CN116785194A - 牛奶外泌体装载烷基化美容肽及在化妆品中的应用 - Google Patents
牛奶外泌体装载烷基化美容肽及在化妆品中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116785194A CN116785194A CN202311047717.7A CN202311047717A CN116785194A CN 116785194 A CN116785194 A CN 116785194A CN 202311047717 A CN202311047717 A CN 202311047717A CN 116785194 A CN116785194 A CN 116785194A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- milk
- palmitoyl
- exosomes
- alkylated
- cosmetic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明提供了牛奶外泌体装载烷基化美容肽及在化妆品中的应用，本发明提供了一种装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂，包括烷基化美容肽和牛奶外泌体，所述烷基化美容肽的烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，所述烷基化美容肽在牛奶外泌体制剂中的包封率大于25%。所述烷基化美容肽装载到牛奶外泌体过程中pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL。装载烷基化美容肽后的牛奶外泌体应用在化妆品中，利用牛奶外泌体增强美容肽的透皮效果，其功效要超过牛奶外泌体与美容肽单独使用的功效加合。
Description
技术领域
本发明属于化妆品领域，尤其涉及牛奶外泌体装载烷基化美容肽及在化妆品中的应用。
背景技术
多肽和蛋白质是氨基酸聚合物。肽是短氨基酸链。peptide这个名字来源于pepton[peptos:消化的(希腊语)]。天然存在的人类多肽用于细胞通讯，如蛋白质调节、细胞增殖、细胞迁移、炎症、血管生成和黑素生成，这导致了各种各样的生理过程，包括防御、免疫、应激、生长、内稳态和繁殖。第一个肽是由埃米尔·费舍尔和霍夫迈斯特在19世纪早期描述的。1901年，Fischer和Fourneauin发表了第一个肽合成。Fischer将第一个肽描述为甘氨酸，并在他的讲座中解释了更多的肽结构，如二肽，三肽和多肽。几年之后，科学家合成了新的多肽，发现了更多的天然多肽，并对它们的功能有了更多的了解。除了不断增长的关于天然和合成肽的知识外，还开发了不同的合成肽。甘氨酸-组氨酸-赖氨酸铜(Cu-GHK)是由洛伦·皮卡德(Loren Pickard)于1973年开发的。在80年代末，第一个铜肽被纳入到护肤品中。直到2000年初，开发了棕榈酰五肽-4，从那时起，研究和工业开发了许多短的、稳定的合成肽，在细胞外基质合成，色素沉着，先天免疫和炎症中起作用。这些肽用于胶原蛋白刺激、伤口愈合、“肉毒杆菌样”平滑皱纹，以及抗氧化、抗菌和美白效果。
美容肽是一类高效的化妆品活性原料，其透皮能力却往往有限。过去的研究表明，只有满足相对苛刻条件的美容肽才有一定的透皮能力：分子量低于500Da，在辛醇/水的分配系数的中对数在1到3之间，融点低于200℃，水溶解度>1mg/mL，分子结构中基本没有极性中心。而大部分的肽并不能满足上述条件。另一方面，抗衰老、美白等作用都需要活性分子深入到真皮层才能发挥作用。肽类产品的透皮效果不佳，极大地限制了其在化妆品中的应用，造成了原料的浪费。
之前的研究结果披露，牛奶外泌体具有保湿修护、抗光老化及美白祛斑的护肤功效，可以应用于保湿修护、紧致抗皱及美白祛斑的化妆品中。此外，作为天然的细胞间信息传递载体，牛奶外泌体具有良好的透皮功能。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，实现利用牛奶外泌体的天然透皮功能，本发明将烷基化美容肽装载到外泌体上，协助递送美容肽透过表皮，到达真皮层的目标靶细胞，可以一方面发挥牛奶外泌体的协同美容功效，另一方面高效利用肽，避免原料浪费。
本发明提供了一种装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂，所述制剂包含有烷基化美容肽和牛奶外泌体，所述烷基化美容肽的烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，所述烷基化美容肽在牛奶外泌体制剂中的包封率大于25%。所述装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂的包封率优选为25%、30%、35%、40%。
优选的，获得所述装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂，在牛奶外泌体与烷基化美容肽混合后，混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，所述烷基化美容肽的饱和浓度是指肽在pH调整后的外泌体制剂中的溶解度。37℃以下温度条件孵育一段时间后，通过分子筛、超滤等分离手段去除游离的肽。
本发明所述烷基化美容肽为十四碳至十八碳的烷烃修饰的肽，所述的肽及烷基化肽为国家药监局所批准《已使用化妆品原料目录2021》中所列到的肽，包括但不限于榈酰三肽-1、棕榈酰五肽-4、棕榈酰四肽-7、棕榈酰六肽-12、肉豆蔻酰六肽-5、棕榈酰六肽-15、棕榈酰二肽-7，棕榈酰六肽-14，棕榈酰三肽-5，棕榈酰三肽-8，棕榈酰四肽-10，棕榈酰四肽-5，棕榈酰五肽-5，肉豆蔻酰五肽-4等。烷基化的改造使得它们在pH6.5-7.5的中性水溶液中的溶解度较低。pH中性的化妆品配方中，烷基化美容肽往往含量较低，或者部分溶解在油相中，并不能充分地发挥其功效。但同时，烷基化的改造，尤其十四碳至十八碳的烷烃修饰，使得美容肽能较为方便地插入到外泌体膜上实现肽的装载。因此，可以借助外泌体优越的透皮能力达到强化递送的目的。
本发明调整pH的方法包括但不限于添加酸、碱溶液或缓冲液，如稀盐酸、NaOH。本发明所述烷基化美容肽优选为具有护肤功效的十四碳至十八碳的烷烃修饰的肽，优选为用于胶原蛋白刺激、伤口愈合、“肉毒杆菌样”平滑皱纹，以及抗氧化、抗菌和美白效果的肽。
本发明所获得的装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体，烷基化美容肽与牛奶外泌体是装载与被装载的关系，不是简单的混合。本发明通过实验表明，通过调整所述含有烷基化美容肽和牛奶外泌体的制剂的pH，使所述烷基化美容肽与牛奶外泌体带有相反的静电荷，两者之间通过静电作用力互相吸引，烷基化美容肽的烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系（随着所述烷基化美容肽与牛奶外泌体之间的相互作用发生装载，溶液中过饱和的烷基化美容肽不断的溶解在混合溶液中，与所述牛奶外泌体发生静电吸引，并进一步装载进牛奶外泌体中，实现了肽的高效应用），而不是简单的物理混合，使烷基化美容肽在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
优选的，为获得本发明所述装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂，牛奶外泌体与烷基化美容肽混合后，混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述烷基化美容肽的饱和浓度达到或超过10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL或50μg/mL，所述烷基化美容肽的饱和浓度是指肽在pH调整后的外泌体制剂中的溶解度。
上述任一项优选的是，牛奶外泌体的浓度为：颗粒数1×1011-1×1012颗粒/mL，蛋白浓度200-500μg/mL ；蛋白浓度优选为300-400μg/mL，进一步优选为200、250、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、450、500μg/mL；牛奶外泌体颗粒数优选为1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、10×1011颗粒/mL。
