CN116942887A - 一种高生物黏附性和高生物相容性的促周围神经损伤修复新型生物粘合剂的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药及卫生技术领域，具体涉及一种高生物黏附性和高生物相容性的促周围神经损伤修复新型生物粘合剂的制备及应用，包括以下步骤：(1)、在壳聚糖上接枝乙酰半胱氨酸和多巴制备具有自交联性能的改性壳聚糖凝胶，为粘合层。(2)、制备具有高强度和强韧性的海藻酸钠和聚丙烯酰胺共价/非共价双交联凝胶，为基底层。(3)、将粘合层均匀涂布于基底层上，按照使用的要求切割成不同大小的块状物，即得到高生物黏附性和高生物相容性的促周围神经损伤修复新型生物粘合剂。

Description

一种高生物黏附性和高生物相容性的促周围神经损伤修复新 型生物粘合剂的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种高生物黏附性和高生物相容性的新型生物粘合剂的制备，及其在周围神经损伤修复中的应用，属于医药及卫生技术领域。

背景技术：

周围神经损伤是一种发病率较高，治疗困难且愈后较差的疾病，多出现于车祸，利器伤等情况。周围神经损伤患者仅有部分轻症可以完全治愈，绝大多数患者在治疗完成后仍会受困于后遗症，包括功能不全或瘫痪。所以，提升周围神经损伤修复效果对于神经损伤患者具有重要意义。

目前周围神经损伤的修复方法主要有：(1)手术法(包括端端缝合，神经移植术等)；(2)组织工程法(包括导管支架法和生物粘合法)；(3)基因工程法；(4)神经生长因子调节法等。由于缝合线对神经功能的恢复有不利影响，还会增加神经瘢痕发生概率，目前组织工程法已成为代替手术法的研究中热门方向之一。导管支架通常需要4-6个月的恢复周期，且费用较高；生物粘合法中已上市纤维蛋白胶力学强度较差。生物粘合水凝胶用于软组织修复可以简化手术过程，减少对组织损伤，在一定程度上可以取代缝合术。虽暂无临床案例报道，但类似于纤维蛋白胶的生物粘合剂已经成为了热门的研究领域。

现有文献中关于周围神经损伤修复的生物粘合剂仍有一定缺陷与不足，如：加入氧化剂，表面活性剂或强碱等交联剂来增加凝胶的强度，降低了凝胶的生物安全性；合成方式复杂或造价昂贵；降解时间不符合周围神经损伤修复周期等。

针对目前周围神经损伤修复方法中存在的问题，理想的用于周围神经损伤修复的生物粘合剂，应同时具备可减少缝合线降低不利影响；具有良好生物黏附性以及生物相容性；制备使用简易且造价不高；无需额外添加剂等功能。

壳聚糖是唯一天然的碱性含氮多糖，在经过衍生改性后，可以制备出纳米粒、水凝胶、薄膜等多种形式的材料，目前在药物载体、组织工程、医用敷料等生物医学领域有着广泛应用。壳聚糖及其衍生物作为促进周围神经修复材料优点有以下几点：①无毒、刺激性低、生物可降解以及生物相容性好；②壳聚糖可以促进细胞增殖，抑制成纤维细胞增殖，减少瘢痕组织形成；③壳聚糖成本低廉且有很高的改性潜力；④壳聚糖的降解产物壳寡糖(COS)可以促进细胞增殖并防止外源性损伤诱导的细胞凋亡；等等。

根据周围神经损伤修复用生物粘合剂的性能要求，拟设计一种新型生物粘合剂，由粘合层和基底层双层结构组成。粘合层是具有良好生物黏附性的水凝胶，可以与组织进行强力黏附；基底层是一种凝胶膜状材料，发挥多种功能：①被覆粘合层，便于包裹神经的操作，且可以让粘合层紧密牢固地黏附于神经组织；②具有强韧性，能抵御外界额外张力、拉伸力的影响，防止粘合的神经分离。

通过在壳聚糖骨架分子上偶联乙酰半胱氨酸(NAC)和多巴(DA)制备乙酰半胱氨酸和多巴偶联的巯基化壳聚糖凝胶(CS-NAC-DA)作为粘合层。CS-NAC-DA具有以下特点：①在一定浓度下可以进行自交联反应，无需额外加入交联剂，在增强了生物黏附性的同时保持良好的生物相容性；②其作为水凝胶，可以均匀覆盖至损伤组织处，并且因为多巴和巯基双基团的引入，具有良好的生物黏附性，在生理条件下CS-NAC-DA可以将受损神经断端粘合在一起。

制备海藻酸盐和聚丙烯酰胺非共价/共价双交联凝胶作为基底层。非共价交联的海藻酸盐凝胶可以发挥迟滞耗散功能使外界影响无法直接作用于受损部位；共价交联的聚丙烯酰胺凝胶具备很高强度。基底层具有高生物相容性，高韧性，高能量耗散性，可以帮助粘合层在复杂多变的机体环境内保持稳定，持续发挥助修复作用。

将粘合层均匀涂布于基底层上，按照使用的要求切割成不同大小的块状物，即得到所设计的新型生物粘合剂。基底层可以与粘合层之间也形成氢键，二者相互适配，可以协同发挥作用。

综上所述，新型生物粘合剂的粘合层加基底层组合，使其可以在周围神经损伤修复中较为便捷地使用，且材料强度足以承担保护受损神经的需求，具有工业化制备和临床转化前景。同时，新型生物粘合剂因为其优良的性质，可以探索其在更多领域的使用，如血管，软骨，关节以及其他非医学领域等，其可以成为未来组织工程学中的优选材料。

发明内容

本发明的目的是针对目前市售的纤维蛋白胶以及现有研究中存在的缺陷，提供一种具有修复周围神经损伤的新型生物粘合剂。

在壳聚糖分子链上偶联乙酰半胱氨酸和多巴即制得粘合层；通过海藻酸钠和聚丙烯酰胺的共价/非共价双交联制备了基底层；将粘合层均匀涂于基底层即制备出力学强度和生物相容性均具备的新型生物粘合剂。

本发明所述的新型生物粘合剂，制备过程主要包括以下步骤：

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

(3)基底层的制备：

(4)新型生物粘合剂的制备：

将适量CS-NAC-DA铺展于基底层表面，即得到新型生物粘合剂。

详细的，本发明所述的新型生物粘合剂，制备过程主要包括以下步骤：

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

(1.1)壳聚糖(CS)酸化溶解：称取壳聚糖置于三角烧瓶中，加入盐酸溶液，搅拌使其充分溶胀、溶解，得壳聚糖溶液；

(1.2)配制乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取乙酰半胱氨酸的固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(1.3)配制1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基磺酸基丁二酰亚胺(NHS)溶液：称取EDC与NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(1.4)羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

(1.5)偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌，并调节pH值；

(1.6)透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC；

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

(2.1)CS-NAC溶解：称取CS-NAC置于三角烧瓶中，加入去离子水溶液，搅拌使其充分溶胀；

(2.2)配制多巴(DA)溶液：称取DA固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(2.3)配制EDC与NHS溶液：称取EDC与的NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(2.4)羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

(2.5)偶联反应与调节pH：将CS-NAC溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌，调节pH，将混合溶液置于层析柜中搅拌；

(2.6)透析与冷冻干燥：将反应液装入透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC-DA；

(3)基底层的制备：

(3.1)使用HBSS缓冲液(Hank's平衡盐溶液)配制的海藻酸钠溶液和丙烯酰胺溶液，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

(3.2)使用HBSS缓冲液配制适量的亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)溶液，硫酸钙(CaSO4)溶液，过硫酸铵(APS)溶液；

(3.3)将MBAA溶液，四甲基乙二胺(TEMED)和CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液内，搅拌至混合均匀；

(3.4)在混合溶液中迅速加入APS溶液，快速搅拌；

(3.5)将混合溶液灌入模具中，放置过夜使其交联，即得基底层；

(4)新型生物粘合剂的制备：

使用注射器吸取适量CS-NAC-DA凝胶，缓慢铺展在基底层表面，即得到新型生物粘合剂。

优选的，(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

壳聚糖(CS)酸化溶解：称取壳聚糖250-1000mg置于三角烧瓶中，加入盐酸溶液，搅拌使其充分溶胀、溶解，得壳聚糖溶液；

配制乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取500-2000mg的乙酰半胱氨酸的固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取500-2000mg的EDC与250-1000mg的NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌，之后通过滴加氢氧化钠溶液调节pH至5.8-6.0，将混合溶液置于层析柜中搅拌；

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入的透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC。

