CN116855472B - BAZ1B_K426hy的多克隆抗体及其免疫原多肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供了BAZ1B_K426羟基化(hydroxylation，hy)在制备检测肿瘤的产品中的应用，属于生物技术领域。本发明还提供了一组免疫原多肽，包括多肽A和多肽B，通过所述免疫原多肽混合免疫动物制备得到抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体，该多克隆抗体可以通过ELISA/Dot blot/Western blot方法特异性识别内源性BAZ1B_K426hy蛋白，用于肿瘤和威廉姆斯综合征检测产品的制备。

Description

BAZ1B_K426hy的多克隆抗体及其免疫原多肽

本申请是申请日为2022年10月21日、申请号为202211290030.1、发明名称为《BAZ1B_K426hy及其多克隆抗体在制备检测肿瘤的产品中的应用》的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及BAZ1B_K426hy及其多克隆抗体在制备检测肿瘤的产品中的应用。

背景技术

BAZ1B基因(也被称为WSTF基因)，是在Williams综合征患者体内检测到的转录因子BAZ1B的编码基因。Williams综合征是一种遗传病，已知有20多种基因与其发病相关，研究发现在患者所表现出的一系列系统性缺陷中，BAZ1B基因扮演着较其他基因更为重要的角色。研究人员发现，与正常对照小鼠比较，BAZ1B基因敲除的小鼠体型较小，而且出生几天后即死去，提示该基因在小鼠正常生长发育中发挥着重要作用。进一步的机制研究揭示，BAZ1B蛋白功能非常多样，其参与的生物学过程包含染色质重塑、基因转录和表达调控、细胞周期和凋亡调节、DNA损伤修复和维生素代谢等。在基因转录调控方面，BAZ1B的参与方式尤为复杂，在三个重要的ATP依赖性染色质重塑复合物中均检测到了BAZ1B蛋白，兼具转录激活和抑制双重作用，这使得BAZ1B被认为处于染色质调控的核心位置。

目前，有研究表明，BAZ1B可与分泌蛋白NRG3(neuregulin-3)结合，被运输至细胞外，通过旁分泌方式促进结肠癌发生、发展。又有研究阐明了BAZ1B通过促进细胞增殖、迁移等方式，调控乳腺癌和肺癌发生、发展的作用，将BAZ1B引入肿瘤学研究领域，引起了本领域的密切关注。BAZ1B属于bromodomain adjacentto azinc-fingermotif(BAZ)蛋白家族，该家族蛋白具有多个结构域(见图1)，生物学功能多样。BAZ1B可通过PHD(planthomeodomain)、WAC(WSTF/Acf1/cbpq46)和Bromodomain结构域识别并结合组蛋白，参与调控组蛋白修饰。BAZ1B的WAC结构域具有酪氨酸激酶活性，能够磷酸化组蛋白H2A.X的第142位酪氨酸残基，参与DNA损伤后的修复或凋亡调控。含有PHD结构域的蛋白通常能够与甲基化的Lys残基(K，Lysine，赖氨酸)结合并调控基因转录，但与WSTF的PHD结构域特异性结合的组蛋白修饰位点尚未被确定。WSTF的Bromodomain结构域可与乙酰化的组蛋白结合(如H3K14Ac、H4K16Ac和H2BK12Ac)，调控下游靶基因转录。

BAZ1B促进乳腺癌细胞增殖、迁移等的功能是受到其翻译后修饰的种类和水平调控的，而且BAZ1B在多个位点可以发生多种翻译后修饰。在乳腺癌细胞中已鉴定出，在BAZ1B的Ser158(S，Serine，丝氨酸)和Lys426残基能够分别发生磷酸化(S158ph)和乙酰化(K426Ac)修饰。然而不管是Ser158残基磷酸化还是Lys426残基乙酰化，都正向调控BAZ1B活性。负向调控信号对于蛋白功能的发挥也同样具有重要的调节作用。在一定的时空特异性背景下，负向和正向调控的平衡才能使细胞和组织处于正常的稳定状态。然而目前，尚未有关于BAZ1B其他修饰位点及对应多克隆抗体/免疫原多肽的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供BAZ1B_K426hy在制备检测肿瘤的产品中的应用，通过BAZ1B_K426hy的表达量可诊断肿瘤细胞的发生。

本发明的目的在于提供一种免疫原多肽，可用于制备抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体。

本发明的目的还在于提供一种抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体，可以通过ELISA/Dotblot/Western blot方法特异性识别内源性BAZ1B_K426hy蛋白。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了BAZ1B_K426hy在制备检测肿瘤的产品中的应用。

优选的，所述产品包括抗体、药物和试剂盒。

优选的，所述肿瘤包括肺癌、三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌、结直肠癌、色素瘤、胃癌、宫颈癌、胶质瘤、食管癌、卵巢癌和胰腺癌。