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽添加量为5μg/mL-10mg/mL，优选为1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。进一步优选为，5μg/mL 、10μg/mL 、20μg/mL 、50μg/mL、100μg/mL 、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL 、600μg/mL 、700μg/mL 、800μg/mL、900μg/mL 、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL、3.5 mg/mL、4 mg/mL、4.5mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL。
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽包括棕榈酰三肽-1、棕榈酰五肽-4、棕榈酰四肽-7、棕榈酰六肽-12、肉豆蔻酰六肽-5、棕榈酰六肽-15、棕榈酰二肽-7，棕榈酰六肽-14，棕榈酰三肽-5，棕榈酰三肽-8，棕榈酰四肽-10，棕榈酰四肽-5，棕榈酰五肽-5，肉豆蔻酰五肽-4中的至少一种。本发明优选的烷基化美容肽均为药监局允许添加在化妆品中的，并且能够通过商业化途径购买获得的烷基化美容肽。
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽为棕榈酰三肽-1。为获得装载有棕榈酰三肽-1的牛奶外泌体制剂，牛奶外泌体与棕榈酰三肽-1混合后的混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述棕榈酰三肽-1的饱和浓度≥10μg/mL。
进一步优选的，装载有棕榈酰三肽-1的牛奶外泌体制剂的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰三肽-1使之达到或未达到过饱和状态，优选的棕榈酰三肽-1添加量为5μg/mL-10mg/mL，5μg/mL-1mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。优选的牛奶外泌体颗粒数1×1011-1×1012颗粒/mL，或优选的牛奶外泌体蛋白浓度200-500μg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-6；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰三肽-1，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰三肽-1的方式为分子筛、超滤等分离手段。
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽为棕榈酰五肽-4。为获得装载有棕榈酰五肽-4的牛奶外泌体制剂，牛奶外泌体与棕榈酰五肽-4混合后的混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述棕榈酰五肽-4的饱和浓度≥10μg/mL。
进一步优选的，装载有棕榈酰五肽-4的牛奶外泌体制剂的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰五肽-4使之达到或未达到过饱和状态，优选的棕榈酰五肽-4添加量为5μg/mL-10mg/mL，5μg/mL-1mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。优选的牛奶外泌体颗粒数1×1011-1×1012颗粒/mL，或优选的牛奶外泌体蛋白浓度200-500μg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-7；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰五肽-4，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰五肽-4的方式为分子筛、超滤等分离手段。
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽为棕榈酰四肽-7。为获得装载有棕榈酰四肽-7的牛奶外泌体制剂，牛奶外泌体与棕榈酰四肽-7混合后的混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述棕榈酰四肽-7的饱和浓度≥10μg/mL。
进一步优选的，装载有棕榈酰五肽-4的牛奶外泌体制剂的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰四肽-7使之达到或未达到过饱和状态，优选的棕榈酰五肽-4添加量为5μg/mL-10mg/mL，5μg/mL-1mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。优选的牛奶外泌体颗粒数1×1011-1×1012颗粒/mL，或优选的牛奶外泌体蛋白浓度200-500μg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8，进一步优选为5-6；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰四肽-7，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰四肽-7的方式为分子筛、超滤等分离手段。
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽为棕榈酰六肽-12。为获得装载有棕榈酰六肽-12的牛奶外泌体制剂，牛奶外泌体与棕榈酰六肽-12混合后的混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述棕榈酰六肽-12的饱和浓度≥10μg/mL。
进一步优选的，装载有棕榈酰六肽-12的牛奶外泌体制剂的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰六肽-12使之达到或未达到过饱和状态，优选的棕榈酰六肽-12添加量为10μg/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。优选的牛奶外泌体颗粒数1×1011-1×1012颗粒/mL，或优选的牛奶外泌体蛋白浓度200-500μg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为5-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰六肽-12，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰六肽-12的方式为分子筛、超滤等分离手段。
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽为肉豆蔻酰六肽-5。为获得装载有肉豆蔻酰六肽-5的牛奶外泌体制剂，牛奶外泌体与肉豆蔻酰六肽-5混合后的混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述肉豆蔻酰六肽-5的饱和浓度≥10μg/mL。
进一步优选的，装载有肉豆蔻酰六肽-5的牛奶外泌体制剂的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加肉豆蔻酰六肽-5使之达到或未达到过饱和状态，优选的肉豆蔻酰六肽-5添加量为5μg/mL-10mg/mL，5μg/mL-1mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。优选的牛奶外泌体颗粒数1×1011-1×1012颗粒/mL，或优选的牛奶外泌体蛋白浓度200-500μg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-6；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的肉豆蔻酰六肽-5，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的肉豆蔻酰六肽-5的方式为分子筛、超滤等分离手段。
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽为棕榈酰六肽-15。为获得装载有棕榈酰六肽-15的牛奶外泌体制剂，牛奶外泌体与棕榈酰六肽-15混合后的混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述棕榈酰六肽-15的饱和浓度≥10μg/mL。