优选的，(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

CS-NAC溶解：称取250-1000mg的CS-NAC置于三角烧瓶中，加入去离子水溶液，搅拌使其充分溶胀；

配制多巴(DA)溶液：称取750-3000mg的DA固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取750-3000mg的EDC与300-1500mg的NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将CS-NAC溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌，滴加完毕后，室温下继续搅拌，滴加氢氧化钠溶液调节pH至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于层析柜中搅拌；

透析与冷冻干燥：将反应液装入的透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC-DA。

优选的，(3)基底层的制备：

第一步：使用HBSS缓冲液配制1-4％的海藻酸钠溶液和6-24％的丙烯酰胺溶液，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

第二步：使用HBSS缓冲液配制适量1-3％的亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)溶液，0.1-0.75M的硫酸钙(CaSO4)溶液，0.1-0.5M的过硫酸铵(APS)溶液；

第三步：将36-140μL MBAA溶液，8-32μL四甲基乙二胺(TEMED)和200-400μL CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液内，搅拌至混合均匀；

第四步：在混合溶液中迅速加入250-1000μL APS溶液，快速搅拌；

第五步：将混合溶液灌入模具中，放置过夜使其交联，即得基底层。

优选的，(4)新型生物粘合剂的制备：

配制2-8％的CS-NAC-DA凝胶，使用注射器吸取适量缓慢滴加在基底层表面，并使其均匀铺展，根据需要切割成适宜大小，即得到新型生物粘合剂。

进一步优选的，本发明所述的新型生物粘合剂的制备，包括以下步骤：

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

壳聚糖(CS)酸化溶解：称取分子量为1000KDa的壳聚糖500mg置于100mL三角烧瓶中，加入30mL pH＝5的盐酸溶液，搅拌2h使其充分溶胀。

配制乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取1000mg的乙酰半胱氨酸的固体置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用。

配制EDC与NHS溶液：称取1000mg的EDC与500mg的NHS置于50mL三角烧瓶中，加入10mL去离子水，室温溶解，备用。

羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化。

偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌半小时。之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌8h。

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h。透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC。冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用。

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

CS-NAC溶解：称取CS-NAC500mg置于200mL三角烧瓶中，加入50mL去离子水溶液，搅拌1h使其充分溶胀。

配制多巴(DA)溶液：称取1500mg的DA固体置于50mL三角烧瓶中，加入50mL去离子水，室温溶解，备用。

配制EDC与NHS溶液：称取1500mg的EDC与750mg的NHS置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用。

羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化。

偶联反应与调节pH：将CS-NAC溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌半小时。滴加完毕后，室温下继续搅拌半小时。之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌48h。

透析与冷冻干燥：将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h。透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC-DA。冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用。

(3)基底层的制备：

第一步：使用HBSS缓冲液配制2％的海藻酸钠(粘度：20-100Cp)溶液和12％的丙烯酰胺溶液20mL，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

第二步：使用HBSS缓冲液配制适量2％的亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)溶液，0.375M的硫酸钙(CaSO4)溶液，0.27M的过硫酸铵(APS)溶液；

第三步：将72μL MBAA溶液，16μL四甲基乙二胺(TEMED)和400μL CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液内，搅拌至混合均匀；

第四步：在混合溶液中迅速加入500μL APS溶液，快速搅拌2分钟；

第五步：将混合溶液灌入模具中，放置过夜使其交联，即得基底层。

(4)新型生物粘合剂的制备：

配制4％的CS-NAC-DA凝胶，使用1mL注射器吸取适量缓慢滴加在基底层表面，并使其均匀铺展(约10μL/0.32cm²)，根据需要切割成适宜大小，即得到新型生物粘合剂。

其中，4％的CS-NAC-DA凝胶的配制过程：

第一步：称取120mg的CS-NAC-DA冻干品，将其放入西林瓶中；

第二步：使用移液枪吸取3ml去离子水滴入西林瓶中，使冻干品溶胀2小时；

第三步：将溶胀后4％的CS-NAC-DA涡旋混匀，静置去除气泡。

本发明的另一个目的在于提供新型生物粘合剂作为周围神经损伤修复手术后防止粘连的医用材料。

本发明的另一个目的在于提供新型生物粘合剂在制备促周围神经损伤修复、粘肌腱，血管受伤，手术切口的药物中的应用。

本发明所述的新型生物粘合剂，可以与其他药物活性成分联合使用，将其他药物活性成分加入到该生物粘合剂中。

其中，所述其他药物活性成分选自：

(1)生长因子类，如神经生长因子(NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、肌纤维细胞生长因子(MGF)等；

(2)药物类，如神经节苷脂、胞二磷胆碱等。

本发明相对于现有的生物粘合剂，具有以下优点：

(1)生物相容性好，可生物降解且降解速度适宜；(2)粘合层具有自交联性能，不依靠额外交联剂即可自交联形成凝胶，方便制备及使用的同时不影响生物安全性；(3)粘合层具有足够的生物黏附力，可以牢固覆盖在湿润细小的神经上，将神经断端粘合促进神经损伤修复；(4)基底层具有强韧性及高强度，可以很大程度上减小外力对受损部位的影响，具有较好生物黏附性，不易从手术部位脱落；(5)所有原料均获取容易，且成本低廉。

本发明相对于现有技术而言，最大的技术改进和创新在于步骤(2)和(4)。现有技术中，成品粘合剂一般需要对凝胶进行氧化、碱化等处理。该处理步骤会增加使用繁琐性，降低生物相容性，且抗干扰能力较弱。本发明创新点在于①成品CS-NAC-DA具有自交联属性，无需额外成胶步骤；②不使用传统处理方法，而使用基底层负载粘合层进行对受损神经部位的粘合。该方法保证了粘合层高生物相容度的同时，高韧性的基底层可以减小干扰保证粘合层的效用。

本发明还具有以下优点：粘合层具有自交联性，无需额外使用交联剂；基底层具有强韧性，以及包裹凝胶保护周围神经损伤处的功能；新型生物粘合剂力学性质优良，生物黏附性强，生物相容度高，可以促进周围神经损伤修复进程，在修复效果方面明显优于常规手术法。

本发明的反应条件是经过大量筛选后得到的，特别是对于CS、NAC、DA等成分的用量、溶液浓度、反应时间、pH值、反应温度等条件都进行优选。

附图说明：

图1、CS-NAC不同投料比-巯基偶联率图

图2、CS-NAC不同反应时长-巯基偶联率图

图3、CS-NAC-DA不同投料量-多巴偶联率图

图4、CS-NAC-DA不同反应时长-多巴偶联率图

图5、粘合层凝胶材料CS-NAC-DA紫外光谱图

图6、粘合层凝胶材料扫描电镜图

图7、不同浓度CS-NAC-DA凝胶的流变学振幅扫描图谱

图8、不同浓度CS-NAC-DA凝胶的流变学频率扫描图谱

图9、不同浓度CS-NAC-DA凝胶的流变学时间扫描图谱

图10、不同浓度CS-NAC-DA凝胶的流变学应力应变测试图谱

图11、不同浓度CS-NAC-DA凝胶的生物黏附强度。

其中****代表与纤维蛋白胶相比P<0.0001；##代表与4％的CS-NAC-DA相比P<0.01；####代表与4％的CS-NAC-DA相比P<0.0001。图片显示平均数，误差线表示±SD。

图12、基底层流变学频率扫描图谱

图13、基底层流变学应力应变测试图谱

图14、基底层扫描电镜图

图15、粘合层的体外降解中剩余质量随时间变化曲线图

图16、基底层的体外降解中剩余质量随时间变化曲线图

图17、新型生物粘合剂的体内降解实验中不同部位每周剩余质量与百分比对比图

图18、凝胶浸提液对L929细胞的细胞毒作用图。

a：100％ CS-NAC-DA浸提液组；b：75％ CS-NAC-DA浸提液组；c：50％ CS-NAC-DA浸提液组；d：25％ CS-NAC-DA浸提液组；e：100％基底层浸提液组；f：75％基底层浸提液组；g：50％基底层浸提液组；h：25％基底层浸提液组。

图19、大鼠坐骨神经横断修复手术后大鼠步距随时间变化曲线图。

其中，A为对照组；B为横断组；C为阳性对照组；D为手术组；E为实验组一；F为实验组二。检验方法采用单因素方差分析，*代表与横断组相比，P<0.05；#代表与阳性对照组相比，P<0.05；＝代表与手术组相比，P<0.05；+代表与实验组一相比，P<0.05。

图20、坐骨神经横断修复手术后大鼠抓握力随时间变化曲线图。

其中，A为对照组；B为横断组；C为阳性对照组；D为手术组；E为实验组一；F为实验组二。*代表与横断组相比，P<0.05；#代表与阳性对照组相比，P<0.05；＝代表与手术组相比，P<0.05；+代表与实验组一相比，P<0.05。

