CN113583937B - 用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法 - Google Patents
用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加ATP和NAC中的至少一种。所述方法包括：采用所述的培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，以使分化成定型内胚层细胞。本发明通过向基本培养基中添加ATP和NAC中的至少一种，以提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率或/和降低Activin A的用量从而降低成本；本发明提供的培养基，成本较低，性能稳定，可以将人多能干细胞高效率地分化为定型内胚层细胞。这为体外进行内胚层相关发育问题的研究提供了一个低成本高效率的研究体系。同时也降低了再生医学的应用成本。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞和再生医学领域，特别涉及一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法。
背景技术
多能性的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell，iPSC)是类特殊的细胞。一方面，具有几乎无限的自我更新能力，另一方面有分化成组成人体的各种细胞类型的潜能，其体外分化系统提供了一个快捷的、方便的手段来阐述相关疾病发生的分子基础，并且为再生医学提供了良好的技术体系。多能干细胞可以向内、中、外三胚层谱系分化，其中内胚层来源的肝脏、肠、胰腺等组织出现缺陷造成的相关疾病严重影响着人类的生活质量，比如糖尿病尚不能根治，而再生医学为根治提供了可能。但为了体外获得内胚层各组织细胞，首先需要获得较高效率的定型内胚层细胞。
目前，人们已经获得了较为成熟稳定的定型内胚层分化体系。其中nodal/activinA信号通路发挥了关键的作用，因此向培养基中加入Activin A便可以获得一定比例的内胚层细胞。然而Activin A作为生长因子，其价格昂贵，从而使体外获得定型内胚层细胞的成本偏高。因此，有必要建立一种成本低、成分简单、效率较高的体系来获得定型内胚层细胞将极大扩展其在基础科研以及再生医学中的应用。
发明内容
本发明目的是提供一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法，通过向基本培养基中添加ATP和NAC中的至少一种，以提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率或/和降低Activin A的用量从而降低成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供一种ATP的应用，所述应用包括：加入ATP提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率。
在本发明的第二方面，提供一种NAC的应用，所述应用包括：加入NAC提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率。
在本发明的第三方面，提供一种用于提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率的化合物，其特征在于，所述化合物包括ATP和NAC中的至少一种。
在本发明的第四方面，提供一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加ATP和NAC中的至少一种。
进一步地，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加1～100ng/ml ActivinA、B27、牛血清白蛋白、双抗，以及ATP和NAC中的至少一种。
进一步地，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加1～10ng/ml Activin A、0.5～1.5％ B27、0.1～0.3％牛血清白蛋白、0.5～1.5％双抗，以及以下化合物中的一种：
化合物A：0.1～4mMATP；
化合物B：1～4mM NAC；
化合物C：0.05～0.15mM ATP和1.5～2.5mM NAC。
进一步地，所述培养基的组分还包括：2～3mM GSK3抑制剂。具体地，GSK3抑制剂可以为例如CHIR99021或者Wnt信号传导激活剂，例如Wnt3A。