进一步优选的，装载有棕榈酰六肽-15的牛奶外泌体制剂的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰六肽-15使之达到或未达到过饱和状态，优选棕榈酰六肽-15的添加量为5μg/mL-10mg/mL，5μg/mL-1mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。优选的牛奶外泌体颗粒数1×1011-1×1012颗粒/mL，或优选的牛奶外泌体蛋白浓度200-500μg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰六肽-15，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰六肽-15的方式为分子筛、超滤等分离手段。
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽为棕榈酰二肽-7，棕榈酰六肽-14，棕榈酰三肽-5，棕榈酰三肽-8，棕榈酰四肽-10，棕榈酰四肽-5，棕榈酰五肽-5，肉豆蔻酰五肽-4中的至少一种。为获得装载有所述的烷基化美容肽牛奶外泌体制剂，牛奶外泌体与所述的烷基化美容肽混合后的混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述所述的烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL。进一步优选的，装载有所述的烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加所述的烷基化美容肽使之达到或未达到过饱和状态，优选的添加量为5μg/mL-10mg/mL，5μg/mL-1mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL；优选的牛奶外泌体颗粒数1×1011-1×1012颗粒/mL，或优选的牛奶外泌体蛋白浓度200-500μg/mL；调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的所述烷基化美容肽，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的所述的烷基化美容肽的方式为分子筛、超滤等分离手段。
上述任一项优选的是，所述牛奶外泌体制剂还包括增溶剂和/或冻干保护剂。
上述任一项优选的是，所述增溶剂为阳离子乳化剂。所述阳离子乳化剂增溶所述烷基化美容肽，并与之形成表面带正电荷的阳离子胶束，与表面带负电荷的牛奶外泌体37℃以下温度条件孵育的过程中，两者通过静电作用力互相吸引，并最终实现牛奶外泌体中的所述烷基化美容肽的装载。
上述任一项优选的是，所述增溶剂为十六烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵的至少一种。上述任一项优选的是，所述增溶剂的添加量为3-10mg/mL。进一步优选为3、4、5、6、7、8、9、10mg/mL。
上述任一项优选的是，所述增溶剂为3-10mg/mL的十六烷基三甲基氯化铵。进一步优选为3、4、5、6、7、8、9、10mg/mL的十六烷基三甲基氯化铵。或优选为3-10mg/mL的十四烷基三甲基氯化铵；或优选为3-10mg/mL的十八烷基三甲基氯化铵。
上述任一项优选的是，所述冻干保护剂为甘露醇和/或海藻糖。
本发明还提供了上述任一项所述的装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1）在牛奶外泌体溶液中，添加烷基化美容肽；步骤2）调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL。
优选的，所述制备方法还包括步骤3），37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的肽，添加冻干保护剂冻干保存。
优选的，步骤1）中，在牛奶外泌体溶液中，添加烷基化美容肽，添加后所述烷基化美容肽在未达饱和浓度时进行装载。
优选的，步骤1）中，在牛奶外泌体溶液中，添加烷基化美容肽，使所述烷基化美容肽为过饱和状态；所述烷基化美容肽为过饱和状态下的装载，其载量大大提高。
优选的，步骤3）中，物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的烷基化美容肽的方式为分子筛、超滤等分离手段。
优选的，本发明提供的牛奶外泌体装载烷基化美容肽的方法为：在1×1011-1×1012颗粒/mL，蛋白浓度为200-500μg/mL的牛奶外泌体中，添加烷基化美容肽，所述烷基化美容肽终浓度设置为0.1-10mg/mL。调整混合溶液的pH值：使得牛奶外泌体的结构稳定，电镜能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上；并且，使所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL。可适量添加增溶剂。37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的肽，添加冻干保护剂甘露醇和海藻糖，冻干保存。
优选的，调整混合溶液的pH满足以下条件：①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到外泌体形态，本发明所述外泌体形态为完整清晰的外泌体，即典型的茶托状外泌体。HPLC测得的纯度在55%以上，并且②所述烷基化美容肽的饱和浓度达到或超过10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL或50μg/mL，所述烷基化美容肽的饱和浓度是指肽在pH调整后的外泌体制剂中的溶解度。其中，所述烷基化美容肽在pH6.5-7.5的水溶液中饱和浓度≤50μg/mL，包括但不限于棕榈酰三肽-1、棕榈酰五肽-4、棕榈酰四肽-7、棕榈酰六肽-12、肉豆蔻酰六肽-5、棕榈酰六肽-15等。
上述任一项优选的是，牛奶外泌体的浓度为300-400μg/mL；
上述任一项优选的是，所述烷基化美容肽的浓度为1-5mg/mL、6-10mg/mL或4-10mg/mL;
上述任一项优选的是，在混合溶液中，添加增溶剂十六烷基三甲基氯化铵3-10mg/mL。
上述任一项优选的是，除去游离脂肪酰胜肽的方式为分子筛层析或超滤。
本发明还提供了上述任一项所述的装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂在化妆品中的应用。
进一步的，提供了牛奶外泌体-烷基化美容肽复合原料在化妆品中的应用，应用技术方案是：装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体复合原料，以0.01-10.00%的比例添加到化妆品中。
在本发明一项优选的实施方式中，所述烷基化美容肽优选为棕榈酰三肽-1。
优选的，调整pH为4-6，使满足①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且②棕榈酰三肽-1的饱和浓度≥10μg/mL。
在本发明一项优选的实施方式中，所述烷基化美容肽优选四肽。
优选的，调整pH为5-6，使满足①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且②四肽的饱和浓度≥10μg/mL。
在本发明一项优选的实施方式中，所述烷基化美容肽优选为棕榈酰六肽-12。
优选的，调整pH为5-6，使满足①所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且②棕榈酰六肽-12的饱和浓度≥10μg/mL。
在本发明一项优选的实施方式中，提供了装载有棕榈酰三肽-1的牛奶外泌体（本发明中简称为ME-GHK）制剂在制备化妆品中的应用，尤其是在制备眼部护肤品中的应用。
优选的，制备方法步骤为：
1）将A组分加入油相锅，开启搅拌，转速为1000rpm，并升温至80℃，保温10min，得到油相混合液；
2）将B组分加入水相锅，开启搅拌，转速为600rpm，并升温至85℃，保温15min，得到水相混合液；
3）将水相混合液吸入乳化锅后，开启乳化锅搅拌，转速60rpm，通过控制真空阀门缓慢将油相混合液吸入乳化锅，然后开启均质，均质的时间为5min，转速3000rpm;
4）均质完成后，开启降温水降温至30℃，加入组分C，搅拌5min，再开启均质，均质5min，均质的转速为1000rpm。
优选的A组分包括卵磷脂、澳洲坚果籽油、小麦胚芽油、16/18醇;
