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CN116829595A - 用于治疗由失调的血浆激肽释放酶介导的疾病的抗体的腺相关病毒载体递送 - Google Patents

用于治疗由失调的血浆激肽释放酶介导的疾病的抗体的腺相关病毒载体递送 Download PDF

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CN116829595A
CN116829595A CN202180093553.4A CN202180093553A CN116829595A CN 116829595 A CN116829595 A CN 116829595A CN 202180093553 A CN202180093553 A CN 202180093553A CN 116829595 A CN116829595 A CN 116829595A
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raav
raav vector
promoter
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J·肯尼斯顿
A·赛瑞金
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本公开提供了尤其是一种重组腺相关病毒(rAAV)载体,其包含编码抑制血浆激肽释放酶的蛋白水解活性的剂的经密码子优化的核苷酸序列。本公开还提供了一种编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的重组腺相关病毒(rAAV)载体。

Description

用于治疗由失调的血浆激肽释放酶介导的疾病的抗体的腺相 关病毒载体递送
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月16日提交的美国临时申请第63/126,300号的优先权和权益,其内容据此通过引用方式以其整体并入。
序列表
本申请含有序列表,所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并且特此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2021年12月13日,命名为SHR-2020US1_SL.txt,大小为63,250字节。
背景技术
失调的血浆激肽释放酶活性可能导致促炎和血管活性肽缓激肽的过量产生。此种疾病的实例是遗传性血管性水肿(HAE),这是一种罕见但可能危及生命的病症,其特征是表现为皮下和粘膜下血管性水肿的不可预测且反复的血管扩张发作。在一些情况下,HAE与C1抑制剂的低血浆水平相关(I型),而在其他情况下,该蛋白质以正常或升高的量循环,但它是功能障碍(II型)。C1抑制剂是血浆激肽释放酶活性的主要调节剂。HAE发作的症状包括自发发生或由轻度外伤引发的面部、口腔和/或气道肿胀。影响气道的水肿发作可能是致命的。除了急性炎症发作外,过度的血浆激肽释放酶活性还与慢性疾患(诸如包括红斑狼疮在内的自身免疫性疾病)相关联。
已经考虑和开发了各种用于治疗C1-INH缺乏或功能障碍的策略,包括例如抑制接触系统的成员。例如,拉那利尤单抗(lanadelumab)是血浆激肽释放酶的全人源化单克隆抗体抑制剂,该抑制剂已被批准用于治疗HAE。
使用在体内产生包括抗体在内的蛋白质的载体对于疾病的治疗是理想的,但受到包括递送给受试者后抗体产生不足在内的各种因素的限制。
发明内容
本发明提供了编码抗血浆激肽释放酶抗体的有效且稳健的重组腺相关病毒(rAAV)载体。本发明部分基于这样的令人惊讶的发现,即包含编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的经密码子优化的核苷酸序列的特异性重组AAV载体导致在体内产生高水平的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,对载体构建体进行密码子优化以减少CpG含量和重复序列。在一些实施方案中,对载体构建体进行工程改造以将GC含量百分比标准化为在天然的、未修饰的AAV8中发现的GC含量百分比。在一些实施方案中,评估该载体构建体中的每个载体构建体的CpG含量、密码子适应指数(CAI)、密码子上下文(CC)、GC含量和重复基序。因此,在一些实施方案中,评估载体构建体的CpG含量。在一些实施方案中,评估载体构建体的密码子适应指数(CAI)。在一些实施方案中,评估载体构建体的GC含量。在一些实施方案中,评估载体构建体的重复基序的量。具体而言,rAAV导致在体内稳健且持续地产生抗血浆激肽释放酶mAb,并且载体介导的表达的抗血浆激肽释放酶抗体保留了与由传统重组表达方法(例如,CHO细胞)产生的抗体蛋白相当的靶向活性。在本发明之前,通过施用携带所需有效载荷的rAAV载体递送抗血浆激肽释放酶抗体导致未知量的活性抗体产生。因此,在本发明之前,使用编码抗血浆激肽释放酶的rAAV载体治疗C1-INH缺乏或病症(包括例如遗传性血管性水肿)是不可预测或不可行的。
在一些方面,提供了一种包含经密码子优化的核苷酸序列的重组腺相关病毒(rAAV)载体,该rAAV载体编码包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的全长抗体,并且其中经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或大于95%的同一性。因此,在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有至少约75%的同一性。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有至少约80%的同一性。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有至少约85%的同一性。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有至少约90%的同一性。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有至少约95%的同一性。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有大于95%的同一性。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:23-36中的任一者是同一的。SEQ ID No:23-36包括SEQ ID No:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36中的任一者。SEQ IDNO:23-36中的每一者均列于表3中。
在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列选自SEQ ID NO:23-36中的任一者。因此,在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:23。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:24。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ IDNO:25。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:26。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:27。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:28。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:29。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:30。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:31。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:32。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:33。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:34。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:35。在一些实施方案中,经密码子优化的序列是SEQ ID NO:36。
在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约50个CpG位点、少于约40个CpG位点、少于约35个CpG位点、少于约30个CpG位点、少于约25个CpG位点、少于约20个CpG位点、少于约15个CpG位点或少于约10个CpG位点的CpG含量。因此,在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约50个CpG位点的CpG含量。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约45个CpG位点的CpG含量。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约40个CpG位点的CpG含量。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约35个CpG位点的CpG含量。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约30个CpG位点的CpG含量。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约25个CpG位点的CpG含量。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约20个CpG位点的CpG含量。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约15个CpG位点的CpG含量。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约10个CpG位点的CpG含量。在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有少于约5个CpG位点的CpG含量。
在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列具有约5个CpG位点。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链是通过接头连接的。在一些实施方案中,所述接头包括可切割的接头。在一些实施方案中,所述接头包括不可切割的接头。
在一些实施方案中,经密码子优化的核苷酸序列包含接头。在一些实施方案中,所述接头包括可切割的接头。在一些实施方案中,所述接头包括不可切割的接头。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由单一的启动子控制。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由分开的启动子控制。
在一些实施方案中,该单一的启动子或该分开的启动子选自遍在启动子、组织特异性启动子或可调节型启动子。因此,在一些实施方案中,该单一的启动子或该分开的启动子是遍在启动子。在一些实施方案中,该单一的启动子或该分开的启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中,该单一启动子或该分开的启动子是可调节型启动子。
在一些实施方案中,组织特异性启动子是肝脏特异性启动子。
在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括选自以下的启动子:人转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、经修饰的hTTR(hTTR mod.)、α-抗胰蛋白酶启动子、肝脏启动子1(LP1)、TRM启动子、人凝血因子IX pro/肝转录因子反应性低聚物、LSP、CMV/CBA启动子(1.1kb)、CAG启动子(1.7kb)、mTTR、经修饰的mTTR、mTTR pro、mTTR增强子或碱性白蛋白启动子。因此,在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括人转甲状腺素蛋白启动子(TTR)。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括经修饰的hTTR(hTTR mod.)。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括α-抗胰蛋白酶启动子。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括肝脏启动子1(LP1)。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括TRM启动子。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括人凝血因子IX pro/肝转录因子反应性低聚物。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括LSP。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括CMV/CBA启动子(1.1kb)。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括CAG启动子(1.7kb)。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括mTTR。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括mTTR pro。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括mTTR增强子。在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括碱性白蛋白启动子。
在一些实施方案中,肝脏特异性启动子是人转甲状腺素蛋白启动子(TTR)。
在一些实施方案中,可调节型启动子是诱导型或可阻遏型启动子。因此,在一些实施方案中,可调节型启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中,可调节型启动子是可阻遏型启动子。
在一些实施方案中,载体还包含以下的一种或多种:5'和3'反向末端重复体、序列上游的内含子和顺式作用调节性模块(CRM)。因此,在一些实施方案中,载体还包含5'反向末端重复体和3'反向末端重复体。在一些实施方案中,载体还包含序列上游的内含子。在一些实施方案中,载体还包含顺式作用调节性模块(CRM)。
在一些实施方案中,载体还包含WPRE序列。
在一些实施方案中,WPRE序列是经修饰的。
在一些实施方案中,WPRE含有mut6delATG修饰。
在一些实施方案中,CRM是肝脏特异性CRM。
在一些实施方案中,CRM是CRM8。
在一些实施方案中,载体包含至少三个CRM。在一些实施方案中,载体包含三个CRM。在一些实施方案中,载体包含四个CRM。在一些实施方案中,载体包含至少五个CRM。在一些实施方案中,载体包含多于五个CRM。
在一些实施方案中,载体包含三个CRM8。
在一些实施方案中,rAAV载体包含IRES序列。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体轻链和/或重链包含提高抗体的半衰期和/或降低抗体的效应子功能的一种或多种突变。
在一些实施方案中,所述一种或多种突变包括LALA突变(L234A和L235A)和/或NHance突变(H433K和N434F)。
在一些实施方案中,所述一种或多种突变包括LALA突变(L234A和L235A)。在一些实施方案中,所述一种或多种突变包括NHance突变(H433K和N434F)。
如前述权利要求中任一项的rAAV载体,其中所述AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAVrh.10。因此,在一些实施方案中,AAV载体是AAV1。在一些实施方案中,AAV载体是AAV2。在一些实施方案中,AAV载体是AAV3。在一些实施方案中,AAV载体是AAV4。在一些实施方案中,AAV载体是AAV5。在一些实施方案中,AAV载体是AAV6。在一些实施方案中,AAV载体是AAV7。在一些实施方案中,AAV载体是AAV8。在一些实施方案中,AAV载体是AAV9。在一些实施方案中,AAV载体是AAV10。在一些实施方案中,AAV载体是AAV11。在一些实施方案中,AAV载体是AAVrh.10。
在一些实施方案中,rAAV载体具有这样的GC含量,其被工程改造成具有与天然存在的AAV约相同的GC含量。在一些实施方案中,rAAV载体具有这样的GC含量,其被工程改造成具有与天然存在的AAV8约相同的GC含量。
在一些实施方案中,rAAV载体衣壳是经工程改造的。
在一些实施方案中,经工程改造的rAAV载体包含具有经修饰的氨基酸序列的AAV衣壳序列。
在一些实施方案中,经修饰的氨基酸序列包含氨基酸序列的插入、缺失或取代。因此,在一些实施方案中,经修饰的氨基酸序列包含一处或多处插入。在一些实施方案中,经修饰的氨基酸序列包含一处或多处缺失。在一些实施方案中,经修饰的氨基酸序列包含一处或多处氨基酸取代。
在一些实施方案中,rAAV衣壳是天然衍生的。
在一些实施方案中,AAV载体衣壳是AAV8。
在一些实施方案中,可切割的序列是弗林蛋白酶可切割的序列。
在一些实施方案中,弗林蛋白酶可切割的序列之后是接头和2A序列。
在一些实施方案中,该接头是GSG接头。
在一些实施方案中,2A序列是T2A、P2A、E2A或F2A序列。因此,在一些实施方案中,2A序列是T2A序列。在一些实施方案中,2A序列是P2A序列。在一些实施方案中,2A序列是E2A序列。在一些实施方案中,2A序列是F2A序列。
在一些实施方案中,载体还编码分泌信号。
在一些实施方案中,分泌信号是天然存在的信号肽。
在一些实施方案中,分泌信号是人工信号肽。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链产生能够与血浆激肽释放酶结合的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体抑制血浆激肽释放酶的蛋白水解活性。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体与血浆激肽释放酶活性位点结合。
在一些实施方案中,该结合阻断血浆激肽释放酶的活性位点。
在一些实施方案中,该结合抑制血浆激肽释放酶的活性。
在一些实施方案中,该抗体不结合前激肽释放酶
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链是由同一种载体表达。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链是由不同的rAAV载体表达。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链是由分开的rAAV载体表达。
在一些实施方案中,载体还包含5'和3'反向末端重复体(ITR)、一种或多种增强子元件和/或多聚腺苷酸(poly(A))尾巴。因此,在一些实施方案中,载体还包含5'和3'反向末端重复体(ITR)。在一些实施方案中,载体还包含一种或多种增强子元件。在一些实施方案中,载体还包含多聚腺苷酸尾巴。
在一些实施方案中,所述一种或多种增强子元件选自转录因子结合位点簇(cluster)和/或WPRE序列。因此,在一些实施方案中,所述一种或多种增强子元件是转录因子结合位点簇。在一些实施方案中,所述一种或多种增强子元件是WPRE序列。
在一些方面,提供了一种重组腺相关病毒(rAAV),其包含AAV8衣壳和包含与SEQID NO:23-36中的任一者具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或大于95%同一性的经密码子优化的核苷酸序列的rAAV载体,所述载体包含:a.5'反向末端重复体(ITR);b.顺式作用调节性模块(CRM);c.肝脏特异性启动子;e.经密码子优化的抗血浆激肽释放酶抗体重链序列和抗血浆激肽释放酶抗体轻链序列;f.土拨鼠肝炎病毒转录后调节性元件(WPRE);以及g.3'ITR。
在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括选自以下的启动子:人转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、经修饰的hTTR(hTTR mod.)、α-抗胰蛋白酶启动子、肝脏启动子1(LP1)、TRM启动子、人因子IX pro/肝转录因子反应性低聚物、LSP、CMV/CBA启动子(1.1kb)、CAG启动子(1.7kb)、mTTR、经修饰的mTTR、mTTR pro、mTTR增强子或碱性白蛋白启动子。
在一些实施方案中,肝脏特异性启动子包括人转甲状腺素蛋白启动子(hTTR)。
在一些实施方案中,CRM是肝脏特异性CRM。
在一些实施方案中,载体包含至少三个CRM。
在一些实施方案中,载体包含三个CRM8。
在一些实施方案中,WPRE序列是经修饰的。
在一些实施方案中,WPRE序列是WPRE mut6delATG。
在一些方面,提供了治疗有需要的受试者的与激活的激肽释放酶-激肽通路缺乏或失调相关的疾病或病症的方法,所述方法包括施用如本文所述的重组腺相关病毒载体(rAAV)。
在一些实施方案中,激活的激肽释放酶-激肽通路缺乏或失调是与C1酯酶抑制剂的缺乏相关的疾病或病症。