本发明还提供了制备抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体的免疫原多肽，所述多肽包括序列为SKSPK-hydroxyl K-GLKTP的多肽A和序列为NSKSPK-hydroxyl K-GLKTPK的多肽B。

本发明还提供了抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体，所述多克隆抗体由所述免疫原多肽混合免疫动物获得。

优选的，多肽A和多肽B分别与KLH偶联后进行混合免疫。

优选的，偶联后的多肽A溶液与偶联后的多肽B溶液按照体积比1～2:1～2混合。

优选的，所述动物为兔。

本发明还提供了上述多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将上述免疫原多肽分别与KLH偶联，偶联后的多肽溶液按照体积比1～2:1～2混合后用于动物免疫，收集免疫后动物的血清进行纯化，得到抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体。

优选的，所述动物免疫次数为3～5次。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明发现BAZ1B的Lys426残基在肿瘤细胞内也能够发生羟基化修饰，并与同位点的乙酰化修饰存在竞争关系。BAZ1B_K426hy蛋白在肿瘤细胞中的表达量与正常细胞中的表达量存在明显差异，通过BAZ1B_K426hy的表达量可诊断到肿瘤细胞的发生。

本发明提供的免疫原多肽具有良好的免疫原性，使用该多肽作为抗原免疫动物所获得的抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体具有较好的亲和性能，可以通过ELISA/Dot blot/Western blot方法特异性识别内源性BAZ1B_K426hy蛋白，具有高特异性、高灵敏度和较高的效价，可用于制备BAZ1B_K426hy蛋白相关疾病检测试剂。

附图说明

图1：WSTF(BAZ1B)结构示意图；

图2：BAZ1B多肽A质谱检测结果；

图3：BAZ1B多肽B质谱检测结果；

图4：BAZ1B非修饰多肽质谱检测结果；

图5：血清Westernblot初筛结果；

图6：抗体Dotblot检测结果；

图7：抗体Westernblot检测结果，A～D分别表示Mouse testis、Rat testis、HeLa和MCF-7细胞裂解液；

图8：Ab1在HeLa和MCF-7裂解液中Westernblot检测结果；

图9：Transwell检测各组细胞的侵袭能力结果；

图10：克隆形成实验检测各组细胞的增殖能力；

图11：JMJD6敲低、过表达或突变的MCF-7细胞中BAZ1B_K426hy表达水平WB检测结果；

图12：多种肿瘤细胞中BAZ1B_K426hy表达水平WB检测结果。

具体实施方式

本发明提供了BAZ1B_K426hy在制备检测肿瘤的产品中的应用。

本发明所述BAZ1B_K426hy是指WSTF(BAZ1B)的Lys426残基发生羟基化(Hydroxylation，Hy)修饰后的蛋白。本发明发现BAZ1B的Lys426残基在肿瘤细胞内也能够发生羟基化修饰，并与同位点的乙酰化修饰存在竞争关系。Lys426羟基化可能是BAZ1B蛋白的负向调控修饰，该位点羟基化能抑制WSTF转录调控活性并诱导其降解。BAZ1B_K426hy蛋白在肿瘤细胞中的表达量与在正常细胞中的表达量存在显著差异，通过BAZ1B_K426hy的表达量可诊断到肿瘤细胞的发生。

本发明所述产品包括抗体、药物和试剂盒。本发明所述肿瘤包括肺癌、三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌、结直肠癌、色素瘤、胃癌、宫颈癌、胶质瘤、食管癌、卵巢癌和胰腺癌。本发明通过将肺癌细胞、三阴性乳腺癌细胞、非三阴性乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、色素瘤细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞、胶质瘤细胞、食管癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞中BAZ1B_K426hy表达量和正常细胞中的肺上皮细胞、卵巢上皮细胞的BAZ1B_K426hy表达量进行对比，发现肿瘤细胞与正常细胞中的BAZ1B_K426hy表达量存在明显差异，可通过检测BAZ1B_K426hy表达量判断肿瘤的发生。

本发明提供了免疫原多肽，所述多肽包括序列为SKSPK-hydroxyl K-GLKTP的多肽A和序列为NSKSPK-hydroxyl K-GLKTPK的多肽B。本发明所述多肽A和多肽B是根据BAZ1B蛋白序列和修饰类型(羟基化修饰)设计合成的。

本发明多肽A的氨基酸序列为：SKSPK-(hydroxyl)K-GLKTP C(末端“C”表示氨基酸序列的碳端)，分子量为1289.6，该氨基酸序列第6位“K”进行羟基化修饰，氨基酸连接序列如SEQ ID NO.1所示，质谱检测结果见图1。所述多肽B的氨基酸序列为：NSKSPK-(hydroxyl)K-GLKTPK C(末端“C”表示氨基酸序列的碳端)，分子量为1531.8，该氨基酸序列第7位“K”进行羟基化修饰，氨基酸连接序列如SEQ ID NO.2所示，质谱检测结果见图2。