优选的B组分包括AVC（丙烯酸聚合物），尼泊金甲酯，双丙甘醇，去离子水；
优选的C组分包括ME-GHK，苯氧乙醇。
优选的A组分：卵磷脂1.0%, 澳洲坚果籽油1.5%，小麦胚芽油0.5%，16/18醇0.5%;
优选的B组分：AVC（丙烯酸聚合物）0.5%，尼泊金甲酯0.1%，双丙甘醇5%，去离子水90.1%；
优选的C组分：ME-GHK 0.5%，苯氧乙醇0.3%。
优选的ME-GHK 1.0 %，苯氧乙醇0.3%。
本发明提供的装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体是一款功能强大的复合化妆品原料产品。作为天然的细胞间信息传递载体，牛奶外泌体具有良好的透皮功能。以牛奶外泌体作为美容肽的递送载体，综合利用了牛奶外泌体的装载能力、递送能力和护肤功效，以及美容肽本身的护肤、抗衰老功效，同时又可以利用牛奶外泌体增强美容肽的透皮效果。装载烷基化美容肽后的牛奶外泌体应用在化妆品中，其功效要超过牛奶外泌体与美容肽单独使用的功效加合，达到1+1>2的综合效果。
附图说明
图1本发明优选实施例1中pH 为1和2时pH对牛奶外泌体稳定性的影响。
图2本发明优选实施例1中pH 为3和4时pH对牛奶外泌体稳定性的影响。
图3本发明优选实施例1中pH 为5和6时pH对牛奶外泌体稳定性的影响。
图4本发明优选实施例1中pH 为7和8时pH对牛奶外泌体稳定性的影响。
图5本发明优选实施例1中pH 为9和10时pH对牛奶外泌体稳定性的影响。
图6本发明优选实施例1中pH对牛奶外泌体稳定性的影响的电镜结果。
图7本发明优选实施例2中包封率的检测，其中，A图为Milk-exo对照组，B图为实施例2中装载到牛奶外泌体上的ME-GHK。
图8本发明优选实施例2中装载前后的牛奶外泌体电镜图。
图9本发明优选实施例3中装载过程示意图。
图10本发明对比例实施例4样品中包封率的检测，其中A图为Milk-exo牛奶外泌体空白样本，B图为实施例4中与Pal-GHK混合后的Milk-exo牛奶外泌体。
图11本发明优选实施例5中细胞实验检测实施例2及实施例4样品对ColⅠ表达的影响。
图12本发明优选实施例6中斑马鱼实验检测实施例三样品的对ColⅠ表达的影响。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
实施例1
外泌体的稳定pH
牛奶外泌体水溶液用稀盐酸和NaOH溶液调不同pH。孵育1h后通过分子排阻色谱检测样品的纯度，大颗粒的外泌体先出峰，外泌体裂解后的碎片后出峰。因此，外泌体峰越少，纯度越高，则外泌体越完整，相应的pH环境下外泌体越稳定。结果如图1-图6（图1-图5中的百分数表示的是各pH条件下外泌体纯度，图6是外泌体电镜图）所示，pH4-pH6的外泌体纯度较高，外泌体形态清晰完整，因此牛奶外泌体的稳定pH为4-6。
实施例2
装载工艺1
在300μg/mL的牛奶外泌体中，添加Pal-GHK（棕榈酰三肽-1）至浓度为3.7mg/mL。用稀盐酸和NaOH调整混合溶液至pH4.0，此时Pal-GHK的饱和浓度为20μg/mL。37℃以下温度条件搅拌，物理装载。
物理装载1-3h后，用分子筛层析除去游离的Pal-GHK小分子，添加冻干保护剂甘露醇和海藻糖，冻干保存。冻干后的牛奶外泌体-棕榈酰三肽-1（ME-GHK）经反相色谱HPLC检测样品中的Pal-GHK，计算包封率。
包封率%=HPLC检出的装载Pal-GHK/总的Pal-GHK投药量×100%
由图7计算得到，包封率为25.4%。图7中，A图为Milk-exo对照组，B图为实施例2中装载到牛奶外泌体上的ME-GHK，ME-GHK图中箭头处的峰值对应的时间为7.458min。此时，平均一个外泌体颗粒上装载了4*10^6个棕榈酰三肽-1分子。图8所示为装载前后的外泌体电镜图，可见，装载后的外泌体颗粒形态发生变化，尺寸变大了，只有零星两个未装载的外泌体呈现100nm以内的粒径。
实施例3
装载工艺2
在400μg/mL的牛奶外泌体中，添加棕榈酰三肽-1（Pal-GHK）至浓度为5mg/mL，添加增溶剂十六烷基三甲基氯化铵5mg/mL，用稀盐酸和NaOH调整混合溶液至pH6.0。37℃以下温度条件搅拌，物理装载。
图9示意装载过程，阳离子乳化剂增溶Pal-GHK，并与之形成表面带正电荷的阳离子胶束，与表面带负电荷的外泌体37℃以下温度条件孵育的过程中，两者通过静电作用力互相吸引，并最终实现外泌体中的Pal-GHK装载。所述阳离子乳化剂为3-10mg/mL的十六烷基三甲基氯化铵。
物理装载1-3h后，用分子筛层析除去游离的Pal-GHK小分子，添加冻干保护剂甘露醇和海藻糖，冻干保存。冻干后的牛奶外泌体-棕榈酰三肽-1（ME-GHK）经反相色谱HPLC检测样品中的Pal-GHK，计算包封率。
包封率%=HPLC检出的装载Pal-GHK/总的Pal-GHK投药量×100%
计算得到，包封率为32.3%。在500mL的装载体系中，Pal-GHK的包封率高达32.3%。意味着平均1分子牛奶外泌体上装载了106个Pal-GHK分子。
实施例4（对比例）
混合工艺
在300μg/mL的牛奶外泌体中，添加Pal-GHK至浓度至0.94mg/mL，用NaOH调整混合溶液至pH7.0。37℃以下温度条件搅拌，物理混合。物理混合1h后，用分子筛层析除去游离的Pal-GHK小分子，添加冻干保护剂甘露醇和海藻糖，冻干保存。此实施例中的Pal-GHK与实施例2样品中一致，所不同的是，实施例2样品中的Pal-GHK全都装载在了牛奶外泌体上。
在pH7.0时，电镜下观察到外泌体结构完整清晰，但Pal-GHK的饱和浓度仅为4.7μg/mL。
物理混合1h后，检测Pal-GHK是否装载到了外泌体上：8000rpm离心30min去沉淀，去除未溶解的Pal-GHK，上清用超滤除去游离的可溶Pal-GHK小分子，截留外泌体及装载后的外泌体。经反相色谱HPLC检测截留样品中的Pal-GHK，计算得到，牛奶外泌体上多肽的包封率仅为0.06%（图10，其中A图为Milk-exo牛奶外泌体空白样本，B图为实施例4中与Pal-GHK混合后的Milk-exo牛奶外泌体，B图中7.729min所对应的峰为Pal-GHK）。
因此，可以认为，本实施例中，牛奶外泌体与Pal-GHK仅为物理混合。
实施例5
细胞测试
在人皮肤成纤维细胞的培养基中，添加实施例2得到的冻干后的ME-GHK至终浓度0.067%(w/w)，此时对应牛奶外泌体的添加量为2μg/mL，pal-GHK的添加量为6.3μg/mL。设置空白对照样本（control），牛奶外泌体2μg/mL对照样本，pal-GHK 6.3μg/mL对照样本。同时添加等量的实施例4中的冻干样本至外泌体添加量达到2μg/mL。37℃，5%的CO2培养箱中培养，一天两次照射剂量为50mJ/cm2的UVB(310nm)紫外光，48小时后收集细胞。通过RT-PCR检测细胞样本的ColⅠ转录水平。结果如图11所示，2μg/mL的牛奶外泌体可提高ColⅠ转录水平33.5%，6.3μg/mL pal-GHK提高ColⅠ转录水平至5.29倍，复合原料提高至7.82倍。由此可知，复合原料对胶原I的转录水平提升超过同给药量的外泌体和多肽的功效总和。两者的组合达到了1+1>2的效果。
另一方面，实施例4样品对ColⅠ转录水平提高至1.54倍。然而，这种程度的改变与外泌体本身没有显著性差异。这个结果同样说明了实施例4中的外泌体样本中，基本不含Pal-GHK。
RT-PCR检测的引物序列如下表所示：
表 1 人成纤维细胞的RT-PCR引物序列
| Primer | Sequences (5' to 3') | Bases number |
| Seq ID NO：1 Col Ⅰ-F | CCAGAAGAACTGGTACATCA | 20 |
| Seq ID NO：2 Col Ⅰ-R | CCGCCATACTCGAACTGGAA | 20 |
| Seq ID NO：3 GAPDH-F | CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT | 20 |
| Seq ID NO：4 GAPDH-R | GCGACGCAAAAGAAGATG | 18 |
实施例6
斑马鱼测试
为了量化地研究ME-GHK的体内功效，本文采用了斑马鱼实验，考查ME-GHK，牛奶外泌体及pal-GHK对胶原ColⅠ转录水平的影响。
本实验随机选取了 180 尾 5 dpf （受精后 5 d） 野生型 AB品系斑马鱼，放置在六孔板 （容量 3 mL），每孔中30 尾斑马鱼。设置待测样品组：添加冻干后的牛奶外泌体-棕榈酰三肽-1复合原料（ME-GHK，即本发明实施例3提供的装载有棕榈酰三肽-1的牛奶外泌体制剂）至终浓度0.05%(w/w)，此时对应牛奶外泌体的添加量为1.5μg/mL，pal-GHK的添加量为8μg/mL。同时设置空白对照组（control），牛奶外泌体对照组（牛奶外泌体，1.5μg/mL），pal-GHK对照组（pal-GHK，8μg/mL）。