在其他实施方式中，所述培养基还可包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，例如，丁酸钠(NaB)、丁酸苯酯(PB)、丙戊酸盐/酯(valproate)、曲古抑菌素A、恩替司他(Entinostat)或帕比司他(Panobinstat)。所述分化培养基还可包含一种或更多种生长因子，例如FGF1、FGF2 和FGF4和/或血清，例如FBS或FCS。所述分化培养基还可包含PI3K(磷酸肌醇3-激酶) 抑制剂，例如LY294002。
进一步地，所述哺乳动物多能干细胞的类型包括：哺乳动物胚胎干细胞或哺乳动物诱导多能干细胞；
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物胚胎干细胞时，所述化合物A为0.1～2mMATP，所述化合物B为1～3mM NAC；
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物诱导多能干细胞时，所述化合物A为0.1～4mM ATP，所述化合物B为1～4mM NAC。
具体地，所述哺乳动物多能干细胞包括：人多能干细胞、灵长类动物多能干细胞、小鼠多能干细胞、大鼠多能干细胞、犬多能干细胞、猫多能干细胞、猪多能干细胞、牛多能干细胞和马多能干细胞中的一种。
在本发明的第五方面，提供一种哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法，所述方法包括：采用所述的培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，以使分化成定型内胚层细胞。
进一步地，所述方法包括：
将哺乳动物多能干细胞使用生长培养基进行培养3-7天，后消化计数并接种于包被有基质胶的孔板内，采用正常生长培养基培养；
待达到75～85％的密度，换上所述的培养基进行培养，获得定型内胚层细胞。
上述技术方案中，所述生长培养基具体可以为mTeSR+1％双抗，基质胶以1：100稀释比例包被于板孔内，在其他实施方式中也可适当调整添加比例；
上述技术方案中，对于24孔板，所述消化计数后按0.8X105每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内；在其他实施方式中，对于不同的培养皿，适当相应调整接种的细胞数。
本发明的NAC全称为N-乙酰-L-半胱氨酸；ATP全称为腺嘌呤核苷三磷酸(简称三磷酸腺苷)；
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法，通过向基本培养基中添加ATP和NAC中的至少一种，以提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率或/和降低Activin A的用量从而降低成本；具体地：
(1)培养基中加入ATP或NAC，使多能干细胞分化第3或4天时即可达到较高的分化效率，可以缩短分化时间。
(2)培养基中Activin A的浓度降低为10ng/ml，仅为现在流行培养基中Activin A浓度的1/10，在此基础上加入ATP或NAC，可使分化效率达到与100ng/ml浓度Activin A相当的水平。ATP和NAC的价格相对Activin A低很多，从而使定型内胚层的分化成本降低为原来的1/10以内。
(3)本发明提供的培养基，成本较低，性能稳定，可以将人多能干细胞高效率地分化为定型内胚层细胞。这为体外进行内胚层相关发育问题的研究提供了一个低成本高效率的研究体系。同时也降低了再生医学的应用成本，这将极大地促进细胞疗法的研究与应用，有着很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为实施例1和对比例1对比显示ATP对人胚胎干细胞内胚层分化阳性率影响的流式结果；
图2为实施例1和对比例1对比显示ATP对人胚胎干细胞内胚层分化标志基因表达影响的定量PCR结果；
图3为实施例2和对比例2对比显示NAC对人胚胎干细胞内胚层分化阳性率影响的流式结果；
图4为实施例2和对比例2对比显示NAC对人胚胎干细胞内胚层分化标志基因表达影响的定量PCR结果；
图5为实施例3和对比例3、4对比显示ATP在Activin A用量降低时对人胚胎干细胞内胚层分化阳性率影响的流式结果；
图6为实施例3和对比例3、4对比显示ATP在Activin A用量降低时对人胚胎干细胞内胚层分化影响的免疫荧光结果；
图7为实施例4和对比例3、对比例5对比显示NAC在Activin A用量降低时对人胚胎干细胞内胚层分化阳性率影响的流式结果；
图8为实施例4和对比例3、对比例5对比显示NAC在Activin A用量降低时对人胚胎干细胞内胚层分化影响的免疫荧光结果；