本发明还提供了上述免疫原多肽在制备抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体中的应用。通过将免疫原多肽与KLH偶联，可用于动物免疫制备抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体。

本发明还提供了抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体，所述多克隆抗体由上述免疫原多肽混合免疫动物获得。多肽A和多肽B分别与KLH偶联，偶联后的多肽A溶液与偶联后的多肽B溶液按照体积比1～2:1～2混合，用于动物免疫。所述偶联后的多肽A溶液与偶联后的多肽B溶液的体积比优选为1:1，所述动物优选为兔。

本发明还提供了上述多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将上述免疫原多肽分别与KLH偶联，偶联后的多肽溶液按照体积比1～2:1～2混合后用于动物免疫，收集免疫后动物的血清进行纯化，得到抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体，所述动物免疫次数优选为3～5次，更优选为4次。

作为一种可选的实施方式，所述抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，用注射器抽取抗原混合物，于兔子双肩皮下两点和双后腿肌肉两点注射抗原。每个区域大约1/4体积的免疫原乳剂，可以保证免疫原持久存在从而提高免疫应答。优选的，所述抗原多肽用生理盐水进行稀释，所述稀释倍数为10～20倍，更优选为12～15倍；所述佐剂为弗氏佐剂；所述免疫原与佐剂的混合比例为1:1。

本发明所述免疫原多肽或所述多克隆抗体或所述多克隆抗体的制备方法可用于制备BAZ1B_K426hy蛋白相关疾病的检测试剂。优选的，所述相关疾病包括肿瘤和威廉姆斯综合征。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

根据BAZ1B蛋白序列和修饰类型，设计并合成2条抗原多肽，分别为多肽A和多肽B，用于后续动物免疫、纯化和检测；同时设计并合成1条非修饰的对照多肽(SEQ ID NO.3，末端“C”表示氨基酸序列的碳端)，用于纯化和检测。多肽信息见表1。

表1多肽信息表

对3条序列进行质谱检测，图2为多肽A质谱检测结果，图3为多肽B质谱检测结果，图4为对照多肽质谱检测结果，图2～4中坐标轴纵轴表示离子峰的强度，横轴表示质量和电荷的比率。由图2～4可知，3条肽段的实测质量和理论质量的差别在10ppm之内，序列无误。

实施例2

本实施例采用健康新西兰兔3只进行动物免疫实验，该实验委托杭州景杰生物科技股份有限公司完成。

1、多肽偶联

将实施例1中2条修饰多肽(多肽A、多肽B)分别与KLH偶联，用于兔子免疫。多肽偶联步骤为：

(1)将20mg SMCC溶于2ml DMF。

(2)将0.8ml KLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH 7.2)使蛋白终浓度为15mg/ml。

(3)将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h。

(4)用1L 1×PBS(pH 7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。

(5)将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mg KLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中。

(6)将3.0mg多肽用0.6ml 1×PBS(pH 7.2)溶液溶解。

(7)将多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。

2、兔子免疫

(1)准备免疫材料

将步骤1中偶联好的修饰多肽按照1:1混合得到免疫原，用生理盐水稀释免疫原，稀释倍数为15倍，然后与相应的佐剂(弗氏佐剂)进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，用注射器抽取抗原混合物用于兔子免疫。

(2)免疫

于兔子双肩皮下两点和双后腿肌肉两点注射抗原。每个区域大约1/4体积的免疫原。每只兔子共免疫4次，分别在第1天，第21天，第28天，第35天。

(3)取血

取血第1次：在第45天，取全血30mL并进行离心(离心参数为4000转，5分钟)，离心后取上清，送实验室进行血清筛选检测，检测内容包括ELISA和Westernblot；

取血第2/3/4次：在第50天，第65天，第70天分3次取全血，每次20mL，离心后取上清，送实验室进行血清筛选检测，检测内容包括ELISA和Westernblot。

将BAZ1B多肽A和BAZ1B多肽B混合免疫的兔子分别标识为R1、R2、R3，第45天的血清ELISA检测结果见表2。

表2血清ELISA检测结果

根据表2中ELISA检测三只兔子血清结果，识别修饰多肽的滴度都在1:10K(OD>1)以上。

第45天的血清Westernblot初筛结果见图5，根据Western blot结果显示，三只兔子的血清中均未检测到目的蛋白理论分子量175kDa左右条带。

综合ELISA和Westernblot的检测结果，选取所有3只兔子的血清(测结果阳性)进行纯化。

3、抗体纯化

(1)准备proteinA亲和柱：

选取10mL proteinA填料，将填料和等体积的PBS缓冲溶液混合、搅拌，抽气去除填料中的气泡。将proteinA填料缓慢加入玻璃柱中，灌制层析柱。此过程中避免柱干。灌注完毕后用10倍体积预冷的PBS缓冲溶液平衡柱子。

