CN116904609B - 与马头山羊多羔性状相关的snp标记的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与马头山羊多羔性状相关的SNP标记的用途，包括SNP标记及用于检测SNP标记的试剂盒在辅助鉴定马头山羊多羔性状或选育具有多羔性状的马头山羊中的用途，该SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处，为APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点，该位点CC基因型或AC基因型的马头山羊个体的产羔数显著高于AA基因型。该SNP标记的使用提高了多羔性状鉴定结果的准确性，用其选育马头山羊，使得母羊单胎平均产羔数量增加60％以上，育种成本降低，有利于加速建立马头山羊高繁群体。

Description

与马头山羊多羔性状相关的SNP标记的用途

技术领域

本发明涉及动物分子标记技术领域，具体涉及一种与马头山羊多羔性状相关的SNP标记的用途。

背景技术

马头山羊具有性格温顺、合群性强、抗病性强、生长速度快、肉用性能好等优良特性。然而，繁殖母羊存栏量不足、饲养成本高、养殖模式落后等因素使得马头山羊生产不能完全满足消费快速增长的需要，提高母羊的繁殖效率以及优质群体的存栏量是促进马头山羊养殖提质增效的关键。产羔数是衡量母羊繁殖性能的重要指标之一，由于多羔性状是受多基因调控的复杂性状，其遗传力相对较低，以表型为基础的传统育种方法无法在短时间内提高产羔数，且其准确性是基于山羊每个世代大量表型数据，这在一定程度上限制了马头山羊品种选育的进展和准确性。

虽然分子育种技术和分子标记辅助选择为畜禽育种开辟了全新快速的道路，但是目前很少有关于山羊多羔性状候选基因的报道，关于马头山羊多羔性状候选基因的报道更少，因此，通过分子辅助标记技术对马头山羊实施早期选择的手段匮乏。

发明内容

申请人发现APOE基因(见SEQNO.1)遗传变异对马头山羊产羔数有着一定的影响，进一步探究发现，APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点与马头山羊产羔数显著相关，基于此，提供一种与马头山羊多羔性状相关的SNP标记的用途。

第一方面，本发明提供SNP标记在辅助鉴定马头山羊多羔性状中的用途，该SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处，为APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点。CC基因型或AC基因型的马头山羊个体的产羔数显著高于AA基因型。

该SNP标记丰富了山羊育种的分子标记遗传资源库，将其单独或与其他与马头山羊个体多羔性状相关的SNP标记联用来对马头山羊多羔性状进行鉴定，提高了鉴定结果的准确性。

第二方面，本发明提供用于检测SNP标记的试剂盒在辅助鉴定马头山羊多羔性状或选育具有多羔性状的马头山羊中的用途，该试剂盒含有引物对：

上游引物F：5’-TTAGGATGTTGCTGGGAGCG-3’(见SEQNO.2)，

下游引物R：5’-GTGTTGGTGATGGGGACAGA-3’(见SEQNO.3)；

该SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处。

该试剂盒中的引物对是针对18号染色体第53695869-53696787bp区间设计，包含了SNP标记，可以扩增含SNP标记的片段，提高待测物中SNP标记的浓度。