图21、坐骨神经横断修复手术六周后大鼠坐骨神经拉断力测定。

其中，A为对照组；B为横断组；C为阳性对照组；D为手术组；E为实验组一；F为实验组二。*代表与横断组相比，P<0.05；#代表与阳性对照组相比，P<0.05；＝代表与手术组相比，P<0.05；+代表与实验组一相比，P<0.05。

图22、坐骨神经横断修复手术六周后大鼠IL-6含量测定。其中，A为对照组；B为横断组；C为阳性对照组；D为手术组；E为实验组一；F为实验组二。*代表与对照组相比，P<0.05；**代表与对照组相比，P<0.01。

图23、大鼠跟腱横断修复手术后大鼠步距随时间变化曲线图。其中，A为对照组；B为横断组；C为手术组一；D为手术组二；E为实验组一；F为实验组二。*代表与横断组相比，P<0.05；#代表与手术组二相比，P<0.05；＝代表与实验组一相比，P<0.05。

图24、大鼠跟腱横断修复手术后大鼠抓握力随时间变化曲线图。其中，A为对照组；B为横断组；C为手术组一；D为手术组二；E为实验组一；F为实验组二。*代表与横断组相比，P<0.05；#代表与手术组二相比，P<0.05；＝代表与实验组一相比，P<0.05。

图25、大鼠跟腱横断修复手术两周后大鼠坐骨神经拉断力测定。其中，A为对照组；B为横断组；C为手术组一；D为手术组二；E为实验组一；F为实验组二。#代表与手术组二相比，P<0.05；＝代表与实验组一相比，P<0.05。

图26、大鼠跟腱横断修复手术四周后大鼠坐骨神经拉断力测定。其中，A为对照组；B为横断组；C为手术组一；D为手术组二；E为实验组一；F为实验组二。*代表与横断组相比，P<0.05；#代表与手术组二相比，P<0.05；＝代表与实验组一相比，P<0.05。

图27、大鼠跟腱横断修复手术两周后大鼠IL-6含量测定。其中，A为对照组；B为横断组；C为手术组一；D为手术组二；E为实验组一；F为实验组二。#代表与对照组相比，P<0.05；*代表与横断组相比，P<0.05；；＝代表与实验组一相比，P<0.05。

图28、大鼠跟腱横断修复手术四周后大鼠IL-6含量测定。其中，A为对照组；B为横断组；C为手术组一；D为手术组二；E为实验组一；F为实验组二。#代表与对照组相比，P<0.05；*代表与横断组相比，P<0.05；＝代表与实验组一相比，P<0.05。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步的解释和说明，但不作为对于本发明的限制使用。

实施例1、粘合层材料的合成

乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖的合成方法如下：

壳聚糖酸化溶解：称取分子量为1000KD的壳聚糖500mg置于100mL三角烧瓶中，加入30mL pH＝5的盐酸溶液，搅拌2h使其充分溶胀。

配制乙酰半胱氨酸溶液：称取1000mg的乙酰半胱氨酸的固体置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用。

配制EDC与NHS溶液：称取1000mg的EDC与500mg的NHS置于50mL三角烧瓶中，加入10mL去离子水，室温溶解，备用。

羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化。

偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌半小时。之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌8h。

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h。透析结束后冷冻干燥，冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用。

多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖的合成方法如下：

巯基壳聚糖溶解：称取巯基壳聚糖500mg置于200mL三角烧瓶中，加入50mL去离子水溶液，搅拌1h使其充分溶胀。

配制多巴溶液：称取1500mg的多巴固体置于50mL三角烧瓶中，加入50mL去离子水，室温溶解，放于一旁备用。

配制EDC与NHS溶液：称取1500mg的EDC与750mg的NHS置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，放于一旁备用。

羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的多巴溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化。

偶联反应与调节pH：将巯基壳聚糖溶液，缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌半小时。之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌48h。

透析与冷冻干燥：将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h。透析结束后冷冻干燥，冻干产物置于4℃冰箱密封保存备用。

实施例2、粘合层材料制备工艺的优化

CS-NAC投料量优化

壳聚糖酸化溶解：称取分子量为1000KD的壳聚糖100mg置于50mL三角烧瓶中，加入20mL pH＝5的盐酸溶液，搅拌1h使其充分溶胀，平行进行四组。

配制乙酰半胱氨酸溶液：分别称取乙酰半胱氨酸的固体100mg(A组)、150mg(B组)、200mg(C组)、300mg(D组)，并分别置于50mL三角烧瓶中，加入10mL去离子水，室温溶解，备用。

配制EDC与NHS溶液：分别称取100mg的EDC与50mg的NHS(A组)；150mg的EDC与75mg的NHS(B组)；200mg的EDC与100mg的NHS(C组)；300mg的EDC与150mg的NHS(D组)，并分别置于50mL三角烧瓶中，加入10mL去离子水，室温溶解，备用。

羧基活化：将同一组别的EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化。

偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌半小时。之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌8h。

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h。透析结束后冷冻干燥，冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用。

对A～D组冻干产物进行巯基偶联率检测并作图，选择适宜投料量比。

图1可见，偶联率随NAC与CS的质量比增大而增加，且D组(CS：NAC＝1：3)与C组(CS：NAC＝1：2)相比无明显优势，考虑经济性等因素，选择CS：NAC＝1：2的投料比。

CS-NAC反应时长优化

壳聚糖酸化溶解：称取分子量为1000KD的壳聚糖100mg置于50mL三角烧瓶中，加入20mL pH＝5的盐酸溶液，搅拌1h使其充分溶胀，平行进行四组。

配制乙酰半胱氨酸溶液：称取乙酰半胱氨酸的固体200mg置于50mL三角烧瓶中，加入10mL去离子水，室温溶解，备用。平行进行四组。

配制EDC与NHS溶液：称取200mg的EDC与100mg的NHS并置于50mL三角烧瓶中，加入10mL去离子水，室温溶解，备用。平行进行四组。

羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化。

偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌半小时。之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌。将平行的四组溶液分为A、B、C、D组，分别反应2h、4h、8h、12h。

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h。透析结束后冷冻干燥，冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用。

对A～D组冻干产物进行巯基偶联率检测并作图，选择适宜反应时长。

图2可见，偶联率随时长增加而增加，且D组(反应12h)与C组(反应8h)相比无明显优势，考虑经济性等因素，选择8h的反应时长。

CS-NAC-DA投料量优化

巯基壳聚糖溶解：称取巯基壳聚糖100mg置于100mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水溶液，搅拌1h使其充分溶胀。平行进行五组。

配制多巴溶液：分别称取多巴的固体100mg(A组)、150mg(B组)、200mg(C组)、300mg(D组)、400mg(E组)，并分别置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用。

配制EDC与NHS溶液：分别称取100mg的EDC与50mg的NHS(A组)；150mg的EDC与75mg的NHS(B组)；200mg的EDC与100mg的NHS(C组)；300mg的EDC与150mg的NHS(D组)；400mg的EDC与200mg的NHS(E组)，并分别置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用。

羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入同一组别搅拌中的多巴溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化。

偶联反应与调节pH：将巯基壳聚糖溶液，缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌半小时。之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌48h。

透析与冷冻干燥：将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h。透析结束后冷冻干燥，冻干产物置于4℃冰箱密封保存备用。

对A～E组冻干产物进行多巴偶联率检测并作图，选择适宜投料量比。

图3可见，偶联率随DA与CS-NAC的质量比增大而增加，且E组(CS-NAC：DA＝1：4)与D组(CS-NAC：DA＝1：3)相比无明显优势，考虑经济性等因素，选择CS-NAC：DA＝1：3的投料比。

CS-NAC-DA反应时长优化

巯基壳聚糖酸化溶解：称称取巯基壳聚糖100mg置于100mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水溶液，搅拌1h使其充分溶胀。平行进行六组。

配制多巴溶液：称取多巴的固体300mg置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用。平行进行六组。

配制EDC与NHS溶液：称取300mg的EDC与150mg的NHS并置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用。平行进行六组。

羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化。

偶联反应与调节pH：巯基壳聚糖溶液，缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌半小时。之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌。将平行的六组溶液分为A、B、C、D、E、F组，分别反应8h、12h、24h、36h、48h、60h。

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h。透析结束后冷冻干燥，冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用。

