPDH反向引物:AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA;
PDX1正向引物:TTAGGATGTGGACGTAATTCCTGTT,
PDX1反向引物:GGCCACTGTGCTTGTCTTCA;
NKX6-1正向引物:AGACCCACTTTTTCCGGACA,
NKX6-1反向引物:CCAACGAATAGGCCAAACGA;
INS正向引物:GCAGCCTTTGTGAACCAACAC,
INS反向引物:CCCCGCACACTAGGTAGAGA;
NEUROD1正向引物:ACCAAATCGTACAGCGAGAGT,
NEUROD1反向引物:CTCGTCCTGAGAACTGAGACA;
MAFA正向引物:CTTCAGCAAGGAGGAGGTCATC,
MAFA反向引物:CTCGTATTTCTCCTTGTACAGGTCC;
ISL1正向引物:AAACAGGAGCTCCAGCAAAA,
ISL1反向引物:AGCTACAGGACAGGCCAAGA。
(3)成熟β细胞阶段培养3天后的分化结果如下:
图11所示免疫荧光染色检测PDX1及C-Peptide评估胰岛β细胞阶段分化情况,说明本发明所提出的分化方案可以有效获得成熟β细胞;图12所示实时荧光定量PCR检测标志基因PDX1、NKX6-1、INS、NEUROD1、MAFA、ISL1表达情况,验证本发明获得的β细胞高表达关键基因。
Claims (10)
1.一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的培养基组合,其特征在于:所述的培养基组合包含下述培养基中的至少一种:
(1)诱导人扩展多能干细胞向定型内胚层细胞分化的定型内胚层第一阶段培养基、定型内胚层第二阶段培养基;所述的定型内胚层第一阶段培养基中添加了LY294002;
(2)诱导定型内胚层细胞向原始肠管细胞分化的原始肠管细胞培养基;所述的原始肠管细胞培养基中添加了SB431542;
(3)诱导原始肠管细胞向胰腺前体细胞第一阶段分化的胰腺前体细胞第一阶段培养基;
(4)诱导胰腺前体细胞第一阶段向胰腺前体细胞第二阶段分化的胰腺前体细胞第二阶段培养基;所述的胰腺前体细胞第二阶段培养基中添加了EGF和烟酰胺;
(5)诱导胰腺前体细胞向胰腺内分泌祖细胞分化的胰腺内分泌祖细胞分化培养基;
(6)诱导胰腺内分泌祖细胞向不成熟胰岛β细胞分化的不成熟胰岛β细胞阶段1培养基、不成熟胰岛β细胞阶段2培养基;
(7)诱导不成熟的胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化的成熟胰岛β细胞分化培养基。
2.根据权利要求1所述的由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的培养基组合,其特征在于:所述的培养基组合包含下述培养基中的至少一种:
(1)诱导人扩展多能干细胞向定型内胚层细胞分化的定型内胚层第一阶段培养基、定型内胚层第二阶段培养基;
所述的定型内胚层第一阶段培养基的组成为:将IMDM和F12培养基按体积比1:1混合作为基础培养基,添加以下浓度的成分:2g/L牛血清白蛋白、1%B27、100ng/mL Activin A、2.5μM CHIR99021、5μM LY294002,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍;
所述的定型内胚层第二阶段培养基的组成为:将IMDM和F12培养基1:1混合作为基础培养基,添加以下浓度的成分:2g/L牛血清白蛋白、1%B27、100ng/mL Activin A,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍;
(2)诱导定型内胚层细胞向原始肠管细胞分化的原始肠管细胞培养基;
所述的原始肠管细胞培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:5g/L牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、10mM葡萄糖、0.25mM的维生素C、50ng/mL KGF、1-2μM WNT信号通路抑制剂、5μM SB431542,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍;
(3)诱导原始肠管细胞向胰腺前体细胞第一阶段分化的胰腺前体细胞第一阶段培养基;
所述的胰腺前体细胞第一阶段培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/L牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、10mM葡萄糖、1%ITS-X、0.25mM的维生素C、50ng/mL KGF、0.25μM SANT1、100nM TTNPB、500nM PDBu、200nMLDN193189、1-2μM WNT信号通路抑制剂,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍;
(4)诱导胰腺前体细胞第一阶段向胰腺前体细胞第二阶段分化的胰腺前体细胞第二阶段培养基;
所述的胰腺前体细胞第二阶段培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/L牛血清白蛋白、2.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、10mM葡萄糖、1%ITS-X、0.25mM的维生素C、2ng/mL KGF、0.25μM SANT1、10nM TTNPB、250nM PDBu、400nMLDN193189、1-2μM WNT信号通路抑制剂、50ng/mL EGF、10mM烟酰胺,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍;
