CN116773315A - 一种基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，该方法通过基于疏水阻隔组织阵列包埋框制成组织阵列蜡块并进一步制成组织阵列切片，所制成切片在经历常规脱蜡水化后组织区可被水化，而包埋框区蜡被保留，借此阻隔各个组织点。在抗原修复中通过限制温度避免包埋框区蜡遭到破坏。在第一抗体孵育步骤中，将待筛选抗体逐一点加在组织点上进行孵育，完成全部染色后，可在镜下观察各点染色，最终选择出符合要求的具有免疫组化适用性的抗体。因此，本发明有效地解决了现有免疫组织化学检测技术因操作步骤繁多、试剂消耗相对多、难以批量化而不能用于抗体筛选的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于分子病理学技术领域，涉及一种通过免疫组织化学技术批量筛选抗体的方法。
背景技术
免疫组织化学是一种在临床病理中常用到的针对经福尔马林固定-石蜡包埋手术后样本的检测方法。在检测过程中需要用到一抗，一抗具有特异性识别功能，可直接识别组织中包含的靶分子。
免疫组织化学技术中因被检测样本经历了福尔马林固定与石蜡包埋等处理过程，导致其识别的靶分子与普通分子生物学或细胞生物学中的靶分子产生了一定变化。因此常规可用于普通分子与细胞生物学检测的抗体在免疫组织化学技术中常常不能使用。
免疫组织化学检测形式具有样本制备复杂、操作频繁、试剂耗用量相对多等特征，导致其难以成为一种可用于抗体批量筛选的技术。正因如此，免疫组织化学适用抗体的筛选长期依赖于常规分子与细胞生物学技术，该现状直接导致免疫组化类应用抗体开发效率很低。
组织阵列片是一种将多个组织通过取样集成于一个石蜡块后再经超微切片制成的石蜡切片样本，通常被用于提高单个抗体试剂的检测通量，不能被用于抗体筛选。其不能被用于抗体筛选的原因在于，切片中各阵列点在与试剂反应过程中不能保持相互间独立。
发明内容
针对现有免疫组化类抗体筛选技术中存在的不足，本发明是提供一种基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，以解决现有免疫组织化学检测技术因操作步骤繁多、试剂消耗相对多、难以批量化等原因不能作为筛选性方法的技术问题。
本发明的技术方案是：一种基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，包括以下步骤：
A1：基于疏水阻隔组织阵列包埋框制备组织阵列蜡块并进一步制成组织阵列切片；
A2：对组织阵列切片进行抗原修复时，限制修复液温度不超过100℃；A3：将被筛选抗体依次有对应关系地点加在组织阵列切片的阵列点上，而后孵育。
进一步，上述方法中，所述组织阵列切片的制作方法如下：
B1：选择确认特定抗原为阳性的石蜡组织块并做好区域标记或者为特定抗原阳性的细胞蜡块；
B2：用钻芯工具提取组织块或细胞块，将同类的取出物系列植入特制的疏水阻隔组织阵列包埋框孔中，通过加热将包埋框石蜡与组织中石蜡融合成一体并制成新的组织蜡块；
B3：将制成组织蜡块经切片机切片制成组织阵列切片。
更进一步，上述方法中，所述组织阵列切片经常规二甲苯脱蜡与梯度乙醇水化处理，处理后组织区石蜡被完全脱去并实现水化，包埋框区域的蜡被保留可提供疏水阻隔效应。
进一步，上述方法中，对组织阵列切片进行抗原修复时，按如下步骤进行：
C1：将组织阵列切片放入预热至小于100℃的抗原修复液中，水浴30-50分钟；
C2：用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
更进一步，上述抗原修复液预热至90-98℃。
进一步，上述方法中，组织阵列切片完成抗原修复后，按如下步骤制片：
D1：甩干切片，加阻断剂封闭内源性干扰物；
D2：用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟，甩干切片。
进一步，上述方法中，所述孵育过程如下：
E1：将待筛选抗体样本分别点加在组织阵列切片对应的组织点上，室温或37℃孵育30-60分钟；
E2：用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
E3：甩干切片，加二抗覆盖切片，室温或37℃孵育15-30分钟；
E4：用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
E5：甩干切片，然后加DAB显色液，室温反应3-10分钟；
E6：用去离子水冲洗切片；
E7：然后用苏木素染色液染色2-3分钟；
E8：用去离子水冲洗切片；
E9：将切片放自来水下流水冲洗20-30分钟完成返蓝；
E10：按照常规进行切片染色后脱水、透明、封片处理步骤；
E11：普通光学显微镜下观察有染色的组织点，对应选择出具有预期染色性能的抗体克隆。
进一步，上述方法中，制备组织阵列蜡块需要通过用取芯工具从组织蜡块中取材，然后将组织芯样植入疏水阻隔组织阵列包埋框的孔中，重复取样、植入，得到中间形态蜡块。
进一步，上述方法中，将中间形态蜡块放入模具中85℃加热，使蜡块融为一体，最终制成完整的组织阵列蜡块。
优选可替代的，上述方法中，将中间形态蜡块放入模具中90℃加热，使蜡块融为一体，最终制成完整的组织阵列蜡块。