图9为实施例5和对比例3、对比例6对比显示ATP和NAC联用在Activin A用量降低时对人胚胎干细胞内胚层分化阳性率影响的流式结果；
图10为实施例5和对比例3、对比例6对比显示ATP和NAC联用在Activin A用量降低时对人胚胎干细胞内胚层分化影响的免疫荧光结果；
图11为实施例6和对比例7对比显示ATP对人诱导多能干细胞内胚层分化阳性率影响的流式结果；
图12为实施例7和对比例8对比显示NAC对人诱导多能干细胞内胚层分化阳性率影响的流式结果；
图13为本发明实施例提供的一种哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法的流程模式图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法进行详细说明。
实施例1
1、一种人多能干细胞分化为定性内胚层细胞的培养基
该培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括以下组分：100ng/ml Activin A，2.5uM CHIR99021，1％B27，0.2％牛血清白蛋白，1％双抗，ATP。
2、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体包括以下步骤：
(1)使用mTeSR+1％双抗作为生长培养基，在1：100稀释比例的基质胶上培养人胚胎干细胞。
(2)步骤(1)中的人胚胎干细胞培养4-5天后克隆长大，此时细胞密度约为培养板孔板底面积的80％-90％，使用Accutase于37℃细胞培养箱中静置3分钟，显微镜下观察细胞呈圆球状，立即加入DMEM/F12培养基终止消化，轻轻吹打重悬后计数，按0.8X105/每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内，正常生长培养基培养。
(3)步骤(2)中的细胞培养一天后密度达到80％左右，此时换上上述新鲜配制的培养基开始进行定型内胚层分化，记为分化D0天。
(4)分化开始后每24小时更换新鲜的上述培养基，于D3天时即可获得定型内胚层细胞。
对比例1
该对比例1中，除分化培养基中不添加ATP外，其他步骤均同实施例1。
实施例2
1、一种人多能干细胞分化为定性内胚层细胞的培养基，该培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括以下组分：100ng/ml Activin A，2.5uM CHIR99021，1％B27，0.2％牛血清白蛋白，1％双抗，NAC。
2、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体包括以下步骤：
(1)使用mTeSR+1％双抗作为生长培养基，在1：100稀释比例的基质胶上培养人胚胎干细胞。
(2)步骤(1)中的人胚胎干细胞培养4-5天后克隆长大，此时细胞密度约为培养板孔板底面积的80％-90％，使用Accutase于37℃细胞培养箱中静置3分钟，显微镜下观察细胞呈圆球状，立即加入DMEM/F12培养基终止消化，轻轻吹打重悬后计数，按0.8X105/每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内，正常生长培养基培养。
(3)步骤(2)中的细胞培养一天后密度达到80％左右，此时换上上述新鲜配制的培养基开始进行定型内胚层分化，记为分化D0天。
(4)分化开始后每24小时更换新鲜的上述培养基，于D3天时即可获得定型内胚层细胞。
对比例2
该对比例2中，除分化培养基中不添加NAC外，其他步骤同实施例2。
实施例3
1、一种人多能干细胞分化为定性内胚层细胞的培养基，该培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括以下组分：10ng/ml Activin A，1％B27，0.2％牛血清白蛋白，1％双抗，ATP。
2、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体包括以下步骤：
(1)使用mTeSR+1％双抗作为生长培养基，在1：100稀释比例的基质胶上培养人胚胎干细胞。
(2)步骤(1)中的人胚胎干细胞培养4-5天后克隆长大，此时细胞密度约为培养板孔板底面积的80％-90％，使用Accutase于37℃细胞培养箱中静置3分钟，显微镜下观察细胞呈圆球状，立即加入DMEM/F12培养基终止消化，轻轻吹打重悬后计数，按0.8X105/每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内，正常生长培养基培养。
(3)步骤(2)中的细胞培养一天后密度达到80％左右，此时换上上述新鲜配制的培养基开始进行定型内胚层分化，记为分化D0天。