第三方面，本发明提供一种鉴定马头山羊多羔性状的方法，包括：

提取待测马头山羊的基因组DNA；

以待测马头山羊的基因组DNA为模板进行扩增；

对扩增产物测序，确定SNP标记的基因型；SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处；

根据SNP标记的基因型预测马头山羊个体多羔性状。

在本发明提供的一些实施方式中，以待测马头山羊的基因组DNA为模板进行扩增包括：

利用引物对将待测马头山羊的基因组DNA进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物；

引物对的上游引物为F：5’-TTAGGATGTTGCTGGGAGCG-3’，

引物对的下游引物为R：5’-GTGTTGGTGATGGGGACAGA-3’。

在本发明提供的一些实施方式中，根据SNP标记的基因型确定马头山羊个体的多羔性状包括：

若此SNP标记的基因型为CC基因型或AC基因型，则该马头山羊个体具有多羔性状；

若此SNP标记的基因型为AA基因型，则该马头山羊个体不具有多羔性状。

第四方面，本发明提供一种选育具有多羔性状的马头山羊的方法，对待测马头山羊的SNP标记进行检测，选择目标基因型的个体用于培育具有多羔性状的优势品种；

其中：该SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处。

在本发明提供的一些实施方式中，目标基因型最优为CC基因型，次优为AC基因型。

在本发明提供的一些实施方式中，包括以下步骤：

提取待测马头山羊的基因组DNA；

以待测马头山羊的基因组DNA为模板进行扩增反应；

对扩增产物测序，确定SNP标记的基因型；SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处；

选择目标基因型的个体用于培育具有多羔性状的优势品种。

在本发明提供的一些实施方式中，以待测马头山羊的基因组DNA为模板进行扩增包括：

利用引物对将待测马头山羊的基因组DNA进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物；

引物对的上游引物为F：5’-TTAGGATGTTGCTGGGAGCG-3’，

引物对的下游引物为R：5’-GTGTTGGTGATGGGGACAGA-3’。

本发明具有以下有益效果：

本发明利用位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处的SNP标记，即APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点对马头山羊进行多羔性状鉴定和多羔母羊选育，提高了多羔性状鉴定结果的准确性，使得母羊单胎平均产羔数量增加60％以上，育种成本降低，有利于加速建立马头山羊高繁群体。

附图说明

图1为马头山羊APOE基因内含子4序列PCR扩增产物示意图；其中：L代表MarkerDL5000，泳道1-10代表不同马头山羊个体DNA扩增结果。

图2展示了马头山羊APOE基因g.1489C>A位点的分型结果，从左到右分别是CC型、CA型和AA型的测序峰图。

具体实施方式

下面将通过以下实施例的详细说明并结合附图来进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的部分说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

山羊载脂蛋白E(ApolipoproteinE，APOE)基因位于第18号染色体上，包括6个外显子和5个内含子。APOE是由多种脂蛋白构成，通过低密度脂蛋白胆固醇受体途径摄取脂蛋白残粒，在胆固醇和其他脂质的代谢中起关键作用。颗粒细胞增殖、卵母细胞成熟以及排卵过程均需要耗能，卵母细胞和邻近卵丘细胞内的代谢和ATP水平对卵母细胞质量和胚胎健康发育起重要作用，而脂质代谢是重要的能量来源之一。有研究表明APOE(-/-)小鼠血浆胆固醇代谢紊乱，脂质堆积导致卵巢重量增加且发情频率和持续时间减少，APOE缺失使得卵泡数量增加，同时卵泡闭锁和凋亡比例增加。在人类医学中，APOE基因也被证实可以调控类固醇激素的功能，并对人类生殖有重要影响。尽管之前的报道提示APOE可能通过调节类固醇代谢影响卵巢发育进而影响马头山羊产羔数，但截至目前关于APOE基因遗传变异对山羊产羔数的影响还没有报道。

本发明通过以下实施例对APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点与马头山羊多羔性状的关系进行验证，g.1489C>A位点在APOE基因上的位置如下所示：

GTATGGGGGCGGGGCTTGCCCAGGTTCTTTGCCCCACCCCCTCCC

ATCCTCATCTTGTCGTCCTCCCGTCCGTGGTCCGTGGGTCCTCTCA

TCTGCTGGTCTATCTCCCCAGGTCTGAGGTCTCTCTGACATTCCTT

GGTTCTGAGCTGCAGTTTTACTTTCTCAGAGCCTCAGTTTCCCCA

TCCTTAAAATGAGAGTTTCTAGCGCACTACTGTCAGGCAGGTAGT

GAGGAGCAGCTAAGTGTCAGCGGTGATTATTCTCTATCTGGGGCT

GTTTTATTCTCTATCGCCCCAGCGTGGCAGTACGTGGAA(g.1489C>A)CACACATAATCCATGCTTATCAAGTGCTTAAACCG GCTGGGCGTCTCTCCACCCCATCTCCACCCCCCAGTGCTCTAAAGAAGCCCACCAGCCTCTGTGGAGCACCTCCTCTGTACCGGGTACTGTGTGCCTGGAGCGGGCAGAGGACCCTGACCGCGGTGAACTGTCTGTGTGCAG。

