CN116731934B - 一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用，大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1009，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.26218。本发明使用大肠埃希氏菌ecozh1009发酵生产氨基葡萄糖，在发酵过程中菌株能保持良好的性能，经过稳定性试验测试该菌株具有良好的稳定性，发酵结束后产物的浓度有了显著提高，该菌株培养基成分简单、培养条件粗放，易于工业化放大生产，具有较好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物制造领域，尤其涉及一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用。
背景技术
氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）简称氨糖，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后形成的一种重要的功能性单糖产物，是合成糖胺聚糖如透明质酸、硫酸软骨素和硫酸角藻聚糖的重要前体物质，广泛存在于所有生物体中，包括细菌、酵母、丝状真菌及动植物。作为生物体内多糖的重要单体之一，氨基葡萄糖可有效治疗关节炎，参与肝肾解毒和护肝，还能抗衰老、刺激婴儿肠道内双歧杆菌的生长、调节内分泌。氨基葡萄糖还是组成黏膜分泌物、结缔组织、皮肤、肌腱、韧带和软骨等必不可少的成分。
氨基葡萄糖常用的生产方法包括三种，即几丁质水解法、生物转化法与微生物发酵法。几丁质水解法是利用强酸将虾蟹外壳中提取的几丁质进行水解来获得氨基葡萄糖，会产量大量的环境污染物，而且其原料会受到地域和季节的限制；生物转化法生产氨基葡萄糖，为了维持酶制剂的活性和稳定性，该方法生产成本过高，因此很难实现工业生产；微生物发酵法作为最有潜力的生产方式，基本克服了以上两种生产方式的缺点，具有发酵时间短、生产效率高、环境污染小、易于规模化生产的优点。随着生物技术的发展，氨基葡萄糖的生产方式主要以微生物发酵法为主。但是目前发酵法生产氨基葡萄糖仍然存在菌种不稳定、发酵水平波动较大等问题，时常出现发酵生产异常，使氨基葡萄糖的生产成本居高不下，因此，选育优良稳定的氨基葡萄糖生产菌株对工业生产具有极其重要的意义。
发明内容
本发明提出了一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用。发酵过程菌株性能稳定，发酵液中具有较高的产物浓度。
本发明的目的之一，是提供一株大肠埃希氏菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1009，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.26218。
本发明的目的之二，是提供一种大肠埃希氏菌的应用，采用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1009生产氨基葡萄糖。使用该菌株进行发酵生产氨基葡萄糖，发酵过程菌株性能稳定，发酵液中具有较高的产物浓度。
所述生产氨基葡萄糖的方法包括：
（1）菌种活化：将冷冻保藏的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1009室温下解冻，在超净工作台上取解冻后的菌液接种于LB液体培养基中进行活化培养，在200 rpm的恒温摇床中37℃培养12h；
（2）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基中种子培养；
（3）发酵培养：将扩大培养后的种子液移种至发酵培养基中发酵培养得到含有氨基葡萄糖的发酵液。
进一步地，LB液体培养基包含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L，pH调至7.0。
进一步地，种子培养基包含葡萄糖30~50 g/L、磷酸二氢钾1~5 g/L、磷酸氢二钾5~20 g/L、硫酸铵1~3 g/L、硫酸镁1~5 g/L、多肽粉1~10 g/L、蛋白胨1~10 g/L、酵母浸粉1~10g/L。
进一步地，发酵培养基包含葡萄糖30~50 g/L、磷酸5~20 g/L、氯化钾1~10 g/L、硫酸铵5~10 g/L、硫酸镁0.1~2 g/L、多肽粉10~30 g/L、酵母浸粉5~10 g/L。
进一步地，种子培养控制条件：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，培养时间10~15h。
进一步地，发酵培养条件为：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L。
本发明的有益效果是：
本发明通过大量诱变筛选试验，获得一株大肠埃希氏菌ecozh1009，该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26218，经过检测鉴定，该菌株具有独特的生理和生化特性，可在科研、工业生产等领域进行应用。本发明中的大肠埃希氏菌ecozh1009，在发酵过程中菌株能保持良好的性能，经过稳定性试验测试该菌株具有良好的稳定性，发酵结束后产物的浓度有了显著提高，该菌株培养基成分简单、培养条件粗放，易于工业化放大生产，具有较好的实际应用价值。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
