CN116377082B - 绵羊lcorl基因单核苷酸多态性标记在生长性状选择中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了绵羊LCORL基因单核苷酸多态性标记在生长性状选择中的应用。所述LCORL基因单核苷酸多态性标记位于绵羊6号染色体的第38069494位。以湖羊为例，该位点的基因型为AA的个体，与基因型为GA或GG的个体相比具有更快的生长速度。本发明确定了与绵羊生长性状相关的LCORL基因单核苷酸多态性标记，可以用于快速建立具有优良生长性状的绵羊种群，从而用于绵羊生长性状的早期选择，并加快绵羊分子标记辅助选择育种进程。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与家畜分子育种领域，涉及一种影响绵羊生长性状的单核苷酸多态性(SNP)标记及其应用。
背景技术
生长性状是绵羊的重要经济性状，是绵羊遗传改良的关注重点。绵羊的生长性状包括体重、体尺、生长速度等。生长性状通常受到遗传与环境因素的共同影响。在生产实践中，通过遗传改良可以有效的提高家畜的生长性状。因此，探寻与生长性状相关的候选基因或有效QTL是提高绵羊生长性状和生产性能的重要途径。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)指的是在个体基因组上的单个核苷酸发生变异，进而导致其所在整个基因位点的序列发生多态性变化。目前，以SNP为代表的第三代遗传标记正在助力畜牧业的快速发展，其相对于以限制性片段长度多态性为代表的第一代遗传标记和微卫星多态性为代表的第二代遗传标记，具有分布广泛、数量多等特点，更加适合于基因性状的研究。
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR。其依据引物末端碱基的特异性匹配，利用Touch-down PCR与荧光淬灭探针，并结合发出的荧光信号对SNP位点进行分型。具体而言，KASP需要在标记附近的扩增目标DNA序列内部进行引物设计：对于共显性标记，由于存在两条目标序列，故相应设计三条引物，包括两条位点特异性引物和一条通用引物。位点特异性引物的3’端为SNP位点，在KASP扩增过程中分别与两个通用淬火探针FAM和HEX结合，从而发出荧光信号，最后根据荧光信号进行基因分型。KASP技术可以对广泛存在于基因组DNA中的SNPs进行精准的检测，是一种高通量、低成本、低失误率的SNP分型技术，而且可以避免实验室凝胶电泳，从而实现自动化、平台化操作。
LCORL(Ligand dependent nuclear receptor compressor like)基因位于绵羊6号染色体，又称配体依赖性核受体抑制因子。LCORL基因与精氨酸代谢相关，其作用于C末端结合蛋白1(Vinayagam et al.2011)，影响基因的表达和细胞周期。LCORL基因编码一个与泛素C存在交互作用的转录因子，而多泛素编码基因已被证明参与多个细胞生物过程(Kimura et al.2010)，会影响家畜的体重和体尺性状，在已有研究中已将其作为影响马和牛生长发育的候选基因(韩玉娇等2016)。尽管有文献报道“LCORL在川中黑山羊群体中受到强烈的选择”(郭家中,等.川中黑山羊基因组近交系数和选择信号分析.四川农业大学学报,2022,40(05):656-663.DOI:10.16036/j.issn.1000-2650.202209126)，但目前尚未见到应用于绵羊的兼顾生长速度、体重和体尺性状选育的SNP标记。
发明内容
本发明的目的在于提供绵羊LCORL基因单核苷酸多态性标记在生长性状选择中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种绵羊LCORL基因单核苷酸多态性标记在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用，所述单核苷酸多态性标记位于绵羊参考基因组(ARS-UI_Ramb_v2.0)第6号染色体的第38069494位。
优选的，所述单核苷酸多态性标记为AA基因型。
一种用于检测绵羊LCORL基因单核苷酸多态性标记的KASP引物，该KASP引物包括通用引物和具有FAM接头的野生型位点特异性引物，以及具有HEX接头的突变型位点特异性引物，所述野生型位点特异性引物和突变型位点特异性引物为3’末端碱基分别与定位于绵羊参考基因组(ARS-UI_Ramb_v2.0)第6号染色体的第38069494位的单核苷酸多态性位点的等位基因A和G相同的竞争性上游引物，通用引物为下游引物(野生型位点特异性引物所加FAM接头在KASP检测中显示出红色荧光，突变型位点特异性引物所加HEX接头在KASP检测中显示出蓝色荧光)。