各组经样品处理24h后，使用 Trizol 法提取各试验组斑马鱼总 RNA，然后对总RNA 质量浓度和纯度进行测定。
测定用到的引物序列如下表所示：
表 3 斑马鱼的RT-PCR引物序列
| Primer | Sequences (5' to 3') | Bases number |
| Seq ID NO：5 Col Ⅰ-F | ACCGTAATGTGCGACGAAGT | 20 |
| Seq ID NO：6 Col Ⅰ-R | CCTGGAAATCGTCGTCTGGG | 20 |
| Seq ID NO：7 β-actin-F | TCGAGCAGGAGATGGGAACC | 20 |
| Seq ID NO：8 β-actin-R | CTCGTGGATACCGCAAGATTC | 21 |
结果如图12所示，1.5μg/mL的牛奶外泌体可提高ColⅠ转录水平5.5%，8μg/mL pal-GHK提高ColⅠ转录水平79%，复合原料提高182%。由此可知，复合原料对胶原I转录水平的提升效果远超同给药量的外泌体和多肽的功效总和。其提升比例甚至也超过人皮肤成纤维细胞的实验数据。这说明，复合样品ME-GHK除了具有综合两个组分对胶原转录的上调功效之外，还有促进多肽透皮吸收的效果。
实施例7
一种包含ME-GHK的眼部精华，按质量百分比计，由以下组分组成：
A组分：卵磷脂1.0%, 澳洲坚果籽油1.5%，小麦胚芽油0.5%，16/18醇0.5%;
B组分：AVC（丙烯酸聚合物）0.5%，尼泊金甲酯0.1%，双丙甘醇5%，去离子水90.1%；
C组分：ME-GHK 0.5%，苯氧乙醇0.3%。
实施例8
一种包含ME-GHK的眼部精华，按质量百分比计，由以下组分组成：
A组分：卵磷脂1.0%, 澳洲坚果籽油1.5%，小麦胚芽油0.5%，16/18醇0.5%;
B组分：AVC（丙烯酸聚合物）0.5%，尼泊金甲酯0.1%，双丙甘醇5%，去离子水89.6%；
C组分：ME-GHK 1.0 %，苯氧乙醇0.3%。
实施例9（对比例）
一种不包含ME-GHK的眼部精华，按质量百分比计，由以下组分组成：
A组分：卵磷脂1.0%, 澳洲坚果籽油1.5%，小麦胚芽油0.5%，16/18醇0.5%;
B组分：AVC（丙烯酸聚合物）0.5%，尼泊金甲酯0.1%，双丙甘醇5%，去离子水90.6%；
C组分：苯氧乙醇0.3%
实施例10
眼部精华的制备方法：
1）将实施例7、8、9中的A组分加入油相锅，开启搅拌，转速为1000rpm，并升温至80℃，保温10min，得到油相混合液；
2）将B组分加入水相锅，开启搅拌，转速为600rpm，并升温至85℃，保温15min，得到水相混合液；
3）将水相混合液吸入乳化锅后，开启乳化锅搅拌，转速60rpm，通过控制真空阀门缓慢将油相混合液吸入乳化锅，然后开启均质，均质的时间为5min，转速3000rpm;
4）均质完成后，开启降温水降温至30℃，加入组分C，搅拌5min，再开启均质，均质5min，均质的转速为1000rpm。出料，得到眼部精华。
实施例11
三种眼部精华的试用效果检测
受试人群：30名成年女性，年龄在45-55周岁之间，分成三组；
试验方法：在眼周区使用实施例7、实施例8和实施例9制备的眼部精华，早晚各一次，持续使用4周，用FOITS（皮肤快速光学成像法）测量肌肤纹理变化，以评估眼角鱼尾纹区皱纹和细纹的数量、深度和面积，其测试结果如下
表3
| 实施例7 | 实施例8 | 实施例9（对比例） | |
| 平均皱纹数量变化 | -9.0%* | -13.1%* | 1.2% |
| 平均皱纹深度变化 | -8.3%* | -15.3%* | 0.0% |
| 平均皱纹面积变化 | -37.4%* | -47.2%* | -3.4% |
实施例12
装载工艺
在300μg/mL的牛奶外泌体中，添加棕榈酰四肽-7，至浓度为8mg/mL，用稀盐酸和NaOH调整混合溶液至pH5.0-pH6.0，添加2mg/mL的胆固醇助溶。37℃以下温度条件搅拌，物理装载。
物理装载1-3h后，用分子筛层析除去游离的棕榈酰四肽-7小分子和胆固醇，添加冻干保护剂甘露醇和海藻糖，冻干保存。冻干后的牛奶外泌体-棕榈酰四肽-7经反相色谱HPLC检测样品中的棕榈酰四肽-7，计算包封率。
包封率%=HPLC检出的装载棕榈酰四肽-7/总的棕榈酰四肽-7投药量×100%
计算得到，包封率为41.2%。
实施例13
装载有棕榈酰五肽-4的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰五肽-4，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-7；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰五肽-4，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰五肽-4的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰五肽-4烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰五肽-4在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例13进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰五肽-4使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰五肽-4使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰五肽-4的牛奶外泌体的包封率。
实施例14
装载有棕榈酰六肽-12的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰六肽-12，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为5-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰六肽-12，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰六肽-12的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰六肽-12烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰六肽-12在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例14进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰六肽-12使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰六肽-12使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰六肽-12的牛奶外泌体的包封率。
实施例15
装载有肉豆蔻酰六肽-5的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加肉豆蔻酰六肽-5，优选的添加量为10ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-6；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的肉豆蔻酰六肽-5，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的肉豆蔻酰六肽-5的方式为分子筛、超滤等分离手段。
肉豆蔻酰六肽-5烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，肉豆蔻酰六肽-5在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例15进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加肉豆蔻酰六肽-5使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加肉豆蔻酰六肽-5使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有肉豆蔻酰六肽-5的牛奶外泌体的包封率。