在一些实施方案中,rAAV载体是通过静脉内、皮下或经皮施用来施用。因此,在一些实施方案中,rAAV载体是通过静脉内施用来施用。在一些实施方案中,rAAV载体是通过皮下施用来施用。在一些实施方案中,rAAV载体是通过经皮施用来施用。
在一些实施方案中,经皮施用是通过基因枪进行的。
在一些实施方案中,与激活的激肽释放酶-激肽通路缺乏或失调或C1酯酶抑制剂缺乏相关的病症是遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、具有正常C1抑制剂的血管性水肿、糖尿病性黄斑水肿、偏头痛、肿瘤学、神经退行性疾病、类风湿性关节炎、痛风、肠道疾病、口腔粘膜炎、神经性疼痛、炎性疼痛、椎管狭窄-退行性脊柱疾病、动脉或静脉血栓形成、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨关节炎、血管炎、水肿、脑水肿、肺栓塞、中风、心室辅助装置或支架引起的凝血、头部外伤或肿瘤周围脑水肿、脓毒症、急性大脑中动脉(MCA)缺血事件、再狭窄、系统性红斑狼疮肾炎/血管炎或烧伤。
在一些实施方案中,与C1酯酶抑制剂缺乏相关的病症是HAE。
在一些实施方案中,HAE是I型、II型或III型。因此,在一些实施方案中,HAE是I型HAE。在一些实施方案中,HAE是II型HAE。在一些实施方案中,HAE是III型HAE。
在一些实施方案中,rAAV载体在施用后是游离型的。
在一些实施方案中,在施用后,抗血浆激肽释放酶抗体重链和轻链组装为功能性抗体。
在一些实施方案中,抗体是IgG。
在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后约2至6周时可在受试者的血浆中检测到。例如,在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后约2周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后约3周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后约4周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后约5周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后约6周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后多于6周时可在受试者的血浆中检测到。
在一些方面,提供了DNA表达盒,其包括经密码子优化的核苷酸序列,该核苷酸序列编码包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的全长抗体,并且其中该DNA表达盒包含与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或大于95%同一性的序列。
在一些实施方案中,DNA表达盒被包含在递送媒介物内。
在一些实施方案中,递送媒介物选自病毒载体、脂质纳米颗粒或细胞外囊泡。因此,在一些实施方案中,递送媒介物是病毒载体。在一些实施方案中,递送媒介物选自脂质纳米颗粒。在一些实施方案中,递送媒介物选自细胞外囊泡。
附图说明
图1是例示使用编码抗血浆激肽释放酶抗体的rAAV载体的示例性基因治疗方法的示意图。图1描绘静脉内(IV)施用于有需要的受试者的编码抗血浆激肽释放酶抗体的AAV载体;该载体被翻译成功能性抗血浆激肽释放酶抗体,该抗体被分泌到受试者的循环中;并且该抗体导致受试者的血浆激肽释放酶的结合和抑制。IV=静脉内;HC=重链;LC=轻链。
图2是编码抗-PKa IgG-2930-LALA的表达构建体的示意图。ITR:反向末端重复体;hTTR:人转甲状腺素蛋白启动子;CRM:顺式作用调节性模块;内含子可以是MVM内含子(小鼠细小病毒内含子);WPRE:肝脏特异性启动子;SS:分泌信号;多聚腺苷酸是上游增强子。
图3是示出在用编码第1轮密码子优化的2930-LALA构建体的质粒转染后HepG2培养基中活性IgG水平的图表。将HepG2细胞转染48小时或72小时。使用六种不同的rAAV第1轮密码子优化的构建体-A010、A013、A014、A015、A016和A017。
图4是示出在用编码第2轮基因优化(GO)的载体化2930-LALA构建体的质粒转染后HepG2培养基中活性IgG水平的图表。将HepG2细胞转染48小时或72小时。使用15种不同的rAAV GO载体化构建体-B041、B042、B043、B044、B045、B046、B047、B048、B049、B050、B051、B063、B065、B011、B021。
图5是显示分别在静脉内施用指示的载体后0周和2周时的小鼠血浆中活性IgG水平的图表。以5×1011或5×1012vg/kg的剂量给C57B6小鼠注射AAV载体,并在第0天和注射rAAV后2周时收集血浆,并通过MSD测定法确定血浆中的活性抗PKa抗体,该测定法通过使用固定化的PKa表面检测抗PKa IgG1分子。
图6是显示在经rAAV8处理的小鼠中产生的抗PKa抗体的离体生物活性的图表。在静脉内施用5×1012vg/kg的B041载体构建体后14天收集血浆样本。将体内rAAV8产生的抗PKa抗体抑制经处理小鼠的血浆样本中激肽释放酶-激肽通路的效力与市售抑制剂TakhzyroTM(拉那利尤单抗,一种血浆激肽释放酶的全人源化单克隆抗体抑制剂)抑制相同通路的效力进行比较,其中Takhzyro药物产品被加标到对照小鼠血浆中。生物活性是根据作为抗PKa抗体浓度的函数的血浆激肽释放酶活性的抑制百分比测量的。
图7是示出在经rAAV8处理的小鼠中产生的抗PKa抗体的离体生物活性的图表。在静脉内施用5×1012vg/kg B048载体构建体后14天时收集血浆样本。将体内rAAV8产生的抗PKa抗体抑制经处理小鼠的血浆样本中激肽释放酶-激肽通路的效力与市售抑制剂TakhzyroTM(拉那利尤单抗,一种血浆激肽释放酶的全人源化单克隆抗体抑制剂)抑制相同通路的效力进行比较,其中Takhzyro药物产品被加标到对照小鼠血浆中。生物活性是根据作为抗PKa抗体浓度的函数的血浆激肽释放酶活性的抑制百分比测量的。
定义
为了更容易地理解本发明,下文首先定义了某些术语。在整个专利说明书中阐述了以下术语和其他术语的另外的定义。
除上下文另有明确规定外,如本专利说明书和权利要求书中所用,单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代项。例如,术语“一个细胞”包括多个细胞,包括它们的混合物。
2A序列:如本文所用,“2A”或“2A序列”或“2A肽”是指一类可自切割的肽。2A肽的实例包括T2A、P2A、E2A和F2A。T2A具有序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:13);P2A具有序列ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:14);E2A具有序列QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ IDNO:15);F2A具有序列VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:16)。适用于本文所述的rAAV载体的切割有效的2A肽描述于Chng J.等人.Mabs.2015;7(2):403-412,以及Kim等人.PLoS One 2011;6(4)中,其每一者的内容都特此通过引用方式以其整体并入。
腺相关病毒(AAV):如本文所用,术语“腺相关病毒”或“AAV”或重组AAV(“rAAV”)包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV 11型、禽AAV、牛科动物AAV、犬科动物AAV、马科动物AAV和绵羊AAV(参见,例如,Fields等人,Virology,第2卷,第69章(第4版,Lippincott-Raven Publishers);Gao等人,J.Virology 78:6381-6388(2004);Mori等人,Virology330:375-383(2004))。通常,AAV可以感染分裂细胞和非分裂细胞,并且可以以染色体外状态存在而不整合到宿主细胞的基因组中。AAV载体常用于基因疗法中。在一些实施方案中,AAV是经工程改造的。可以通过本领域已知的任何方法对AAV进行工程改造。例如,在一些实施方案中,通过蛋白质工程方法对AAV衣壳进行工程改造。
施用:如本文所用,术语“施用”或“引入”在通过导致有效递送rAAV载体的方法或途径将编码抗体的rAAV载体递送至受试者中的上下文中可互换使用。本领域中已知用于施用rAAV载体的各种方法,包括例如静脉内、皮下或经皮。rAAV载体的经皮施用可以通过使用“基因枪”或生物射弹粒子递送系统来进行。在一些实施方案中,rAAV载体是通过非病毒脂质纳米颗粒施用的。
动物:如本文所用,术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中,“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中,“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中,非人动物是哺乳动物(例如,啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中,动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中,动物可以是转基因动物、经基因工程改造的动物和/或克隆。
抗体:如本文所用,术语“抗体”或“Ab”或“Abs”或“mAbs”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分,即含有特异性地结合抗原(与抗原发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性地结合......”或“与......发生免疫反应”是指抗体与所需抗原的所需抗原的一个或多个区域发生反应。抗体包括抗体片段。抗体还包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。抗体可以是完整抗体或免疫球蛋白或抗体片段。
公认的免疫球蛋白多肽包括k轻链和λ轻链以及其他物种中的α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ重链或等效物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25KDa或约214个氨基酸)包含位于NH2末端的约110个氨基酸的可变区和位于COOH末端的κ或λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50KDa或约446个氨基酸)类似地包含可变区基因(约116个氨基酸),和前述重链恒定区之一,例如,γ(约330个氨基酸)。
抗原结合位点:如本文所用,术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度不同的延伸段(称为“高变区”)被插入在称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼延伸段之间。因此,术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间和附近的氨基酸序列。在抗体分子中,轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中被彼此相对地布置以形成抗原结合表面。该抗原结合表面与被结合的抗原的三维表面互补,并且重链和轻链中的每一者的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。
大约或约:如本文所用,如应用于一个或多个目标值的术语“大约”或“约”是指与所陈述的参考值相似的值。在某些实施方案中,除非另有说明或从上下文中明显看出,否则术语“大约”或“约”是指在所陈述的参考值的任一方向上(大于或小于陈述的参考值)落入25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小以内的值的范围(除了这样的数将超过可能值的100%的情况外)。
生物活性:如本文所用,短语“生物活性”是指在生物系统中并且特别是在生物体中具有活性的任何剂的特性。例如,当施用于生物体时对该生物体具有生物效应的剂被认为具有生物活性。在特定的实施方案中,在肽具有生物活性的情况下,该肽的共享该肽的至少一种生物活性的部分通常被称为“生物活性”部分。
C1-酯酶缺乏或C1-酯酶病症:如本文所用,“C1-酯酶缺乏”或“C1-酯酶病症”意指与健康个体相比受试者中存在减少量的功能性C1-酯酶抑制剂。
GC含量:GC含量(或鸟嘌呤-胞嘧啶含量)是DNA或RNA分子中为鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)的含氮碱基的百分比。
密码子适应指数(CAI):CAI是用于分析密码子使用偏倚的最广泛技术。密码子使用偏倚是指编码DNA中同义密码子出现频率的差异。
密码子优化:如本文所用,术语“密码子优化”是指在不改变氨基酸序列的情况下基于各种标准改进重组基因的密码子组成的方法。密码子优化的各种方式是本领域中已知的,并且包括例如用于合成基因设计的基于网络的多目标优化平台,诸如称为COOL(在线密码子优化)的平台。各种出版物涉及密码子优化策略,诸如,例如Bioinformatics,2014年8月1日;30(15)2210-2;BMC Syst Biol.,2012年10月20日;6:134;Methods,2016年6月1日;102:26-35;以及Enzyme Microb Technol.,2015年7月至8月;75-76:57-63。这些出版物中的每一篇均通过引用方式并入本文。
可切割接头:如本文所用,术语“可切割接头”包括能够被化合物切割的任何多肽接头。例如,可切割接头可以是酶促可切割的多肽接头。各种酶促可切割接头都适用于本发明,包括例如弗林蛋白酶可切割接头或凝血酶可切割接头。
CpG位点:CpG位点或CG位点是这样的DNA区域,其中胞嘧啶核苷酸后面为沿其5'→3'方向呈线性碱基序列的鸟嘌呤核苷酸。
偶联(的)、连接(的)、接合(的)或融合(的):如本文所用,术语“偶联(的)”、“连接(的)”、“接合(的)”、“融合(的)”和“融合”可互换使用。这些术语是指通过任何手段(包括化学缀合或重组手段)将两个以上的元件或组分接合在一起。
表位:如本文所用,术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或片段特异性结合的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面分组(诸如氨基酸或糖侧链)组成并且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。例如,可以产生针对多肽的N末端肽或C末端肽的抗体。
功能性等效物或衍生物:如本文所用,术语“功能性等效物”或“功能性衍生物”在氨基酸序列的功能性衍生物的上下文中表示保留与原始序列实质上相似的生物活性(功能或结构)的分子。功能性衍生物或等效物可以是天然衍生物或合成制备的。示例性功能性衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列,条件是蛋白质的生物活性是保守的。取代氨基酸理想地具有与被取代的氨基酸相似的化学-物理特性。理想的相似化学-物理特性包括电荷、体积、疏水性、亲水性等的相似性。
遗传性血管性水肿或HAE:如本文所用,术语“遗传性血管性水肿”或“HAE”是指以不可预测和反复的炎症发作为特征的血液病症。HAE通常与C1-INH缺乏相关联,C1-INH缺乏可能是C1-INH水平低或C1-INH活性受损或降低的结果。HAE还与其他基因突变,诸如FXII等的突变相关联。症状包括但不限于可发生在身体的任何部位诸如面部、四肢、生殖器、胃肠道和上呼吸道的肿胀。
体外:如本文所用,术语“体外”是指在人工环境中(例如,在试管或反应容器中、在细胞培养物中等)而不是在多细胞生物体中发生的事件。
体内:如本文所用,术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人和非人动物中发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中,该术语可用于指在活细胞内(而不是例如在体外系统中)发生的事件。
IRES:如本文所用,术语“IRES”是指任何合适的内部核糖体进入位点序列。
分离的:如本文所用,术语“分离的”是指已经(1)与至少一些它在最初产生(无论在自然界中和/或在实验情形下)时与之相关联的组分分离,和/或(2)由人工产生、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约98%、约99%、实质上100%或100%的它们最初与之相关联的其他组分分开。在一些实施方案中,分离的剂为超过约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、实质上100%或99%纯。如本文所用,如果物质实质上不含其他组分,则该物质是“纯的”。如本文所用,术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物体中的细胞。
免疫结合:术语“免疫结合”是指发生在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白特异性抗原之间的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以根据相互作用的解离常数(Kd)来表示,其中较小的Kd表示较大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可以使用本领域熟知的方法进行量化。
接头或肽接头:如本文所用的术语“接头”或“肽接头”是指连接两个多肽结构域的氨基酸序列。例如,“接头”或“肽接头”可以将抗体重链氨基酸序列和抗体轻链氨基酸序列分开。多种接头适用于本发明,包括例如具有Gly-Ser-Gly(GSG)基序的接头。
多肽:如本文所用的术语“多肽”是指通过肽键连接在一起的连续氨基酸链。该术语用于指任何长度的氨基酸链,但本领域普通技术人员将理解,该术语不限于长链并且可以指包括通过肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员所知,可对多肽进行加工和/或修饰。
预防:如本文所用,当与疾病、病症和/或疾患的发生结合使用时,术语“预防(prevent)”或“预防(prevention)”是指降低发生疾病、病症和/或疾患的风险。
蛋白质:如本文所用的术语“蛋白质”是指作为离散单元起作用的一个或多个多肽。如果单个多肽是离散的功能单元并且不需要与其他多肽永久或暂时性地物理缔合以形成离散的功能单元,则术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如果离散的功能单元由多于一个物理上彼此缔合的多肽组成,则术语“蛋白质”是指物理联接并作为离散单元一起发挥作用的多个多肽。
重复序列:重复序列是在整个基因组中以多个拷贝出现的核酸(DNA或RNA)模式。
受试者:如本文所用,术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如,小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中,受试者是人类。受试者可以是患者,其是指提供给医疗提供者用于诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有或易患疾病或病症,但可表现出或可不表现出该疾病或病症的症状。
实质上:如本文所用,术语“实质上”是指表现出感兴趣的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解,生物和化学现象很少(如果有的话)走到完全和/或继续进行至完全或者实现或避免绝对结果。因此,术语“实质上”在本文中用于捕捉许多生物和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
实质同源性:短语“实质同源性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解,如果两个序列在相应位置上含有同源的残基,则它们通常被视为“实质上同源的”。同源残基可以是同一的残基。可替代地,同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特性的非同一残基。例如,如本领域普通技术人员众所周知,某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸,和/或具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对相同类型的另一个氨基酸的取代通常被视为“同源”取代。
如本领域众所周知,氨基酸或核酸序列可以使用多种算法中的任一种进行比较,包括市售计算机程序中可用的那些算法,如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、空位型BLAST和PSI-BLAST。以下文献描述了示例性此类程序:Altschul等人,Basiclocal alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990;Altschul等人,Methods in Enzymology;Altschul等人,"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997;Baxevanis等人,Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis ofGenes and Proteins,Wiley,1998;以及Misener等人(编辑),Bioinformatics Methodsand Protocols(Methods in Molecular Biology,第132卷),Humana Press,1999。除了鉴定同源的序列以外,上文提到的程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施方案中,如果两个序列的相应残基中有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高在相关残基延伸段上是同源的,则它们被视为实质上同源的。在一些实施方案中,相关延伸段是完整序列。在一些实施方案中,相关延伸段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多残基。