优选的，所述KASP引物具体为：
上游引物1-FAM：
5’-gaaggtgaccaagttcatgctTCTGGCAACTAAGATAAAAATCACAAA-3’(小写字母部分为FAM接头)
上游引物2-HEX：
5’-gaaggtcggagtcaacggattTCTGGCAACTAAGATAAAAATCACAAG-3’(小写字母部分为HEX接头)
下游引物：
5’-TGGTAAGTATTGAGCTCTGGATAATGT-3’。
一种绵羊LCORL基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
以待测绵羊的基因组DNA为模板，通过上述KASP引物扩增包含LCORL基因单核苷酸多态性位点的部分片段，然后通过对荧光的检测鉴定该单核苷酸多态性位点的基因型，所述LCORL基因单核苷酸多态性位点为绵羊参考基因组(ARS-UI_Ramb_v2.0)第6号染色体的第38069494位。
优选的，根据对荧光的区分即可确定所述LCORL基因单核苷酸多态性位点的3种基因型(参见SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的第101位碱基处的一A/G的突变位点)：AA为红色、GA为绿色、GG为蓝色。
优选的，所述绵羊为湖羊。
上述绵羊LCORL基因单核苷酸多态性的检测方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。
优选的，所述LCORL基因单核苷酸多态性位点的AA基因型为提高生长性状的遗传标记。
优选的，所述生长性状为生长速度(如日增重)、体重以及体尺性状(如体高、体长)中的任意一种或多种。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过对于绵羊LCORL基因的核苷酸突变检测分析，发现并鉴定了与绵羊生长性状相关的LCORL基因SNP位点(即绵羊参考基因组第6号染色体的第38069494位)，并就此提供了一种鉴别绵羊生长性状的分子标记(遗传标记)及方法，可以用于快速建立生长性状优良的绵羊种群，从而为绵羊品种改良提供遗传样本依据，有利于缩短品种培育周期，加快品种培育进程，同时也有利于提高选种的准确性。
附图说明
图1为绵羊LCORL基因单核苷酸多态性的检测总体技术流程图。
图2为湖羊样本基因组DNA质检电泳图；图中：1、8、16为样本编号，M为Marker。
图3为湖羊样本第6号染色体的第38069494位KASP分型结果(AA、GA、GG基因型)；图中：NTC为无模板对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到解释本发明的目的，并不是用于对本发明的保护范围进行限制。
(一)鉴定绵羊6号染色体上与生长性状相关的单核苷酸多态性标记
1.开展对于绵羊LCORL基因的核苷酸突变检测分析
参见图1，对所获得的绵羊重测序数据进行单倍型分析，发现具有不同生长性状的绵羊在6号染色体的LCORL基因区域具有不同的单倍型，且在6号染色体的第38069494位不同类型绵羊(肉用型绵羊、乳肉兼用型绵羊、中国地方品种绵羊)的等位基因频率存在明显差异，具体说明如下。
实验中获取了包括25只萨福克羊、28只杜泊羊、31只无角陶赛特羊、54只东弗里生羊、34只巴音布鲁克羊、22只哈萨克羊、10只欧拉藏羊、5只苏尼特羊、57只湖羊在内的9个品种共计266只绵羊的重测序结果(具体样本来源见表1)。这些品种的绵羊按其生长速度可分为三种类型，分别为：肉用型绵羊(萨福克羊、杜泊羊、无角陶赛特羊)、乳肉兼用型绵羊(东弗里生羊)和中国地方品种绵羊(巴音布鲁克羊、哈萨克羊、欧拉藏羊、苏尼特羊、湖羊)。其中肉用型绵羊的生长速度高于乳肉兼用型绵羊，乳肉兼用型绵羊的生长速度高于中国地方品种绵羊。
表1.样品信息表
对上述9个品种的266只绵羊的重测序数据进行单倍型分析，发现三种类型绵羊(肉用型绵羊、乳肉兼用型绵羊、中国地方品种绵羊)在LCORL基因区域分别呈现出三种不同类型的单倍型。用VCFtools软件计算各样本在LCORL基因区域各SNP位点的基因频率，发现三种类型(肉用型绵羊、乳肉兼用型绵羊、中国地方品种绵羊)绵羊在绵羊参考基因组ARS-UI_Ramb_v2.0版本第6号染色体的第38069494位的基因频率有明显差异(表2)。
表2.不同绵羊品种LCORL基因突变位点(第6号染色体的第38069494位)的遗传多态性统计
