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CN116615464A - Itpripl1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途 - Google Patents

Itpripl1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途 Download PDF

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CN116615464A
CN116615464A CN202180073521.8A CN202180073521A CN116615464A CN 116615464 A CN116615464 A CN 116615464A CN 202180073521 A CN202180073521 A CN 202180073521A CN 116615464 A CN116615464 A CN 116615464A
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CN
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itpripl1
protein
antibody
cells
seq
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CN202180073521.8A
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许杰
邓守言
宋腾
王一婷
王运刚
王焕彬
池浩
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Shanghai Baiquan Biotechnology Co ltd
Fudan University
Original Assignee
Shanghai Baiquan Biotechnology Co ltd
Fudan University
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Abstract

提供了ITPRIPLl的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，所述的调节剂用于提高或降低机体的ITPRIPLl基因或蛋白的表达或功能。还提供了一种药物组合物，其包含所述的用途中采用的调节剂。还公开了一种分离的ITPRIPLl重组蛋白，以及一种识别并结合ITPRIPLl的抗体。基于ITPRIPLl蛋白结合CD3ε与NRP2受体调节不同免疫细胞功能，进而参与免疫反应的调节和肿瘤的免疫逃逸过程的原理，证实ITPRIPLl的调节剂可用于制备药物或药物组合物，可应用在抑制肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反应、过敏和感染等疾病。