(4)分化开始后每24小时更换新鲜的上述培养基，于D4天时即可获得定型内胚层细胞。
对比例3
该对比例中，作为阳性对照,具体操作如下：
1、一种人多能干细胞分化为定性内胚层细胞的培养基
该培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括以下组分：100ng/ml Activin A，2.5uM CHIR99021，1％B27，0.2％牛血清白蛋白，1％双抗，ATP。
2、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体包括以下步骤：
(1)使用mTeSR+1％双抗作为生长培养基，在1：100稀释比例的基质胶上培养人胚胎干细胞。
(2)步骤(1)中的人胚胎干细胞培养4-5天后克隆长大，此时细胞密度约为培养板孔板底面积的80％-90％，使用Accutase于37℃细胞培养箱中静置3分钟，显微镜下观察细胞呈圆球状，立即加入DMEM/F12培养基终止消化，轻轻吹打重悬后计数，按0.8X105/每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内，正常生长培养基培养。
(3)步骤(2)中的细胞培养一天后密度达到80％左右，此时换上上述新鲜配制的培养基开始进行定型内胚层分化，记为分化D0天。
(4)分化开始后每24小时更换新鲜的上述培养基，于D4天时收获定型内胚层细胞，作为阳性对照。
对比例4
该对比例中，具体操作同实施例3，不同之处在于，培养基中不添加ATP，作为阴性对照。
实施例4
1、一种人多能干细胞分化为定性内胚层细胞的培养基，该培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括以下组分：10ng/ml Activin A，1％B27，0.2％牛血清白蛋白，1％双抗，NAC。
2、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体包括以下步骤：
(1)使用mTeSR+1％双抗作为生长培养基，在1：100稀释比例的基质胶上培养人胚胎干细胞。
(2)步骤(1)中的人胚胎干细胞培养4-5天后克隆长大，此时细胞密度约为培养板孔板底面积的80％-90％，使用Accutase于37℃细胞培养箱中静置3分钟，显微镜下观察细胞呈圆球状，立即加入DMEM/F12培养基终止消化，轻轻吹打重悬后计数，按0.8X105/每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内，正常生长培养基培养。
(3)步骤2)中的细胞培养一天后密度达到80％左右，此时换上上述新鲜配制的培养基开始进行定型内胚层分化，记为分化D0天。
(4)分化开始后每24小时更换新鲜的上述培养基，于D4天时即可获得定型内胚层细胞。
对比例5
该对比例中，具体操作同实施例4，不同之处在于，培养基中不添加NAC，作为阴性对照。
实施例5
1、一种人多能干细胞分化为定性内胚层细胞的培养基，该培养基以DMEM/F12为基础培养基，还包括以下组分：10ng/ml Activin A，1％B27，0.2％牛血清白蛋白，1％双抗，ATP， NAC。
2、一种人多能干细胞分化为定型内胚层细胞的培养方法，使用上述培养基进行培养，具体包括以下步骤：
(1)使用mTeSR+1％双抗作为生长培养基，在1：100稀释比例的基质胶上培养人胚胎干细胞。
(2)步骤(1)中的人胚胎干细胞培养4-5天后克隆长大，此时细胞密度约为培养板孔板底面积的80％-90％，使用Accutase于37℃细胞培养箱中静置3分钟，显微镜下观察细胞呈圆球状，立即加入DMEM/F12培养基终止消化，轻轻吹打重悬后计数，按0.8X105/每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的24孔板内，正常生长培养基培养。
(3)步骤(2)中的细胞培养一天后密度达到80％左右，此时换上上述新鲜配制的培养基开始进行定型内胚层分化，记为分化D0天。
(4)分化开始后每24小时更换新鲜的上述培养基，于D4天时即可获得定型内胚层细胞。
对比例6
该对比例中，具体操作同实施例5，不同之处在于，培养基中不添加ATP和NAC，作为阴性对照。
实施例6
1、一种人多能干细胞分化为定性内胚层细胞的培养基，具体操作步骤与实施例1相同，不同之处主要在于，人多能干细胞为人诱导多能干细胞，为了验证不同细胞系中有着一致的效果。不同之处次要部分，基础培养基为DMEM，分化时间为4天。
对比例7
该对比例中，具体操作同实施例6，不同之处在于，培养基中不添加ATP。
实施例7