实施例16
装载有棕榈酰六肽-15的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰六肽-15，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰六肽-15，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰六肽-15的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰六肽-15烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰六肽-15在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例16进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰六肽-15使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰六肽-15使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰六肽-15的牛奶外泌体的包封率。
实施例17
装载有棕榈酰二肽-7的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰二肽-7，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰二肽-7，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰二肽-7的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰二肽-7烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰二肽-7在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例17进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰二肽-7使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰二肽-7使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰二肽-7的牛奶外泌体的包封率。
实施例18
装载有棕榈酰六肽-14的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰六肽-14，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰六肽-14，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰六肽-14的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰六肽-14烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰六肽-14在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例18进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰六肽-14使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰六肽-14使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰六肽-14的牛奶外泌体的包封率。
实施例19
装载有棕榈酰三肽-5的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰三肽-5，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰三肽-5，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰三肽-5的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰三肽-5烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰三肽-5在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例19进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰三肽-5使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰三肽-5使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰三肽-5的牛奶外泌体的包封率。
实施例20
装载有棕榈酰三肽-8的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰三肽-8，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰三肽-8，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰三肽-8的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰三肽-8烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰三肽-8在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例20进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰三肽-8使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰三肽-8使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰三肽-8的牛奶外泌体的包封率。
实施例21
装载有棕榈酰四肽-10的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰四肽-10，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰四肽-10，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰四肽-10的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰四肽-10烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰四肽-10在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例21进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰四肽-10使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰四肽-10使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰四肽-10的牛奶外泌体的包封率。
实施例22
装载有棕榈酰四肽-5的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰四肽-5，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰四肽-5，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰四肽-5的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰四肽-5烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰四肽-5在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例22进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰四肽-5使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰四肽-5使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰四肽-5的牛奶外泌体的包封率。