(2)ProteinA亲和层析：

将血清用过滤器进行过滤后，上样到平衡好的proteinA层析柱上，为检测抗血清与填料的结合效率，需保留上样流出液。用PBS缓冲溶液清洗柱子，再用150mM pH3.4甘氨酸缓冲液进行洗脱(150mM pH3.4甘氨酸)。收集洗脱液，并加入中和缓冲溶液调制pH为7.0。

(3)富集目的抗体：

将proteinA纯化后得到的粗纯IgG上样到平衡好的抗原多肽亲和层析柱上，专一性的富集目的抗体。

(4)去除非特异性抗体：

将上一步得到的目的抗体上样到非修饰的亲和层析柱上，直接收集流出液(FT3)，从而去除非特异性的抗体成分。得到抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体。

(5)抗体保存：

测定蛋白质的含量。加入10％的甘油以便保存抗体，将纯化的抗体分装后在-20℃保存。R1～R3纯化后的抗体分别标记为Ab1～Ab3。

实施例3

对实施例2制备得到的纯化的抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体Ab1、Ab2和Ab3分别进行ELISA，Dotblot，Westernblot。

1、ELISA检测

(1)抗原包被：

用包被液(PBS)将抗原(抗原修饰性多肽)稀释10倍，按照50μg/孔的量依次加入酶标板，冰箱4℃过夜。

(2)洗板：

将前一天包被好的酶标板取出，加入1×TBST进行洗涤，将洗涤液注满板孔，共洗涤3次。

(3)封闭：

将清洗后的酶标板加入1％BSA封闭液，封闭液加满各反应孔，37℃孵育1h后再次加入1×TBST洗涤液，将洗涤液注满板孔进行洗涤，共洗涤2次。

(4)一抗孵育：

将抗体按照1:1K开始做梯度稀释，稀释后浓度见表3。依次加入酶标板中，每孔100μL，37℃温育1.5h后再次加入1×TBST进行洗涤，将洗涤液注满板孔，共洗涤2次。

(5)二抗孵育：

用1％BSA封闭液100μL将二抗(兔抗)稀释到1:10K，37℃孵育45min后再次加入1×TBST进行洗涤，将洗涤液注满板孔，共洗涤2次。

(6)显色：

加入TMB显色液100μL，8min后加入1M硫酸100μL终止显示反应，用酶标仪读取数据。抗体ELISA检测结果见表3。

表3抗体ELISA检测结果

由表3中ELISA检测结果显示，3支抗体对于至少一条修饰多肽的识别能力不低于1:50K稀释度，其中Ab1和Ab3识别修饰性多肽的杂交信号10倍强于识别非修饰性多肽的杂交信号。

2、Dotblot检测

(1)点样：

按照1ng，4ng，16ng，64ng梯度将未交联抗原多肽A、抗原多肽A和非修饰多肽分别点到PVDF膜上。

(2)封闭：

待膜表面干燥后，加入封闭液(3～5ml 5％脱脂牛奶)，室温封闭60min。

(3)洗涤：

用1×TBST洗涤10min。

(4)一抗孵育：

用5％的脱脂奶粉将抗体稀释，稀释至1:2000浓度，室温孵育2h后用1×TBST洗涤3次，每次8min。

(5)二抗孵育：

选择兔抗；将二抗按照1:10K稀释比加入，室温孵育1h后，用1×TBST洗涤3次，每次8min。

(6)将洗涤后的膜加0.5-1ml显色液(Chemiluminescent HRP Substrate)后曝光。

抗体Dotblot检测结果见图6，由图6可知，Ab1、Ab2、Ab3和阴性非修饰多肽没有结合，和阳性修饰多肽尤其是多肽A有较强的结合。

3、Westernblot检测

(1)裂解细胞：

根据实验需求选取细胞或组织检测，根据不同样品选取不同裂解方法得到样品全蛋白，并通过BCA法进行蛋白浓度测定：

加热1xHot裂解液：1xHot裂解液放进水浴锅中加热接近至100℃。

细胞：每1ml体积的细胞(估计细胞沉淀的量)加入3ml煮沸的1xHot裂解液，用枪头吹散细胞，将细胞放在水浴锅煮沸，继续用移液枪来回吹打至呈现明显的透明澄清均一液体状即可。组织：取适量组织，用剪刀剪碎，加入适量1xHot裂解液吹打，放在水浴锅煮沸至少20min，每5min吹打一次。