对A～F组冻干产物进行多巴偶联率检测并作图，选择适宜反应时长。

图4可见，偶联率随时长增加而增加，且F组(反应60h)与E组(反应48h)相比无明显优势，考虑经济性等因素，选择48h的反应时长。

实施例2、粘合层材料的紫外光谱扫描

使用pH＝4的盐酸配制1mg/mL的壳聚糖溶液，使用去离子水配制0.1mg/mL的乙酰半胱氨酸和多巴溶液，以及1mg/mL的多巴-巯基化壳聚糖溶液。使用紫外-分光光度计对以上溶液进行波长扫描。从图5可以看出，多巴在278nm处有紫外吸收，乙酰半胱氨酸没有紫外吸收，CS-NAC-DA紫光光谱扫描显示成功将DA偶联至壳聚糖大分子上。

实施例3、粘合层材料的微观结构检测

取适量CS-NAC；CS-DA；CS-NAC-DA样品，分别配制为2％、4％以及6％的溶液，取2mL进行冷冻干燥，冻干样品进行，扫描电镜(SEM)观察凝胶在使用浓度下的内部结构。图6可见，CS-NAC冻干样品具有排列整齐且致密的片层状结构；CS-DA凝胶冻干样品具有大量三维多孔的结构；CS-NAC-DA凝胶冻干样品具有CS-NAC和CS-DA共同的性质，即同时具有排列整齐且致密的片层状结构以及三维多孔网络结构。随着浓度升高，CS-NAC-DA孔洞数量增加，孔径减小，片层致密性增加，三维网络结构致密性增加。

实施例4、粘合层的流变学性质测定

(1)改性壳聚糖的流变学性质振幅扫描

用旋转流变仪测定CS；CS-NAC；CS-DA；CS-NAC-DA弹性模量G’和粘性模量G”随应变变化曲线。测试时向流变仪测试圆平台上滴加400μL溶液，旋转流变仪的参数设置为：温度为25℃，频率固定为1rad/s，对数变化的应变范围为0.1％至100％，取20个点。启动仪器，流变仪会在运行时自动记录流变学数据。从图7可见，除2％的CS-NAC-DA在高应变区间弹性模量G’小于粘性模量G”，表现出流体性质，4％和6％的CS-NAC-DA弹性模量G’始终大于粘性模量G”，证明其始终表现为固体状凝胶。CS-NAC-DA的线性粘弹区约为0.1％-13％的应变区间。

(2)改性壳聚糖的频率扫描

用旋转流变仪测定CS；CS-NAC；CS-DA；CS-NAC-DA弹性模量G’和粘性模量G”随频率变化曲线。测试时向流变仪测试圆平台上滴加400μL溶液，旋转流变仪的参数设置为：温度为25℃，应变固定为1％，对数变化的频率范围为0.1至100rad/s，取20个点。启动仪器，流变仪会在运行时自动记录流变学数据。从图8可见，2％的CS-NAC-DA弹性模量G’和粘性模量G”曲线同样在约0.12rad/s处相交，证明低浓度的CS-NAC-DA交联度较低。4％和6％的CS-NAC-DA弹性模量G’始终大于粘性模量G”，证明其内部存在交联结构，侧面反映了CS-NAC-DA自交联的可行性。

(3)改性壳聚糖的时间扫描

用旋转流变仪测定CS；CS-NAC；CS-DA；CS-NAC-DA弹性模量G’和粘性模量G”随时间变化曲线。测试时向流变仪测试圆平台上滴加400μL溶液，旋转流变仪的参数设置为：温度为25℃，应变固定为1％，频率固定为1rad/s，线性变化的时间范围为0至240s，取20个点。启动仪器，流变仪会在运行时自动记录流变学数据。从图9可见，2％和4％的CS-NAC-DA在整个时段内均保持良好的稳定性，未出现CS-DA所表现出的氧化导致曲线上升的现象，说明相同浓度下CS-NAC-DA更为稳定。6％的CS-NAC-DA时间扫描曲线出现了升高的现象，高浓度的CS-NAC-DA在空气中更易被氧化。

(4)改性壳聚糖的应力应变

用旋转流变仪测定CS；CS-NAC；CS-DA；CS-NAC-DA应力随应变变化曲线。测试时向流变仪测试圆平台上滴加400μL溶液，旋转流变仪的参数设置为：温度为25℃，频率固定为1rad/s，对数变化的应变范围为0.1％至100％，取20个点。启动仪器，流变仪会在运行时自动记录流变学数据。图10可见，CS-NAC-DA拥有较高的抗应变性能。

实施例5、不同浓度CS-NAC-DA凝胶的生物黏附强度测试

本实验采用国际标准改进的ASTM F2255-05方法测试粘合剂样品的黏附强度。具体操作如下：

第一步：准备新鲜猪皮，将其切割为2cm宽的条状，用生理盐水将其冲洗干净并擦干；

第二步：准备不同浓度的样品，使用pH＝5的盐酸配制2％CS溶液，使用去离子水配制2％、4％以及6％的CS-NAC；CS-DA；CS-NAC-DA样品；

第三步：将50μL不同浓度的各样品均匀涂抹至猪皮上，涂抹面积为2cm×2cm；

第四步：将涂抹样品部分粘结在一起，使用500g砝码压在粘结部位，持续10min；

第五步：使用物性仪夹具夹紧猪皮未粘结部分，调整夹具距离，是粘结部分处于未受力状态；

第六步：设定物性仪驱动参数，驱动臂以10mm/s的速度上升，上升400mm后自动停止，期间物性仪可记录拉伸过程中最大拉伸力。拉伸力与粘结面积的比值即为黏附强度(单位Kpa)。

图11可见，4％的CS-NAC-DA与2％的CS-NAC-DA的黏附强度具有极显著性差异(P<0.001)，与6％的CS-NAC-DA的黏附强度具有显著性差异(P<0.01)；并且4％的CS-NAC-DA的黏附强度与阳性对照纤维蛋白胶组具有显著性差异(P<0.0001)，说明合成的改性壳聚糖较纤维蛋白胶具有更强大的力学性质。

实施例6、基底层的合成

基底层的合成步骤如下：

第一步：使用HBSS配制2％的海藻酸钠溶液和12％的丙烯酰胺溶液20mL，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

第二步：使用HBSS配制适量2％的MBAA溶液，0.375M CaSO4，0.27M APS；

第三步：将72μL MBAA溶液，16μL TEMED溶液和400μL CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液，搅拌至混合均匀；

第四步：在混合溶液中迅速加入500μL APS，快速搅拌2分钟；

第五步：将混合溶液倒出装入模具中，放置过夜使其交联。

实施例7、基底层的微观结构检测

第一步：配制块状基底层。将配制好的凝胶液，倒入六孔板中，密封交联48小时。48小时后，取出块状基底层；

第二步：将冻干样品进行切片，用扫描电镜(SEM)观察凝胶在使用浓度下的内部结构。

图12可见，基底层的横截面具有大量交联结构形成的孔洞，致密且排布整齐。纵截面与横截面类似，更多体现出一些片层结构。可以看出基底层的均匀性，也可以观察到基底层紧密规律的三维网状结构，从微观结构上证明了该凝胶紧密的双交联形式。

实施例8、基底层的流变学

(1)基底层的频率扫描测试

用旋转流变仪测定基底层弹性模量G’和粘性模量G”随频率变化曲线。测试时向流变仪测试圆平台上放置半径为1cm，高度为0.2cm的圆柱形基底层，旋转流变仪的参数设置为：温度为25℃，应变固定为1％，对数变化的频率范围为0.1至100rad/s，取20个点。启动仪器，流变仪会在运行时自动记录流变学数据。图13可见，基底层的弹性模量G’始终远远高于粘性模量G”，说明其在任何情况下均表现出固体性质；随着频率的升高，其仍然表现出固体性质，也未发生断裂情况，说明其本身强度足够且相对稳定。

(2)基底层的应力应变测试

用旋转流变仪测定基底层应力随应变变化曲线。测试时向流变仪测试圆平台上放置半径为1cm，高度为0.2cm的圆柱形基底层，旋转流变仪的参数设置为：温度为25℃，频率固定为1rad/s，对数变化的应变范围为0.1％至100％，取20个点。启动仪器，流变仪会在运行时自动记录流变学数据。从图14可见，在50％应变之前，底部几乎没有收到压强信号。说明在50％应变之前的应变，基底层的内部结构就将其耗散，从而证明基底层可以迟滞并耗散小应变而不影响其内部的受损组织。在50％应变之后，接收器逐渐接收到其信号，并且直到100％的应变。该现象说明基底层几乎可以达到100％的应变而不解体断裂，充分证明了其韧性；同时，100％应变对应压强为4Mpa。