实质同一性:短语“实质同一性”在本文用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解,如果两个序列在相应位置上含有同一的残基,则它们一般被视为“实质上同一的”。如本领域众所周知,氨基酸或核酸序列可以使用多种算法中的任一种进行比较,包括市售计算机程序中可用的那些算法,如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、空位型BLAST和PSI-BLAST。以下文献描述了示例性此类程序:Altschul等人,Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990;Altschul等人,Methods in Enzymology;Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997;Baxevanis等人,Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysisof Genes and Proteins,Wiley,1998;以及Misener等人(编辑),Bioinformatics Methodsand Protocols(Methods in Molecular Biology,第132卷),Humana Press,1999。除了鉴定同一的序列以外,上述程序通常还提供同一性程度的指示。在一些实施方案中,如果两个序列的相应残基中有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上在相关残基延伸段上是同一的,则它们被视为实质上同一的。在一些实施方案中,相关延伸段是完整序列。在一些实施方案中,相关延伸段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多残基。
患有:“患有”疾病、病症和/或疾患的个体已被诊断具有或表现出该疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状。
治疗有效量:如本文所用,术语治疗剂的“治疗有效量”意指当施用于患有或易患疾病、病症和/或疾患的受试者时足以治疗、诊断、预防疾病、病症和/或疾患和/或延迟其症状发作的量。本领域普通技术人员将理解,治疗有效量通常经由包含至少一个单位剂量的给药方案施用。
治疗:如本文所用,术语“治疗(treat、treatment或treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的任何方法。可向未表现出疾病迹象和/或仅表现出疾病早期迹象的受试者施用治疗,以用于降低发展与该疾病相关的病理学的风险。
本文中通过端点表述的数值范围包括该范围内包含的所有数值和分数(例如,1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.9、4和5)。还应当理解,所有的数值及其分数被假定为由术语“约”修饰。
在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。这些部分的使用并不意味着限制本发明。每个部分可以应用于本发明的任何方面。在本申请中,除非另有说明,否则“或”的使用意指“和/或”。如本文所用,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数指示物,除非上下文另有明确说明。
在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。这些部分的使用并不意味着限制本发明。每个部分可以应用于本发明的任何方面。在本申请中,除非另有说明,否则“或”的使用意指“和/或”。
具体实施方式
本发明提供了编码抗血浆激肽释放酶抗体的载体和用于将此类载体递送于被诊断患有需要用这些治疗性抗体治疗的疾病或疾患的受试者的方法。此类载体的递送可通过基因疗法-例如,通过如下方式实现:将病毒载体或编码治疗性抗体或其抗原结合片段的其他DNA表达构建体施用于被诊断患有需要用此类治疗性抗体治疗的疾患的受试者,以在该受试者的组织或器官中产生储库,该储库将该抗体或治疗性抗体的抗原结合片段连续地供应到靶组织,在这里该抗体或抗原结合片段发挥其治疗作用。
在一些实施方案中,本公开描述了有效且稳健的重组腺相关病毒(rAAV)载体,其包含编码用于治疗血浆激肽释放酶介导的病症(诸如HAE相关C1 INH缺乏)的抗血浆激肽释放酶抗体的经密码子优化的核酸序列。人C1-INH是一种具有广泛抑制性和非抑制性生物活性的重要抗炎血浆蛋白。从序列同源性、其C端结构域的结构以及蛋白酶抑制的机制来看,人C1-INH属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)超家族(其是最大的一类血浆蛋白酶抑制剂),该超家族还包括抗凝血酶、α1-蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活剂抑制剂以及调节不同生理系统的许多其他结构相似的蛋白质。C1-INH是补体系统、激肽生成接触系统和内在凝血途径中蛋白酶的抑制剂。
C1-INH的低血浆含量或它的功能障碍导致补体和接触血浆级联两者的激活,并且也可能影响其他系统。C1-INH血浆含量降低至低于55μg/mL(正常值的约25%)的水平已被证明会诱导C1的自发激活。即使在存在正常的C1-INH活性的情况下,激肽释放酶激肽系统也可以通过其他手段过度激活。例如,凝血因子XII(FXII)中存在导致其更容易被激活并且因此更倾向于随后将前激肽释放酶激活为血浆激肽释放酶的已知突变。在一些实施方案中,本文所述的rAAV载体被用于治疗患有由过度血浆激肽释放酶活性介导的疾病或功能障碍的受试者。
图1中描绘了例示用于递送与血浆激肽释放酶结合的抗体的rAAV载体方法的示意图。如图1所示,包含重组抗血浆激肽释放酶抗体序列的rAAV载体被施用于受试者并且导致产生融合的重链和轻链mRNA转录物。在此转录物的翻译期间,产生了不同的重链和轻链多肽,导致产生分泌到循环中的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。图2描绘本文所述的rAAV载体的实施方案。
因此,本公开提供了尤其是rAAV载体,该rAAV载体包含编码可用于治疗疾病(诸如与激肽释放酶-激肽系统功能障碍相关的疾病)的抗体的经密码子优化的核酸序列。该rAAV载体可以被构建成编码靶向激肽释放酶-激肽系统的选定蛋白质成员(诸如例如血浆激肽释放酶)的抗体。
在一些实施方案中,该rAAV载体编码抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,该rAAV载体编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链。
本公开进一步提供了尤其是一种使用本文所述的rAAV载体治疗疾病的方法。在一些实施方案中,该疾病是与激肽释放酶-激肽级联的过度活性相关的疾病,诸如C1-INH缺乏或病症。
在一些实施方案中,该C1-INH缺乏或病症是HAE。
载体设计
本文提供了编码抗血浆激肽释放酶抗体或其抗原结合片段的载体。编码抗血浆激肽释放酶抗体或抗原结合片段的载体包括病毒载体以及非病毒载体。本文提供的病毒载体和其他DNA表达载体包括用于将转基因递送至靶细胞的任何合适的方法,诸如例如病毒载体和/或细胞外囊泡。转基因的递送工具(means)包括病毒载体、脂质体、其他含有脂质的复合体(包括脂质纳米颗粒(LNP))、其他大分子复合体、无机纳米颗粒、合成的经修饰的mRNA、未修饰的mRNA、小分子、非生物活性分子(例如,金颗粒)、聚合分子(例如,树枝状高分子)、裸DNA、质粒、噬菌体、转座子、粘粒或游离体。在一些实施方案中,载体是靶向载体,例如,靶向视网膜色素上皮细胞、CNS细胞、肌肉细胞或肝细胞的载体。
病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒(AAV,例如,AAV8)、慢病毒、辅助依赖性腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、日本血凝素病毒(HVJ)、甲病毒、痘苗病毒和逆转录病毒载体。逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MLV)的载体和基于人类免疫缺乏病毒(HIV)的载体。甲病毒载体包括塞姆利基(semliki)森林病毒(SFV)和辛德毕斯(sindbis)病毒(SIN)。在某些实施方案中,本文提供的病毒载体是重组病毒载体。在某些实施方案中,本文提供的病毒载体被改变成使得它们在人类中是复制缺乏的(replication-deficient)。在某些实施方案中,病毒载体是杂交载体,例如,置于“无助”腺病毒载体中的AAV载体。在某些实施方案中,本文提供了包含来自第一病毒的病毒衣壳和来自第二病毒的病毒包膜蛋白的病毒载体。在特定的实施方案中,第二病毒是水疱性口炎病毒(VSV)。在一些实施方案中,包膜蛋白是VSV-G蛋白。
在某些实施方案中,病毒载体是基于HIV的病毒载体。在某些实施方案中,基于HIV的载体包含至少两个多核苷酸,其中gag基因和pol基因来自HIV基因组并且env基因来自另一种病毒。
在某些实施方案中,病毒载体是基于单纯疱疹病毒的病毒载体。在某些实施方案中,基于单纯疱疹病毒的载体被修饰成使得它们不包含一个或多个即早(IE)基因,从而使它们无细胞毒性。
在某些实施方案中,病毒载体是基于MLV的病毒载体。在某些实施方案中,基于MLV的载体包含至多8kb的异源DNA来代替病毒基因。
在某些实施方案中,病毒载体是基于慢病毒的病毒载体。在某些实施方案中,慢病毒载体源自人类慢病毒。在某些实施方案中,慢病毒载体源自非人慢病毒。在某些实施方案中,慢病毒载体被包装到慢病毒衣壳中。在某些实施方案中,慢病毒载体包含以下元件中的一种或多种:长末端重复体、引物结合位点、多嘌呤区(polypurine tract)、att位点和衣壳化位点。
在某些实施方案中,病毒载体是基于甲病毒的病毒载体。在某些实施方案中,甲病毒载体是重组的、复制缺陷型甲病毒。在某些实施方案中,甲病毒载体中的甲病毒复制子通过在其病毒粒子表面展示功能性异源配体而靶向特定细胞类型。
在某些实施方案中,病毒载体是基于AAV的病毒载体。在某些实施方案中,该基于AAV的载体不编码AAV rep基因(复制所需)和/或AAV cap基因(合成衣壳蛋白所需)(rep蛋白和cap蛋白可由包装细胞以反式提供)。已鉴定出多种AAV血清型。在某些实施方案中,本文提供的基于AAV的载体包含来自一种或多种AAV血清型的组分。在一些实施方案中,本文提供的病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。
在一些方面,本文提供了重组腺相关病毒(rAAV)载体,其包含编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的经密码子优化的核酸序列。
在一些实施方案中,本文所述的rAAV载体在mRNA转录物中产生融合的抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链。该融合的重链和轻链转录物随后被切割从而产生分泌到循环中的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。因此,在一些实施方案中,本文所述的rAAV载体提供一种包含抗血浆激肽释放酶抗体重链序列和抗血浆激肽释放酶抗体轻链序列两者的基因盒。在一些实施方案中,肝脏在施用rAAV载体后充当储库。
在一些实施方案中,rAAV载体产生一种或多种通过mRNA键联连接在一起的mRNA转录物。因此,在一些实施方案中,rAAV载体产生一种包含通过mRNA键联连接在一起的重链和轻链核苷酸序列的mRNA转录物。在一些实施方案中,rAAV载体产生多于一种包含通过mRNA键联连接在一起的重链和轻链核苷酸序列的mRNA转录物。在一些实施方案中,该mRNA键联随后被切割并且重链和轻链多肽在翻译过程中被表达为不同的实体。在一些实施方案中,mRNA键联保持完整并且重链和轻链多肽在翻译过程中被表达为不同的实体。
在一些实施方案中,接头连接抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链。各种类型的接头可被用于rAAV载体中。在一些实施方案中,接头是甘氨酸/丝氨酸接头,即基本上由甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头。在示例性实施方案中,该接头包括GS或GSG。在一些实施方案中,该接头是GSG。在另一个实施方案中,该接头包含Gly-Ser-Gly(GSG)基序,诸如GGSG(SEQ ID NO:7)、(GS)x3(SEQ ID NO:12)、(GGSG)x2(SEQ ID NO:8)、SGGSGGSGG(SEQ ID NO:9)、GGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:10)、(GGGGS)x3(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中,该接头是可切割接头。许多类型的可切割接头在本领域中是已知的,例如那些可被酶切割的接头。在一些实施方案中,该接头是弗林蛋白酶或凝血酶可切割接头。在一些实施方案中,该接头(L)是弗林蛋白酶可切割接头。
在一些实施方案中,该弗林蛋白酶可切割接头之后是2A序列。各种类型的2A序列是本领域已知的,并且包括例如T2A、P2A、E2A或F2A。在一些实施方案中,2A序列是T2A。在一些实施方案中,2A序列是P2A。在一些实施方案中,2A是E2A。在一些实施方案中,2A是F2A。
在一些实施方案中,AAV载体具有IRES序列。在一些实施方案中,连接子包含IRES序列。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由单一的启动子控制。此类构型将导致产生包含转录物的一条融合的重链和轻链,并且在切割该融合的重链和轻链序列之后,产生两种多肽产物。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链由分开的启动子控制。
各种类型的启动子可用于本文所述的rAAV载体。这些包括,例如,遍在启动子、组织特异性启动子和可调节型(例如可诱导型或可阻遏型)启动子。在一些实施方案中,启动子是经修饰的。各种类型的经修饰的启动子是本领域已知的,并且包括例如缩短的最小启动子等。在一些实施方案中,启动子是遍在启动子。在一些实施方案中,启动子是鸡β肌动蛋白启动子。在一些实施方案中,启动子是肝脏特异性启动子。合适的肝脏特异性启动子的实例包括人转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、经修饰的hTTR(hTTR mod.)、α-抗胰蛋白酶启动子、肝脏启动子1(LP1)、TRM启动子、人凝血因子IX pro/肝转录因子反应性低聚物、LSP、CMV/CBA启动子(1.1kb)、CAG启动子(1.7kb)、mTTR、经修饰的mTTR、mTTR pro、mTTR增强子和碱性白蛋白启动子。肝脏特异性启动子描述于例如Zhijian Wu等人,Molecular Therapy第16卷,第2期,2008年2月,其内容通过引用方式并入本文。
rAAV载体可含有另外的增强子或调节性元件以促进mRNA的转录和/或翻译(例如,增强子序列、Kozak序列、多聚腺苷酸化序列、转录终止序列、IRES等)。在一些实施方案中,载体包含5'和3'反向末端重复体(ITR)。在一些实施方案中,载体包含一种或多种增强子元件。在一些实施方案中,载体包含多聚腺苷酸尾巴。在一些实施方案中,rAAV载体包含肝特异性控制元件/区域(HCR)。在一些实施方案中,rAAV载体包含ApoE增强子。在一些实施方案中,rAAV载体包含肝脏特异性核酸调节性元件,诸如例如顺式调节性元件(CRE)。CRE描述于EP 18202888中,其内容特此通过引用方式以其整体并入。示例性CRE包括例如CRE4和CRE6。在一些实施方案中,CRE4与载脂蛋白A-II基因组合使用。在一些实施方案中,CRE6与载脂蛋白C-I基因组合使用。
在一些实施方案中,rAAV载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后控制元件(WPRE)。WPRE的各种优化或变体形式可与本文所述的载体一起使用,并且包括例如WPRE野生型、WPRE3和WPREmut6delATG等。WPRE和相关的WPRE变体描述于美国专利第10,179,918号;美国专利第7,419,829号;美国专利第9,731,033号;美国专利第8,748,169号;美国专利第7,816,131号;美国专利第8,865,881号;美国专利第6,287,814号;美国专利公布第2016/0199412号;美国专利公布第2017/0114363号;美国专利公布第2017/0360961号;美国专利公布第2019/0032078号;美国专利公布第2018/0353621号;国际公布第WO2017201527号;国际公布第WO2018152451号;国际公布第WO2013153361号;国际公布第WO2014144756号;欧洲专利第EP1017785号;以及欧洲专利公布第3440191号。上述公布中的每一者均通过引用方式以其整体并入本文。
在一些实施方案中,rAAV载体包含WPRE元件,和/或转录因子结合位点簇。因此,在一些实施方案中,rAAV载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后控制元件(WPRE)。在一些实施方案中,rAAV载体包含转录因子结合位点簇。
在一些实施方案中,rAAV载体包含顺式调节性模块(CRM)。各种类型的CRM适用于本文所述的载体,并且包括例如肝脏特异性CRM、神经元特异性CRM和/或CRM8。因此,在一些实施方案中,CRM是肝脏特异性CRM。在一些实施方案中,CRM是神经元特异性CFM。在一些实施方案中,CRM是CRM8。在一些实施方案中,载体包括多于一个CRM。例如,在一些实施方案中,载体包含两个、三个、四个、五个或六个CRM。在一些实施方案中,载体包含三个CRM,例如三个CRM8。
rAAV载体包含分泌信号,该分泌信号是天然存在的和/或人工信号肽(例如经重组工程改造的)。在一些实施方案中,分泌信号是天然存在的信号肽。在一些实施方案中,分泌信号是人工信号肽(例如经重组工程改造的)。在一些实施方案中,分泌信号是人分泌信号。在一些实施方案中,分泌信号是鼠分泌信号。
在一些实施方案中,对rAAV载体进行序列优化以增加转录物稳定性以获得更有效的翻译并且降低免疫原性。在一些实施方案中,对包含抗血浆激肽释放酶重链和轻链的rAAV载体进行序列优化以增加转录物稳定性以获得更有效的翻译并且降低免疫原性。在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶重链和轻链是经密码子优化的。
在一些实施方案中,rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11载体。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV 1。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV 2。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV 3。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV4。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV 5。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV 6。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV 7。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV 8。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV 9。在一些实施方案中,rAAV载体是AAV 10。在一些实施方案中,AAV载体是AAV 11。
在一些方面,本文提供了包含编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中,该核酸为DNA。在一些实施方案中,该核酸为RNA。在一些实施方案中,该核酸为DNA和RNA的组合。在一些实施方案中,本文提供了包含编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的核苷酸序列的载体。
在一些实施方案中,核苷酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方案中,启动子是肝脏特异性启动子。肝脏特异性启动子的实例包括人转甲状腺素蛋白启动子(TTR)和经修饰的hTTR(hTTR mod.)。上文描述了可用于各种实施方案的各种合适的启动子。
在一些实施方案中,核苷酸序列可操作地连接至顺式肌动蛋白调节性模块(CRM)。在一些实施方案中,CRM包括肝脏特异性CRM。一些实施方案包括三个CRM,例如三个CRM8。本文描述了可用于各种实施方案的各种类型的合适的CRM。
在一些实施方案中,核苷酸序列可操作地连接至土拨鼠肝炎病毒转录后控制元件(WPRE)。在一些实施方案中,WPRE是WPREmut6。WPRE的各种优化或变体形式在本领域中是已知的,并且已经在本文中进行了描述。