一株大肠埃希氏菌ecozh1009，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.26218。
实施例1
一株大肠埃希氏菌的应用，采用大肠埃希氏菌ecozh1009发酵生产氨基葡萄糖。
发酵生产氨基葡萄糖的方法如下：
（1）菌种活化：将冷冻保藏在-80℃冰箱中的大肠埃希氏菌ecozh1009取出后在室温下解冻，在超净工作台上取解冻后的菌液接种于LB液体培养基中进行活化培养，在200rpm的恒温摇床中37℃培养12h；LB液体培养基为胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L、调pH至7.0。
（2）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基中种子培养；种子罐培养控制条件：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，培养时间10~15h；种子培养基包括葡萄糖30 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、磷酸氢二钾5 g/L、硫酸铵3 g/L、硫酸镁3 g/L、多肽粉7g/L、蛋白胨1 g/L、酵母浸粉8 g/L。
（3）发酵培养：按10~15%接种量将种子液移种至发酵培养基中发酵培养得到含有氨基葡萄糖的发酵液；发酵培养控制条件：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L；发酵培养基为葡萄糖30 g/L、磷酸5 g/L、氯化钾1 g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁0.1 g/L、多肽粉10 g/L、酵母浸粉5g/L。
通过该种方式，采用30 L发酵罐培养，培养45h，培养结束发酵液中氨基葡萄糖浓度为137.95 g/L，对葡萄糖的转化率为41.82%，转化率计算公式=（发酵液体积L×发酵产氨基葡萄糖含量g/L）/发酵葡萄糖用量g×100%。
实施例2
一株大肠埃希氏菌的应用，采用大肠埃希氏菌ecozh1009发酵生产氨基葡萄糖。
发酵生产氨基葡萄糖的方法如下：
（1）菌种活化：将冷冻保藏在-80℃冰箱中的大肠埃希氏菌ecozh1009取出后在室温下解冻，在超净工作台上取解冻后的菌液接种于LB液体培养基中进行活化培养，在200rpm的恒温摇床中37℃培养12h；LB液体培养基为胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L、调pH至7.0。
（2）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基中种子培养；种子罐培养控制条件：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，培养时间10~15h；种子培养基包括葡萄糖40 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、磷酸氢二钾20 g/L、硫酸铵2 g/L、硫酸镁1g/L、多肽粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10g/L。
（3）发酵培养：按10~15%接种量将种子液移种至发酵培养基中发酵培养得到含有氨基葡萄糖的发酵液；发酵培养控制条件：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L；发酵培养基为葡萄糖50 g/L、磷酸18 g/L、氯化钾10 g/L、硫酸铵9 g/L、硫酸镁1g/L、多肽粉25 g/L、酵母浸粉8g/L。
通过该种方式，采用30 L发酵罐培养，培养45h，培养结束发酵液中氨基葡萄糖浓度为139.37 g/L，对葡萄糖的转化率为42.02%，转化率计算公式=（发酵液体积L×发酵产氨基葡萄糖含量g/L）/发酵葡萄糖用量g×100%。
实施例3
一株大肠埃希氏菌的应用，采用大肠埃希氏菌ecozh1009发酵生产氨基葡萄糖。
发酵生产氨基葡萄糖的方法如下：
（1）菌种活化：将冷冻保藏在-80℃冰箱中的大肠埃希氏菌ecozh1009取出后在室温下解冻，在超净工作台上取解冻后的菌液接种于LB液体培养基中进行活化培养，在200rpm的恒温摇床中37℃培养12h；LB液体培养基为胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L、调pH至7.0 g/L。
（2）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基中种子培养；种子罐培养控制条件：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，培养时间10~15h；种子培养基包括葡萄糖35g/L、磷酸二氢钾3 g/L、磷酸氢二钾15 g/L、硫酸铵1g/L、硫酸镁2g/L、多肽粉5g/L、蛋白胨6 g/L、酵母浸粉5g/L。
（3）发酵培养：按10~15%接种量将种子液移种至发酵培养基中发酵培养得到含有氨基葡萄糖的发酵液；发酵培养控制条件：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L；发酵培养基为葡萄糖40g/L、磷酸15 g/L、氯化钾5g/L、硫酸铵7g/L、硫酸镁1.5 g/L、多肽粉15 g/L、酵母浸粉7 g/L。