(5)诱导胰腺前体细胞向胰腺内分泌祖细胞分化的胰腺内分泌祖细胞分化培养基;
所述的胰腺内分泌祖细胞分化培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/L牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、20mM葡萄糖、1%ITS-X、0.25mM维生素C、0.25μM SANT1、5nM TTNPB、200nM LDN193189、10μM ALK5Inhibitor II、10μg/mL肝素钠、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM硫酸锌,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍;
(6)诱导胰腺内分泌祖细胞向不成熟胰岛β细胞分化的不成熟胰岛β细胞阶段1培养基、不成熟胰岛β细胞阶段2培养基;
所述的不成熟胰岛β细胞阶段1培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/L牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、20mM葡萄糖、1%ITS-X、0.05mM维生素C、200nM LDN193189、10μM ALK5 Inhibitor II、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM硫酸锌、100nM Yo-01027,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍;
所述的不成熟胰岛β细胞阶段2培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/L牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、20mM葡萄糖、1%ITS-X、0.05mM维生素C、200nM LDN193189、10μM ALK5 Inhibitor II、10μg/mL肝素钠、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM硫酸锌,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍;
(7)诱导不成熟的胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化的成熟胰岛β细胞分化培养基;
所述的成熟胰岛β细胞分化培养基的组成为:将MCDB131作为基础培养基,添加以下浓度的成分:20g/L牛血清白蛋白、1.5g/L碳酸氢钠、2mM GlutaMAX、20mM葡萄糖、1%ITS-X、0.05mM维生素C、10μM ALK5 Inhibitor II、10μg/mL肝素钠、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM硫酸锌、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、2μM R428、10μM Trolox,所述浓度均为终浓度,所有成分浓度能上下浮动2倍。
3.根据权利要求2所述的由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的培养基组合,其特征在于:所述的WNT信号通路抑制剂选自XAV-939、IWR-endo-1、IWP2中的至少一种。
4.一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞的培养基组合,其特征在于:所述的培养基组合包含:权利要求1或2中(1)-(4)所述的培养基中的至少一种。
5.一种由胰腺前体细胞定向分化为胰岛β细胞的培养基组合,其特征在于:所述的培养基组合包含:权利要求1或2中(5)-(7)所述的培养基中的至少一种。
6.权利要求1-3或5所述的培养基组合在制备胰岛β细胞中的应用。
7.权利要求4所述的培养基组合在制备胰腺前体细胞中的应用。
8.一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法,其特征在于:所述的方法采用权利要求1或2所述的培养基组合,所述的方法包括如下步骤:
(1)诱导人扩展多能干细胞向定型内胚层细胞分化:人扩展多能干细胞先用定型内胚层第一阶段培养基培养20-28小时、再用定型内胚层第二阶段培养基培养2-3天,得到定型内胚层细胞;
(2)诱导定型内胚层细胞向原始肠管细胞分化:定型内胚层细胞用原始肠管细胞培养基培养1-2天,得到原始肠管细胞;
(3)诱导原始肠管细胞向胰腺前体细胞第一阶段分化:原始肠管细胞用胰腺前体细胞第一阶段培养基培养3-4天,得到胰腺前体细胞第一阶段;
(4)诱导胰腺前体细胞第一阶段向胰腺前体细胞第二阶段分化:胰腺前体细胞第一阶段用胰腺前体细胞第二阶段培养基培养3-5天,得到胰腺前体细胞;
(5)诱导胰腺前体细胞向胰腺内分泌祖细胞分化:胰腺前体细胞使用胰腺内分泌祖细胞分化培养基培养2-3天,得到胰腺内分泌祖细胞;
(6)诱导胰腺内分泌祖细胞向不成熟胰岛β细胞分化:胰腺内分泌祖细胞先用不成熟胰岛β细胞阶段1培养基培养3-7天、再用不成熟胰岛β细胞阶段2培养基培养3-7天,得到不成熟胰岛β细胞;
(7)诱导不成熟的胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化:不成熟胰岛β细胞用成熟胰岛β细胞分化培养基培养3-7天,得到熟胰岛β细胞。
9.一种由扩展性多能干细胞定向分化为胰腺前体细胞的方法,其特征在于:包括权利要求7中的步骤(1)-(4)。
10.一种由胰腺前体细胞定向分化为胰岛β细胞的方法,其特征在于:包括权利要求7中的步骤(5)-(7)。
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