Tips：组织跟1xHot裂解液比例按蛋白得率适量调整，(对于蛋白含量较少的组织降低加入裂解液的量)。

眼球、垂体、海马体等较低得率的组织按体积比1：2添加，其余得率高的组织按体积比1：3添加。

超声破碎：25％W超声5min，每超声3s，间隔5s。

Tips：超声过程中，样品一定要放置在冰水混合物中，探头要处于液面以下，超声时间要小于间隔时间，避免出现气泡。每裂解一个新的细胞或者组织，探头要用纯水超声清洗3s，轻轻用无尘纸拭干，确保没有交叉污染。

1×Hot Lysis buffer(100ml)配制：1g SDS(1％w/v)，0.12g Tris-base(10mM)g，18mg正矾酸钠(1.0mM)依次加入80ml去离子水中，待试剂完全溶解后，用HCl调节pH到8.0，定容至100ml。

(2)蛋白电泳及转膜：

蛋白电泳：选择6％浓度的分离胶。配胶时最后加10％过硫酸铵和TEMED，每板分离胶4.7mL。按照每孔20μg样品上样，并电泳；电泳条件为：浓缩胶80v，分离胶120v。

湿法转膜：将转膜液在转膜前遇冷，将胶、膜、滤纸在转膜液中铺成三明治结构，避免气泡产生。转膜电压为120v。

(3)封闭：

将转好的膜，加入封闭液(5％的脱脂奶粉)，室温封闭60min。孵育后用1×TBST洗涤10min。

(4)一抗孵育：

用5％的脱脂奶粉将抗体稀释(1:100/1:500)，室温孵育2h后用1×TBST洗涤3次，每次8min。

(5)二抗孵育：

选择兔抗；将二抗按照1:10K稀释比加入，室温孵育1h后，用1×TBST洗涤3次，每次8min。

(6)将洗涤后的膜加显色底物后曝光。

抗体Westernblot检测结果见图7，抗体Ab1和Ab2在HeLa和MCF-7细胞裂解液中检测到175KDa左右的目的条带。

选择Ab1在HeLa和MCF-7细胞裂解液中再进行一次Westernblot实验确认，结果见图8，根据图8中Westernblot结果显示，Ab1在HeLa和MCF-7细胞裂解液中可以检测到目的条带。Dotblot阳性检测限达到4ng，并且比识别非修饰多肽信号强于10倍。Westernblot实验结果显示，抗体Ab1可以特异性识别内源性BAZ1B_K426hy蛋白。

实施例4

1、细胞培养

MCF-7细胞(非三阴性乳腺癌细胞)：用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。

2、细胞转染

(1)细胞分组

实验组1：WSTF+si-NC，表达WSTF及非特异性siRNA对照组；

实验组2：WSTF+si-JMJD6，表达WSTF及JMJD6特异性siRNA实验组；

实验组3：WSTF+JMJD6 WT，表达WSTF及野生型JMJD6对照组；

实验组4：WSTF+JMJD6 Mut，表达WSTF及突变型JMJD6实验组；

实验组5：MCF-7/WSTF^-/-+si-NC，WSTF低表达及非特异性siRNA对照组；

实验组6：MCF-7/WSTF^-/-+si-JMJD6，WSTF低表达及JMJD6特异性siRNA实验组；

实验组7：MCF-7/WSTF^-/-+JMJD6 WT，WSTF低表达及野生型JMJD6对照组；

实验组8：MCF-7/WSTF^-/-+JMJD6 Mut，WSTF低表达及突变型JMJD6实验组；

(2)细胞接种：将对数生长期的MCF-7或MCF-7/WSTF^-/-细胞(敲减WSTF的细胞株)接种于6孔板中，至次日转染时密度为60～70％左右；

(3)转染液制备：在无菌的1.5mL离心管中配制A、B转染液。

A液制备：

实验组1A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释0.5μg WSTF和0.5μL si-NC加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μL，轻轻混匀；

实验组2A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释0.5μg WSTF和0.5μL si-JMJD6加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μL，轻轻混匀；

实验组3A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释0.5μg WSTF和0.5μL JMJD6 WT加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μL，轻轻混匀；

实验组4A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释0.5μg WSTF和0.5μL JMJD6 Mut加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μL，轻轻混匀；

实验组5A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释0.5μg MCF-7/WSTF^-/-和0.5μL si-NC加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μL，轻轻混匀；

实验组6A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释0.5μg MCF-7/WSTF^-/-和0.5μL si-JMJD6加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μL，轻轻混匀；

实验组7A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释0.5μg MCF-7/WSTF^-/-和0.5μL JMJD6WT加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μL，轻轻混匀；