在一些实施方案中,核苷酸序列可操作地连接至分泌信号,该分泌信号是天然存在的或人工信号肽(例如,经重组工程改造的)。在一些实施方案中,分泌信号是天然存在的信号肽。在一些实施方案中,分泌信号是人工信号肽(例如经重组工程改造的)。在一些实施方案中,分泌信号是人分泌信号。在一些实施方案中,分泌信号是鼠分泌信号。
抗血浆激肽释放酶抗体
由rAAV载体编码的示例性重链和轻链抗血浆激肽释放酶氨基酸序列显示在下表1至表2中。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体被工程改造为具有延长的半衰期。为此,在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体包含NHance突变(即,H433K和N434F)。在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体包含YTE突变(即,M252Y/S254T/T256E)。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体被工程改造成具有减少的与Fc受体的相互作用。为此,在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体包含LALA突变(即,L234A和L235A)。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体被工程改造成具有减少的CpG和重复序列。在一些实施方案中,对抗血浆激肽释放酶抗体进行工程改造以针对天然AAV8的GC含量百分比进行标准化。为此,在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体包含2930-LALA突变。
在一些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体与白蛋白或FcRn相互作用肽融合。
在一些实施方案中,重链和轻链序列与下表中所述序列是约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约50%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约55%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约60%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约65%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约70%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约75%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约80%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约85%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约90%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约95%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是约100%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表1至表2中所述序列是同一的。
表1:示例性抗血浆激肽释放酶重链和轻链氨基酸序列
*下划线表示LALA突变氨基酸
表2:示例性抗血浆激肽释放酶蛋白序列——具有前导序列
下表3显示了编码抗血浆激肽释放酶抗体的示例性经密码子优化的核苷酸序列。
在一些实施方案中,重链和轻链序列与下表中所述序列是约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约50%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约55%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约60%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约65%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约70%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约75%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约80%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约85%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约90%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约95%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是约100%同一的。在一些实施方案中,重链和轻链序列与表3中所述序列是同一的。
表3:示例性经基因优化(GO)的载体化DNA序列
在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含FTF SHYIMM(SEQ IDNO:17)的重链CDR1。在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含GIYSSGGITVYADSVKGRFTI(SEQ ID NO:18)的重链CDR2。在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含RRIGVPRRDEFDI(SEQ ID NO:19)的重链CDR3。在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含FTFSHYIMM(SEQ ID NO:17)的重链CDR1、包含GIYSSGGIT VYADSVKGRFTI(SEQ ID NO:18)的CDR2和包含RRIGVPRRDE FDI(SEQ ID NO:19)的CDR3。
在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含RASQSISSWLA(SEQ IDNO:20)的轻链CDR1。在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含YKASTLESGVPSRF(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2。在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含QQYNTYWT(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含RASQSISSWLA(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含QQYNTYWT(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。
在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含FTF SHYIMM(SEQ IDNO:17)的重链CDR1、包含GIYSSGGITVYAD SVKGRFTI(SEQ ID NO:18)的CDR2和包含RRIGVPRRDEFDI(S EQ ID NO:19)的CDR3。在一些实施方案中,示例性抗血浆激肽释放酶抗体具有包含RASQSISSWLA(SEQ ID NO:20)的轻链CDR1、包含YKASTLESGVPSRF(SEQ ID NO:21)的轻链CDR2和包含Q QYNTYWT(SEQ ID NO:22)的轻链CDR3。
在一些实施方案中,本文公开的CDR相对于本文所述的CDR具有1、2、3或4处氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中,本文公开的CDR与所述CDR序列相比含有不超过3、2或1处氨基酸取代、缺失或插入。在一些实施方案中,获得了具有所需结合特性的亲和力成熟的变体。WO2014152232中呈现了各种亲和力成熟的CDR序列,其内容据此通过引用方式以其整体并入。
本公开的示例性抗血浆激肽释放酶抗体包括但不限于IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA(例如,IgA1、IgA2和IgAsec)、IgD、IgE、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv、scFv-Fc和SMIP结合部分。在某些实施方案中,抗血浆激肽释放酶抗体编码拉那利尤单抗的重链和轻链序列。在一些实施方案中,该抗体是全长抗体。在一些实施方案中,该抗体不是抗体片段。在一些实施方案中,该抗体不是Fab。
在某些实施方案中,该抗体是scFv。scFv可以包括例如允许scFv以不同方向定向以实现抗原结合的柔性接头。在各种实施方案中,该抗体可以是细胞溶质稳定的scFv或胞内抗体,其在细胞内的还原环境中保持其结构和功能(参见,例如,Fisher和DeLisa,J.Mol.Biol.385(1):299-311,2009;其通过引用方式并入本文)。在特定的实施方案中,根据本文所述的方法将scFv转化为IgG或嵌合抗原受体。在实施方案中,抗体与变性蛋白质靶标和天然蛋白质靶标两者结合。在实施方案中,抗体与变性蛋白质或天然蛋白质结合。在一些实施方案中,抗体结合补体系统的选定成员。在一些实施方案中,抗体与血浆激肽释放酶结合。
在包括人类在内的大多数哺乳动物中,完整抗体至少具有通过二硫键连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链均由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)以及介于CH1和CH2之间的铰链区组成。每条轻链均由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以被进一步细分为中间穿插有更保守的区域(称为“框架区”(“FR”))的高变异性区域(称为“互补决定区”(“CDR”))。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR构成,该三个CDR和四个FR从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
抗体包括抗体的所有已知形式和其他具有抗体样特性的蛋白质支架。例如,该抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体或具有抗体样特性的蛋白质支架,诸如纤连蛋白或锚蛋白重复体。该抗体可具有以下任何同种型:IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA(例如,IgA1、IgA2和IgAsec)、IgD或IgE。
抗体片段可包括一个或多个源自抗体的区段。该源自抗体的区段可保留与特定抗原特异性结合的能力。抗体片段可以是例如Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv或SMIP。抗体片段可以是例如双抗体、三抗体、亲和抗体、纳米抗体、适体、结构域抗体、线性抗体、单链抗体,或可由抗体片段形成的多种多特异性抗体中的任何一种。
抗体片段的实例包括:(i)Fab片段:由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段:包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段;(iii)Fd片段:由VH结构域和CH1结构域组成的片段;(iv)Fv片段:由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的片段;(v)dAb片段:包括VH结构域和VL结构域的片段;(vi)dAb片段:一种为VH结构域的片段;(vii)dAb片段:一种为VL结构域的片段;(viii)分离的互补决定区(CDR);以及(ix)可任选地通过一个或多个合成接头接合的两个或更多个分离的CDR的组合。此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码,但这两个结构域可以使用重组方法例如通过合成接头接合,该合成接头使它们能够被表达为单个蛋白质,该单个蛋白质的VL区和VH区配对从而形成单价结合部分(称为单链Fv(scFv))。抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得,并且在一些情况下可以以与完整抗体相同的方式使用。抗原结合片段可通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生。抗体片段还可以包括任何上述抗体片段,其中添加了另外的C末端氨基酸、N末端氨基酸或将各个片段分开的氨基酸。
如果抗体包括一个或多个源自第一物种的抗原决定区或恒定区和一个或多个源自第二物种的抗原决定区或恒定区,则该抗体可被称为嵌合抗体。嵌合抗体可以通过例如基因工程来构建。嵌合抗体可以包括属于不同物种(例如,来自小鼠和人)的免疫球蛋白基因区段。
编码抗血浆激肽释放酶抗体的rAAV载体用于疾病治疗的用途
本文描述了治疗有需要的受试者的与不受调节的血浆激肽释放酶活性相关的疾病诸如C1酯酶抑制剂缺乏或病症的方法,所述方法包括施用编码抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗-血浆激肽释放酶抗体轻链的AAV载体。施用本文所述的rAAV载体后,抗血浆激肽释放酶抗体重链和轻链组装为功能性抗体。功能性抗体被分泌到循环中并结合血浆激肽释放酶。
本文所述的rAAV载体可用于治疗任何C1酯酶抑制剂缺乏或病症和/或由失调的血浆激肽释放酶活性介导的病症。在一些实施方案中,该病症是遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、类风湿性关节炎、痛风、肠道疾病、口腔粘膜炎、神经性疼痛、炎性疼痛、椎管狭窄-退行性脊柱疾病、动脉或静脉血栓形成、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨关节炎、血管炎、水肿、脑水肿、肺栓塞、中风、心室辅助装置或支架引起的凝血、头部外伤或肿瘤周围脑水肿、脓毒症、急性大脑中动脉(MCA)缺血事件、再狭窄、系统性红斑狼疮肾炎/血管炎、糖尿病性黄斑水肿或烧伤。在一些实施方案中,C1酯酶抑制剂缺乏或病症是HAE。该HAE可以是任何类型的HAE,包括I型、II型或III型HAE。
在一些实施方案中,rAAV载体在施用于有需要的受试者后保持游离型。在一些实施方案中,rAAV载体在施用于有需要的受试者后不保持游离型。例如,在一些实施方案中,rAAV载体整合到受试者的基因组中。此类整合可以例如通过使用各种基因编辑技术,诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENS)、ARCUS基因组编辑和/或CRISPR-Cas系统来实现。
在一些实施方案中,包含本文所述的rAAV载体的药物组合物被用于治疗有需要的受试者。含有本发明的rAAV载体或颗粒的药物组合物含有药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。合适的药物载体的实例是本领域众所周知的,并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(诸如油/水乳剂)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。此类载体可通过常规方法配制并以治疗有效量施用于受试者。
通过合适的途径将rAAV载体施用于有需要的受试者。在一些实施方案中,rAAV载体是通过静脉内、腹膜内、皮下或皮内施用来施用的。在一些实施方案中,rAAV是静脉内施用的。在实施方案中,皮内施用包括利用“基因枪”或生物射弹粒子递送系统来施用。在一些实施方案中,rAAV载体是通过非病毒脂质纳米颗粒施用的。例如,包含rAAV载体的组合物可以包含一种或多种稀释剂、缓冲剂、脂质体、脂质、脂质复合物。在一些实施方案中,rAAV载体被包含在微球或纳米颗粒诸如脂质纳米颗粒内。
在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后约2至6周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约2周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约3周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约4周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约5周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在约6周时可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后约2至6周时可在受试者的肝细胞中检测到。
在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少3个月、6个月、12个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年可在受试者的血浆中检测到。因此,在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少3个月可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少6个月可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少12个月可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少2年可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少3年可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少4年可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少5年可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少6年可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少7年可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少8年可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少9年可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后至少10年可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用rAAV载体后在受试者的余生中可在受试者的血浆中检测到。在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致活性抗PKa抗体的产生,产生的程度与在静脉内递送的纯化抗PKa IgG施用后发现的程度相同。在一些实施方案中,与静脉内递送的纯化抗PKa IgG施用相比,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生更大量的活性抗PKa抗体。
在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生至少60%的活性抗PKa抗体。在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生至少65%的活性抗PKa抗体。在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生至少70%的活性抗PKa抗体。在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生至少75%的活性抗PKa抗体。在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生至少80%的活性抗PKa抗体。在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生至少85%的活性抗PKa抗体。在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生至少90%的活性抗PKa抗体。在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生至少95%的活性抗PKa抗体。在一些实施方案中,所施用的包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链抗体的rAAV导致产生至少99%的活性抗PKa抗体。