Description

ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途
本申请要求于2020年10月30日提交中国专利局、申请号为202011191447.3、申请名称为“ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途”，以及于2021年5月24日提交中国专利局、申请号为202110566040.2、申请名称为“分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白及其用途”这两项中国专利申请的优先权，其内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途。
背景技术
ITPRIPL1编码蛋白为Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-interacting protein-like 1(肌醇1,4,5-三磷酸受体相互作用蛋白样1)，既往未见到关于ITPRIPL1功能的报道。根据UniProtKB数据库的注释，人类的ITPRIPL1包括555个氨基酸，分为胞外区(1-103氨基酸)、跨膜区(104-124氨基酸)、胞内区(125-555氨基酸)。
T细胞是适应性免疫反应的关键效应细胞，在消除病原体和自身免疫性疾病中具有许多重要作用。T细胞有几个亚群，每个亚群具有不同的功能。在T细胞表面上发现的TCR(T细胞受体)是由α和β多肽链组成的异二聚体，构成大约95％的TCR群体，或者是γ和δ多肽链(Pitcher和van Oers，2003年)。每种多肽均包含恒定(C)和可变(V)区域。恒定区锚定在细胞膜中，而可变区在细胞外延伸并负责结合抗原。TCR的细胞质短尾缺乏转导信号的能力。细胞内信号传导由CD3蛋白复合物启动，该复合物包含细胞内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
CD3(分化簇3)T细胞共受体是一种蛋白质复合物，由四个不同的链组成。在哺乳动物中，复合物包含一条CD3γ(γ)链，一条CD3δ(δ)链和两条CD3ε(ε)链。这些链与TCR和δ链(zeta链)相关，在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR，δ链和CD3分子一起构成TCR复合物。CD3γ，CD3δ和CD3ε链是包含单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。TCR不能结合游离的表位/抗原，相反，TCR会结合酶切的与主要组织相容性复合物(MHC)相关的较大多肽的片段，这与人的人类白细胞抗原(HLA)系统同义。这种相互作用发生在被称为免疫突触的空间中。I类MHC分子在人体所有有核细胞上表达，并向细胞毒性T细胞呈递抗原，这些细胞毒性T细胞上的CD8稳定MHC/TCR相互作用。细胞毒性T细胞的活化随后导致靶细胞的破坏。在巨噬细胞，B细胞和树突状细胞上发现II类MHC。这些免疫细胞将抗原呈递给辅助性T细胞，并带有稳定MHC/TCR相互作用的CD4。MHC II类和TCR之间的相互作用最终导致抗体介导的免疫反应。其他共刺激分子，例如CD45，CD28和CD2有助于免疫突触中的T细胞活化并启动TCR信号体的形成，TCR信号体是负责细胞内信号传导的大分子蛋白质复合物。
结合人CD3ε的几种抗体曾被报道，例如抗体OKT3(参见例如Kung，P.等人，Science 206(1979)347-349；Salmeron，A.等人，J Immunol 147(1991)3047-3052)，抗体UCHT1(参见例如Callard，RE等，Clin Exp Immunol 43(1981)497-505)或抗体SP34(参见例如Pessano，S。等，EMBO J 4(1985)337-344)。目前已知的抗体中SP34是人食蟹猕猴交叉反应性的(Conrad M.L.等人，Cytometry A 71(2007)925-933)。既往已知直接结合CD3ε胞外区的蛋白质都是抗体类分子，并未见到过天然的非抗体类蛋白(例如跨膜蛋白、分泌型蛋白等典型配体)结合CD3ε胞外区的报道。
神经纤毛蛋白-2即NRP-2(neuropilin-2)是一种可调节免疫细胞功能的受体(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2018)，被报道调控抗原递呈细胞的功能，并促进肿瘤的免疫逃逸(Sohini Roy等，Cancer Res.2018)；NRP2可影响免疫细胞的迁移、吞噬功能，以及免疫细胞间的接触(S Schellenburg等，Mol Immunol.2017)。NRP2和Plexin形成的共受体对淋巴管内皮细胞的迁移具有反趋化作用(Liu X等，Cell Rep.2016)。NRP2还可调控细胞的NFKB信号通路，见(Rizzolio,S.等.Cancer Research.2017)等报道。既往已经被发现的NRP2配体包括Semaphorin家族成员，但其它类型的配体未见报道。
发明内容
本申请的目的是提供一种调节免疫反应和抑制肿瘤的方法，以及ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途。
为了达到上述目的，本申请提供了ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，所述的调节剂用于提高或降低机体的ITPRIPL1基因或蛋白的表达或功能。
优选地，所述的调节剂包含以下任意一种：
(1)使细胞内ITPRIPL1基因被敲除或突变的基因编辑系统；
(2)降低ITPRIPL1基因表达水平的RNA分子；
(3)用于导入细胞内的核酸分子，所述核酸分子编码ITPRIPL1并提高ITPRIPL1的表达量；
(4)分离的ITPRIPL1重组蛋白；
(5)识别并结合ITPRIPL1的抗体。
优选地，所述的基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统；用于所述CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶序列选自SEQ ID NO:11-13所示的任意一条序列，用于编码sgRNA的寡聚DNA序列选自SEQ ID NO:14-19；
所述的核酸分子包含：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的序列；
所述的ITPRIPL1重组蛋白包含：ITPRIPL1蛋白胞外区中能够结合CD3ε或NRP2蛋白的功能片段；
所述的识别并结合ITPRIPL1的抗体为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗原结合结构域、双特异性抗体、多特异性抗体，或嵌合抗原受体中的抗原结合部。
优选地，所述的功能片段的序列选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中任意一条，或为其衍生序列，所述衍生序列包括DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRxLEMEFEERxxxAExxQKxENxWxGxTSxDQ(”x”为任意氨基酸)，所述的衍生方法包括：将一个以上的氨基酸进行替换、删除或插入但并未改变序 列的功能。
优选地，所述的ITPRIPL1重组蛋白与抗体恒定区形成融合蛋白(如SEQ ID NOs:5-7所示)或与凝血因子形成融合蛋白；或者，对所述的ITPRIPL1重组蛋白进行修饰，修饰的方式包括：聚乙二醇修饰、糖基化修饰、多聚唾液酸修饰、脂肪酸修饰、KLH修饰、生物素修饰。
优选地，通过药物传递系统将所述的核酸分子导入细胞内，所述的药物传递系统包括：重组表达载体、病毒、脂质体或纳米材料。