实施例9、基底层和粘合层的体外降解

第一步：配制溶菌酶浓度为1200μg/L的0.01MPBS溶液；

第二步：配制粘合层凝胶(即4％的CS-NAC-DA凝胶)，制备基底层凝胶；

第三步：将1g粘合层凝胶或基底层凝胶分别置于15mL离心管中，称取凝胶+离心管的重量；加入10mL溶菌酶PBS溶液，并于6h、12h、24h、以及之后每隔一天更换新的溶菌酶PBS溶液。换液时倒出溶菌酶PBS溶液，称取剩余凝胶+离心管的重量，计算降解率。

从图15、图16可见，粘合层凝胶在第4天就已经降解超过50％，从第6天开始，降解速度逐渐降低，趋于平缓，于第25天完全降解；基底层凝胶在第5天降解达到了50％，从第6天到第15天，降解速度保持稳定，第15天开始，降解速度逐渐趋于平缓，于第29天完全降解。两层凝胶均有良好降解性。

实施例10、粘合层和基底层体内降解

实验测定取200g左右雌性SD大鼠36只，随机分为三组，每组12只，分别用于测定粘合层、基底层、新型生物粘合剂(基底层载粘合层)在大鼠体内的降解速度。具体操作如下：

大鼠腹腔注射20％乌拉坦麻醉，在大鼠背部剪开表皮，将降解样品放入皮下，缝合表皮；大鼠右下肢腿窝处剪开表皮，钝性分离将肌肉层逐层分离，直至可以观察到坐骨神经，将降解样品放入创口，置于坐骨神经上方，缝合表皮；大鼠右下肢腿部剪开表皮，暴露跟腱，将降解样品置于跟腱表面，缝合表皮。

第一组：用于测定粘合层凝胶在背部、坐骨神经处以及跟腱处的降解。每只大鼠在背部皮下放置粘合层凝胶0.25g，在坐骨神经处放置粘合层凝胶0.05g，在跟腱处放置粘合层凝胶0.05g。共12只大鼠，在手术后1/2/3/4周随机挑选3只大鼠处死。观察其降解情况，将降解剩余部分取出，测量降解剩余质量。

第二组：用于测定基底层在背部、坐骨神经处以及跟腱处的降解。每只大鼠在背部皮下放置基底层凝胶0.3g，在坐骨神经处放置基底层凝胶0.1g，在跟腱处放置基底层凝胶0.1g。共12只大鼠，在手术后1/2/3/4周随机挑选3只大鼠处死。观察其降解情况，将降解剩余部分取出，测量降解剩余质量。

第三组：用于测定新型生物粘合剂在背部、坐骨神经处以及跟腱处的降解。第三组降解质量为1、2组加和，即每只大鼠在背部皮下放置粘合层凝胶0.25g+基底层凝胶0.3g，在坐骨神经处放置粘合层凝胶0.05g+基底层凝胶0.1g，在跟腱处放置粘合层凝胶0.05g+基底层凝胶0.1g。共12只大鼠，在手术后1/2/3/4周随机挑选3只大鼠处死。观察其降解情况，将降解剩余部分取出，测量降解剩余质量。

从图17中可见，新型生物粘合剂降解速度较为缓慢，可能的原因是由于基底层的包裹，极大地减缓了粘合层凝胶的降解速度，这也意味着针对于神经组织，新型生物粘合剂的保护性比单凝胶或基底层具有更长的效应期，符合神经组织修复常规时长。

实施例11、水凝胶浸提液的细胞毒

第一步，水凝胶DMEM浸提溶液的制备：将4％ CS-NAC、4％CS-DA、4％CS-NAC-DA样品以体积比1:4的比例，基底层以体积比1:10的比例，加入到DMEM培养液中，在37℃恒温培养箱内静置孵化24h，得到水凝胶DMEM培养液浸提液，吸取浸提液上清液作为100％浓度的凝胶浸提液。用DMEM培养液将凝胶100％浸提液梯度稀释为75％、50％、25％三个不同浓度的浸提液。

第二步，细胞准备：复苏小鼠成纤维细胞(L929)，将其培养于37℃、相对湿度为90％、CO2含量为5％的恒温细胞培养箱中，每两天更换细胞培养液。培养至细胞汇合度达90％左右时，用0.25％胰酶/0.02％ EDTA消化传代，将细胞传代至获得无污染且生长良好的细胞。在96孔培养板每孔中加入5×104/mL浓度的细胞悬液100μL，培养过夜使其贴壁生长。

第三步，加样：

阴性对照组：每孔加入100μL DMEM培养液；

实验组：每孔加入100μL的25％、50％、75％、100％水凝胶浸提液；

第四步，细胞培养方法：将96孔板放入恒温细胞培养箱内培养，12h后在显微镜下观察L929细胞的生长情况；

第五步，MTT检测：

(1)吸出各组每孔中的培养液，用PBS润洗三遍；

(2)用DMEM配制5mg/mL MTT溶液；

(3)每孔加入100μL 5mg/mL MTT溶液；

(4)在细胞培养箱内继续孵育3-4小时；

(5)用酶标仪在490nm处测定96孔板各孔吸光度；

(6)根据测定的吸光度计算各孔细胞的相对增殖率(RGR)。

相对增殖率RGR＝实验组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值×100％。

根据医疗器械生物学国家评价标准评定材料毒性程度，结果标准为：

材料毒性程度分级0-1级为合格；2级可结合细胞形态和细胞生长密度综合评价是否合格；大于3级为不合格。L929细胞相对增殖率与毒性级别的关系如表1所示。RGR值及其材料毒性分级如表2所示。

表1L929细胞相对增殖率与毒性反应级别对照表

表2L929细胞相对增殖率与毒性反应级别对照表

图18和表2可见，CS-NAC-DA和基底层均为0或1级毒性，说明材料生物相容性好。

实施例12、大鼠坐骨神经造模

第一步：腹腔注射乌拉坦溶液(20％，w/v)麻醉大鼠，麻醉剂量为5mL/kg；

第二步：大鼠麻醉完成后将大鼠俯卧固定，将大鼠右后背及右后肢皮毛适当修剪后，涂抹少量脱毛膏使手术部位鼠毛全部除去，以避免后续手术时皮毛掉入影响视野，或造成术后感染。使用纱布蘸取75％酒精清理大鼠背部并消毒；

第三步：于大鼠右后肢肌肉沿线用消毒后的手术剪刀剪开大鼠外皮，再剪开内皮，用消过毒的持针器将大鼠后肢筋膜层以及肌肉层钝性分离，暴露出坐骨神经。

第四步：用消毒过的显微剪刀完全剪断坐骨神经；

第五步：根据实验分组的不同，对造模完成的大鼠进行不同的处理，处理完成后将坐骨神经放回原位；

第六步：用手术缝合线缝合大鼠外皮。根据实验方案定期观察大鼠状态，记录相关数据。

将36只同一批次SD大鼠随机平均分为6组，每组6只，分组设置如表3所示。每组每周随机选择3只大鼠进行大鼠行走步距的测定；每组每周随机选择5只大鼠进行抓握力的测定。在第六周时处死大鼠，每组随机选择3只大鼠进行神经拉断力测定实验；选择3只检测手术部位坐骨神经组织的IL-6含量。

表3坐骨神经损伤修复实验大鼠分组

实施例13、大鼠坐骨神经横断实验修复效果评估实验

(1)将SD大鼠固定，暴露出其右后爪，将其右后爪在红色印泥上按20秒，使其右后爪沾足够的红色颜料。放开大鼠，引导大鼠在铺好白纸的地面进行正常行走行为。收集留有印记的白纸，测量大鼠爪印之间的距离。该实验每组随机选取三只大鼠进行。

实验结果如图19所示。对照组平均步距始终高于四个修复组(C～F)，显著性差异逐渐减小，差距随恢复进程逐渐减小。同时，修复四组(C～F)平均步距始终高于横断组，说明四种方法均有一定修复效果。

纤维蛋白胶是已经上市的可以用于神经修复的医疗材料，本实验选择其作为阳性对照。经过单因素方差分析(ANOVA)发现两组之间无显著性差异。由于实验组一数据始终高于阳性对照组，实验组一所用方法显然非劣于阳性对照组所用方法。因此我们对阳性对照组和实验组一进行了优效性检验。经过计算，第一周至第六周t值均大于95％置信区间所对应T值，可以得出实验组一所用方法步距恢复效果优于纤维蛋白胶+缝合一针方法的结论。

手术组采用目前临床手术中最常用的神经外膜缝合法，在神经外膜一周平均缝合四针，该方法可以在尽可能不损伤神经内膜的情况下将横断神经对接在一起。手术组与实验组一每周平均步距差距极小，经过ANOVA检验两种方法无显著性差异。对手术组和实验组一进行了优效性检验。经过计算，第一周至第六周t值均小于95％置信区间所对应T值，不能得出实验组一所用方法步距恢复效果优于手术法的结论。接下来对手术组和实验组一进行了非劣性检验。经过计算，第一周t值小于95％置信区间所对应T值，第二周至第六周t值均大于95％置信区间所对应T值，可以得出实验组一所用方法步距长效恢复效果不劣于手术法的结论。