一种人多能干细胞分化为定性内胚层细胞的培养基，具体操作步骤与实施例2相同，不同之处主要在于，人多能干细胞为人诱导多能干细胞，为了验证不同细胞系中有着一致的效果。不同之处次要部分，基础培养基为DMEM，分化时间为4天。
对比例8
该对比例中，具体操作同实施例7，不同之处在于，培养基中不添加NAC。
实验例1
对各实施例和各对比例的定型内胚层细胞的阳性率以及定型内胚层细胞标志基因的 mRNA水平或定型内胚层细胞阳性率的免疫荧光进行检测。
一、检测方法为：
1、人胚胎干细胞来源的定型内胚层细胞的阳性率检测：
将上述分化获得的细胞用TrypLE于37℃CO2培养箱中静置1分钟，之后用2％FBS进行终止消化，轻轻吹打收集细胞液于1.5ml EP管中。随即于4℃离心机中3000rpm离心3 分钟，弃上清获得细胞沉淀。用2％FBS按1：200比例配制CXCR4-APC抗体稀释液，每个样品取200ul抗体稀释液轻轻吹打细胞沉淀，并置于冰上避光孵育30分钟。同时准备一个样品加入APC-Isotype稀释液(1：200)作为阴性对照组。之后4℃，3000rpm离心3分钟，弃上清，用2％FBS洗两次。最终用预冷的PBS重悬细胞获得细胞悬液，转移至流式管中，上流式仪检测CXCR4阳性率。本研究中使用的抗体为Ant-CXCR4(555976，1：200， BD Biosciences)。
2、实时荧光定量PCR检测定型内胚层细胞标志基因的mRNA水平变化：
(1)细胞总RNA提取
实验采用美基生物的总RNA小量抽提试剂盒(双柱型)进行细胞的RNA提取，具体操作步骤如下：
将分化的定型内胚层细胞用TrypLE进行消化，离心后弃上清收集细胞沉淀，加入适量的Buffer RL至细胞样品中，用移液枪吹打打散细胞(一般细胞量不超过5X106时加入350ul 的Buffer RL)，可于-80℃保存；准备适量冰，从冰箱取出待提样品，融化混匀后将其转移至gDNA过滤柱中(柱子放于收集管中)，14000g离心2分钟；丢弃gDNA过滤柱，加入样品等倍体积的70％乙醇，用移液枪吹打3-5次；将RNA纯化柱装在收集管上，并把样品溶液转移至RNA柱中，12000g离心1分钟；倒弃滤液，把柱子装回收集管中，并加入500ul 的BufferRW1，12000g离心1分钟；倒弃滤液，把柱子装回收集管中，并加入500ul的Buffer RW2；12000g离心1分钟，此步重复一次；倒弃滤液，把柱子装回收集管中，12000g空离2分钟；将RNA柱转移至新的1.5ml EP管中，加入35ul RNase Free水至柱子膜中央，室温静置2分钟；12000g离心1分钟，弃去柱子，检测RNA浓度及质量，于-80℃保存。
(2)反转录获得cDNA
取1ug上述提取的RNA使用Abclonal反转录试剂盒制备cDNA。从冰箱取出上述提取的RNA置于冰上，融化混匀后取1ug于PCR八联管中，再加入4ul Abclonal的5x qRTSuperMix，最终用RNase Free水补足总体积至20ul；手指轻轻将其拨匀，并用掌上离心机将反应液聚集到管底部，放于Bio-rad的PCR仪中进行反转录反应。反转录条件为25℃5 分钟；42℃20分钟；85℃5秒，结束后于-20℃保存。
(3)实时荧光定量PCR
取适量上述反转录得到的cDNA(对应RNA的量为每孔10-20ng)，加入5ul的Bimake2×SYBR Green qPCR Master Mix，上游引物5μM，下游引物5μM(上下游引物混合液共1ul)，最后用RNase Free的水补足总体积至10μl；使用Bio-rad的CFX384定量PCR仪进行扩增，反应条件为：95℃5min，95℃15s，60℃30s，重复39个循环。实验结果使用△△CT 方法对比管家基因GAPDH进行分析。
本研究中用到的引物：
GAPDH前向引物AATGAAGGGGTCATTGATGG(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA(如SEQ ID NO.2所示)；
FOXA2前向引物GGAGCAGCTACTATGCAGAGC(如SEQ ID NO.3所示)，反向引物CGTGTTCATGCCGTTCATCC(如SEQ ID NO.4所示)；
SOX17前向引物GCATGACTCCGGTGTGAATCT(如SEQ ID NO.5所示)，反向引物TCACACGTCAGGATAGTTGCAGT(如SEQ ID NO.6所示)；
CXCR4前向引物TACACCGAGGAAATGGGCTCA(如SEQ ID NO.7所示)，反向引物AGATGATGGAGTAGATGGTGGG(如SEQ ID NO.8所示)；
3、人胚胎干细胞来源的定型内胚层细胞阳性率的免疫荧光检测：