综上所述，本发明的有益效果是：本发明通过基于疏水阻隔组织阵列包埋框制成组织阵列蜡块并进一步制成组织阵列切片，所制成切片在经历常规脱蜡水化后组织区可被水化，而包埋框区蜡被保留，借此阻隔各个组织点。在抗原修复中通过限制温度避免包埋框区蜡遭到破坏。在第一抗体孵育步骤中，将待筛选抗体逐一点加在组织点上进行孵育，完成全部染色后，可在镜下观察各点染色，最终选择出符合要求的具有免疫组化适用性的抗体。因此，本发明有效地解决了现有免疫组织化学检测技术操作步骤繁多、试剂消耗相对多、难以批量化的技术问题，同时使切片中各阵列点在与试剂反应过程中保持相互间独立。
附图说明
图1为发明实施例中组织阵列蜡块的示意图；
图2为发明实施例中组织阵列切片的示意图；
图3为发明实施例中点加被筛选抗体后的状态示意图；
图4为发明实施例中筛选结果的示意图；
图5为发明实施例中B5点染色结果(阳性)的示意图；
图6为发明实施例中D4点染色结果(阳性)的示意图；
图7为发明实施例中C5点染色结果(阴性)的示意图；
图8为发明实施例二中筛选结果的示意图；
图9为发明实施例二中A2点染色结果(非特异)的示意图；
图10为发明实施例二中A5点染色结果(阳性)的示意图；
图11为发明实施例二中C3点染色结果(非特异)的示意图；
图12为发明实施例二中D1点染色结果(阳性)的示意图；
图13为发明实施例二中B3点染色结果(阴性)的示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例
以下进一步通过利用胎盘组织筛选胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的实施例进一步说明本发明的技术方案。具体实施过程如下：
1)选择均匀规整的胎盘组织蜡块，用取芯工具从组织蜡块中取材，然后将组织芯样植入疏水阻隔组织阵列包埋框的孔中，重复取样、植入，直至完成整个阵列，如图1所示；
2)将组织阵列放入模具中85℃加热，使蜡块融为一体，最终制成完整蜡块；
3)将制好的组织阵列蜡块经切片制成如图2所示的组织阵列切片(以下简称切片)；
4)将切片放入70℃烘箱干烤1小时；
5)将切片依次过二甲苯I(5分钟)、二甲苯II(5分钟)、无水乙醇I(2分钟)、无水乙醇II(2分钟)、95％乙醇(2分钟)、80％乙醇(2分钟)，然后流水冲洗1分钟；
6)将切片放入EDTA抗原修复液(pH8.0)中，98℃水浴修复40分钟；
7)完成修复后，用冲洗缓冲液(TBST或PBST)冲洗切片3次，每次3分钟；
8)将切片浸泡入10％过氧化氢溶液中5分钟，灭活内源性酶；
9)用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
10)甩干切片，将待检测抗体(编号1-20)逐一滴加到点阵的A1-A5、B1-B5、C1-C5、D1-D5的位置，如图3所示，室温孵育45分钟；
11)用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
12)甩干切片，滴加二抗覆盖切片，室温孵育20分钟；
13)用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
14)甩干切片，滴加DAB显色液，室温反应5分钟；
15)用去离子水冲洗切片；
14)将切片放入苏木素染色液中染色2分钟；
15)用去离子水冲洗切片；
16)将切片放自来水下流水冲洗20分钟完成返蓝；
17)将切片依次过80％乙醇(2分钟)、95％乙醇(2分钟)、无水乙醇I(2分钟)、无水乙醇II(2分钟)、二甲苯I(5分钟)、二甲苯II(5分钟)，完成脱水透明；
18)滴加中性树胶，用盖玻片封闭切片。
19)如图4～7所示，普通光学显微镜下观察组织阵列切片B5、D4点有符合预期的染色，对应抗体编号10和19为符合要求的抗体，其它抗体均不结合。
实施例2
通过利用皮肤组织筛选广谱细胞角蛋白(CKpan)的实施例进一步说明本发明的技术方案。具体实施过程如下：
1)选择规整的皮肤组织蜡块，用取芯工具从组织蜡块中取材，然后将组织芯样植入疏水阻隔组织阵列包埋框的孔中，重复取样、植入，直至完成整个阵列；
2)将组织阵列放入模具中90℃加热，使蜡块融为一体，最终制成完整蜡块；
3)将制好的组织阵列蜡块经切片制成的组织阵列切片(以下简称切片)；
4)将切片放入65℃烘箱干烤2小时；
5)将切片依次过二甲苯I(5分钟)、二甲苯II(5分钟)、无水乙醇I(2分钟)、无水乙醇II(2分钟)、95％乙醇(2分钟)、80％乙醇(2分钟)，然后流水冲洗1分钟；
6)将切片放入EDTA抗原修复液(pH8.0)中，98℃水浴修复40分钟；
7)完成修复后，用冲洗缓冲液(TBST或PBST)冲洗切片3次，每次3分钟；
8)将切片浸泡入10％过氧化氢溶液中5分钟，灭活内源性酶；
9)用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
10)甩干切片，将待检测抗体(编号1-20)逐一滴加到点阵的A1-A5、B1-B5、C1-C5、D1-D5的位置，室温孵育45分钟；
11)用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
12)甩干切片，滴加二抗覆盖切片，室温孵育20分钟；