通过该种方式，采用50 L发酵罐培养，培养45h，培养结束发酵液中氨基葡萄糖浓度为142.34 g/L、对葡萄糖的转化率为43.25%。转化率计算公式=（发酵液体积L×发酵产氨基葡萄糖含量g/L）/发酵葡萄糖用量g×100%。
实施例4
一株大肠埃希氏菌的应用，采用大肠埃希氏菌ecozh1009发酵生产氨基葡萄糖。
发酵生产氨基葡萄糖的方法如下：
（1）菌种活化：将冷冻保藏在-80℃冰箱中的大肠埃希氏菌ecozh1009取出后在室温下解冻，在超净工作台上取解冻后的菌液接种于LB液体培养基中进行活化培养，在200rpm的恒温摇床中37℃培养12h；LB液体培养基为胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L、调pH至7.0 g/L。
（2）种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基中种子培养；种子罐培养控制条件：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，培养时间10~15h；种子培养基包括葡萄糖50g/L、磷酸二氢钾1 g/L、磷酸氢二钾12 g/L、硫酸铵2g/L、硫酸镁5g/L、多肽粉1g/L、蛋白胨8 g/L、酵母浸粉1g/L。
（3）发酵培养：按10~15%接种量将种子液移种至发酵培养基中发酵培养得到含有氨基葡萄糖的发酵液；发酵培养控制条件：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L；发酵培养基为葡萄糖45g/L、磷酸20g/L、氯化钾8g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2 g/L、多肽粉30 g/L、酵母浸粉10g/L。
通过该种方式，采用50 L发酵罐培养，培养45h，培养结束发酵液中氨基葡萄糖浓度为141.62 g/L、对葡萄糖的转化率为41.98%。转化率计算公式=（发酵液体积L×发酵产氨基葡萄糖含量g/L）/发酵葡萄糖用量g×100%。
实施例5
诱变筛选方法
以大肠埃希氏菌MG1655变种为出发菌，经过多轮硫酸二乙酯（DES）化学诱变、常压室温等离子（atmospheric and room temperature plasma，ARTP ）诱变处理，同时结合结构类似物抗性定向筛选，筛选获得遗传稳定性好且氨基葡萄糖产物浓度较高的菌株。
硫酸二乙酯（DES）化学诱变方法：将大肠埃希氏菌斜面活化，接种于肉汤培养基中，37℃ 200r/min培养12h，然后用pH7.0磷酸缓冲液洗涤2次，磷酸缓冲液均匀悬浮后取4mL，在装有16mL pH7.0磷酸缓冲液的250mL带玻璃珠三角瓶中加入0.2mL DES原液，37℃恒温震荡诱变30min，加入Na2S2O3终止反应，摇匀，取1mL转入肉汤培养基进行中间培养，37℃200r/min振荡培养过夜，离心，洗涤，弃去上清液，收集菌体，稀释后分别涂布基本营养培养基平板和抗性平板。
ARTP诱变选育方法：从新鲜活化斜面上挑取一环菌种于种子培养基中，180 r/min、37 ℃ 摇床培养4 h，取1 mL种子液于1.5 mL EP管，4000 rpm离心，去除上清液，加入1mL生理盐水，混匀，反复三次，将菌悬液稀释，使菌悬液OD600为0.6~1.0；取10 µL 稀释菌液均匀涂到无菌不锈钢载片上，ARTP 诱变条件：射频功率120 W，处理距离2 mm，载气流量10SLM (Standard liters per minute)，处理温度为室温（20~40 ℃），诱变处理时间选择致死率达到90%以上的处理时间。将处理过的载片放入装有1 mL 无菌生理盐水的EP管中，震荡混匀，然后稀释到10-1、10-2倍，取100 µL均匀涂布到平板上，每个梯度做两个平行，37℃培养48 h。
抗性菌株筛选方法：用接种环从诱变后的平板中取一满环菌种于无菌离心管中，用无菌水离心洗涤两次，然后悬于无菌水中制成菌悬液，按浓度梯度制备一系列的N-乙酰-D-乳糖胺、β1-3半乳糖基-N-乙酰半乳糖胺、β1-6半乳糖基-N-乙酰葡萄糖胺抗性培养基平板，直接将菌悬液分别涂布于抗性平板上，37 ℃培养2～3 d。根据出发菌株耐受结构类似物的浓度确定诱变菌株筛选用结构类似物浓度，随机挑选生长菌落进行筛选。
菌种初筛：将种子培养基分装到96孔板中，每个0.1mL，将平板上的单菌落挑到种子液孔板中，180 r/min，37 ℃培养18h，并同时接种到另一块平板上，37℃ 培养22 h后放入冰箱。将发酵培养基分装到孔板中，每个0.09 mL，种子液接0.015 mL，180 r/min，37℃培养24 h。挑取发酵结束氨基葡萄糖含量较高并且副产物L-异亮氨酸含量较低的菌株，将平板上对应序号的菌种挑至斜面，37℃ 培养24 h，甘油管保存。
菌种复筛：将初筛甘油管保藏的菌种分别划一支斜面，37℃培养24 h。从斜面上挑一环菌至500 mL种子摇瓶中，180 r/min，37℃培养18 h，转接500 mL发酵摇瓶，180 r/min，37℃培养24 h，测发酵液中氨基葡萄糖的产物浓度，挑取产物浓度较高的菌种保存。
遗传稳定性试验：
将上述筛选获得的菌株进行单菌落分离，连续摇瓶传代。摇瓶传代方法：把菌株从斜面转接摇瓶中，培养至对数生长期后转接至发酵摇瓶培养。选择遗传稳定的菌株用于进一步研究。
将最终获得的一株氨基葡萄糖高产菌株ecozh1009再连续传种十次，使用30L发酵罐培养，培养结束检测产物浓度。结果如下：
表1 菌株ecozh1009的遗传稳定性
从表1中可以看出，突变菌株ecozh1009的遗传稳定性良好，连续传代10次在30L发酵罐培养结束的产物浓度均保持较高水平，并且波动很小，菌株ecozh1009的遗传稳定性良好。
对比实验：
使用本发明中的大肠埃希氏菌ecozh1009和原菌株MG1655变种，结合本发明中的相关工艺分别进行30L罐发酵培养，分别培养三批次，取三个批次平均值计算结果如下表：
表2 突变菌株和出发菌发酵性能比较
从表2中可以看出，本发明中的菌株ecozh1009相比出发菌在发酵结束后产物浓度和对葡萄糖的转化率均有了较大提高，分别提高了89.28%和51.16%，菌株ecozh1009生产氨基葡萄糖的能力得到了较大提升，并且菌株稳定性较好，应用于氨基葡萄糖工业化生产，可以产生较好的经济效益，具有良好的工业化应用前景。
对该菌株进行传代保藏，命名为大肠埃希氏菌ecozh1009，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.26218，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
中国科学院微生物研究所对大肠埃希氏菌ecozh1009的细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列（其基因序列如SEQ NO.1所示）等项目进行了检测鉴定，经过对检测鉴定实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌手册》以及International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，菌株编号ecozh1009的鉴定结果为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）。
本发明所述的大肠埃希氏菌ecozh1009及其在发酵生产氨基葡萄糖中的应用，在发酵过程中菌株能保持良好的性能，经过稳定性试验测试该菌株具有良好的稳定性，发酵结束后产物的浓度有了显著提高，该菌株培养基成分简单、培养条件粗放，易于工业化放大生产，具有较好的实际应用价值。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (8)
1.一株大肠埃希氏菌，其特征在于，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1009，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年12月25日，菌种保藏编号为CGMCC No.26218。
2.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，采用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1009生产氨基葡萄糖。
3.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，生产方法包括：
S1、菌种活化：将冷冻保藏的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ecozh1009室温下解冻，在超净工作台上取解冻后的菌液接种于LB液体培养基中进行活化培养，在200 rpm的恒温摇床中37℃培养12h；
S2、种子培养：将培养至对数期的摇瓶菌种接种于种子培养基中种子培养；
S3、发酵培养：将扩大培养后的种子液移种至发酵培养基中发酵培养得到含有氨基葡萄糖的发酵液。
4.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，LB液体培养基包含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L，pH调至7.0。
5.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，种子培养基包含葡萄糖30~50 g/L、磷酸二氢钾1~5 g/L、磷酸氢二钾5~20 g/L、硫酸铵1~3 g/L、硫酸镁1~5 g/L、多肽粉1~10 g/L、蛋白胨1~10 g/L、酵母浸粉1~10 g/L。
6.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，发酵培养基包含葡萄糖30~50 g/L、磷酸5~20 g/L、氯化钾1~10 g/L、硫酸铵5~10 g/L、硫酸镁0.1~2 g/L、多肽粉10~30 g/L、酵母浸粉5~10 g/L。
7.根据权利要求3所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，种子培养控制条件：温度37℃、罐压0.05MPa、pH7.0、初始转速200rpm、初始风量0.18vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，培养时间10~15h。
8.根据权利要求3-7任一项所述的大肠埃希氏菌的应用，其特征在于，发酵培养条件为：温度37℃、罐压0.05~0.10MPa、pH7.0、初始转速300rpm、初始风量0.2vvm，培养过程中控制溶氧20~30%，发酵培养过程中通过补糖控制发酵液中残糖含量在1~10g/L。
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