实验组8A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释0.5μg MCF-7/WSTF^-/-和0.5μL JMJD6Mut加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μL，轻轻混匀；

B液制备：脂质体使用前轻轻混匀，lipofectamine 20001μL加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μL，轻轻混匀，室温静置孵育5min。

将B液分别加入每实验组A液中，轻弹混匀，室温静置孵育20min。

将混合液均匀地慢慢滴加到上述培养瓶中，并混匀，5％CO₂孵箱37℃培养5h，换成正常培养液继续培养。

3、Transwell检测各组细胞的侵袭能力

(1)彻底弃净各组细胞培养液，PBS洗细胞一遍，每孔加消化液(0.02％EDTA、0.25％胰蛋白酶)消化后，加入含有10％FBS的DMEM培养液终止消化并吹打混匀细胞，进行Transwell实验。

(2)每个Transwell小室底面涂10μL纤维连接蛋白(0.5mg/mL)，在超净台内风干，使纤维连接蛋白固化于膜底面。

(3)溶解matrix胶，每孔加入50μL胶，同时消化各组细胞并计数，取10⁵个细胞置于1.5mL EP管中，2000rpm离心5分钟，去上清，加入200μL无血清DMEM培养基重悬细胞，加入Transwell小室中。下层小室加入含20％Gibico血清的DMEM培养基。放入37℃孵箱中培养24h。

(4)取出Transwell小室，用棉签擦除里面的细胞，并用PBS轻轻洗掉里面剩余细胞。用甲醇、冰醋酸按照3：1配制成混合液，固定Transwell小室反面的细胞30min。放入结晶紫染液中，染色15min。清洗干净并将膜固定于载玻片上便于观察。

(5)显微镜下取3个随机视野进行拍照并绘制柱状图分析，结果见图9。

由图9可知，JMJD6-WSTF^K426hy轴调控细胞侵袭能力。

4、克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成能力

(1)彻底弃净各组细胞培养液，PBS洗细胞一遍，每孔加消化液(0.02％EDTA、0.25％胰蛋白酶)消化后，加入含有10％FBS的DMEM培养液终止消化并吹打混匀细胞，进行克隆形成实验。

(2)计数各组细胞，分别取300个接种于12孔板，补足完全培养基2mL。37℃，5％CO₂培养箱培养1～2周。

(3)待每个克隆细胞数长至50个以上，弃去完全培养基，PBS浸洗细胞一遍，每孔加入500μL4％多聚甲醛固定细胞，4℃30min后，PBS浸洗细胞一遍，每孔加入500μL 0.1％结晶紫染色并用水冲洗。

(5)待培养板晾干后，相机拍照并绘制柱状图分析，结果见图10。

由图10可知，JMJD6-WSTF^K426hy轴调控细胞克隆形成能力。

实施例5

采用实施例2制备得到的纯化的抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体Ab1检测羟基化WSTF(BAZ1B)的表达水平。

1、细胞培养

MCF-7细胞：用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。

2、细胞转染

(1)细胞分组

实验组1：WSTF+si-NC，表达WSTF及非特异性siRNA对照组；

实验组2：WSTF+si-JMJD6，表达WSTF及JMJD6特异性siRNA实验组；

实验组3：WSTF+JMJD6 WT，表达WSTF及野生型JMJD6对照组；

实验组4：WSTF+JMJD6 Mut，表达WSTF及突变型JMJD6实验组；

实验组5：MCF-7/WSTF^-/-+si-NC，WSTF低表达及非特异性siRNA对照组；

实验组6：MCF-7/WSTF^-/-+si-JMJD6，WSTF低表达及JMJD6特异性siRNA实验组；

实验组7：MCF-7/WSTF^-/-+JMJD6 WT，WSTF低表达及野生型JMJD6对照组；

实验组8：MCF-7/WSTF^-/-+JMJD6 Mut，WSTF低表达及突变型JMJD6实验组；

(2)细胞接种：将对数生长期的MCF-7或MCF-7/WSTF^-/-细胞(敲减WSTF的细胞株)接种于6孔板中，至次日转染时密度为60～70％左右；

(3)转染液制备：在无菌的1.5mL离心管中配制A、B转染液。

A液制备：

实验组1A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释1.5μg WSTF和1.5μL si-NC加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μl，轻轻混匀；

实验组2A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释1.5μg WSTF和1.5μL si-JMJD6加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μl，轻轻混匀；

实验组3A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释1.5μg WSTF和1.5μL JMJD6 WT加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μl，轻轻混匀；

实验组4A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释1.5μg WSTF和1.5μL JMJD6 Mut加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μl，轻轻混匀；

实验组5A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释1.5μg MCF-7/WSTF^-/-和1.5μL si-NC加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μl，轻轻混匀；