上述细胞分化结束后弃去孔内培养基，用DPBS轻轻清洗两遍细胞；随后每孔小心加入200ul预冷的4％多聚甲醛，室温固定15分钟；固定结束后用DPBS轻轻清洗细胞3次，每次5分钟；每孔内小心加入200ul封闭液(8.7ml DPBS+1ml驴血清+0.3ml 10％Triton-X100)均匀覆盖板孔，于室温孵育1-2小时；之后加入150-200ul含有一抗的封闭液覆盖板孔，室温孵育1-2小时；然后回收一抗溶液保存于4℃冰箱，并用DPBS轻轻清洗细胞3次，每次 5分钟；每孔加入150-200ul含有二抗的封闭液覆盖板孔，室温避光孵育1-2小时；DPBS 轻轻清洗细胞3次，每次5分钟；每孔加入150-200ul的DAPI溶液(1：5000稀释于DPBS 中)，室温避光孵育5-10分钟；DPBS轻轻清洗细胞3次，每次5分钟，最后用DPBS浸泡细胞，置于倒置荧光显微镜下进行荧光观察并采集图片。本研究中使用的一抗为 Anti-FOXA2(ET1703-76，1:200，HuaBio)；Anti-SOX2(66411-1-Ig，1：200，Proteintech)。本研究中使用的荧光二抗为DoαMsTRITC(1:200，Jackson ImmunoResearch)；DoαRb 488 (1:200，Jackson ImmunoResearch)；核染料：DAPI(罗氏，USA)。
二、检测结果及分析
1、实施例1和对比例1
检测实施例1和对比例1中细胞CXCR4阳性率及定型内胚层标志性基因的mRNA表达情况，具体结果见图1-2。
图1为实施例1和对比例1中定型内胚层细胞阳性率的流式结果，其中“0”为对比例1。结果显示，与对比例1的65％左右阳性率相比，实施例1随着ATP浓度的增加CXCR4阳性细胞的比例发生了变化。ATP浓度在1uM以下时对定型内胚层分化没有影响，而浓度在 0.1-2mM范围内可看到CXCR4阳性细胞比例对ATP有着浓度依赖性，此时细胞状态仍旧正常，最终阳性率可达到90％左右，与对比例1相比有着明显的增高，当ATP浓度在3mM 时细胞便会出现大量死亡。
图2为实施例1和对比例1获得的细胞中定型内胚层细胞标志性基因FOXA2、SOX17、CXCR4的mRNA表达情况。与对比例1-“0”相比，实施例1中加入0.1、0.5、1mM的ATP 后可以使FOXA2表达量增加1.5倍，SOX17表达量增加1.8倍，CXCR4表达量增加2倍。
图1和图2结果一致，均显示ATP的加入可以明显促进定型内胚层的分化，并且具有浓度依赖性。同时对于对比例1而言，往往需要分化4-5天才能达到90％左右的分化效率，而实施例1中ATP的加入使分化时间缩短为3天便可达到相当的分化水平，减少了定型内胚层细胞分化所需要的时间。
2、实施例2和对比例2
检测实施例2和对比例2中细胞CXCR4阳性率及定型内胚层标志性基因的mRNA表达情况，具体结果见图3-4。
图3为实施例2和对比例2中定型内胚层细胞阳性率的流式结果，其中“0”为对比例2。结果显示，与对比例2的65％左右阳性率相比，实施例2随着NAC浓度的增加CXCR4阳性细胞的比例发生了变化。NAC浓度在0.5mM以下时对定型内胚层分化没有影响，而浓度在1-3mM范围内可看到CXCR4阳性细胞比例对NAC有着浓度依赖性，最终阳性率可达到 85％左右，与对比例2相比有着明显的提高。
图4为实施例2和对比例2获得的细胞中定型内胚层细胞标志性基因FOXA2、SOX17、CXCR4的mRNA表达情况。与对比例2-“0”相比，实施例2中加入1、2、3mM的NAC后可以使FOXA2表达量增加0.8倍，SOX17表达量增加1.5倍，CXCR4表达量增加1.5倍。
图3和图4结果一致，均显示NAC的加入可以明显促进定型内胚层的分化，并且具有浓度依赖性。同时对于对比例2而言，往往需要分化4-5天才能达到90％左右的分化效率，而实施例2中NAC的加入使分化时间缩短为3天便可达到相当的分化水平，减少了定型内胚层细胞分化所需要的时间。
3、实施例3、对比例3和对比例4
检测实施例3和对比例3、对比例4中细胞CXCR4阳性率的流式及免疫荧光结果，具体结果见图5-6。
图5为实施例3和对比例3、对比例4中定型内胚层细胞阳性率的流式结果。结果显示作为阴性对照的对比例4的CXCR4阳性率约为60％，作为阳性对照的对比例3的阳性率为80％多，说明Activin A浓度由100ng/ml降为10ng/ml使CXCR4阳性率大大降低，此时实施例3中加入0.5或1mM的ATP即可将CXCR4的阳性率提高到与对比例3相当的水平。说明ATP可以部分取代Activin A，从而大大降低分化成本，约不超过对比例3的1/10。
图6为实施例3和对比例3、对比例4中定型内胚层细胞阳性率的免疫荧光结果。结果显示，与对比例3相比，对比例4在降低Activin A浓度后FOXA2阳性的定型内胚层细胞的比例明显降低，约降50％；而实施例3在对比例4基础上加入0.5mM的ATP后，FOXA 2阳性细胞比例大大提高至与对比例3相当的水平。说明ATP的存在可以弥补因Activin A 降低造成的定型内胚层分化效率的降低。