在一些实施方案中,在将AAV载体施用于受试者后,在循环中可检测到的血浆激肽释放酶IgG的水平比在将纯化的血浆激肽释放酶抗体直接施用于受试者后可检测到的IgG高介于约4至10倍之间。在一些实施方案中,在将AAV载体施用于受试者后,可检测到的活性血浆激肽释放酶IgG的水平达到或超过人类治疗水平。在一些实施方案中,施用rAAV载体后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约2至35倍之间。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约2倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约3倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约4倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约5倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约6倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约6倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约7倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约8倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约9倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约10倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约15倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约20倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约25倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约30倍。在一些实施方案中,施用后活性血浆激肽释放酶IgG的水平为人类治疗水平的约35倍。
因此,与向有需要的受试者单次施用纯化的抗血浆激肽释放酶抗体相比,施用包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的rAAV载体导致持续稳健的表达。
在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约50%与95%之间的抗血浆激肽释放酶抗体。因此,在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约50%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约55%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约60%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约65%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约70%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约75%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约75%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约80%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约85%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约90%的抗血浆激肽释放酶抗体。在一些实施方案中,所施用的rAAV载体产生能够将血浆激肽释放酶活性抑制约95%的抗血浆激肽释放酶抗体。
实施例
本发明的其他特征、目的和优点在以下实施例中是显而易见的。然而,应当理解,这些实施例虽然指示本发明的实施方案,但仅以说明而不是限制的方式给出。对于本领域技术人员而言,本发明的范围内的各种变化和修改将从实施例中变得显而易见。
实施例1.载体设计
本实施例中提供了产生包含编码抗激肽释放酶抗体及其变化形式的经密码子优化的核酸序列的rAAV表达构建体(rAAV载体)的示例性方法和设计。在本研究中,使用了重组AAV载体(rAAV8)。rAAV载体的基本设计包括侧接有反向末端重复体(ITR):5'-ITR和3'-ITR的表达盒的设计。这些ITR通过AAV复制蛋白Rep和载体生产细胞中的相关因子介导载体基因组的复制和包装。通常,表达盒含有启动子、编码序列、多聚腺苷酸尾巴和/或标签。使用标准分子生物学技术设计和制备编码经基因密码子优化的载体化抗血浆激肽释放酶(PKa)-IgG抗体的表达构建体。将抗PKa抗体重链(HC)的编码序列和抗PKa抗体轻链(LC)的编码序列插入到启动子鸡B-肌动蛋白启动子(CB)的下游。在另一个示例性方法和设计中,启动子(+/-增强子)是包含3xCRM8/hTTR的肝脏特异性启动子。在一些实施方案中,表达盒还包括WPRE元件和人分泌信号(SS)。在一些实施方案中,表达盒还包括内含子。在HC和LC之间插入包含编码弗林蛋白酶可切割位点(F/2A)的寡核苷酸的短接头。将168bp SV40 pol A序列和DNA滴度序列插入到IgG LC的下游。图2举例说明了表达构建体的示意图。然后将表达构建体连结到AAV载体并通过测序进行测试。载体被包装在病毒颗粒中并被储存。
可以执行上面的方案的任何数目的变化形式。可替代的构建体可以通过如下方式获得:用用于片段抗原结合(Fab)的编码序列替换HC和LC的编码序列;用具有阻止与Fc受体的相互作用的亮氨酸到丙氨酸突变(LALA)的变体替换抗PKa编码序列。另一种可替代构建体可以通过用具有特定亮氨酸到丙氨酸突变的变体2930-LALA替换抗PKa编码序列来获得,该变体减少CpG二核苷酸和重复序列,并针对天然AAV8的鸟嘌呤-胞嘧啶含量(GC含量)百分比进行标准化。另外,可以使用多于一个启动子,并且/或者可以在LC上游引入IRES序列。
此外,载体构建体的设计意图是减少CpG含量和重复序列。还对载体构建体进行工程改造以将GC含量百分比标准化为在天然的、未修饰的AAV8中发现的GC含量百分比。评估所设计的载体构建体中的每个载体构建体的CpG含量、密码子适应指数(CAI)、密码子上下文(CC)、GC含量和重复基序。从这些研究中获得的数据在下表4和5中示出。
表4:包含第1轮密码子优化的LALA或2930-LALA变体的示例性AAV构建体及其特征(包括CpG和%GC含量)
构建体ID CAI CpG %GC 连续重复体 重复基序
A013 0.96305 124 63.05 23 1925
A014 0.81407 43 52.79 0 214
A015 0.81194 44 53.39 0 103
A016 0.7788 74 53.11 0 65
A017 0.70561 0 42.4 10 309
表5:包含经基因优化(GO)的载体化LALA或2930-LALA变体的示例性AAV构建体及其特征(包括CpG和%GC含量)
实施例2.通过rAAV驱动的经POOR密码子优化的抗PKa2930-LALA构建体体外进行的活性IgG抗体表达
图3显示在用包含经POOR密码子优化的抗PKa 2930-LALA构建体的质粒转染HepG2细胞48和72小时后HepG2细胞培养基中活性IgG水平的表达。构建体A010和A013包含与构建体B021的密码子优化相同的密码子优化。构建体B021是GO载体化的抗PKa IgG+LALA构建体变体。
尽管具有大的CpG重复体,但用A013构建体转染的HepG2细胞表达了高水平的活性IgG。相反,具有减少的CpG重复体的A017构建体在HepG2细胞中不表达任何活性IgG水平。在所有经POOR密码子优化的构建体中,只有A016构建体在HepG2细胞中表达活性IgG水平。然而,A016构建体中的活性IgG表达水平仅为A013构建体的约十分之一。A010构建体表达的活性IgG类似于A013构建体。图3和表4表明CpG量与活性IgG表达之间没有直接相关性。
实施例3.通过rAAV驱动的GO载体化抗PKa 2930-LALA构建体体外进行的活性IgG抗体表达
为了在体外评估GO载体化构建体的表达,用编码GO载体化抗PKa 2930-LALA构建体(pAAV)的质粒转染HepG2细胞(1.6×106个细胞/孔;12孔板)。绿色荧光蛋白(GFP)质粒用作对照。在转染72和96小时后收集培养基,并进行如下所述的MSD测定以确定活性抗PKa抗体的水平。
对于MSD测定,给MSD标准96孔板包被在pH 9.4碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中稀释至30μl/孔的最终体积的4μg/ml血浆激肽释放酶(Enzyme Research Labs#HPKa1303)。然后将板在4℃下温育过夜。第二天,用300μl洗涤缓冲液(PBS+0.05%吐温20)将板洗涤五次,并在150μl 5% BSA/PBS中封闭1小时。从最高浓度100ng/ml开始,在2%BSA中准备抗PKa-LALA-IgG(#W28593,内部)的滴定。进行7点3倍滴定。对于第8个点,仅添加血浆作为无抗PKa-LALA对照。将细胞培养上清液在2% BSA中按1:30稀释,然后进行1:3连续稀释。在5次洗涤后,将30μl 0.5ug/ml的磺基标签驴抗人IgG抗体(Jackson709-006-149)添加到所有孔中。将板在室温下振荡温育1小时。在最终洗涤后,将150μl 0.5x MSD读取缓冲液添加到孔中,然后在5分钟内在MSD读数器上读取。
作为除B011之外的治疗组,构建体表达了一些水平的活性IgG,如图4中所示。然而,与其他构建体相比,用B041、B044、B048、B050、B063和B021新构建体转染的细胞表达更高水平的活性IgG。B050构建体表达了最高量的活性IgG水平。然而,如表5所示,B050构建体还含有更大的量的CpG含量。高数量的CpG含量可能与增加的免疫原性有关。其他构建体B041、B044、B048、B063和B021新构建体表现出更高的活性IgG表达,并且它们还含有低CpG含量。B011是阴性对照质粒,并且不表达任何蛋白。
实施例4.通过rAAV驱动的GO载体化抗PKa 2930-LALA构建体体内进行的活性IgG抗体表达
下面所述的示例性研究旨在测试rAAV驱动的抗PKA抗体的表达。给C57B6小鼠注射表达(a)抗PKa B041构建体、(b)抗PKa B048构建体和(c)抗PKa B021的rAAV载体,如表6中所述。
表6.使用编码抗血浆激肽释放酶抗体的rAAV载体进行的示例性体内研究
条件 治疗 体积 剂量(vg/kg) N/组
B041 rAAV8-PKa-B041 200μl 5×1012 5
B041 rAAV8-PKa-B041 200μl 5×1011 5
B048 rAAV8-PKa-B048 200μl 5×1012 5
B048 rAAV8-PKa-B048 200μl 5×1011 5
B021 rAAV8-PKa-B048 200μl 5×1012 5
在第0天给C57B6小鼠注射AAV载体(5×1011或5×1012vg/kg),并在静脉注射rAAV后第14天(2周)时采集血浆,并通过MSD测定确定血浆中的活性抗PKa抗体。简而言之,将PKa蛋白包被在MSD板上以捕获血浆中存在的抗PKa mAb。然后使用抗人IgG检测抗体来量化血浆中的已表达活性IgG。
注射了5×1012vg/kg剂量的rAAV8-PKa-B041构建体的小鼠表达了高水平的活性IgG,如图5中所示。用rAAV8-PKa-B021构建体在5×1012vg/kg剂量下获得了类似的结果,但与rAAV8-PKa-B041构建体相比,活性IgG表达水平的重现性较低。
实施例5:在经rAAV8处理的小鼠血浆中产生的抗PKa抗体的离体效力的评估
此研究说明了在rAAV8构建体静脉内施用后28天时收集的经rAAV8处理的小鼠血浆样本中产生的抗PKa抗体的离体生物活性。在此研究中,在存在逐渐增加(滴定)的外源性抑制剂TakhzyroTM的情况下通过添加鞣花酸在未处理的对照小鼠血浆样本中激活激肽释放酶-激肽通路。TakhzyroTM(拉那利尤单抗-flyo)是FDA批准的用于预防12岁或以上患者的遗传性血管性水肿(HAE)发作的完全人单克隆抗体药物。通过添加PKa特异性促荧光底物(PFR-AMC)以及随后随时间的推移进行荧光测量来监测血浆中的PKa活性。为了测试在经rAAV8处理的小鼠血浆样本中产生的抗PKa抗体的生物活性,通过向这些小鼠的血浆中添加鞣花酸来类似地激活激肽释放酶-激肽通路,并测量PKa活性。具体来说,将来自单个经rAAV8处理的小鼠的给药后血浆连续稀释到来自同一小鼠的给药前血浆样本中,然后添加鞣花酸和PFR-AMC以测量剂量反应。
根据来自这些稀释系列的作为抗PKa抗体浓度的函数的血浆激肽释放酶活性的抑制百分比来测量生物活性,其中较高的抗体水平导致较低的PKa活性%。图6至图7描述了此研究的结果。图6至图7示出分别在静脉内施用rAAV8 B041和rAAV8 B048构建体后14天收集的经rAAV8处理的小鼠血浆样本中产生的抗PKa抗体的离体生物活性。将来自个体小鼠的第14天血浆样本滴定到同一只小鼠的第0天血浆中,以便维持激肽释放酶-激肽通路组分的相似水平,但稀释抗PKa mAb转基因蛋白。结果表明,在经rAAV8处理的小鼠中产生的抗PKa抗体的剂量反应与FDA批准的药物TakhzyroTM的剂量反应是同一的。这表明在经rAAV8处理的小鼠血浆中产生的抗PKa抗体具有非常高的完整性,与TakhzyroTM药物产品无法区分。
等效物和范围
本领域技术人员将认识到,或者仅仅使用常规试验就能够确定本文所描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。本发明的范围不希望受限于以上说明,而是如所附权利要求书所阐述。
序列表
<110>武田药品工业株式会社(TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED)
<120>用于治疗由失调的血浆激肽释放酶介导的疾病的抗体的腺相关病毒载体递送
<130> SHR-2020WO1
<140>
<141>
<150> 63/126,300
<151> 2020-12-16
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多肽"
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Tyr Arg Arg Ile Gly Val Pro Arg Arg Asp Glu Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 2
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多肽"
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多肽"
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Tyr Arg Arg Ile Gly Val Pro Arg Arg Asp Glu Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
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000
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<400> 5
000
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<400> 6
000
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 7
Gly Gly Ser Gly
1
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 8
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 9
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 10
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 12
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 13
<211> 18
<212> PRT
<213> 明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)
<400> 13
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 14
<211> 19
<212> PRT
<213> 捷申病毒A(Teschovirus A)
<400> 14
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 马鼻炎A病毒(Equine rhinitis A virus)
<400> 15
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 16
<211> 22
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<400> 16
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 17
Phe Thr Phe Ser His Tyr Ile Met Met
1 5
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 18
Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg Phe Thr Ile
20
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 19
Arg Arg Ile Gly Val Pro Arg Arg Asp Glu Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 20
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 21
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
1 5 10
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
肽"
<400> 22
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Trp Thr
1 5
<210> 23
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多核苷酸"
<400> 23
atggaattcg gtctatcttg ggtgttccta gtggctctat tcagaggtgt gcagtgcgag 60
gtgcaattgc tggaatccgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctccct gagactgtct 120
tgcgccgcct ccggcttcac cttctcccac tacatcatga tgtgggtgcg acaggctcct 180
ggcaaggggc tggaatgggt gtccggcatc tactcctccg gcggcatcac cgtgtacgcc 240
gactccgtga agggccggtt caccatctct cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccta ccggcggatc 360
ggcgtgccca gacgggacga gttcgacatc tgggggcagg gcaccatggt gacagtgtcc 420
tccgcttcca ccaagggccc atccgtgttt ccgctagcac cttcctccaa gtccacctct 480
ggcggcaccg ccgctctggg ctgcctggtg aaggactact tccctgagcc tgtgaccgtg 540
agctggaact ctggcgccct gacctccggc gtgcatacct tccctgccgt gctgcagtcc 600
tccggcctgt actccctgtc ctccgtggtg acagtgcctt cctcctccct gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagcct tccaacacca aggtggacaa gcgggtggag 720
cctaagtcct gcgacaagac ccacacctgc cctccctgcc ctgcccctga ggccgccggc 780
ggaccctccg tgttcctgtt ccctcctaag cctaaggaca ccctgatgat ctcccggacc 840
cctgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg acccagaggt gaagtttaat 900
tggtatgtgg acggcgtgga ggtccacaac gccaagacca agcctcggga ggaacagtac 960
aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1020
aaggaataca agtgcaaagt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaggcca agggccagcc tcgcgagcct caggtgtaca ccctgcctcc tagccgggag 1140
gaaatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta cccttccgac 1200
atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag cctgagaaca actacaagac cacccctcct 1260