参见表2，肉用型绵羊在上述第6号染色体的第38069494位多为参考型碱基A，而中国地方品种绵羊具有更多的突变型碱基G，乳肉兼用型绵羊在上述第6号染色体的第38069494位的基因频率则介于肉用型绵羊和中国地方品种绵羊之间。
据此，可将上述第6号染色体的第38069494位作为预测绵羊生长性能的候选单核苷酸多态性位点。
(二)利用绵羊第6号染色体单核苷酸多态性标记选择具有生长性状优势的绵羊个体
本发明利用KASP分型的方法对绵羊样本6号染色体的第38069494位的多态性进行检测，并揭示该位点具有可以用作绵羊育种辅助选择的分子标记，具体说明如下。
(1)采集血样
选择湖羊为试验材料。所用湖羊均来自于陕西省榆林市上河羊厂，血样采集时间为2022年6月。
(2)基因组DNA的提取
从湖羊血样中提取DNA，DNA样品全部采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANamp Genomic DNAKit)进行提取，提取时按试剂盒提供的操作说明书进行操作。
(3)样品DNA质量
使用Thermo Scientific公司的NanoDrop 2000C超微量分光光度计测量所提取的基因组DNA浓度，结果显示，样品浓度均在100ng/μL以上，260/280值在1.8-2.0之间；电泳结果显示基因组DNA条带清晰无杂质(图2)，表明所提取的基因组DNA完整度良好，符合后续试验标准。
(4)引物设计
以SEQ.ID.NO.1所示的含有绵羊参考基因组ARS-UI_Ramb_v2.0版本第6号染色体的第38069494位的LCORL基因部分片段为模板，使用Primer5.0等软件设计PCR扩增引物：
上游引物F1：5’-TCTGGCAACTAAGATAAAAATCACAAA-3’
上游引物F2：5’-TCTGGCAACTAAGATAAAAATCACAAG-3’
下游引物R：5’-TGGTAAGTATTGAGCTCTGGATAATGT-3’。
分别在两个上游引物(F1和F2)5’端加上不同的KASP接头，即FAM接头(序列如SEQ.ID.NO.5所示)和HEX接头(序列如SEQ.ID.NO.6所示)，接上FAM接头后的上游引物1-FAM的序列与接上HEX接头后的上游引物2-HEX的序列如下：
上游引物1-FAM：
5’-gaaggtgaccaagttcatgctTCTGGCAACTAAGATAAAAATCACAAA-3’
上游引物2-HEX：
5’-gaaggtcggagtcaacggattTCTGGCAACTAAGATAAAAATCACAAG-3’
将设计的上游引物1-FAM、2-HEX与通用引物(即下游引物R)一起送康普森农业科技有限公司合成。
(5)KASP扩增
以提取所得的基因组DNA为模板，以合成的上游引物1-FAM、2-HEX与通用引物作为实验引物组进行PCR扩增，具体反应体系和反应程序如下：
反应体系为：20ng/μL的基因组DNA 5μL、2×KASP Master mix 5μL，以及KASPAssay
mix(上游引物1-FAM浓度为12μM，上游引物2-HEX浓度为12μM，通用引物浓度为30μM)
0.14μL。
反应程序为：94.0℃预变性15min；94.0℃变性20s，61.0℃复性延伸60s，10个循环
(每个循环复性温度降低0.6℃)；94.0℃变性20s，55℃复性延伸60s，重复26个循环。
(6)基因分型
使用ABI 7900HT实时荧光定量PCR检测系统进行基因分型，根据分析结果确定所述的第6号染色体的第38069494位的基因型，分型结果如图3所示。
(7)基因型与性状关联分析
试验共对536只湖羊的6号染色体的第38069494位的基因型进行了检测，并测定每个个体在其2月龄时的体重、体高、体长、胸围以及出生重、日增重等数据。将基因型与表型性状进行关联分析，建立了以下最小二乘模型：
Yilkm＝μ+Genotypei+Pk+Tl+Combinationm+εilkm
其中，Yilkm是性状观察值，μ是总体均数，Genotypei为基因型效应，Pk为场次效应，Tl
为胎数效应，Combinationm为组合效应，εilkm为随机误差，假定εilkm相互独立、服从N(0，
σ2)分布。
KASP分型结果显示在536个个体当中AA基因型有73个，GA基因型有282个，
GG基因型有181个。基因型与性状的关联结果如表3所示。
表3.湖羊LCORL基因突变位点(第6号染色体的第38069494位)多态性与表型的关联分析