图5和图6结果一致，都说明了在10ng/ml的Activin A条件下仅需要0.5mM的ATP即可达到100ng/ml Activin A的分化效果，从而大大降低定型内胚层的分化成本。
4、实施例4、对比例3和对比例5
检测实施例4和对比例3、对比例5中细胞CXCR4阳性率的流式及免疫荧光结果，具体结果见图7-8。
图7为实施例4和对比例3、对比例5中定型内胚层细胞阳性率的流式结果。结果显示作为阴性对照的对比例5的CXCR4阳性率约为60％，作为阳性对照的对比例3的阳性率为80％多，说明Activin A浓度由100ng/ml降为10ng/ml使CXCR4阳性率大大降低，此时实施例4中加入2mM的NAC即可将CXCR4的阳性率提高到70％多。说明NAC可以部分取代Activin A，从而大大降低分化成本。
图8为实施例4和对比例3、对比例5中定型内胚层细胞阳性率的免疫荧光结果。结果显示，与对比例3相比，对比例5在降低Activin A浓度后FOXA2阳性的定型内胚层细胞的比例明显降低，约降50％；而实施例4在对比例5基础上加入2mM的NAC后，FOXA2 阳性细胞比例大大提高接近于对比例3的水平。说明NAC的存在可以弥补因Activin A降低造成的定型内胚层分化效率的降低。
图7和图8结果一致，都说明了在10ng/ml的Activin A条件下仅需要2mM的NAC即可接近于100ng/ml Activin A的分化效果，从而大大降低定型内胚层的分化成本。
5、实施例5、对比例3和对比例6
检测实施例5和对比例3、对比例6中细胞CXCR4阳性率的流式及免疫荧光结果，具体结果见图9-10。
图9为实施例5和对比例3、对比例6中定型内胚层细胞阳性率的流式结果。结果显示作为阴性对照的对比例6的CXCR4阳性率约为60％，作为阳性对照的对比例3的阳性率为80％多，说明Activin A浓度由100ng/ml降为10ng/ml使CXCR4阳性率大大降低，此时实施例5中加入0.1mM的ATP和2mM的NAC即可将CXCR4的阳性率提高到80％多，与对比例3水平相当。ATP和NAC的组合比单独加入相同水平的其中任一种获得的定型内胚层的阳性率都高，并且组合时仅需要0.1mM的ATP，比单独加入ATP所需要的浓度低，从而说明ATP和NAC可以同时部分取代Activin A，从而大大降低分化成本，但两者需要合适的浓度配比。
图10为实施例5和对比例3、对比例6中定型内胚层细胞阳性率的免疫荧光结果。结果显示，实施例5中加入0.1mM的ATP和2mM的NAC即可将CXCR4的阳性率提高到与对比例3相当的水平。
图9和图10结果一致，都说明了在10ng/ml的Activin A条件下仅需要0.1mM的ATP和2mM的NAC即可接近于100ng/ml Activin A的分化效果，从而大大降低定型内胚层的分化成本。ATP和NAC在定型内胚层分化过程中有着一定的协同作用，但需要找到合适的浓度组合，0.05～0.15mM ATP和1.5～2.5mM NAC为合适的浓度组合范围。
6、实施例6和对比例7
图11为实施例6和对比例7中定型内胚层细胞阳性率的流式结果，其中“0”为对比例7。结果显示，对比例7中人诱导多能干细胞的定型内胚层细胞分化效率仅为40％，而实施例6 中加入3mM或4mM的ATP可将分化效率分别提高至50％、70％。说明在人诱导多能干细胞的定型内胚层分化体系中ATP也有利于其分化。
实施例6和实施例1都说明了ATP对定型内胚层的正向调控作用，尤其对于分化能力较弱的细胞系作用更明显，但所需的具体浓度不同。实施例1中ATP在3mM时会影响人胚胎干细胞的存活，但此浓度却是实施例6中人诱导多能干细胞所需要的，只有在5mM时才会明显影响人诱导多能干细胞的存活。所以同时说明对于不同的细胞系而言，定型内胚层分化所需要ATP的合适浓度是不一样的；具体地：
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物胚胎干细胞时，ATP较为优选的浓度为 0.1～2mM；
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物诱导多能干细胞时，ATP较为优选的浓度为0.1～4mM。
7、实施例7和对比例8
图12为实施例7和对比例8中定型内胚层细胞阳性率的流式结果，其中“0”为对比例8。结果显示，对比例8中人诱导多能干细胞的定型内胚层细胞分化效率仅为40％，而实施例7 中加入1mM的NAC可将分化效率分别提高至60％，且提高NAC浓度至2mM后分化效率可达到接近80％，进一步提到浓度至4mM后分化效率仍维持在近80％的水平。说明在人诱导多能干细胞的定型内胚层分化体系中NAC也有利于其分化。