13)用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
14)甩干切片，滴加DAB显色液，室温反应5分钟；
15)用去离子水冲洗切片；
14)将切片放入苏木素染色液中染色2分钟；
15)用去离子水冲洗切片；
16)将切片放自来水下流水冲洗20分钟完成返蓝；
17)将切片依次过80％乙醇(2分钟)、95％乙醇(2分钟)、无水乙醇I(2分钟)、无水乙醇II(2分钟)、二甲苯I(5分钟)、二甲苯II(5分钟)，完成脱水透明；
18)滴加中性树胶，用盖玻片封闭切片。
19)如图8～12所示，普通光学显微镜下观察组织阵列切片A2、A5、C3、D1点有染色，其中镜下观察仅A5和D1点符合预期染色特点，对应抗体编号5和16为符合要求的抗体，其它抗体均不结合或不符合要求。
Claims (10)
1.一种基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
A1：基于疏水阻隔组织阵列包埋框制备组织阵列蜡块并进一步制成组织阵列切片；
A2：对组织阵列切片进行抗原修复时，限制修复液温度不超过100℃；
A3：将被筛选抗体依次有对应关系地点加在组织阵列切片的阵列点上，而后孵育。
2.根据权利要求1所述的基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，其特征在于：所述步骤A1中的组织阵列切片的制作方法如下：
B1：选择确认特定抗原为阳性的石蜡组织块并做好区域标记或者为特定抗原阳性的细胞蜡块；
B2：用钻芯工具提取组织块或细胞块，将同类的取出物系列植入特制的疏水阻隔组织阵列包埋框孔中，通过加热将包埋框石蜡与组织中石蜡融合成一体并制成新的组织蜡块；
B3：将制成组织蜡块经切片机切片制成组织阵列切片。
3.根据权利要求2所述的基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，其特征在于：所述组织阵列切片经常规二甲苯脱蜡与梯度乙醇水化处理，处理后组织区石蜡被完全脱去并实现水化，包埋框区域的蜡被保留可提供疏水阻隔效应。
4.根据权利要求1所述的基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，其特征在于：所述步骤A2中对组织阵列切片进行抗原修复时，按如下步骤进行：
C1：将组织阵列切片放入预热至小于100℃的抗原修复液中，水浴30-50分钟；
C2：用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟。
5.根据权利要求4所述的基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，其特征在于：所述抗原修复液预热后的温度为90-98℃。
6.根据权利要求4所述的基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，所述组织阵列切片完成抗原修复后，按如下步骤制片：
D1：甩干切片，加阻断剂封闭内源性干扰物；
D2：用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟，甩干切片。
7.根据权利要求1所述的基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，其特征在于：所述步骤A3中孵育过程如下：
E1：将待筛选抗体样本分别点加在组织阵列切片对应的组织点上，15-40℃孵育30-60分钟；
E2：用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
E3：甩干切片，加二抗覆盖切片，15-40℃孵育15-30分钟；
E4：用冲洗缓冲液冲洗切片3次，每次3分钟；
E5：甩干切片，然后加DAB显色液，室温反应3-10分钟；
E6：用去离子水冲洗切片；
E7：然后用苏木素染色液染色2-3分钟；
E8：用去离子水冲洗切片；
E9：将切片放自来水下流水冲洗20-30分钟完成返蓝；
E10：按照常规进行切片染色后脱水、透明、封片处理步骤；
E11：普通光学显微镜下观察有染色的组织点，对应选择出具有预期染色性能的抗体克隆。
8.根据权利要求1所述的基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，其特征在于：制备所述组织阵列蜡块需要通过用取芯工具从组织蜡块中取材，然后将组织芯样植入疏水阻隔组织阵列包埋框的孔中，重复取样、植入，得到中间形态蜡块。
9.根据权利要求8所述的基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，其特征在于：将所述中间形态蜡块放入模具中85℃加热，使蜡块融为一体，最终制成完整的组织阵列蜡块。
10.根据权利要求8所述的基于免疫组织化学技术的批量化抗体筛选方法，其特征在于：将所述中间形态蜡块放入模具中90℃加热，使蜡块融为一体，最终制成完整的组织阵列蜡块。
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2023
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