(2)将SD大鼠固定，暴露出其右后爪，使其右后爪抓握抓力仪测试器，调整老鼠位置，使老鼠无意识和无外力作用下抓握测试器并后拉，抓力仪可以记录大鼠右后肢最大抓握力。该实验每组随机选取五只大鼠进行。

实验结果如图20所示。从第四周开始，实验组一平均抓握力恢复达到了显著优于阳性对照组的效果。对本实验阳性对照组和实验组一进行了优效性检验，可以得出实验组一所用方法抓握力长效恢复效果优于纤维蛋白胶+缝合一针方法的结论。

对手术组和实验组一进行了优效性检验和非劣性检验，经过计算，不能得出实验组一所用方法抓握力恢复效果优于手术法的结论，可以得出实验组一所用方法抓握力恢复效果不劣于手术法的结论。

(3)造模六周后将大鼠腹腔注射过量乌拉坦处死，解剖出大鼠手术部位坐骨神经，使用物性仪测试损伤修复神经的拉断力。使用夹具将手术部位坐骨神经上下固定，试验前调整夹具距离，使神经处于未受力状态。设定物性仪驱动参数，驱动臂以10mm/s的速度上升，上升400mm后自动停止。物性仪会在实验过程中自动记录手术部位坐骨神经断开时所产生的力，即神经拉断力。该实验每组随机选取三只大鼠进行。

实验结果如图21所示。、对照组大鼠坐骨神经拉断力达到仪器测量最大值(5N)，说明正常坐骨神经可以承受5N的拉力。横断组大鼠六周之后仅有细微的重连接，有一只大鼠神经断端之间完全没有重连接，说明神经横断之后若不做任何处理则神经修复的效果很差。所有修复组与横断组相比均有显著性差异，也证明了各修复组神经重连接显著强于横断组。阳性对照组平均神经拉断力强于横断组，但仍显著弱于正常对照组(P<0.001)，说明纤维蛋白胶修复法仅有较弱的修复效果，与正常水平差异较大。手术法是目前临床方法中修复效果最好的方法，手术组大鼠神经拉断力已经达到了5N，与对照组持平。实验组一与手术组和对照组一样，所有大鼠神经拉断力均已到达5N，说明在该仪器测定范围内，实验组一中所使用的方法的修复效果不亚于手术法，同时也均与阳性对照组有显著性差异(P<0.001)，说明这两种方法优于纤维蛋白胶粘合法。实验组二的平均神经拉断力高于横断组和阳性对照组，但与阳性对照组相比无显著性差异，说明该方法的修复效果略优于纤维蛋白胶；平均拉断力低于手术组和实验组一且与其相比有显著性差异(P<0.01)，说明六周时该方法修复效果弱于手术法和协同作用法。

实施例14、IL-6细胞因子含量测定

造模六周后将大鼠腹腔注射过量乌拉坦处死，，解剖出大鼠手术部位坐骨神经，使用组织研磨仪在-10℃研磨，研磨条件为运行频率70HZ，运行时间45s，暂停时间15s，运行次数30次。研磨后使用离心机在3000rpm 4℃的条件下离心10min，取上清，得到大鼠损伤修复神经组织的组织研磨液，用大鼠IL-6ELISA试剂盒测各组大鼠修复神经组织的组织研磨液中炎症因子IL-6的含量。该实验每组随机选取三只大鼠进行。测定步骤如下：

第一步，于实验前30min从4℃冰箱中取出试剂盒，恢复至室温，洗板3次并在滤纸上充分甩干；

第二步，加入100μL系列梯度标准品和待检测血清样本至反应孔中,封板，放入37℃孵箱中孵育90min；

第三步，洗板4次并在滤纸上充分甩干，加入100μL生物素化抗体工作液至各个反应孔中，封板，放入37℃孵箱中孵育60min；

第四步，洗板4次并在滤纸上充分甩干，加入100μL酶结合物工作液至各个反应孔中，封板，放入37℃孵箱中孵育30min；

第五步，洗板5次并在滤纸上充分甩干，加入100μL显色底物至各个反应孔中，封板，放入37℃孵箱中避光显色15min；

第六步，向各个反应孔中加入50μL终止液，5分钟内用酶标仪在450nm波长下测量各个反应孔OD值。

实验结果如图22所示。阳性对照组数值小于手术组和实验组一，说明纤维蛋白胶引起的炎症反应更小；手术组数值略高于实验组一，说明缝合线对大鼠造成的异物感和炎症反应要高于新型生物粘合剂，说明实验组一所用方法在生物相容性方面不亚于手术法；实验组二的数值低于实验组一，说明缝合线确实会对机体造成不利影响。

实施例15、大鼠跟腱造模

第一步：腹腔注射乌拉坦溶液(20％，w/v)麻醉大鼠，麻醉剂量为5mL/kg；

第二步：大鼠麻醉完成后将大鼠俯卧固定，将大鼠右后肢皮毛适当修剪后，涂抹少量脱毛膏使手术部位鼠毛全部除去。使用纱布蘸取75％酒精清理大鼠腿部并消毒；

第三步：于大鼠右后肢肌肉沿线用消毒后的手术剪刀剪开大鼠腿部外皮，再剪开内皮，暴露出跟腱。

第四步：用消毒过的显微剪刀完全剪断跟腱；

第五步：根据实验分组的不同，对造模完成的大鼠进行不同的处理，处理完成后将跟腱放回原位；

第六步：用手术缝合线缝合大鼠外皮。根据实验方案定期观察大鼠状态，记录相关数据。

将30只同一批次SD大鼠随机平均分为5组，每组6只，分组设置如表4所示。每组每周随机选择3只大鼠进行大鼠行走步距的测定；每组每周随机选择3只大鼠进行抓握力的测定。在第二周和第四周时每组随机选择3只大鼠处死后进行跟腱拉断力测定实验和手术部位跟腱组织的IL-6含量。

表4跟腱损伤修复实验大鼠分组

实施例16、大鼠跟腱横断实验修复效果评估实验

(1)步距测定实验：与实施例13实验步骤相同。

实验结果如图所示。在四周内，对照组平均步距始终高于四个修复组(C～F)，彼此之间显著性差异逐渐减小甚至消失，说明四周内造模组仍与正常大鼠有差别，但修复后期已经接近于正常大鼠水平。修复四组(C～F)平均步距始终高于横断组，且与横断组显著性差异逐渐增加，说明这四组修复速率均高于横断组。

手术法是目前临床中修复跟腱常见方法，也是目前修复效果较好的方法之一。手术组一采取的是常规的缝合一针方法(后简称手术法一)，主要目的是与实验组一使用方法形成对照；手术组二采取的是缝合四针方法(后简称手术法二)，主要目的是作为阳性对照。

图23可见，经过ANOVA检验四周内手术组二与手术组一无显著性差异。于是对手术组二和实验组一进行了优效性检验。界值δ0取0，置信区间为95％。经过计算，第一周至第四周t值均小于95％置信区间所对应T值，所以不能得出实验组一所用方法步距恢复效果优于手术法的结论。接下来对手术组和实验组一进行了非劣性检验。取手术组二与横断组四周后步距均值的差值作为阳性对照药与安慰剂比较时的效应差值，界值δ0取效应差值1/2，约为1.192cm，置信区间为95％。经过计算，第一周第二周t值小于95％置信区间所对应T值，第三周第四周t值均大于95％置信区间所对应T值，可以得出实验组一所用方法步距长效恢复效果不劣于手术组二所用方法的结论。

(2)抓握力测定实验：与实施例13实验步骤相同。

图24可见，四周内，经过ANOVA检验，手术组二与实验组一无显著性差异。于是对手术组和实验组一进行了优效性检验。界值δ0取0，置信区间为95％。经过计算，第一周至第四周t值均小于95％置信区间所对应T值，不能得出实验组一所用方法抓握力恢复效果优于手术法的结论。接下来我们对手术组和实验组一进行了非劣性检验。取手术组二与横断组四周后抓握力均值的差值作为阳性对照药与安慰剂比较时的效应差值，界值δ0取效应差值1/2，约为73.4N，置信区间为95％。经过计算，除第二周外第一周至第四周t值均大于95％置信区间所对应T值，可以得出实验组一所用方法抓握力恢复效果不劣于手术组二使用方法的结论。

(3)造模二/四周后将大鼠腹腔注射过量乌拉坦处死，解剖出大鼠手术部位跟腱，使用物性仪测试损伤修复跟腱的拉断力。使用夹具将手术部位跟腱上下固定，试验前调整夹具距离，使跟腱处于未受力状态。设定物性仪驱动参数，驱动臂以10mm/s的速度上升，上升400mm后自动停止。物性仪会在实验过程中自动记录手术部位跟腱断开时所产生的力，即跟腱拉断力。该实验每组随机选取三只大鼠进行。

跟腱属于肌肉组织，肌肉组织在收到损伤后，将会自我修复愈合，愈合的快慢即为修复速率，愈合的程度即为修复效果。本实验采用测定拉断跟腱的所需作用力来判断已损伤跟腱的愈合程度，从而定量表征修复效果。我们分别在第二周和第四周测定了跟腱拉断力从而判断跟腱的修复进程。

图25可见，在第二周时，对照组跟腱可承受5N作用力。横断组跟腱因为其没有互相愈合或愈合部分无法承受自身重力，因此无法测量拉断力，显示为0N。剩余四组均有一定数值，说明这四种方法均可以促进跟腱修复。手术组一、实验组一、实验组二与手术组二相比，跟腱平均拉断力均小于手术组二，说明在第二周时，手术法二的修复效果最佳。手术组一和实验组二与手术组二相比均有显著性差异(p<0.01)，但实验组一与手术组二相比无显著性差异，同时数值差距极小，说明在第二周时实验组一修复效果仅略低于手术组二，无明显差异。手术组一和实验组二与实验组一相比均具有显著性差异，说明在第二周时新型生物粘合剂和一针缝合线的协同作用法修复效果优于两种单一方法。

图26可见，在第四周时，对照组、手术组二以及实验组一均可以承受5N作用力，说明四周时在该仪器测定范围内手术组二和实验组一采用方法修复程度已经接近于正常大鼠，同时实验组一修复效果不亚于手术组二。手术组一与手术组二相比具有显著性差异(p<0.05)，说明手术法一与手术法二相比仍有差距；因为手术组二和实验组一数据相同，也说明手术法一修复效果弱于协同作用法，证明了新型生物粘合剂的功能性。实验组二和实验组一相比无显著性差异，但数值仍低于实验组一，说明第四周时实验组二恢复效果已接近实验组一，但仍弱于实验组一。实验组二与手术组一相比无显著性差异，且数值高于手术组一，说明新型生物粘合剂粘合法第四周时对于跟腱重连接的效果在数据上超过了手术法一。

实施例17、IL-6细胞因子含量测定

造模二/四周后将大鼠腹腔注射过量乌拉坦处死，，解剖出大鼠手术部位跟腱，使用组织研磨仪在-10℃研磨，研磨条件为运行频率70HZ，运行时间45s，暂停时间15s，运行次数50次。研磨后使用离心机在3000rpm 4℃的条件下离心10min，取上清，得到大鼠损伤修复跟腱组织的组织研磨液，用大鼠IL-6ELISA试剂盒测各组大鼠修复跟腱组织的组织研磨液中炎症因子IL-6的含量。该实验每组随机选取三只大鼠进行。测定步骤与实施例14相同。

图27可见，在第二周时，手术组一和实验组二与实验组一相比均具有显著性差异，说明在第二周时新型生物粘合剂和一针缝合线的协同作用修复法比两者单一方法均会造成更多炎症反应。

图28可见，在第四周时，手术组二与实验组一相比具有显著性差异，特别是第二周时实验组一IL-6含量略高于手术组二，四周时实验组一IL-6含量低于手术组二同时具有显著性差异，说明四针缝合线所造成的炎症反应更为持久，四周时新型生物粘合剂与一针缝合线的协同作用法在生物相容性方面优于手术法二。

实验组二与实验组一相比具有显著性差异，说明协同作用法中缝合线会造成更多更持久的炎症反应。

实施例18、生物粘合剂

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

壳聚糖(CS)酸化溶解：称取分子量为1000KDa的壳聚糖500mg置于100mL三角烧瓶中，加入30mL pH＝5的盐酸溶液，搅拌2h使其充分溶胀；

配制乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取1000mg的乙酰半胱氨酸的固体置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取1000mg的EDC与500mg的NHS置于50mL三角烧瓶中，加入10mL去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌半小时；之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌8h；

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h；透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC；冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用；

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

CS-NAC溶解：称取CS-NAC500mg置于200mL三角烧瓶中，加入50mL去离子水溶液，搅拌1h使其充分溶胀；

配制多巴(DA)溶液：称取1500mg的DA固体置于50mL三角烧瓶中，加入50mL去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取1500mg的EDC与750mg的NHS置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将CS-NAC溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌半小时；滴加完毕后，室温下继续搅拌半小时；之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌48h；

透析与冷冻干燥：将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h；透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC-DA；冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用；

(3)基底层的制备：

第一步：使用HBSS缓冲液配制2％的海藻酸钠溶液和12％的丙烯酰胺溶液20mL，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

第二步：使用HBSS缓冲液配制适量2％的亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)溶液，0.375M的硫酸钙(CaSO4)溶液，0.27M的过硫酸铵(APS)溶液；

第三步：将72μL MBAA溶液，16μL四甲基乙二胺(TEMED)和400μL CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液内，搅拌至混合均匀；

第四步：在混合溶液中迅速加入500μL APS溶液，快速搅拌2分钟；

第五步：将混合溶液灌入模具中，放置过夜使其交联，即得基底层；

(4)新型生物粘合剂的制备：

配制4％的CS-NAC-DA凝胶，使用1mL注射器吸取适量缓慢滴加在基底层表面，并使其均匀铺展，根据需要切割成适宜大小，即得到新型生物粘合剂。

实施例19、生物粘合剂

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

壳聚糖(CS)酸化溶解：称取壳聚糖250mg置于三角烧瓶中，加入盐酸溶液，搅拌使其充分溶胀；

配制乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取500mg的乙酰半胱氨酸的固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取500mg的EDC与250mg的NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌，之后通过滴加氢氧化钠溶液调节pH至5.8，将混合溶液置于层析柜中搅拌；

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入的透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC。

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

CS-NAC溶解：称取250mg的CS-NAC置于三角烧瓶中，加入去离子水溶液，搅拌使其充分溶胀；

配制多巴(DA)溶液：称取750mg的DA固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取750mg的EDC与300mg的NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将CS-NAC溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌，滴加完毕后，室温下继续搅拌，滴加氢氧化钠溶液调节pH至5.8后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于层析柜中搅拌；

透析与冷冻干燥：将反应液装入的透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC-DA。

(3)基底层的制备：

第一步：使用HBSS缓冲液(Hank's平衡盐溶液)配制1％的海藻酸钠溶液和6％的丙烯酰胺溶液，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

第二步：使用HBSS缓冲液配制适量1％的亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)溶液，0.1M的硫酸钙(CaSO4)溶液，0.1M的过硫酸铵(APS)溶液；

第三步：将36μL MBAA溶液，8μL四甲基乙二胺(TEMED)和200μL CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液内，搅拌至混合均匀；

第四步：在混合溶液中迅速加入250μL APS溶液，快速搅拌；

第五步：将混合溶液灌入模具中，放置过夜使其交联，即得基底层。

(4)新型生物粘合剂的制备：

配制6％的CS-NAC-DA凝胶，使用注射器吸取适量缓慢滴加在基底层表面，并使其均匀铺展，根据需要切割成适宜大小，即得到新型生物粘合剂。

Claims (10)

1.一种促周围神经损伤修复的生物粘合剂，其特征在于，由以下方法制备而成：

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备；

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备；

(3)基底层的制备；

(4)新型生物粘合剂的制备：将适量CS-NAC-DA铺展于基底层表面，即得到新型生物粘合剂。

2.根据权利要求1所述的生物粘合剂，其特征在于，由以下方法制备而成：

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

(1.1)壳聚糖(CS)酸化溶解：称取壳聚糖置于三角烧瓶中，加入盐酸溶液，搅拌使其充分溶胀、溶解，得壳聚糖溶液；

(1.2)配制乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取乙酰半胱氨酸的固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(1.3)配制1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基磺酸基丁二酰亚胺(NHS)溶液：称取EDC与NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(1.4)羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

(1.5)偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌，并调节pH值；

(1.6)透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC；

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

(2.1)CS-NAC溶解：称取CS-NAC置于三角烧瓶中，加入去离子水溶液，搅拌使其充分溶胀；

(2.2)配制多巴(DA)溶液：称取DA固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(2.3)配制EDC与NHS溶液：称取EDC与的NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(2.4)羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