实施例7和实施例2都说明了NAC对定型内胚层的正向调控作用，且在分化能力较弱的细胞系内作用更明显，但所需的具体浓度不同。实施例1中NAC在3mM后会影响人胚胎干细胞的存活，但此浓度却不影响人诱导多能干细。所以同时说明对于不同的细胞系而言，定型内胚层分化所需要NAC的合适浓度是不一样的；具体地：
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物胚胎干细胞时，NAC较为优选的浓度为1～2mM NAC；
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物诱导多能干细胞时，NAC较为优选的浓度为1～4mM。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgaagggg tcattgatgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggtgaagg tcggagtcaa 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagcagcta ctatgcagag c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtgttcatg ccgttcatcc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcatgactcc ggtgtgaatc t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcacacgtca ggatagttgc agt 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tacaccgagg aaatgggctc a 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agatgatgga gtagatggtg gg 22
Claims (8)
1.一种ATP的应用，其特征在于，所述应用包括：加入ATP提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物多能干细胞的类型包括：哺乳动物胚胎干细胞或哺乳动物诱导多能干细胞；
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物胚胎干细胞时，所述ATP的浓度为0.1～2mM；
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物诱导多能干细胞时，所述ATP的浓度为0.1～4mM。
3.一种NAC的应用，其特征在于，所述应用包括：加入NAC提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物多能干细胞的类型包括：哺乳动物胚胎干细胞或哺乳动物诱导多能干细胞；
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物胚胎干细胞时，所述NAC的浓度为1～2mM；
所述哺乳动物多能干细胞为哺乳动物诱导多能干细胞时，所述NAC的浓度为1～4mM。
5.一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加1～10ng/ml Activin A、0.5～1.5% B27、0.1～0.3%牛血清白蛋白、0.5～1.5%双抗，0.05～0.15 mM ATP和1.5～2.5 mM NAC。
6.根据权利要求5所述的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述培养基的组分还包括：2～3 mM GSK3抑制剂。
7.一种哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求5-6任一项所述的培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，以使分化成定型内胚层细胞。
8.根据权利要求7所述的一种哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：
将哺乳动物多能干细胞使用生长培养基进行培养3-7天，后消化计数并接种于包被有基质胶的孔板内，采用正常生长培养基培养；
待达到75～85%的密度，换上权利要求5-6任一项所述的培养基进行培养，获得定型内胚层细胞。
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