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtcccgg 1320
tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380
acccagaagt ccctgtccct gagccctggc cggaagcggc ggggcagcgg cgccaccaac 1440
ttcagcctgc tgaagcaggc cggcgacgtg gaggagaacc ccggccccga tatgagagtg 1500
cctgctcagc tactaggtct actactacta tggctatctg gtgctagatg cgacatccag 1560
atgacccagt ccccctccac cctgtccgcc tctgtgggcg acagagtgac catcacctgt 1620
cgggcctccc agtccatctc cagctggctg gcctggtatc agcagaagcc cggcaaggcc 1680
cccaagctgc tgatctacaa ggccagcacc ctggaatccg gcgtgccctc cagattctcc 1740
ggctctggct ccggcaccga gttcaccctg accatcagct ccctgcagcc cgacgacttc 1800
gccacctact actgccagca gtacaacacc tactggacct tcggccaggg caccaaggtg 1860
gaaatcaagc ggaccgtggc cgctccctcc gtgttcatct tcccaccctc cgacgagcag 1920
ctgaagtccg gcaccgcctc cgtggtctgc ctgctgaaca acttctaccc ccgcgaggcc 1980
aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg cagtccggca actcccagga atccgtgacc 2040
gagcaggact ccaaggacag cacctactcc ctgtcctcta ccctgaccct gtccaaggcc 2100
gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgc gaagtgaccc accagggcct gtccagcccc 2160
gtgaccaagt ccttcaaccg gggcgagtgc tga 2193
<210> 24
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多核苷酸"
<400> 24
atggagtttg gcctgtcttg ggtgtttctg gtggccctct tcagaggtgt gcagtgtgaa 60
gtccagctcc tggagtctgg aggtgggctg gttcagcccg gaggcagcct gagactgagc 120
tgtgctgcat ctggcttcac cttcagccac tatatcatga tgtgggtgag gcaagcacct 180
gggaagggcc tggaatgggt ttctggcatc tattcttctg gaggaatcac tgtttatgct 240
gattctgtga aaggaagatt cactatcagc agagacaact ccaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaatt ccctgagggc tgaggacaca gctgtgtatt actgtgccta cagaaggatt 360
ggagtcccca gaagagatga atttgacatc tggggccaag ggaccatggt gactgtgtcc 420
tctgcctcta ccaaaggccc ctctgtattt cccctggctc caagctcaaa gtccacatct 480
ggtggcactg cagccctggg ctgtctcgtg aaggactact tcccagagcc tgtcactgtg 540
agctggaact ctggggcctt gaccagtggt gtccacacct ttcctgcagt gctccagagc 600
tctggcctct acagcctctc aagtgtggtc acagtgccct ccagttccct ggggactcag 660
acctacatct gcaatgtgaa ccataagccc agcaacacca aggtggacaa aagggtggag 720
cccaagtcct gtgacaagac acacacatgt cctccctgcc ctgcccctga ggctgctgga 780
gggcccagtg tcttcctgtt tccacccaaa ccaaaggaca ccctgatgat ctcaagaacc 840
cctgaagtga cctgtgtggt ggttgatgtc agccatgaag accccgaggt caagttcaac 900
tggtatgtgg atggagtgga ggtgcacaat gccaaaacca agccaagaga agaacagtac 960
aacagcacct atagagttgt gtctgtcctg actgtcctcc atcaagactg gctgaatgga 1020
aaggagtaca aatgcaaagt ctccaacaag gcactgcctg ctcctattga gaagaccatc 1080
tctaaagcaa aggggcagcc tagggagcca caagtgtaca cccttcctcc atccagagag 1140
gagatgacaa agaaccaagt ctctctgaca tgcctggtga agggattcta tccatctgac 1200
attgctgttg agtgggagtc caatggccag ccagaaaaca actacaagac caccccacct 1260
gtgctggact ctgatggctc cttcttcctc tatagcaagc tcacagtgga caagagcaga 1320
tggcagcaag gaaatgtctt ttcctgctct gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380
acacagaagt cactgtccct ttctcctgga aggaagagga gaggctctgg agctaccaac 1440
ttctccttgc tgaaacaagc tggggatgtg gaagagaacc ctggtcctga catgagagtg 1500
ccagcccagc ttctgggact tctcctgctg tggctctctg gagccagatg tgatatccag 1560
atgacccagt ccccaagtac cttgtctgct tccgtgggag acagagtcac catcacctgc 1620
agagccagcc agtccatctc ctcctggctg gcctggtacc agcagaaacc tggcaaggct 1680
cccaagctgc tcatctacaa ggcctccact ctggagagtg gggtgccttc taggttctct 1740
ggaagtggca gtggaacaga gttcacactg accatttcca gcctgcaacc tgatgacttt 1800
gccacctact actgccagca gtataacact tactggacat ttggacaagg caccaaagta 1860
gagatcaaga gaacagttgc tgccccatca gtgttcatct tccctccttc agatgagcag 1920
ctgaagtctg gcacagcctc agtggtgtgt ctgctgaaca atttctaccc tagggaagcc 1980
aaggtgcagt ggaaggttga caatgctctg cagtctggca actcacaaga atctgttact 2040
gagcaagatt ccaaagacag cacatattcc ctcagctcca ccctcaccct gagcaaagct 2100
gactatgaaa agcacaaggt ctatgcctgt gaggtgaccc accaaggtct gagcagccca 2160
gtgacaaaat cctttaacag aggagagtgc taa 2193
<210> 25
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多核苷酸"
<400> 25
atggagtttg gactcagctg ggtctttctg gtggccctct tcagaggtgt gcagtgtgag 60
gtgcagctgc ttgaatctgg tggtggcctg gttcagcccg gaggctccct gaggctgtca 120
tgtgctgcct ctggcttcac cttctctcac tacatcatga tgtgggtgag gcaagcacct 180
gggaaggggc tggaatgggt ttctggaatc tacagctctg gaggcatcac tgtctatgct 240
gactctgtga agggaagatt cactatctct agagacaact caaagaatac cctgtacctg 300
cagatgaact ccctcagagc tgaggataca gcagtgtact actgtgccta cagaaggatt 360
ggagtgccca gaagagatga atttgatatc tggggccaag ggaccatggt gacagtgtcc 420
tctgcttcca ccaagggccc ctcagtgttt cccctggctc ccagcagcaa gtctacctct 480
ggaggaactg ctgctctggg ctgtctggtc aaggactact tcccagagcc agtgacagtc 540
tcttggaaca gtggagctct caccagtggg gtgcacacct ttccagctgt ccttcagtct 600
tctgggctct attctctgtc ttcagttgtc actgtgcctt ccagttcctt gggcactcag 660
acctatatct gcaatgtcaa ccacaaaccc tccaacacca aagttgacaa aagggtggaa 720
cccaagagct gtgataagac tcacacatgt ccaccctgcc ctgctcctga agcagctggt 780
gggcccagtg tcttcctgtt tcctcctaag cccaaagaca ccctgatgat ctccagaact 840
ccagaagtca cctgtgtggt ggttgatgtg tctcatgagg accccgaggt gaagttcaac 900
tggtatgtgg atggggttga ggtccacaat gctaaaacaa aaccaagaga agaacagtat 960
aattccacat atagagtggt gtcagtcctc acagtgctgc atcaagactg gctgaatgga 1020
aaggagtaca agtgcaaagt cagcaacaag gcactgccag cccctattga gaagaccatc 1080
agcaaagcca aaggccagcc aagggagccc caagtctaca ccctgcctcc aagccgggag 1140
gagatgacaa agaaccaagt gagcctgaca tgcctggtga aaggattcta tccatctgac 1200
attgctgtgg agtgggagag caatgggcag cctgagaaca actacaaaac caccccacct 1260
gtcctggaca gtgatggcag cttcttcctc tactccaagc tgactgtgga caagtcaaga 1320
tggcagcaag gaaatgtgtt ctcctgctct gtgatgcacg aagccctgca caaccattac 1380
acacagaaat ctctatccct ctctcctggc agaaagagga gaggctctgg agccaccaac 1440
ttctcactgc tgaagcaagc tggagatgtt gaagagaatc ctggccctga catgagggtc 1500
cctgcccagc ttctgggact gttgctgctg tggctcagtg gggccagatg tgacatccag 1560
atgacccaga gccccagcac cttgtctgcc tcagtgggag acagagtcac catcacctgc 1620
agagcctccc agtccatctc atcctggctg gcctggtacc agcagaagcc tggcaaggct 1680
ccaaagctcc tcatctataa ggccagcaca ctggagagtg gagtccccag cagattttct 1740
ggcagtggtt ctggaacaga gttcacacta accatttcca gcctccagcc tgatgacttt 1800
gctacctatt actgccagca gtacaacact tactggacat ttgggcaagg caccaaagtg 1860
gagatcaaga gaacagttgc tgcaccctct gttttcatct tccctccctc tgatgagcag 1920
ctcaagagtg gcacagccag tgtggtctgc ctcctgaaca atttctaccc tagagaggcc 1980
aaggtccagt ggaaggtgga caatgccctg cagagtggca acagccaaga gtccgtgact 2040
gagcaagatt ctaaggattc cacctacagt ctgagctcca ctctgaccct ctccaaagca 2100
gattatgaaa agcacaaggt gtatgcctgt gaagtgaccc accaaggcct gtcctcccct 2160
gtgaccaagt cctttaacag aggagagtgc taa 2193
<210> 26
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多核苷酸"
<400> 26
atggagtttg gactctcatg ggtcttcctg gtggccctct tcagaggtgt gcagtgtgaa 60
gttcagctcc tggagtctgg aggtgggctg gtgcagcctg gaggcagcct gaggctgagc 120
tgtgctgcca gtggctttac cttctcccat tacatcatga tgtgggtgag gcaagcacct 180
ggcaagggct tggagtgggt ttctggaatc tactccagtg gtggcatcac tgtctatgct 240
gattctgtca agggaagatt cacaatctca agagacaaca gcaagaatac cctctacctg 300
cagatgaata gcctgagagc tgaggacacc gctgtctact actgtgccta cagaaggatt 360
ggagtgccta ggagagatga atttgatatc tggggccaag gcaccatggt gacagtgagc 420
tctgcttcca ccaaaggacc cagtgtgttc cctctggctc catccagcaa gagtacctct 480
ggaggaacag cagccctggg ctgcctggtt aaggactact ttccagagcc tgtcacagtc 540
tcctggaaca gtggagcctt gacttctggc gtgcacacat ttcctgctgt tcttcagtca 600
agtggcctgt acagtctgtc ttcagtggtg actgtgccca gcagctccct ggggactcag 660
acatatatct gcaatgtgaa ccataagccc tccaacacta aggttgacaa aagagttgaa 720
cccaagtcct gtgataaaac ccacacctgt cctccctgcc ctgcccctga agctgctggt 780
ggaccttctg tgtttctgtt cccacccaag ccaaaggata ccctgatgat ctccagaacc 840
cctgaggtga cttgtgtggt tgtggatgtc tctcatgagg atccagaagt gaagtttaac 900
tggtatgtgg atggggtgga ggtccacaat gccaaaacaa agcctaggga ggagcagtat 960
aattccactt acagagtggt cagtgtcctg acagttctcc accaagactg gctcaatgga 1020
aaggagtaca aatgcaaagt cagcaacaag gcactgccag ctcctattga gaagaccatc 1080
tctaaagcca aggggcagcc cagagagccc caagtgtaca ctctgcctcc aagcagagaa 1140
gagatgacca agaaccaagt ttccctcaca tgtctggtca aaggcttcta tccatctgac 1200
attgctgtgg aatgggagtc caatggccag ccagagaaca actacaagac caccccacct 1260
gtgctggact ctgatggctc cttcttcctc tattccaagc tgactgtgga caagtcaaga 1320
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多核苷酸"
<400> 27
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atgacccagt ccccatccac cctgtctgcc tcagtgggag acagagtgac catcacctgc 1620
agagcctccc agagcatctc ttcctggctg gcctggtacc agcagaaacc tgggaaggct 1680
cccaaactgc tgatctacaa ggccagcacc ctggagagtg gggtgccatc taggttctct 1740
gggtctggca gtggcactga gttcactctg accatctcca gcctgcagcc tgatgacttt 1800
gccacctatt actgccagca gtataacacc tactggacat ttggccaagg gaccaaggtg 1860
gagatcaaga ggacagtggc tgcaccttct gtgttcatct tcccaccttc agatgagcag 1920
ctgaaatctg gcacagcctc tgtggtgtgt ctcctgaaca atttctatcc aagggaggcc 1980
aaagtccagt ggaaggtgga caatgccctg cagtctggca actcccaaga gtctgtcaca 2040
gagcaagatt ccaaagactc cacttactcc ctctcctcca cactgaccct gagcaaagct 2100
gattatgaga agcacaaagt gtatgcctgt gaggtgaccc accaaggcct gagcagccca 2160
gtgaccaaat ccttcaacag aggagagtgc taa 2193
<210> 33
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多核苷酸"
<400> 33
atggagtttg gactctcctg ggtcttcctg gttgctctct tcagaggtgt gcagtgtgaa 60
gttcagctcc tggagagcgg aggcggcttg gtgcagcccg gaggaagcct gcggctgagc 120
tgtgctgcct ctggctttac cttctcccac tacatcatga tgtgggtgag gcaagcacct 180
ggaaaaggat tggagtgggt gtccggcatc tacagctctg gtggaatcac tgtctatgct 240
gactcagtga agggaagatt caccatctcc agagacaact ccaagaatac actgtacctg 300
cagatgaatt ccctgagagc tgaggacacc gctgtgtact actgtgccta cagaagaatt 360
ggcgtgccaa ggagagatga atttgacatc tggggacaag gcaccatggt gacagtctcc 420
tctgcctcaa ccaaaggccc ctccgtattt cccctggctc cttccagtaa gagcacctcc 480
ggagggacag cagccctggg ctgtctggtg aaagactact tccccgagcc agtgacagtg 540
tcttggaaca gcggcgccct gaccagcggt gtccacacat tcccagccgt cctgcagagc 600