(2.5)偶联反应与调节pH：将CS-NAC溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌，调节pH，将混合溶液置于层析柜中搅拌；

(2.6)透析与冷冻干燥：将反应液装入透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC-DA；

(3)基底层的制备：

(3.1)使用HBSS缓冲液(Hank's平衡盐溶液)配制的海藻酸钠溶液和丙烯酰胺溶液，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

(3.2)使用HBSS缓冲液配制适量的亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)溶液，硫酸钙(CaSO4)溶液，过硫酸铵(APS)溶液；

(3.3)将MBAA溶液，四甲基乙二胺(TEMED)和CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液内，搅拌至混合均匀；

(3.4)在混合溶液中迅速加入APS溶液，快速搅拌；

(3.5)将混合溶液灌入模具中，放置过夜使其交联，即得基底层；

(4)新型生物粘合剂的制备：

使用注射器吸取适量CS-NAC-DA凝胶，缓慢铺展在基底层表面，即得到新型生物粘合剂。

3.根据权利要求1所述的生物粘合剂，其特征在于，由以下方法制备而成：

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

壳聚糖(CS)酸化溶解：称取壳聚糖250-1000mg置于三角烧瓶中，加入盐酸溶液，搅拌使其充分溶胀、溶解，得壳聚糖溶液；

配制乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取500-2000mg的乙酰半胱氨酸的固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取500-2000mg的EDC与250-1000mg的NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌，之后通过滴加氢氧化钠溶液调节pH至5.8-6.0，将混合溶液置于层析柜中搅拌；

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入的透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC。

4.根据权利要求1所述的生物粘合剂，其特征在于，

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

CS-NAC溶解：称取250-1000mg的CS-NAC置于三角烧瓶中，加入去离子水溶液，搅拌使其充分溶胀；

配制多巴(DA)溶液：称取750-3000mg的DA固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取750-3000mg的EDC与300-1500mg的NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将CS-NAC溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌，滴加完毕后，室温下继续搅拌，滴加氢氧化钠溶液调节pH至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于层析柜中搅拌；

透析与冷冻干燥：将反应液装入的透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC-DA。

5.根据权利要求1所述的生物粘合剂，其特征在于，

(3)基底层的制备：

第一步：使用HBSS缓冲液(Hank's平衡盐溶液)配制1-4％的海藻酸钠溶液和6-24％的丙烯酰胺溶液，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

第二步：使用HBSS缓冲液配制适量1-3％的亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)溶液，0.1-0.75M的硫酸钙(CaSO4)溶液，0.1-0.5M的过硫酸铵(APS)溶液；

第三步：将36-140μL MBAA溶液，8-32μL四甲基乙二胺(TEMED)和200-400μL CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液内，搅拌至混合均匀；

第四步：在混合溶液中迅速加入250-1000μL APS溶液，快速搅拌；

第五步：将混合溶液灌入模具中，放置过夜使其交联，即得基底层。

6.根据权利要求1所述的生物粘合剂，其特征在于，

(4)新型生物粘合剂的制备：

配制2-8％的CS-NAC-DA凝胶，使用注射器吸取适量缓慢滴加在基底层表面，并使其均匀铺展，根据需要切割成适宜大小，即得到新型生物粘合剂。

7.根据权利要求1所述的生物粘合剂，其特征在于，包括以下步骤：

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

壳聚糖(CS)酸化溶解：称取分子量为1000KDa的壳聚糖500mg置于100mL三角烧瓶中，加入30mL pH＝5的盐酸溶液，搅拌2h使其充分溶胀；

配制乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取1000mg的乙酰半胱氨酸的固体置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取1000mg的EDC与500mg的NHS置于50mL三角烧瓶中，加入10mL去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌半小时；之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌8h；

透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h；透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC；冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用；

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

CS-NAC溶解：称取CS-NAC500mg置于200mL三角烧瓶中，加入50mL去离子水溶液，搅拌1h使其充分溶胀；

配制多巴(DA)溶液：称取1500mg的DA固体置于50mL三角烧瓶中，加入50mL去离子水，室温溶解，备用；

配制EDC与NHS溶液：称取1500mg的EDC与750mg的NHS置于50mL三角烧瓶中，加入20mL去离子水，室温溶解，备用；

羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应半小时进行羧基活化；

偶联反应与调节pH：将CS-NAC溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌半小时；滴加完毕后，室温下继续搅拌半小时；之后通过滴加1M的氢氧化钠溶液调节pH，并观察反应溶液和pH计计数，待计数稳定后至5.8-6.0后停止滴加氢氧化钠溶液，将混合溶液置于4℃层析柜中搅拌48h；

透析与冷冻干燥：将反应液装入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，用3L去离子水透析6次以上，每次透析间隔6-8h；透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC-DA；冻干产物置于4℃冰箱密封保存，备用；

(3)基底层的制备：

第一步：使用HBSS缓冲液配制2％的海藻酸钠溶液和12％的丙烯酰胺溶液20mL，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

第二步：使用HBSS缓冲液配制适量2％的亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)溶液，0.375M的硫酸钙(CaSO4)溶液，0.27M的过硫酸铵(APS)溶液；

第三步：将72μL MBAA溶液，16μL四甲基乙二胺(TEMED)和400μL CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液内，搅拌至混合均匀；

第四步：在混合溶液中迅速加入500μL APS溶液，快速搅拌2分钟；

第五步：将混合溶液灌入模具中，放置过夜使其交联，即得基底层；

(4)新型生物粘合剂的制备：

配制4％的CS-NAC-DA凝胶，使用1mL注射器吸取适量缓慢滴加在基底层表面，并使其均匀铺展，根据需要切割成适宜大小，即得到新型生物粘合剂。

8.权利要求1所述的生物粘合剂的制备方法，其特征在于，由以下方法制备而成：

(1)乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC)的制备：

(1.1)壳聚糖(CS)酸化溶解：称取壳聚糖置于三角烧瓶中，加入盐酸溶液，搅拌使其充分溶胀；

(1.2)配制乙酰半胱氨酸(NAC)溶液：称取乙酰半胱氨酸的固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(1.3)配制EDC与NHS溶液：称取EDC与NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(1.4)羧基活化：将EDC与NHS溶液缓慢逐滴加入搅拌中的NAC溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

(1.5)偶联反应与调节pH：将壳聚糖溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与NAC的混合溶液中，滴加完毕后，室温下继续搅拌，并调节pH值；

(1.6)透析与冷冻干燥：搅拌后将反应液装入透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC；

(2)多巴和乙酰半胱氨酸偶联的巯基化壳聚糖(CS-NAC-DA)的制备：

(2.1)CS-NAC溶解：称取CS-NAC置于三角烧瓶中，加入去离子水溶液，搅拌使其充分溶胀；

(2.2)配制多巴(DA)溶液：称取DA固体置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(2.3)配制EDC与NHS溶液：称取EDC与的NHS置于三角烧瓶中，加入去离子水，室温溶解，备用；

(2.4)羧基活化：将EDC与NHS溶液吸出，缓慢逐滴加入搅拌中的DA溶液中，滴加完毕后于室温搅拌反应进行羧基活化；

(2.5)偶联反应与调节pH：将CS-NAC溶液缓慢逐滴加入搅拌中的EDC、NHS与DA的混合溶液中，滴加完毕后，室温下搅拌，调节pH，将混合溶液置于层析柜中搅拌；

(2.6)透析与冷冻干燥：将反应液装入透析袋中，用去离子水透析，透析结束后冷冻干燥，即得CS-NAC-DA；

(3)基底层的制备：

(3.1)使用HBSS缓冲液配制的海藻酸钠溶液和丙烯酰胺溶液，在磁力搅拌器上搅拌均匀直至固体全部溶解，静置去除其气泡；

(3.2)使用HBSS缓冲液配制适量的亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)溶液，硫酸钙(CaSO4)溶液，过硫酸铵(APS)溶液；

(3.3)将MBAA溶液，四甲基乙二胺(TEMED)和CaSO4溶液依次逐滴加入高速搅拌中的海藻酸钠和丙烯酰胺混合溶液内，搅拌至混合均匀；

(3.4)在混合溶液中迅速加入APS溶液，快速搅拌；

(3.5)将混合溶液灌入模具中，放置过夜使其交联，即得基底层；

(4)新型生物粘合剂的制备：

使用注射器吸取适量CS-NAC-DA凝胶，缓慢滴加在基底层表面，即得到新型生物粘合剂。

9.权利要求1所述的生物粘合剂在制备促周围神经损伤修复、粘肌腱，血管受伤，手术切口的药物中的应用。

10.权利要求1所述的生物粘合剂在制备作为周围神经损伤修复手术后防止粘连的医用材料中的应用。