实施例

1、实验材料及方法

1.1实验群体与表型数据

以湖北郧西县青青马头羊养殖专业合作社和湖北鑫农生态科技有限责任公司提供的97只马头山羊母羊为试验对象，颈静脉采血，EDTA抗凝，-20℃保存，记录这些母羊的单胎产羔数，共获得母羊产羔数据97个。

1.2血液基因组DNA提取

用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，步骤如下：

1)取200μL血液样品，在样品中加入400μL的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀。向细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入4μL核糖核酸酶A(RNaseA，100mg/mL)溶液至上述处理获得的200μL样品中，振荡15s，室温放置5min。

2)加入200μL缓冲液GB和20μL蛋白酶K(ProteinaseK)的预混溶液至上述处理获得的200μL样品中，充分颠倒混匀，56℃放置15min，其间颠倒混匀数次。

3)室温放置2-5min后加入350μL缓冲液BD，充分颠倒混匀。

4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CG2中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中。

5)向吸附柱CG2中加入500μL缓冲液GDB，12000rpm(～13400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中。

6)向吸附柱CG2中加入600μL漂洗液PWB，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中。

7)重复操作步骤6。

8)12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CG2置于室温放置2min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

9)将吸附柱CG2转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加60μL洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

10)用NanoDrop分光光度计检测DNA浓度和纯度，OD260/OD280值应在1.7～2.0之间，1％琼脂凝胶电泳检测DNA质量。

1.3引物设计和PCR扩增

DNA样本经质量检查后，针对97个样本的18号染色体上53695869-53696787区间设计引物、扩增并测序。该区间内待检测的SNP标记信息如下(表1)：

表1待检测SNP标记信息

注：参考NCBI中APOE基因序列(NC_030825.1及XM_018062561.1)将该基因起始的第1个碱基标记为1，依照SNP通用编号规则由5’到3’编码排列。

主要步骤为：

(1)引物设计

根据Ensembl提供的参考序列(参考基因组ARS1:CM004579.1)，用Primer5.0设计PCR扩增引物。

上游引物F：5’-TTAGGATGTTGCTGGGAGCG-3’

下游引物R：5’-GTGTTGGTGATGGGGACAGA-3’

(2)PCR扩增

PCR反应体系(20μL)包含其中上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×TaqPCRMasterMix10μL，模板DNA1μL，ddH₂O补充至20μL。

反应过程：①95℃3min；②依次进行94℃30s、58℃45s、72℃60s三步共30个循环；③72℃10min。

(3)序列分析

扩增产物经琼脂凝胶电泳检测后送至北京擎科生物科技有限公司武汉分公司进行双向测通测序。用SeqMan软件检查测序结果，对检测到的SNP标记分型。

1.4统计分析

用Excel计算每个位点的基因型频率和等位基因频率，利用卡方检验分析每个位点的哈代—温伯格平衡情况。利用IBMSPSSStatistics21软件中一般线性模型的单变量分析，多重比较采用LSD法，对各位点基因型与产羔数进行关联分析，结果以“平均值±标准误”表示。分析模型为：Y＝μ+G+ε，其中Y为性状的观察值；μ为群体平均值；G为基因型效率；ε为随机残差效应。

2、试验结果

2.1PCR扩增结果

PCR扩增产物电泳结果如图1所示，扩增效果良好，扩增片段大小约900bp，与预期目的片段大小吻合，可用于后续测序与分析。

2.2g.1489C>A位点多态性分析

g.1489C>A位点在马头山羊群体中的多态性如图2所示。测序峰图显示该位点在马头山羊群体中存在CC、CA和AA三种基因型。

g.1489C>A位点的基因型频率、基因频率、遗传多样性及哈代—温伯格平衡检验分析结果如表2所示，g.1489C>A处于哈代—温伯格平衡状态，其位点为中度多态(0.25<PIC<0.50)。

表2g.1489C>A位点的多态性分析

注：PIC为多态性信息量，He为期望杂合度，Ne为有效群体含量，χ²为卡方值(P<0.05)。

2.3SNP标记与山羊多羔性状的关联分析

采用IBMSPSSStatistics21软件分析了APOE基因g.1489C>A位点的不同基因型对山羊产羔数的影响(表3)。结果显示g.1489C>A位点CC基因型和AC基因型个体的产羔数显著高于AA型(P<0.05)。CC及AC基因型个体与AA基因型个体相比，产羔数分别平均增加0.80和0.72只，分别提高了66.67％和60％。