实施例23
装载有棕榈酰五肽-5的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰五肽-5，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10 mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的棕榈酰五肽-5，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的棕榈酰五肽-5的方式为分子筛、超滤等分离手段。
棕榈酰五肽-5烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，棕榈酰五肽-5在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例23进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加棕榈酰五肽-5使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加棕榈酰五肽-5使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有棕榈酰五肽-5的牛奶外泌体的包封率。
实施例24
装载有肉豆蔻酰五肽-4的牛奶外泌体制剂的的制备方法为：所述在牛奶外泌体中，添加肉豆蔻酰五肽-4，优选的添加量为5ug/mL-10mg/mL， 1-5mg/mL，4-10mg/mL,或6-10mg/mL。调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL，优选的pH为4-8；37℃以下温度条件搅拌，以物理方式装载1-12h后，除去游离的肉豆蔻酰五肽-4，添加冻干保护剂冻干保存。优选的物理装载方式为搅拌孵育或者静置孵育，优选的除去游离的肉豆蔻酰五肽-4的方式为分子筛、超滤等分离手段。
肉豆蔻酰五肽-4烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，实现了肽与牛奶外泌体的装载与被装载的关系，肉豆蔻酰五肽-4在所述牛奶外泌体制剂中的饱和浓度大大提高。
实施例24进一步优选的是，所述在牛奶外泌体中，添加肉豆蔻酰五肽-4使之达到过饱和状态，调整混合溶液pH。添加肉豆蔻酰五肽-4使之达到过饱和状态能够进一步提高装载有肉豆蔻酰五肽-4的牛奶外泌体的包封率。
实施例25
实施例25与实施例1-24相似，不同的是外泌体的添加采用颗粒计数方式，优选的在实施例1、2、3、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16中，采用颗粒数为1×1011-1×1012颗粒/mL，蛋白浓度200-500μg/mL的牛奶外泌体。
Claims (10)
1.一种装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂，包括烷基化美容肽和牛奶外泌体，其特征在于，所述烷基化美容肽的烷烃链插入到牛奶外泌体的磷脂双分子层膜中，所述烷基化美容肽在牛奶外泌体制剂中的包封率大于25%。
2.如权利要求1所述的牛奶外泌体制剂，其特征在于，牛奶外泌体的蛋白浓度为200-500μg/mL，或外泌体颗粒数为1×1011-1×1012颗粒/mL。
3.如权利要求2所述的牛奶外泌体制剂，其特征在于，所述烷基化美容肽的添加量为5ug/mL-10mg/mL。
4.如权利要求3所述的牛奶外泌体制剂，其特征在于，所述烷基化美容肽包括棕榈酰三肽-1、棕榈酰五肽-4、棕榈酰四肽-7、棕榈酰六肽-12、肉豆蔻酰六肽-5、棕榈酰六肽-15、棕榈酰二肽-7，棕榈酰六肽-14，棕榈酰三肽-5，棕榈酰三肽-8，棕榈酰四肽-10，棕榈酰四肽-5，棕榈酰五肽-5，肉豆蔻酰五肽-4中的至少一种。
5.如权利要求4所述的牛奶外泌体制剂，其特征在于，所述牛奶外泌体制剂还包括增溶剂和/或冻干保护剂。
6.如权利要求5所述的牛奶外泌体制剂，其特征在于，所述增溶剂为阳离子乳化剂。
7.如权利要求6所述的牛奶外泌体制剂，其特征在于，所述增溶剂添加量3-10mg/mL。
8.如权利要求5所述的牛奶外泌体制剂，其特征在于，所述冻干保护剂为甘露醇和/或海藻糖。
9.如权利要求1-8任一项所述的装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在牛奶外泌体溶液中，添加烷基化美容肽；调整混合溶液的pH值，使满足：所述牛奶外泌体制剂在电镜下能观察到完整清晰的外泌体，HPLC测得的纯度在55%以上 ，并且所述烷基化美容肽的饱和浓度≥10μg/mL。
10.权利要求1-8任一项所述的装载有烷基化美容肽的牛奶外泌体制剂在在化妆品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311047717.7A CN116785194A (zh) | 2023-08-21 | 2023-08-21 | 牛奶外泌体装载烷基化美容肽及在化妆品中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311047717.7A CN116785194A (zh) | 2023-08-21 | 2023-08-21 | 牛奶外泌体装载烷基化美容肽及在化妆品中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116785194A true CN116785194A (zh) | 2023-09-22 |
Family
ID=88044043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311047717.7A Pending CN116785194A (zh) | 2023-08-21 | 2023-08-21 | 牛奶外泌体装载烷基化美容肽及在化妆品中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116785194A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020018926A1 (en) * | 2018-07-19 | 2020-01-23 | Intrexon Corporation | Exosome delivery of skin care peptides |
| CN115089727A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-09-23 | 天津医科大学眼科医院 | Kc26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用 |
| KR20220153271A (ko) * | 2021-05-11 | 2022-11-18 | 충북대학교 산학협력단 | 우유로부터 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 흉터 생성 억제용 조성물 |
| CN115427014A (zh) * | 2019-11-28 | 2022-12-02 | 韩国科学技术研究院 | 牛奶外泌体的新用途 |
| CN116392601A (zh) * | 2023-04-26 | 2023-07-07 | 陕西微泌生物科技有限公司 | 一种复合修饰外泌体包裹白藜芦醇的制剂及其制备方法 |
| CN116549650A (zh) * | 2023-05-25 | 2023-08-08 | 江苏集萃功能材料研究所有限公司 | 一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物及其制备方法 |
-
2023
- 2023-08-21 CN CN202311047717.7A patent/CN116785194A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020018926A1 (en) * | 2018-07-19 | 2020-01-23 | Intrexon Corporation | Exosome delivery of skin care peptides |