实验组6A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释1.5μg MCF-7/WSTF^-/-和1.5μL si-JMJD6加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μl，轻轻混匀；

实验组7A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释1.5μg MCF-7/WSTF^-/-和1.5μL JMJD6WT加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μl，轻轻混匀；

实验组8A液：用无血清培养基Opti-MEM稀释1.5μg MCF-7/WSTF^-/-和1.5μL JMJD6Mut加入Opti-MEM无血清培养基至终体积50μl，轻轻混匀；

B液制备：用无血清培养基Opti-MEM稀释3μL脂质体Lipofectamine2000 Reagent，终量50μL，轻轻混匀，室温静置5min。

将B液分别滴加入每实验组A液中，轻轻混匀，室温静置20min。

(4)转染：将转染液加入对应孔中，100μL/孔，每孔补加600μLOpti-MEM轻晃培养板使其分布均匀后，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。

4h后每孔换成10％FBS(不含抗生素)的完全培养基3mL，继续于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。

3、WB检测羟基化WSTF的表达水平

(1)细胞核的裂解：48h后将各实验组转染细胞原培养液吸弃(6孔板)，用1×PBS浸洗一次后，加入1mL 0.05％胰酶消化，1mL完全培养基吹打细胞并收集到1.5EP管，2000rpm离心5min，PBS重悬漂洗一次，彻底弃上清后，加入150μL的0.4％NP-40(含蛋白酶抑制剂cocktail)，涡旋混匀5min，4℃5000rpm离心10min，沉淀即细胞核，向其中加入100μL的0.1％NP-40(含蛋白酶抑制剂cocktail)，弹起混匀，4℃5000rpm离心10min，彻底弃上清，加入100μL的RIPA，充分混匀打散，-80℃冻融一次即可获得胞核蛋白。

(2)配制SDS变性6％聚丙烯酰胺凝胶(下层分离胶，单面)

表4 6％聚丙烯酰胺凝胶配方

混匀后，迅速灌胶至玻璃板总高度的约2/3位置，而后在凝胶上方加入水饱和正丁醇1mL以保证凝胶上层的平整，静置待胶凝固。

(3)配制SDS变性5％聚丙烯酰胺凝胶(上层积层胶，单面)

表5 5％聚丙烯酰胺凝胶配方

混匀后，迅速灌胶至填满玻璃板，插入梳子，静置待胶凝固。电泳前拔去梳子，将凝胶置于1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液中，并用注射器针头吹净上样孔。

(4)将蛋白样品与5×上样缓冲液(含β-巯基乙醇)混合后，煮沸变性5min，冰浴5min。取合适量的蛋白样品上样，进行SDS变性6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，直至目的蛋白有效分离后停止电泳。

(5)电泳完毕后将凝胶取出，置于转膜专用的三明治夹中，凝胶置于负极，PVDF膜置于正极，于转膜缓冲液中4℃350mA恒流转膜2h，使凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上形成印迹。

(6)将膜置于1×Blotto中，室温摇动封闭2h。

(7)将膜按蛋白的印迹位置剪开，置于含对应一抗(实施例2制备得到的纯化的多克隆抗体Ab1)的Blotto中，4℃摇动作用过夜。

(8)将膜置于1×TBST溶液中，摇动漂洗5min，共4次。

(9)将膜置于含对应二抗(HRP标记羊抗兔IgG抗体)Blotto中，室温作用1.5h.

(10)将膜置于1×TBST溶液中，摇动漂洗5min，共4次。

(11)将膜置于Western LightningTM Chemiluminescence Reagent显色剂中30s。

(12)立即将膜置于曝光盒中，并在暗室中对感光胶片进行曝光1min，而后进行显影、定影处理。

(13)胶片用LabWorksTM凝胶成像及分析系统进行摄像，分析各组目的条带的亮度值。方法为计算每个样品的目的条带亮度值与对应LMNB1(内参照)条带亮度值的比值，得到校正后目的条带亮度值。以对照组为标准值1，并绘制柱状图，结果见图11。

由图11可知，JMJD6敲低或突变后，WSTF羟基化水平显著降低。

实施例4～5结果表明，Lys426羟基化(K426Hy)能抑制WSTF转录调控活性并诱导其降解。在乳腺癌细胞中JMJD6可以通过羟基化修饰负向调控WSTF的转录因子活性和自身稳定性，进而影响肿瘤的发生、发展。

实施例6

采用实施例2制备得到的纯化的抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体Ab1检测不同细胞中的羟基化WSTF(BAZ1B)的表达水平。

1、细胞培养

Beas-2B(人正常肺上皮细胞)：用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

A549(人肺癌细胞)：用含10％FBS、1％双抗的Ham's F-12K培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