注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母或未标字母表示差异不显著(P>0.05)；
日增重统计为出生到2月龄
结果表明(表3)，LCORL基因突变位点(第6号染色体的第38069494位)与湖羊二月龄体重、体高、体长以及日增重呈显著相关：AA基因型个体的二月龄体重、体高、
体长以及日增重数据显著高于GA基因型和GG基因型的个体。因此筛选出具有AA基因型的个体可以有效的建立高生长性能(生长速度更快、体重及体尺性状更优)的绵羊种群。
总之，本发明通过对绵羊LCORL基因进行遗传信息分析，并结合KASP分型技术，提供了一种利用与绵羊生长性状相关的SNP标记以及在DNA水平上检测绵羊生长性能的方法，该方法不受绵羊年龄等限制，可用于在绵羊生长性状的早期选育中更有效、全面的鉴定绵羊的生长性能，同时有利于克服传统育种周期长、效率低等缺点，为快速建立高生长性能的绵羊种群提供参考，并提高绵羊生长性能的选种选育过程的针对性、准确性，从而加快绵羊的选种选育进程，促进绵羊的培育改良。
Claims (5)
1.一种绵羊LCORL基因单核苷酸多态性标记在绵羊生长性状分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述单核苷酸多态性标记位于绵羊参考基因组第6号染色体的第38069494位；
所述绵羊参考基因组的版本为ARS-UI_Ramb_v2.0；
所述第6号染色体的第38069494位参考碱基为A、突变碱基为G；
所述绵羊为湖羊；所述生长性状为体重、体高、体长以及日增重中的任意一种或多种；AA基因型个体的生长性状体重、体高、体长以及日增重显著高于GA基因型和GG基因型的个体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：用于检测绵羊LCORL基因单核苷酸多态性标记的KASP引物，该KASP引物包括具有FAM接头的野生型位点特异性引物、具有HEX接头的突变型位点特异性引物和通用引物，所述野生型位点特异性引物和突变型位点特异性引物为末端碱基分别与定位于绵羊参考基因组第6号染色体的第38069494位的单核苷酸多态性位点的等位基因A和G相同的竞争性上游引物，通用引物为下游引物；
所述绵羊参考基因组的版本为ARS-UI_Ramb_v2.0；
所述单核苷酸多态性标记为AA基因型；
所述绵羊为湖羊；AA基因型个体的体重、体高、体长以及日增重显著高于GA基因型和GG基因型的个体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述KASP引物具体为：
上游引物1-FAM：
5’-gaaggtgaccaagttcatgctTCTGGCAACTAAGATAAAAATCACAAA-3’
上游引物2-HEX：
5’-gaaggtcggagtcaacggattTCTGGCAACTAAGATAAAAATCACAAG-3’
下游引物：
5’-TGGTAAGTATTGAGCTCTGGATAATGT-3’。
4.一种绵羊LCORL基因单核苷酸多态性的检测方法在绵羊生长性状分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述绵羊LCORL基因单核苷酸多态性的检测方法包括以下步骤：以待测绵羊的基因组DNA为模板，通过KASP引物扩增包含LCORL基因单核苷酸多态性位点的部分片段，然后通过对荧光的检测鉴定该单核苷酸多态性位点的基因型，所述LCORL基因单核苷酸多态性位点为绵羊参考基因组第6号染色体的第38069494位；
所述绵羊参考基因组的版本为ARS-UI_Ramb_v2.0；
所述第6号染色体的第38069494位参考碱基为A、突变碱基为G；
所述绵羊为湖羊；所述生长性状为体重、体高、体长以及日增重中的任意一种或多种；AA基因型个体的生长性状体重、体高、体长以及日增重显著高于GA基因型和GG基因型的个体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述KASP引物包括具有FAM接头的野生型位点特异性引物、具有HEX接头的突变型位点特异性引物和通用引物，所述野生型位点特异性引物和突变型位点特异性引物为末端碱基分别与定位于绵羊参考基因组第6号染色体的第38069494位的单核苷酸多态性位点的等位基因A和G相符的竞争性上游引物，通用引物为下游引物，根据对荧光的区分即可确定所述LCORL基因单核苷酸多态性位点的3种基因型：AA为红色、GA为绿色、GG为蓝色。
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