agcggcctgt attccctttc ttcagttgtc actgtgccca gttcctcctt gggcactcag 660
acctatatct gcaatgtcaa ccacaaaccc agcaatacca aggtcgataa gcgagtggaa 720
cccaagtcat gtgacaagac tcacacctgt cctccctgcc ctgctccaga agctgctggc 780
gggcccagcg tctttctgtt tccacctaag ccaaaggaca cactgatgat ctcaagaacc 840
cctgaggtta catgtgtggt ggtggatgtc agccatgagg atcctgaagt gaagtttaac 900
tggtatgtgg atggggtgga ggtgcacaat gctaaaacaa agccccggga ggagcagtac 960
aactcaactt accgcgtggt ttctgtcctc actgttctgc accaagactg gctgaatgga 1020
aaggagtaca agtgcaaagt gagcaacaag gcactgcccg cgcccatcga gaagaccatt 1080
tccaaagcca aggggcagcc cagagagccc caagtctaca ccctgcctcc aagccgggaa 1140
gagatgacta agaaccaagt gagtctgaca tgcctggtca agggcttcta cccctctgac 1200
attgccgtgg aatgggagtc caatggccag ccagagaaca actacaaaac caccccaccc 1260
gtgctggact ccgatggcag cttcttcctc tactcaaagc tgactgtgga caaaagcaga 1320
tggcagcaag gaaatgtgtt ttcctgctcc gtgatgcacg aggccctcca caaccattac 1380
acacagaaat ctctgtcact gtctcctggg aggaagagaa ggggctctgg ggccaccaac 1440
ttctctttgc tgaaacaagc tggagatgtg gaggaaaacc ccggccctga catgagggtg 1500
cctgcccagc ttctgggact gctgctgctg tggctctctg gagccagatg tgatatccag 1560
atgacccagt ctccatccac tctgtctgct tccgtgggcg acagagtgac catcacctgc 1620
cgggcctccc agtccatctc tagctggctg gcctggtacc agcagaagcc tggcaaggct 1680
cccaaactgc tcatctataa ggccagcaca ctggaatctg gagtcccctc ccgcttcagc 1740
ggctccggaa gtggcacaga gttcacactc acaatcagct ccctccagcc tgatgacttt 1800
gccacatatt actgccagca gtataacacc tactggacat ttggccaagg aacaaaagta 1860
gagatcaaga ggaccgtggc cgccccatct gtgttcatct tccctccttc agatgagcag 1920
ctgaagagtg ggaccgccag tgtggtctgc ctcctgaaca atttctatcc aagagaagcc 1980
aaagtccagt ggaaggtgga caatgccctt cagagtggca actctcaaga gtctgtgact 2040
gagcaagaca gcaaggattc cacctactcc ctgagttcta ccctcaccct gagcaaagca 2100
gattatgaaa agcacaaggt ttatgcctgt gaggtcaccc accaagggct gtccagccct 2160
gtgaccaagt ccttcaacag aggagagtgc taa 2193
<210> 34
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多核苷酸"
<400> 34
atggagtttg gcctgtcctg ggtgttcctg gtggccctgt tcagaggagt gcagtgtgag 60
gtgcagctcc tggagtctgg aggaggcctg gtgcagcctg gaggctccct gagactgtcc 120
tgtgctgcct ctggcttcac cttctcccac tacatcatga tgtgggtgag acaagcccct 180
ggaaagggcc tggagtgggt gtctggcatc tactcctctg gaggcatcac agtgtatgct 240
gactctgtga agggcagatt caccatctcc agagacaact ccaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaatt ccctgagagc tgaggacacc gctgtgtact actgtgccta cagaagaatt 360
ggagtgccca gaagagatga gtttgacatc tggggccaag gaaccatggt gactgtgtcc 420
tctgcctcca ccaagggccc ctctgtgttt cccctggccc cttcctccaa gagcaccagt 480
ggaggcacag ctgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccctgagcc tgtgaccgtg 540
tcctggaact ctggagccct gacctctgga gtgcacacct tccctgctgt gctgcagtcc 600
tctggcctgt actctctgtc ctcagtggtg acagtgccct cctcctccct gggcacccag 660
acctacatct gcaatgtgaa ccacaagccc tccaacacca aagtggacaa gagggtggag 720
cccaagtcct gtgacaagac ccacacctgc cctccctgcc ctgcccctga ggctgctggc 780
ggcccttctg tgttcctgtt ccctcccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 840
cctgaagtga cctgtgtggt ggtggatgtg tcccatgagg accctgaggt gaagttcaac 900
tggtatgtgg atggagtgga ggtgcacaat gccaagacca agccaagaga ggagcagtac 960
aactccacct acagagtggt gtctgtgctg acagtgctgc accaagactg gctgaatggc 1020
aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag gccctgcctg cccctattga gaagaccatc 1080
agcaaggcca agggccagcc cagagagcct caagtgtaca ccctgcctcc ttccagagag 1140
gagatgacca agaaccaagt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta cccctctgac 1200
attgctgtgg agtgggagtc caatggccag cctgagaaca actacaagac caccccacct 1260
gtgctggact ctgatggctc cttcttcctg tactccaagc tgactgtgga caagtccaga 1320
tggcagcaag gcaatgtgtt ctcctgctct gtgatgcatg aggccctgca caaccactac 1380
acccagaagt ccctgtccct gtctcctggc agaaagagaa gaggcagtgg agccaccaac 1440
ttcagcctgc tgaagcaagc tggagatgtg gaggagaacc ctggccctga catgagagtg 1500
cctgcccagc tgctgggcct gctgctgctg tggctgtctg gagccagatg tgacatccag 1560
atgacccaga gcccttccac cctgtctgcc tccgtgggag acagagtgac catcacctgt 1620
agagcctccc agtccatctc ctcctggctg gcctggtacc agcagaagcc tggcaaggcc 1680
cctaagctgc tgatctacaa ggcctccacc ctggagagtg gagtgccttc cagattctct 1740
ggctccggct ctggcacaga gttcaccctg accatctctt ccctgcagcc tgatgacttt 1800
gccacctact actgccagca gtataacacc tactggacct ttggccaagg caccaaggtg 1860
gagatcaaga gaacagtggc tgccccatct gtgttcatct tccctccttc tgatgagcag 1920
ctgaagtctg gcactgcctc tgtggtgtgt ctgctgaaca acttctaccc tagagaggcc 1980
aaggtgcagt ggaaggtgga caatgccctg cagtctggca actcccaaga gtctgtgaca 2040
gagcaagact ccaaggattc cacctactcc ctgtcctcta ccctgaccct gtccaaggct 2100
gactatgaga agcacaaggt gtatgcctgt gaggtgaccc accaaggcct gagctcccct 2160
gtgaccaagt ccttcaacag aggagagtgc taa 2193
<210> 35
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多核苷酸"
<400> 35
atggagtttg gactctcctg ggtcttcctg gttgctctct tcagaggtgt gcagtgtgaa 60
gttcagctcc tggagagcgg aggcggcttg gtgcagcccg gaggaagcct gcggctgagc 120
tgtgctgcct ctggctttac cttctcccac tacatcatga tgtgggtgag gcaagcacct 180
ggaaaaggat tggagtgggt gtccggcatc tacagctctg gtggaatcac tgtctatgct 240
gactcagtga agggaagatt caccatctcc agagacaact ccaagaatac actgtacctg 300
cagatgaatt ccctgagagc tgaggacacc gctgtgtact actgtgccta cagaagaatt 360
ggcgtgccaa ggagagatga atttgacatc tggggacaag gcaccatggt gacagtctcc 420
tctgcctcaa ccaaaggccc ctccgtattt cccctggctc cttccagtaa gagcacctcc 480
ggagggacag cagccctggg ctgtctggtg aaagactact tccccgagcc agtgacagtg 540
tcttggaaca gcggcgccct gaccagcggt gtccacacat tcccagccgt cctgcagagc 600
agcggcctgt attccctttc ttcagttgtc actgtgccca gttcctcctt gggcactcag 660
acctatatct gcaatgtcaa ccacaaaccc agcaatacca aggtcgataa gcgagtggaa 720
cccaagtcat gtgacaagac tcacacctgt cctccctgcc ctgctccaga agctgctggc 780
gggcccagcg tctttctgtt tccacctaag ccaaaggaca cactgatgat ctcaagaacc 840
cctgaggtta catgtgtggt ggtggatgtc agccatgagg atcctgaagt gaagtttaac 900
tggtatgtgg atggggtgga ggtgcacaat gctaaaacaa agccccggga ggagcagtac 960
aactcaactt accgcgtggt ttctgtcctc actgttctgc accaagactg gctgaatgga 1020
aaggagtaca agtgcaaagt gagcaacaag gcactgcccg cgcccatcga gaagaccatt 1080
tccaaagcca aggggcagcc cagagagccc caagtctaca ccctgcctcc aagccgggaa 1140
gagatgacta agaaccaagt gagtctgaca tgcctggtca agggcttcta cccctctgac 1200
attgccgtgg aatgggagtc caatggccag ccagagaaca actacaaaac caccccaccc 1260
gtgctggact ccgatggcag cttcttcctc tactcaaagc tgactgtgga caaaagcaga 1320
tggcagcaag gaaatgtgtt ttcctgctcc gtgatgcacg aggccctcca caaccattac 1380
acacagaaat ctctgtcact gtctcctggg aggaagagaa ggggctctgg ggccaccaac 1440
ttctctttgc tgaaacaagc tggagatgtg gaggaaaacc ccggccctga catgagggtg 1500
cctgcccagc ttctgggact gctgctgctg tggctctctg gagccagatg tgatatccag 1560
atgacccagt ctccatccac tctgtctgct tccgtgggcg acagagtgac catcacctgc 1620
cgggcctccc agtccatctc tagctggctg gcctggtacc agcagaagcc tggcaaggct 1680
cccaaactgc tcatctataa ggccagcaca ctggaatctg gagtcccctc ccgcttcagc 1740
ggctccggaa gtggcacaga gttcacactc acaatcagct ccctccagcc tgatgacttt 1800
gccacatatt actgccagca gtataacacc tactggacat ttggccaagg aacaaaagta 1860
gagatcaaga ggaccgtggc cgccccatct gtgttcatct tccctccttc agatgagcag 1920
ctgaagagtg ggaccgccag tgtggtctgc ctcctgaaca atttctatcc aagagaagcc 1980
aaagtccagt ggaaggtgga caatgccctt cagagtggca actctcaaga gtctgtgact 2040
gagcaagaca gcaaggattc cacctactcc ctgagttcta ccctcaccct gagcaaagca 2100
gattatgaaa agcacaaggt ttatgcctgt gaggtcaccc accaagggct gtccagccct 2160
gtgaccaagt ccttcaacag aggagagtgc taa 2193
<210> 36
<211> 2193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多核苷酸"
<400> 36
atggagtttg gactctcctg ggtcttcctg gttgctctct tcagaggtgt gcagtgtgaa 60
gttcagctcc tggagagcgg aggcggcttg gtgcagcccg gaggaagcct gcggctgagc 120
tgtgctgcct ctggctttac cttctcccac tacatcatga tgtgggtgag gcaagcacct 180
ggaaaaggat tggagtgggt gtccggcatc tacagctctg gtggaatcac tgtctatgct 240
gactcagtga agggaagatt caccatctcc agagacaact ccaagaatac actgtacctg 300
cagatgaatt ccctgagagc tgaggacacc gctgtgtact actgtgccta cagaagaatt 360
ggcgtgccaa ggagagatga atttgacatc tggggacaag gcaccatggt gacagtctcc 420
tctgcctcaa ccaaaggccc ctccgtattt cccctggctc cttccagtaa gagcacctcc 480
ggagggacag cagccctggg ctgtctggtg aaagactact tccccgagcc agtgacagtg 540
tcttggaaca gcggcgccct gaccagcggt gtccacacat tcccagccgt cctgcagagc 600
agcggcctgt attccctttc ttcagttgtc actgtgccca gttcctcctt gggcactcag 660
acctatatct gcaatgtcaa ccacaaaccc agcaatacca aggtcgataa gcgagtggaa 720
cccaagtcat gtgacaagac tcacacctgt cctccctgcc ctgctccaga agctgctggc 780
gggcccagcg tctttctgtt tccacctaag ccaaaggaca cactgatgat ctcaagaacc 840
cctgaggtta catgtgtggt ggtggatgtc agccatgagg atcctgaagt gaagtttaac 900
tggtatgtgg atggggtgga ggtgcacaat gctaaaacaa agccccggga ggagcagtac 960
aactcaactt accgcgtggt ttctgtcctc actgttctgc accaagactg gctgaatgga 1020
aaggagtaca agtgcaaagt gagcaacaag gcactgcccg cgcccatcga gaagaccatt 1080
tccaaagcca aggggcagcc cagagagccc caagtctaca ccctgcctcc aagccgggaa 1140
gagatgacta agaaccaagt gagtctgaca tgcctggtca agggcttcta cccctctgac 1200
attgccgtgg aatgggagtc caatggccag ccagagaaca actacaaaac caccccaccc 1260
gtgctggact ccgatggcag cttcttcctc tactcaaagc tgactgtgga caaaagcaga 1320
tggcagcaag gaaatgtgtt ttcctgctcc gtgatgcacg aggccctcca caaccattac 1380
acacagaaat ctctgtcact gtctcctggg cggaagcggc ggggcagcgg cgccaccaac 1440
ttcagcctgc tgaagcaggc cggcgacgtg gaggagaacc ccggccccga catgagggtg 1500
cctgcccagc ttctgggact gctgctgctg tggctctctg gagccagatg tgatatccag 1560
atgacccagt ctccatccac tctgtctgct tccgtgggcg acagagtgac catcacctgc 1620
cgggcctccc agtccatctc tagctggctg gcctggtacc agcagaagcc tggcaaggct 1680
cccaaactgc tcatctataa ggccagcaca ctggaatctg gagtcccctc ccgcttcagc 1740
ggctccggaa gtggcacaga gttcacactc acaatcagct ccctccagcc tgatgacttt 1800
gccacatatt actgccagca gtataacacc tactggacat ttggccaagg aacaaaagta 1860
gagatcaaga ggaccgtggc cgccccatct gtgttcatct tccctccttc agatgagcag 1920
ctgaagagtg ggaccgccag tgtggtctgc ctcctgaaca atttctatcc aagagaagcc 1980
aaagtccagt ggaaggtgga caatgccctt cagagtggca actctcaaga gtctgtgact 2040