MDA-MB-231(人三阴性乳腺癌细胞)：用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

SW620(人结直肠癌细胞)：用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

A375(人黑色素瘤细胞)：用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

MGC-803(人胃癌细胞)：用含10％FBS、1％双抗的1640培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

HeLa(人宫颈癌细胞)：用含10％FBS、1％双抗的1640培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

U251(人胶质瘤细胞)：用含10％FBS、1％双抗的DMEM/F12培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

Eca-109(人食管癌细胞)：用含10％FBS、1％双抗的1640培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

IOSE80(人正常卵巢上皮细胞)：用含10％FBS、1％双抗的1640培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

OV2008(人卵巢癌细胞)：用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养；

PANC1(人胰腺癌细胞)：用含10％FBS、1％双抗的DMEM培养液，培养液，置37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。

2、核蛋白提取

细胞收集：将100mL瓶中各个细胞用1×PBS浸洗一次，消化液(0.02％EDTA、0.05％胰蛋白酶)消化后，加入含有10％FBS的完全培养液终止消化并吹打混匀细胞，2000rpm离心5min，PBS重悬漂洗一次，彻底弃上清。

加入450μL的0.4％NP-40(含蛋白酶抑制剂cocktail)，涡旋混匀5min，4℃5000rpm离心10min，沉淀即细胞核，向其中加入300μL的0.1％NP-40(含蛋白酶抑制剂cocktail)，弹起混匀，4℃5000rpm离心10min，彻底弃上清，加入200μL的RIPA，充分混匀打散，-80℃冻融一次即可获得胞核蛋白。。

3、WB检测羟基化WSTF的表达水平

(1)配制SDS变性10％聚丙烯酰胺凝胶(下层分离胶，单面)：

表6 6％聚丙烯酰胺凝胶配方

混匀后，迅速灌胶至玻璃板总高度的约2/3位置，而后在凝胶上方加入水饱和正丁醇1mL以保证凝胶上层的平整，静置待胶凝固。

(2)配制SDS变性5％聚丙烯酰胺凝胶(上层积层胶，单面)

表7 5％聚丙烯酰胺凝胶配方

混匀后，迅速灌胶至填满玻璃板，插入梳子，静置待胶凝固。电泳前拔去梳子，将凝胶置于1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液中，并用注射器针头吹净上样孔。

(3)将蛋白样品与5×上样缓冲液(含β-巯基乙醇)混合后，煮沸变性5min，冰浴5min。取合适量的蛋白样品上样，进行SDS变性10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，直至目的蛋白有效分离后停止电泳。

(4)电泳完毕后将凝胶取出，置于转膜专用的三明治夹中，凝胶置于负极，PVDF膜置于正极，于转膜缓冲液中4℃350mA恒流转膜2h，使凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上形成印迹。

(5)将膜置于1×Blotto中，室温摇动封闭2h。

(6)将膜按蛋白的印迹位置剪开，置于含对应一抗(实施例2制备得到的纯化的多克隆抗体Ab1)的Blotto中，4℃摇动作用过夜。

(7)将膜置于1×TBST溶液中，摇动漂洗5min，共4次。

(8)将膜置于含对应二抗(HRP标记羊抗兔IgG抗体)Blotto中，室温作用1.5h。

(9)将膜置于1×TBST溶液中，摇动漂洗5min，共4次。

(10)将膜置于Western LightningTM Chemiluminescence Reagent显色剂中30s。

(11)立即将膜置于曝光盒中，并在暗室中对感光胶片进行曝光1min，而后进行显影、定影处理。

(12)胶片用LabWorksTM凝胶成像及分析系统进行摄像，分析各组目的条带的亮度值。方法为计算每个样品的目的条带亮度值与对应LMNB1(内参照)条带亮度值的比值，得到校正后目的条带亮度值。以对照组为标准值1，并绘制柱状图，结果见图12。

由图12可知，人正常细胞中BAZ1B_K426hy的表达量近乎稳定，肿瘤细胞中BAZ1B_K426hy的表达量与正常细胞中BAZ1B_K426hy的表达量出现显著的差异。表明，通过对BAZ1B_K426hy表达量的检测可以诊断肿瘤的发生。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体在制备评估肿瘤风险的试剂中的应用，其特征在于，所述多克隆抗体的制备方法包括：

序列为SKSPK-hydroxyl K-GLKTP的多肽A和序列为NSKSPK-hydroxyl K-GLKTPK的多肽B分别与KLH偶联，偶联后的多肽溶液按照体积比1～2:1～2混合后用于动物免疫，收集免疫后动物的血清进行纯化，得到抗BAZ1B_K426hy的多克隆抗体；

所述动物为兔；

所述肿瘤为肺癌和卵巢癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物免疫次数为3～5次。