| CN115427014A (zh) * | 2019-11-28 | 2022-12-02 | 韩国科学技术研究院 | 牛奶外泌体的新用途 |
| KR20220153271A (ko) * | 2021-05-11 | 2022-11-18 | 충북대학교 산학협력단 | 우유로부터 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 흉터 생성 억제용 조성물 |
| CN115089727A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-09-23 | 天津医科大学眼科医院 | Kc26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用 |
| CN116392601A (zh) * | 2023-04-26 | 2023-07-07 | 陕西微泌生物科技有限公司 | 一种复合修饰外泌体包裹白藜芦醇的制剂及其制备方法 |
| CN116549650A (zh) * | 2023-05-25 | 2023-08-08 | 江苏集萃功能材料研究所有限公司 | 一种用于皮肤伤口修复的生物活性组合物及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Manosroi et al. | Transdermal absorption enhancement of papain loaded in elastic niosomes incorporated in gel for scar treatment | |
| CN101172091B (zh) | 含人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子的融合蛋白护肤产品制备工艺和用途 | |
| AU2017267370B2 (en) | A method to enhance wound healing using silk-derived protein | |
| JP2015510884A (ja) | 局所的皮膚用製剤および皮膚の個人向けの処置方法 | |
| CN115554187B (zh) | 一种可湿热灭菌的贻贝粘蛋白皮肤修护乳液及其制备方法 | |
| WO2015009325A1 (en) | Skin cream | |
| EP2629782A1 (en) | Use of exosomes to promote or enhance hair growth | |
| JP2011511774A (ja) | 皮膚、粘膜、頭皮または爪の処置、保護または洗浄において有用なペプチド誘導体 | |
| EP2376529A1 (fr) | Nouveaux peptides anti-age et composition cosmetique et/ou pharmaceutique les contenant | |
| EP3484498A1 (en) | Compositions and methods for providing hair growth | |
| KR20150128481A (ko) | 세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하는 생체 피부용 조성물 | |
| EP2961481B1 (fr) | Composition dermatologique antimicrobienne topique | |
| WO2017105413A1 (en) | Stem cell stimulating compositions and methods of treating melasma | |
| Sun et al. | The preparation of high minoxidil loaded transfersomes and its gel for effective topical treatment of alopecia | |
| US20180193252A1 (en) | Cosmetic Compositions and Method of Making the Same | |
| WO2023154873A2 (en) | Novel methods for decellularizing extracellular matrix | |
| US20160250298A1 (en) | Inclusion bodies for transdermal delivery of therapeutic and cosmetic agents | |
| EP1061942B1 (en) | Topical composition containing human epidermal growth factor | |
| CN116785194A (zh) | 牛奶外泌体装载烷基化美容肽及在化妆品中的应用 | |
| JP2023544824A (ja) | ヒアルロン酸の刺激に関する組成物及び方法 | |
| CN103990136B (zh) | 经皮给药系统及其制备方法和应用 | |
| JP2025512393A (ja) | 局所適用のためのオクタペプチド | |
| EP2523967A1 (fr) | Nouveaux peptides anti-age modulateurs de la survivine et compositions les comprenant | |
| EP4265630A1 (en) | Anti-inflammatory peptide for preventing or treating atopic dermatitis | |
| WO2022006076A1 (en) | Ocular treatment compositions and methods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20241117 Address after: Room 501-17, Building 5, No. 81 Haitong Street, Tianjin Economic and Technological Development Zone, Binhai New Area, Tianjin 300450, China Applicant after: Juntai (Tianjin) Technology Industry Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: Building 302, Building 20, Green Valley Health Industrial Park, No. 59 Kangtai Avenue, Binhai Science and Technology Park, Binhai New Area, Tianjin, 300301 Applicant before: Tianjin exosome Technology Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20250513 Address after: Room 101, Building 10, China Eye Valley Science and Technology Innovation Park (Area A), No. 505 Luodongbei Street, Haibin Street, Longwan District, Wenzhou City, Zhejiang Province, 325000 Applicant after: Bizhiyuan (Zhejiang) Technology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: Room 501-17, Building 5, No. 81 Haitong Street, Tianjin Economic and Technological Development Zone, Binhai New Area, Tianjin 300450, China Applicant before: Juntai (Tianjin) Technology Industry Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |