CN116655762B - 白魔芋AaCaM3基因及其编码的蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个白魔芋钙调素AaCaM3基因及其编码的蛋白质和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的AaCaM3基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，定位于细胞核和细胞质中。本发明所述的AaCaM3基因具有潜在的抗高温胁迫的能力，在高温处理下转录水平显著提高。通过农杆菌介导的花序侵染法将AaCaM3基因表达载体转入到野生型拟南芥中，结果显示转AaCaM3基因的拟南芥植株在高温胁迫下表现出明显的抗高温胁迫性，对培育抗高温胁迫能力的植物具有重要意义，即可用于白魔芋的耐热新品种育种，具有极好的应用前景。

Description

白魔芋AaCaM3基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种白魔芋AaCaM3基因及其编码的蛋白与应用。

背景技术

高温胁迫是最重要的环境胁迫之一，可以对植物造成严重而不可逆的伤害，高温胁迫对植物最直观的伤害就是作物的形态会发生变化，外部形态变化主要体现在作物的种子萌发、植株形态、产量及品质和生殖发育等受到明显的抑制影响，这种影响可能发生在植物生长发育的任何阶段。高温胁迫还会在细胞水平对植物造成的伤害，特别是细胞膜系统会受到严重影响，并导致蛋白质的错误折叠概率增大造成蛋白质聚集体的积累，产生蛋白质毒性，并且植物细胞体内的活性氧(ROS)积累，使得细胞骨架解体。目前大多数研究报道将植物调控高温胁迫的分子机制归为以下几种：信号感知和信号转导途径，转录因子调控途径，ROS清除系统和激素调控途径。

钙离子(Ca²⁺)是保持植物细胞壁完整的必要元素，起到稳固细胞膜和细胞壁的作用，同时还在细胞分裂、微管形成和作物采后生理起到重要作用，Ca²⁺一般储存在植物细胞的液泡、线粒体和内质网等细胞器中，在植物细胞中被证实是参与信号转导的第二信使。钙调蛋白CaM是在真核生物中普遍存在的一种Ca²⁺感受器，也是Ca²⁺-CaM信号转导途径中的重要成员。在植物细胞中CaM是最重要的多功能受体蛋白，它通过参与多种信号分子的活动进而影响植物的抗逆功能等。目前研究表明CaM在植物生长发育和抵抗逆境等方面发挥着重要的作用，具有很高的研究价值。

白魔芋(Amorphophallus albus)是天南星科魔芋属的多年生单子叶草本植物，原产自我国云贵地区，因为白魔芋的地下膨大球茎中的葡甘露聚糖含量丰富，品质好，所以在我国被广泛栽培种植。然而魔芋是起源于热带雨林的底层植物，在长期的驯化栽培中保持了喜荫蔽和温暖湿润，忌高温和强光的栽培环境条件，当栽培环境长期高温时会出现灼伤和热害的症状，甚至倒伏死亡，严重影响魔芋的生长、发育和产量。因此，本发明对白魔芋钙调素AaCaM3基因的序列和转基因功能进行克隆和分析，有助于全面了解AaCaM3基因参与魔芋信号感知和信号转导途径调控高温胁迫的过程，并为魔芋耐热新品种的选育和分子标记的开发提供基因资源。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种白魔芋AaCaM3基因及其编码的蛋白与应用。

首先，本发明提供白魔芋AaCaM3蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的白魔芋AaCaM3蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在培育转基因耐热植物中的应用。

在本发明一个具体实施方案中，将所述的基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使转基因植物在高温胁迫下表现出明显的耐热性。

本发明从白魔芋叶片中得到钙调素AaCaM3基因，其定位于细胞核和细胞质。通过qRT-PCR证实了AaCaM3基因的转录水平在高温处理下会显著提高，AaCaM3基因的表达量会影响植物抗高温胁迫能力，与白魔芋的抗高温胁迫密切相关。利用基因工程的手段构建了AaCaM3基因的植物表达载体，并将其转入野生型拟南芥中，结果显示转基因植株在高温胁迫下表现出明显的耐热性，在高温胁迫下转基因植物的存活率显著高于野生型，对培育抗高温胁迫能力的植株具有重要意义，具有极好的应用前景。

附图说明

图1所示为以白魔芋叶片cDNA为模板的克隆得到的白魔芋钙调素AaCaM3基因CDS的PCR电泳照片。其中M为2K Plus II DNA Marker，1为AaCaM3基因CDS的PCR电泳照片，黑色箭头代表扩增的目的基因所在位置。

图2所示为白魔芋钙调素AaCaM3基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位。GFP：绿色荧光蛋白；mCherry：细胞核定位红色荧光染料Marker；Bright：明场成像；Merge：GFP，mCherry和Bright的合并后的图像。

图3是白魔芋钙调素AaCaM3基因在41℃热胁迫处理0h 1h 8h和24h的白魔芋叶片中的表达量。

图4是AaCaM3基因转基因拟南芥植株的PCR鉴定。

图5所示为转基因拟南芥中AaCaM3基因表达分析。

图6所示为转基因植物与野生型拟南芥在25℃/16h光照，20℃/8h黑暗条件下正常生长未作高温处理的图片。其中WT为野生型拟南芥；L1为转基因拟南芥株系1，L4为转基因拟南芥株系，L5为转基因拟南芥株系5。

图7是转基因植物与野生型拟南芥在41℃热处理1h 8h和24h后在25℃/16h光照，20℃/8h黑暗条件下恢复生长3d后的照片。其中，41℃/1h为41℃热处理1h，41℃/8h为41℃热处理8h；，41℃/24h为41℃热处理24h，以上热处理结束后均在25℃/16h光照，20℃/8h黑暗条件下恢复生长3d，WT为野生型拟南芥；L1为转基因拟南芥株系1，L4为转基因拟南芥株系，L5为转基因拟南芥株系5。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1白魔芋AaCaM3基因cDNA序列的克隆

一、白魔芋叶片总RNA的提取

剪取新鲜的白魔芋幼嫩叶片，快速放入离心管中，放入液氮中速冻后，置于-80℃超低温冰箱中备用。采用RNA提取试剂盒提取白魔芋叶片的总RNA：将-80℃超低温冰箱冷冻保存的白魔芋叶片倒入研钵中并加入液氮，迅速将其研磨成粉末，将样品粉末加入到提前准备好的混有1mL细胞裂解液A和300μLβ-巯基乙醇的1.5mL RNase-Free离心管中，在涡旋振荡器上振荡30s，随后室温条件下静置15min，每3min上下颠倒多次；4℃低温离心机中12,000rpm离心1min后将上清液转移到新的1.5mL RNase-Free离心管中；向管中加入300μL去蛋白液B和200μL三氯甲烷，在涡旋振荡器上振荡30s，使溶液充分混匀呈乳浊状，室温条件下静置2min；4℃低温离心机中12,000rpm离心10min后，此时管中明显分为三层，将上层600-700μL的上清液转移到新的1.5mL RNase-Free离心管时，避免吸取到含有DNA、蛋白质和杂质的中间层和下层有机相；向离心管中加入与上清液等体积的漂洗液C，将颠倒混匀的液体加入到吸附柱中，4℃低温离心机中12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，此步骤重复一次；向吸附柱加500μL洗柱液D，4℃低温离心机中12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，此步骤重复一次；4℃低温离心机中12,000rpm离心3min，开盖挥发5min；配制合适体积的DNA消化液(每个RNA样品需要45μL DNase buffer和5μL RNase-free DnaseΙ的混合液)，配置完成后消化液37℃下预热1min，消化液加入到吸附柱的膜中央，室温放置5min；向吸附柱中加500μL去酶液E，4℃低温离心机中12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，此步骤重复一次；4℃低温离心机中12,000rpm离心3min后弃收集管，将吸附柱放到新的1.5mLRNase-Free离心管中，室温下开盖挥发10min以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇；向吸附柱膜中央加50μL RNA洗脱液F，室温放3min，4℃低温离心机中12,000rpm离心2min，将第一次洗脱液加入到吸附柱中，再重复一次。吸取适量RNA样品，采用1％普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用Nanodrop仪器检测RNA浓度。最后将所得白魔芋叶片的总RNA保存在-80℃超低温冰箱中备份待用。

二、白魔芋叶片cDNA的合成

利用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)合成白魔芋叶片的cDNA：吸取2.0μL 5×gDNA Eraser Buffer，1.0μL gDNA Eraser，5μL Total RNA和2μL RNase-Free ddH2O在冰上配置10μL的基因组DNA去除体系，将混合好的体系离心后置于PCR仪中，反应程序为25℃，5min；PCR结束后在冰面上向基因组DNA去除体系中加入4μL5×PrimeScript Buffer 2，1μL PrimerScript RT Enzyme Mix 1，1μL RT Primer Mix和4μL RNase-Free ddH2O得到总体积为20μL的反转录反应体系，将混合体系离心后置于PCR仪中，反应程序为37℃，15min；85℃，5s。将合成好的白魔芋叶片cDNA放置于-20℃保存备用。

利用已测转录组中白魔芋AaCaM3的mRNA序列，于NCBI数据库中进行Blast比对。采用Primer3 plus设计引物AaCaM3-F(SEQ ID NO.3)：5'-TACAGTTTTTACGTTTCACAATGGT-3'和AaCaM3-R(SEQ ID NO.4)：5'-GAATCGGAACTCACATGGTACT-3'，使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase作为PCR反应用DNA聚合酶进行PCR反应，反应体系如下：

反应程序如下：

PCR反应结束后产物与5μL 10×DNA Loading buffer混匀后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1×TAE电泳缓冲液；110V，25min)检测(图1)。

采用通用型DNA纯化回收试剂盒进行PCR产物回收：吸附柱CB2加收集管，向其加入500μl Buffer BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；将含有单一目的条带的电泳产物于紫外灯下切下后放入1.5mL离心管中，向其加入等体积的Buffer PC，置于55℃300rpm的溶胶仪上使胶块充分溶解；将溶解后所得溶液加入到已柱平衡的吸附柱CB2中，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱CB2中加入600μl Buffer PW，静置5min后12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中，该步骤重复操作一次；12,000rpm离心3min，弃收集管将吸附柱CB2转移到新的1.5mL离心管上，室温下开盖挥发10min以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇；向吸附柱膜中央加30μl的Buffer EB，室温放置2min，室温下12,000rpm离心2min，将第一次洗脱液加入到吸附柱中，再重复一次。

产物回收后，通过pEASY-Blunt Simple Cloning Kit试剂盒将产物连接至pEASY-Blunt Simple载体上：向离心管中加入0.8μL pEASY-Blunt Simple Cloning Kit和4.2μL胶回收产物，将混合好的体系离心后置于连接仪中，连接程序为25℃，20min。

通过热激转化法将混合体系转化至Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞。已转化感受态于37℃、220rpm摇床活化1h后，室温条件下4000rpm，5min后弃300μL上清液，用枪头吸打混匀管底菌体后均匀涂布于含50mg/L卡那霉素溶液(Kana)的LB固体抗性培养基中，并在37℃恒温培养箱中倒置过夜培养。利用灭菌的牙签将单菌落挑入PCR检测体系中，进行阳性单克隆筛选，将电泳检测正确的单克隆用灭菌后的牙签挑取培养基上的单克隆放入LB/Kana液体抗性培养基中，进行测序，其cDNA序列如SEQ ID No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQID No.2所示。

实施例2白魔芋AaCaM3基因的亚细胞定位分析

利用软件BioXM 2.7对AaCaM3基因的CDS序列进行酶切位点分析，并设计包含酶切位点的引物，AaCaM3-1300-F-Xba I(SEQ ID No.5)：5'-GCTCTAGAATGCTGTGTCCACGTA-3'；AaCaM3-1300-R-Kpn I(SEQ ID No.6)：5'-CGGGGTACCCTTGGCCATCATAACT-3'。

以测序正确的AaCaM3-Blunt Simple质粒为模板进行扩增，得到含有Xba I和KpnI酶切位点的已去除终止密码子的AaCaM3基因CDS序列。分别提取目的基因和亚细胞定位载体pCAMBIA1300质粒，用限制性内切酶Xba I和Kpn I分别进行双酶切反应，经1.5％琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用T4 DNA连接酶将双酶切后的目的基因AaCaM3和亚细胞定位载体pCAMBIA1300进行连接，并将重组载体转入Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过化学转化法转入农杆菌LBA4404感受态细胞。

将已转化根癌农杆菌LBA4404感受态的AaCaM3-pCAMBIA1300-GFP和pCAMBIA1300-GFP的保存菌液分别以1：100的比例加入到含50μg/mL kan和20μg/mL Rif的YEB液体培养基中，28℃，220rpm扩繁至OD₆₀₀为0.8-1.6。低温离心机4℃，4000rpm离心10min收集菌体，弃上清培养基后用农杆菌注射渗透缓冲液(10mM MgCl₂、10mM MES-KOH，pH＝5.6，150μM乙酰丁香酮)重悬菌体，调整OD₆₀₀值至0.6-0.8，室温静置2h。选择生长3-4周的健壮本氏烟草叶片，用去针头的1mL无菌注射器吸取农杆菌注射渗透菌悬液，在叶背处避开叶脉，将菌液注入叶片，重复注射操作至叶片被完全注射。注射后保湿暗培养36h-48h，随后取注射部位附近1cm²左右的烟草叶片组织制作玻片，在共聚焦显微镜488nm下进行观察GFP荧光(图2)。结果表明，白魔芋钙调素AaCaM3基因的表达产物定位于细胞核和细胞质中。

实施例3白魔芋AaCaM3基因的表达量分析

分别提取白魔芋叶片在41℃热胁迫处理1h，8h和24h的白魔芋叶片中的总RNA，逆转录成cDNA，将其作为模板(具体方法参见实施例1)。根据白魔芋AaCaM3基因的cDNA序列，利用Primer3 plus在线网站设计实时荧光定量引物AaCaM3-RT-F(SEQ ID No.7):5'-TCTTCGACAAGGACCAGAACG-3'和AaCaM3-RT-R(SEQ ID No.8):5'-AACCTCCTCATCCGTCAACTTC-3'。通过普通PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR。以白魔芋EIF4A基因为内参基因，引物为AaEIF4A-RT-F(SEQ ID No.9)：5'-ACAAGATGAGGAGCAGGG-3'和AaEIF4A-RT-R(SEQ ID NO.10)：5'-GGTGATAAGGACACGAGA-3'。每个反应3个生物学重复，每个生物学重复再进行三次技术重复。PCR反应程序为:95℃预变性5min；95℃30s，56.5℃30s，40个循环；收集溶解曲线。根据得到的Ct值，利用2^-ΔΔCT法，分别计算AaCaM3基因在白魔芋叶片在41℃热胁迫处理1h，8h和24h的表达量(图3)。结果显示：AaCaM3基因在白魔芋叶片的表达量随着热处理时间的增加而增加，表明AaCaM3基因的表达模式变化与热胁迫密切相关。

实施例4白魔芋AaCaM3基因转化拟南芥

一、白魔芋AaCaM3基因的植物转基因载体AaCaM3-pBin35SRed3构建

利用软件BioXM 2.7对AaCaM3基因的CDS序列进行酶切位点分析，并设计两端的酶切位点引物，AaCaM3-pBin35SRed3-F(SEQ ID NO.11)：5'-GCTCTAGAATGCTGTGTCCACGTATT-3'；AaCaM3-pBin35SRed3-R(SEQ ID NO.12)：5'-CCGCTCGAGTCACTTGGCCATCATAAC-3'。以测序正确的AaCaM3-Blunt Simple质粒为模板进行扩增，得到含有Xba I和Xho I酶切位点的AaCaM3基因CDS序列。分别提取目的基因和超表达载体pBin35SRed3质粒，用限制性内切酶Xba I和Xho I分别进行双酶切反应，经1.5％琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用T4 DNA连接酶将双酶切后的目的基因AaCaM3和超表达载体pBin35SRed3进行连接，并将重组载体转入Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液PCR和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过化学转化法转入农杆菌GV3101感受态细胞。

二、转基因表达载体AaCaM3-pBin35SRed3转入野生型拟南芥

将已转化根癌农杆菌GV3101感受态的AaCaM3-pBin35SRed3的保存菌液以1：100的比例加入到含50μg/mL kan和60μg/mL Rif的50mL YEB液体培养基中，在28℃，220rpm摇床中扩繁至OD₆₀₀为1.2-1.6左右；将生长4-5周的已长出花序的野生型拟南芥，剪去已结成的果荚后给底盘浇足水后等待侵染；低温离心机4℃，6000rpm离心10min后弃上清培养基，收集管底菌体，用1/2的MS液体培养基(100ml含5g蔗糖)的重悬液重悬菌体，调整OD₆₀₀值至0.6-0.8左右；将重悬液倒入培养皿中，向重悬液中加入20μL的Silwet L-77，混合均匀后将拟南芥花序浸入重悬液侵染60s；侵染后的拟南芥保湿暗培养24h后进行正常的光培养，每隔5-7d后根据花序生长状况重复进行侵染，共进行三次。

三、白魔芋AaCaM3基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定

等待转AaCaM3基因的拟南芥自然干枯后，收集果荚，将收集到的成熟种子，挑选出在手持式LUYOR-3415RG激发光源下发红光的种子；将挑选出的转基因拟南芥种子单株种植到到混合有泥炭土，蛭石和珍珠岩的培养钵内，比例为4：1：1中，置于人工气候室中进行培养。

待转基因植株抽薹后剪取叶片，提取DNA：使用DNA快速释放法提取植物DNA，取适量幼嫩叶片加入含有30μL TPS buffer的1.5mL离心管中，将叶片捣碎后放于冰上；沸水浴15min，冰上静置2min；加入270μL双蒸水，摇晃后12000rpm离心2min；保存于-20℃冰箱备用。

以野生型拟南芥的DNA作为对照，使用载体引物pBin35SRed3-F和载体构建AaCaM3-pBin35SRed3-R对转基因拟南芥的阳性植株DNA进行PCR筛选。PCR扩增程序：94℃1min30s；94℃20s，58℃20s，72℃45s，进行34个循环；72℃5min；4℃保存。反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中检测(图4)，结果显示共获得8株含有AaCaM3基因的阳性转基因拟南芥植株。

以野生型拟南芥的cDNA为模板，使用实时荧光定量引物AaCaM3-RT-F(SEQ IDNO.7):5'-TCTTCGACAAGGACCAGAACG-3和AaCaM3-RT-R(SEQ ID NO.8):5'-AACCTCCTCATCCGTCAACTTC-3'，和内参基因拟南芥AtTUB2-qPCR-F(SEQ ID NO.13)：5'-ATCCGTGAAGAGTACCCAGAT-3'；AtTUB2-qPCR-R(SEQ ID NO.14)：5'-AAGAACCATGCACTCATCAGC-3'作为对照。对转基因拟南芥的阳性植株进行AaCaM3基因的表达量进行分析，共获得了4个转基因株系(图5)。

对L1，L4和L5这3个转基因株系中，进行耐热胁迫的表型鉴定，对这些拟南芥的热处理后存活率表型进行观察和拍照：向收集到的转基因拟南芥植株的种子与野生型拟南芥种子的离心管中加入1ml70％的无水乙醇后，每20s时上下颠倒5-8次，1min后弃无水乙醇；向离心管中加入1ml10％的次氯酸钠溶液，每3min上下颠倒5-8次，10min后弃无水乙醇；用ddH₂O冲洗5次后将转基因种子和野生型种子分区域播种于同一方形培养皿中，封口膜密封后先置于4℃下低温春化2d后放入人工气候培养箱中，培养条件为23℃/16h光照，20℃/8h黑暗。14d后根据拟南芥生长情况，将人工气候培养箱的温度改为41℃后根据前期计划分别在处理1h，6h和12h后将相应的培养皿取出，在23℃/16h光照，20℃/8h黑暗条件下恢复生长3d后，观察拟南芥的存活率。结果显示：在41℃下处理1h后转基因和野生型拟南芥幼苗几乎没有受到影响，植株存活率相差不大；41℃下处理6h后转基因和野生型幼苗之间开始出现差别，二者都开始出现一定数量的枯萎和死亡，但转基因植株的存活率显著高于野生型；41℃下处理12h后，转基因及野生型幼苗均大量枯萎死亡，但转基因植株的存活率均大于60％，显著高于野生型，转基因植株的存活率均显著高于未转基因的野生型拟南芥(图6-7，表1)。

表1野生型和转基因拟南芥热处理后存活率统计表

结果表明：AaCaM3基因可以增强拟南芥的耐热性，AaCaM3基因的转基因拟南芥材料可用于植物耐热性的改造，进而提高植物的耐热性，有利于抗高温胁迫能力的品种选育。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.白魔芋AaCaM3蛋白，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的白魔芋AaCaM3蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在培育转基因耐热拟南芥中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因转入拟南芥基因组中，并在转基因拟南芥中超量表达，使转基因拟南芥在高温胁迫下表现出明显的耐热性。

8.一种转基因拟南芥的构建方法，将含有权利要求2或3所述基因转入拟南芥基因组中，筛选获得转基因拟南芥。

9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因拟南芥与野生型相比，其在高温胁迫下存活率更高，表现出明显的耐热性。