表3g.1489C>A位点多态性与产羔数关联分析(均值±标准误)

注：产羔数以“均值±标准误”表示。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

以上研究结果提示APOE基因可以作为影响马头山羊多羔性状的重要候选基因，可以利用APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点对马头山羊群体产羔数进行标记辅助选择。在生产实践中，可以对g.1489C>A位点为CC及AC基因型的个体留为种羊使用，提高马头山羊群体的产羔数进而提高经济效益。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.用于检测SNP标记的试剂在辅助鉴定马头山羊多羔性状中的用途，其特征在于：所述SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处，为APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点，CC基因型或AC基因型的马头山羊个体的产羔数显著高于AA基因型；APOE基因在NCBI中的版本号为NC_030825.1。

2.用于检测SNP标记的试剂盒在辅助鉴定马头山羊多羔性状中的用途，其特征在于：所述试剂盒含有引物对：

上游引物F：5’-TTAGGATGTTGCTGGGAGCG-3’，

下游引物R：5’-GTGTTGGTGATGGGGACAGA-3’；

所述SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处，为APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点，CC基因型或AC基因型的马头山羊个体的产羔数显著高于AA基因型；APOE基因在NCBI中的版本号为NC_030825.1。

3.一种鉴定马头山羊多羔性状的方法，其特征在于，包括：

提取待测马头山羊的基因组DNA；

以待测马头山羊的基因组DNA为模板进行扩增；

对扩增产物测序，确定SNP标记的基因型；所述SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处为APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点，CC基因型或AC基因型的马头山羊个体的产羔数显著高于AA基因型；APOE基因在NCBI中的版本号为NC_030825.1；

根据SNP标记的基因型预测马头山羊个体的多羔性状。

4.根据权利要求3所述的鉴定马头山羊多羔性状的方法，其特征在于：所述以待测马头山羊的基因组DNA为模板进行扩增包括：

利用引物对将所述待测马头山羊的基因组DNA进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物；

所述引物对的上游引物为F：5’-TTAGGATGTTGCTGGGAGCG-3’，

所述引物对的下游引物为R：5’-GTGTTGGTGATGGGGACAGA-3’。

5.根据权利要求3所述的鉴定马头山羊多羔性状的方法，其特征在于：所述根据SNP标记的基因型确定马头山羊个体的多羔性状包括：

若所述SNP标记的基因型为CC基因型或AC基因型，则该马头山羊个体具有多羔性状；

若所述SNP标记的基因型为AA基因型，则该马头山羊个体不具有多羔性状。

6.一种选育具有多羔性状的马头山羊的方法，其特征在于：对待测马头山羊的SNP标记进行检测，选择目标基因型的个体用于培育具有多羔性状的优势品种；

其中：所述SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处，为APOE基因内含子4上的g.1489C>A位点，CC基因型或AC基因型的马头山羊个体的产羔数显著高于AA基因型；APOE基因在NCBI中的版本号为NC_030825.1。

7.根据权利要求6所述的选育具有多羔性状的马头山羊的方法，其特征在于：所述目标基因型为CC基因型或AC基因型。

8.根据权利要求6所述的选育具有多羔性状的马头山羊的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测马头山羊的基因组DNA；

以待测马头山羊的基因组DNA为模板进行扩增反应；

对扩增产物测序，确定SNP标记的基因型；所述SNP标记位于马头山羊18号染色体上第53696339bp处；

选择目标基因型的个体用于培育具有多羔性状的优势品种。

9.根据权利要求8所述的选育具有多羔性状的马头山羊的方法，其特征在于：所述以待测马头山羊的基因组DNA为模板进行扩增包括：

利用引物对将所述待测马头山羊的基因组DNA进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物；

所述引物对的上游引物为F：5’-TTAGGATGTTGCTGGGAGCG-3’，

所述引物对的下游引物为R：5’-GTGTTGGTGATGGGGACAGA-3’。