gagcaagaca gcaaggattc cacctactcc ctgagttcta ccctcaccct gagcaaagca 2100
gattatgaaa agcacaaggt ttatgcctgt gaggtcaccc accaagggct gtccagccct 2160
gtgaccaagt ccttcaacag aggagagtgc taa 2193
<210> 37
<211> 730
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述:合成
多肽"
<400> 37
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser His Tyr Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Tyr Arg Arg Ile Gly Val Pro Arg Arg Asp Glu Phe
115 120 125
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Arg Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn
465 470 475 480
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
485 490 495
Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu
500 505 510
Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu
515 520 525
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
530 535 540
Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
545 550 555 560
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro
565 570 575
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
580 585 590
Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
595 600 605
Asn Thr Tyr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
610 615 620
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
625 630 635 640
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
645 650 655
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
660 665 670
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
675 680 685
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
690 695 700
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
705 710 715 720
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
725 730

Claims (75)

1.一种包含经密码子优化的核苷酸序列的重组腺相关病毒(rAAV)载体,所述rAAV载体编码包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的全长抗体,并且其中所述经密码子优化的核苷酸序列与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或大于95%的同一性。
2.如权利要求1所述的rAAV载体,其中所述经密码子优化的核苷酸序列选自SEQ IDNO:23-36中的任一者。
3.如权利要求1所述的rAAV载体,其中所述经密码子优化的核苷酸序列具有少于约50个CpG位点、少于约40个CpG位点、少于约35个CpG位点、少于约30个CpG位点、少于约25个CpG位点、少于约20个CpG位点、少于约15个CpG位点或少于约10个CpG位点的CpG含量。
4.如权利要求2所述的rAAV载体,其中所述经密码子优化的核苷酸序列具有约5个CpG位点。
5.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述经密码子优化的核苷酸序列包含接头。
6.如权利要求5所述的rAAV载体,其中所述接头包括可切割接头。
7.如权利要求5所述的rAAV,其中所述接头包括不可切割接头。
8.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述抗血浆激肽释放酶抗体重链和所述抗血浆激肽释放酶抗体轻链由单一的启动子控制。
9.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述抗血浆激肽释放酶抗体重链和所述抗血浆激肽释放酶抗体轻链由分开的启动子控制。如权利要求5或6所述的rAAV载体,其中所述单一的启动子或所述分开的启动子选自遍在启动子、组织特异性启动子或可调节型启动子。
10.如权利要求9所述的rAAV载体,其中所述组织特异性启动子是肝脏特异性启动子。
11.如权利要求10所述的rAAV载体,其中所述肝脏特异性启动子包括选自以下的启动子:人转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、经修饰的hTTR(hTTR mod.)、α-抗胰蛋白酶启动子、肝脏启动子1(LP1)、TRM启动子、人凝血因子IX pro/肝转录因子反应性低聚物、LSP、CMV/CBA启动子(1.1kb)、CAG启动子(1.7kb)、mTTR、经修饰的mTTR、mTTR pro、mTTR增强子或碱性白蛋白启动子。
12.如权利要求11所述的rAAV载体,其中所述肝脏特异性启动子是人转甲状腺素蛋白启动子(TTR)。
13.如权利要求9所述的rAAV载体,其中所述可调节型启动子是诱导型或可阻遏型启动子。
14.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述载体还包含以下中的一者或多者:5'和3'反向末端重复体、所述序列上游的内含子和顺式作用调节性模块(CRM)。
15.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述载体还包含WPRE序列。
16.如权利要求15所述的rAAV载体,其中所述WPRE序列是经修饰的。
17.如权利要求16所述的rAAV载体,其中所述WPRE含有mut6delATG修饰。
18.如权利要求14-17中任一项所述的rAAV载体,其中所述CRM是肝脏特异性CRM。
19.如权利要求14-18中任一项所述的rAAV载体,其中所述CRM是CRM8。
20.如权利要求14-19中任一项所述的rAAV载体,其中所述载体包含至少三个CRM。
21.如权利要求14-19中任一项所述的rAAV载体,其中所述载体包含三个CRM8。
22.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述rAAV载体包含IRES序列。
23.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述抗血浆激肽释放酶抗体轻链和/或重链包含提高所述抗体的半衰期和/或降低所述抗体的效应子功能的一种或多种突变。
24.如权利要求23所述的rAAV载体,其中所述一种或多种突变包括LALA突变(L234A和L235A)和/或NHance突变(H433K和N434F)。
25.如权利要求23或24所述的rAAV载体,其中所述一种或多种突变包括LALA突变(L234A和L235A)。
26.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAVrh.10。
27.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述AAV载体是AAV8。
28.如权利要求27所述的rAAV载体,其中所述rAAV载体具有这样的GC含量,其被工程改造成具有与天然存在的AAV8约相同的GC含量。
29.如权利要求26或27所述的rAAV,其中所述rAAV载体衣壳是经工程改造的。
30.如权利要求29所述的rAAV,其中所述经工程改造的rAAV载体包含具有经修饰的氨基酸序列的AAV衣壳序列。
31.如权利要求30所述的rAAV,其中所述经修饰的氨基酸序列包含氨基酸序列的插入、缺失或取代。
32.如权利要求26所述的rAAV载体,其中所述rAAV衣壳是天然来源的。
33.如权利要求28所述的rAAV载体,其中所述rAAV载体衣壳是AAV8。
34.如权利要求6所述的rAAV载体,其中所述可切割序列是弗林蛋白酶可切割序列。
35.如权利要求34所述的rAAV载体,其中所述弗林蛋白酶可切割序列之后是接头和2A序列。
36.如权利要求35所述的rAAV载体,其中所述接头是GSG接头。
37.如权利要求35或36所述的rAAV载体,其中所述2A序列是T2A、P2A、E2A或F2A序列。
38.如权利要求37所述的rAAV载体,其中所述2A序列是P2A序列。
39.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述载体还编码分泌信号。
40.如权利要求39所述的rAAV载体,其中所述分泌信号是天然存在的信号肽。
41.如权利要求39所述的rAAV载体,其中所述分泌信号是人工信号肽。
42.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述抗血浆激肽释放酶抗体重链和所述抗血浆激肽释放酶抗体轻链产生能够与血浆激肽释放酶结合的功能性抗血浆激肽释放酶抗体。
43.如权利要求42所述的rAAV载体,其中所述抗血浆激肽释放酶抗体抑制血浆激肽释放酶的蛋白水解活性。
44.如前述权利要求中任一项所述的rAAV,其中所述抗血浆激肽释放酶抗体与所述血浆激肽释放酶活性位点结合。
45.如权利要求42-44中任一项所述的rAAV,其中所述结合阻断血浆激肽释放酶的所述活性位点。
46.如权利要求42-45中一项所述的rAAV,其中所述结合抑制血浆激肽释放酶的所述活性。
47.如权利要求42-46中任一项所述的rAAV,其中所述抗体不结合前激肽释放酶。
48.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述抗血浆激肽释放酶抗体重链和所述抗血浆激肽释放酶抗体轻链由相同的载体表达。
49.如权利要求1-47中任一项所述的rAAV载体,其中所述抗血浆激肽释放酶抗体重链和所述抗血浆激肽释放酶抗体轻链由不同的rAAV载体表达。
50.如权利要求1-47中任一项所述的rAAV,其中所述抗血浆激肽释放酶抗体重链和所述抗血浆激肽释放酶抗体轻链由分开的rAAV载体表达。
51.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体,其中所述载体还包含5'和3'反向末端重复体(ITR)、一种或多种增强子元件和/或多聚腺苷酸尾巴。
52.如权利要求51所述的rAAV载体,其中所述一种或多种增强子元件选自转录因子结合位点簇和/或WPRE序列。
53.一种重组腺相关病毒(rAAV),所述重组腺相关病毒包含AAV8衣壳和包含与SEQ IDNO:23-36中的任一者具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或大于95%同一性的经密码子优化的核苷酸序列的rAAV载体,所述载体包含:
a.5'反向末端重复体(ITR);
b.顺式作用调节性模块(CRM);
c.肝脏特异性启动子;
e.经密码子优化的抗血浆激肽释放酶抗体重链序列和抗血浆激肽释放酶抗体轻链序列;
f.土拨鼠肝炎病毒转录后调节性元件(WPRE);以及
g.3'ITR。
54.如权利要求53所述的重组载体,其中所述肝脏特异性启动子包括选自以下的启动子:人转甲状腺素蛋白启动子(TTR)、经修饰的hTTR(hTTR mod.)、α-抗胰蛋白酶启动子、肝脏启动子1(LP1)、TRM启动子、人凝血因子IX pro/肝转录因子反应性低聚物、LSP、CMV/CBA启动子(1.1kb)、CAG启动子(1.7kb)、mTTR、经修饰的mTTR、mTTR pro、mTTR增强子或碱性白蛋白启动子。
55.如权利要求54所述的重组载体,其中所述肝脏特异性启动子包括所述人转甲状腺素蛋白启动子。
56.如权利要求53-55中任一项所述的重组载体,其中所述CRM是肝脏特异性CRM。
57.如权利要求53-56中任一项所述的重组载体,其中所述载体包含至少三个CRM。
58.如权利要求53-57中任一项所述的rAAV载体,其中所述载体包含三个CRM8。
59.如权利要求53-58中任一项所述的rAAV载体,其中所述WPRE序列是经修饰的。
60.如权利要求53-59中任一项所述的rAAV载体,其中所述WPRE序列是WPREmut6delATG。
61.一种治疗有需要的受试者的与激活的激肽释放酶-激肽通路缺乏或失调相关的疾病或病症的方法,所述方法包括施用前述权利要求中任一项所述的重组腺相关病毒载体(rAAV)。
62.如权利要求61所述的方法,其中所述激活的激肽释放酶-激肽通路缺乏或失调是与C1酯酶抑制剂缺乏相关的疾病或病症。
63.如权利要求61-62中任一项所述的方法,其中所述rAAV载体是通过静脉内、皮下或经皮施用来施用。
64.如权利要求63所述的方法,其中所述经皮施用是通过基因枪施用。
65.如权利要求61-64中任一项所述的方法,其中与所述激活的激肽释放酶-激肽通路缺乏或失调或C1酯酶抑制剂缺乏相关的所述病症是遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、具有正常C1抑制剂的血管性水肿、糖尿病性黄斑水肿、偏头痛、肿瘤学、神经退行性疾病、类风湿性关节炎、痛风、肠道疾病、口腔粘膜炎、神经性疼痛、炎性疼痛、椎管狭窄-退行性脊柱疾病、动脉或静脉血栓形成、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨关节炎、血管炎、水肿、脑水肿、肺栓塞、中风、心室辅助装置或支架引起的凝血、头部外伤或肿瘤周围脑水肿、脓毒症、急性大脑中动脉(MCA)缺血事件、再狭窄、系统性红斑狼疮肾炎/血管炎或烧伤。
66.如权利要求65所述的方法,其中所述与C1酯酶抑制剂缺乏相关的病症是HAE。
67.如权利要求66所述的方法,其中所述HAE是I型、II型或III型。
68.如权利要求61-67中任一项所述的方法,其中所述rAAV载体在施用后是游离型的。
69.如权利要求61-68中任一项所述的方法,其中在施用后,所述抗血浆激肽释放酶抗体重链和轻链组装为功能性抗体。
70.如权利要求69所述的方法,其中所述抗体是IgG。
71.如权利要求61-70中任一项所述的方法,其中所述功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用所述rAAV载体后约2至6周时能够在所述受试者的血浆中检测到。
72.如权利要求71所述的方法,其中所述功能性抗血浆激肽释放酶抗体在施用所述rAAV载体后约4周时能够在所述受试者的血浆中检测到。
73.一种DNA表达盒,其包括经密码子优化的核苷酸序列,所述核苷酸序列编码包含抗血浆激肽释放酶抗体重链和抗血浆激肽释放酶抗体轻链的全长抗体,并且其中所述DNA表达盒包含与SEQ ID NO:23-36中的任一者具有至少约75%、80%、85%、90%、95%或大于95%同一性的序列。
74.一种递送媒介物,其包括权利要求73所述的DNA表达盒。
75.如权利要求74所述的递送媒介物,其选自病毒载体、脂质纳米颗粒或细胞外囊泡。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116790615B (zh) * 2023-07-11 2024-11-22 康霖生物科技(杭州)有限公司 一种用于过敏性疾病的基因治疗载体核酸构建体及其使用方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6136597A (en) 1997-09-18 2000-10-24 The Salk Institute For Biological Studies RNA export element
US7419829B2 (en) 2000-10-06 2008-09-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
US7575924B2 (en) 2000-11-13 2009-08-18 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
NZ532060A (en) 2001-10-02 2005-11-25 Inst Clayton De La Rech Methods and compositions relating to restricted expression lentiviral vectors and their applications
DK1737966T3 (da) 2004-04-02 2012-07-09 Univ Texas Cancerspecifik promotorer
WO2012115980A1 (en) 2011-02-22 2012-08-30 California Institute Of Technology Delivery of proteins using adeno-associated virus (aav) vectors
GB201206455D0 (en) 2012-04-12 2012-05-30 Royal Holloway & Bedford New College Gene expression
HK1218762A1 (zh) 2013-03-15 2017-03-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited 抗血漿激肽釋放酶抗體
US20160039883A1 (en) 2013-03-15 2016-02-11 Medimmune, Llc Palivizumab epitope-based virus-like particles
JP6754361B2 (ja) 2014-12-16 2020-09-09 ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ネブラスカ 若年型バッテン病のための遺伝子療法
CL2014003590A1 (es) 2014-12-30 2015-07-10 Univ Chile Virus aav/xbp1s-ha, método de tratamiento genético y su uso en la optimizacion y mejoramiento de las capacidades cognitivas, de memoria y de aprendizaje.
MA41346A (fr) 2015-01-12 2017-11-21 Juno Therapeutics Inc Eléments régulateurs post-transcriptionnels d'hépatite modifiée
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
GB2547179A (en) 2015-10-26 2017-08-16 Quethera Ltd Genetic construct
EP3368672B1 (en) 2015-10-27 2020-11-25 Celltheon Corporation Chimeric post-transcriptional regulatory element
US20190161530A1 (en) 2016-04-07 2019-05-30 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptor t cell compositions
JP7632835B2 (ja) 2016-05-20 2025-02-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 加齢関連疾患及び症状の遺伝子治療法
CA3053534A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Purdue Research Foundation Targeted ligand-payload based drug delivery for cell therapy
TW202106708A (zh) * 2019-04-24 2021-02-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 全人類轉譯後修飾之抗體治療劑
EP4048800A1 (en) * 2019-10-23 2022-08-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Adeno-associated virus vectors based gene therapy for hereditary angioedema
US20230390418A1 (en) * 2020-10-29 2023-12-07 Regenxbio Inc. Vectorized factor xii antibodies and administration thereof

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