优选地，所述的调节免疫反应包括：在自身免疫反应、抑制移植排斥免疫反应、过敏反应、抗感染免疫反应、抗肿瘤免疫反应的过程中，抗原递呈细胞和T淋巴细胞的功能的调节。
优选地，所述的免疫反应包括：I型糖尿病、免疫性不孕不育、器官移植后排斥反应、过敏反应、全身炎症或细胞因子风暴、感染。
优选地，所述的肿瘤为实体瘤或血液系统肿瘤；所述的实体瘤包括：胶质瘤、肺癌、头颈部癌、胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、食管癌、尿路上皮癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌，黑色素瘤、胰腺癌或肝癌；所述的血液系统肿瘤包括：白血病或淋巴瘤。
本申请还提供了一种药物组合物，其包含上述的用途中采用的调节剂，以及药学上可接受的载体。
本申请还提供了一种分离的ITPRIPL1重组蛋白，所述的重组蛋白为ITPRIPL1蛋白胞外区中能够结合CD3ε或NRP2蛋白的功能片段。
本申请还提供了一种识别并结合ITPRIPL1的抗体，所述的抗体识别并结合ITPRIPL1蛋白的胞外区。
本申请还提供了分离的ITPRIPL1重组蛋白的应用，其用于检测自身抗ITPRIPL1抗体的存在，其中检测的主要步骤包括将所述的ITPRIPL1重组蛋白与受试者的血液样本直接接触，以及洗涤去除非特异性结合。
本申请还提供了上述的抗体用于检测ITPRIPL1在样本中的含量的应用，识别并结合ITPRIPL1的抗体用于判断细胞、组织、器官或个体内ITPRIPL1的表达，或用于判断是否适合施用本申请的通过靶向ITPRIPL1调节免疫反应和抑制肿瘤的方法。在某些实施方式中，特异性识别ITPRIPL1的抗体在标记原发灶内癌症组织和癌旁组织的边界、转移至淋巴结的癌细胞与正常淋巴组织的边界、发生远处转移的癌细胞与转移器官的正常组织的边界，以及在其它生物样本中标记癌症组织活细胞的应用。
本申请提供了一种分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物以及检测ITPRIPL1在个体内表达中的用途，所述分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白能够与抗原ITPRIPL1中如SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列结合。
在某些实施方式中，包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:34中任一项所示的重链可变区VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:35中任一项所示的轻链可变区VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，氨基酸序列SEQ ID NO:24中的重链可变区VH中的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述HCDR3的氨基 酸序列如SEQ ID NO:28所示。
在某些实施方式中，氨基酸序列SEQ ID NO:34中的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在某些实施方式中，氨基酸序列SEQ ID NO:25中的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述LCDR2的氨基酸序列为KV，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，或与SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的相似性超过80％。
在某些实施方式中，氨基酸序列SEQ ID NO:35中的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述LCDR2的氨基酸序列为KV，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。
在某些实施方式中，所述重链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:24所示的重链可变区VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:25所示的轻链可变区VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，所述重链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:34所示的重链可变区VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:35所示的轻链可变区VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区源自人IgG重链恒定区。
在某些实施方式中，其包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区。
在某些实施方式中，其包含抗体重链HC，且所述HC包含SEQ ID NO:22或32中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包含抗体轻链LC，且所述LC包含SEQ ID NO:23或33中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv和/或di-scFv。
在某些实施方式中，所述ITPRIPL1蛋白包含人ITPRIPL1或食蟹猴、大鼠、小鼠、大猩猩、绿猴、金色塌鼻子猴、黑色塌鼻子猴、亚马逊松鼠猴的ITPRIPL1蛋白。
在某些实施方式中，所述人ITPRIPL1蛋白包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请还提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白。
另一方面，本申请还提供了免疫耦联物，其包含本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白。
另一方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白或所述的嵌合抗原受体。
另一方面，本申请还提供了载体，其包含本申请中所述的核酸分子。
另一方面，本申请还提供了细胞，其包含本申请中所述的核酸分子或所述的载体。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫耦联物，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请还提供了制备本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白的方法，所述方法包括在使得本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白表达的条件下，培养本申请所述的细胞。
另一方面，本申请还提供了本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫耦联物、和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤以及淋巴瘤。
另一方面，本申请还提供了一种可用于高效率地筛选和制备ITPRIPL1功能调节抗体的线性表位多肽，其特征在于，所述肽包含：(ⅰ)氨基酸序列为SEQ ID NO:49，即RLLEMEFEERKRAAE；(ⅱ)或氨基酸序列为或xxLxxxFxxRxxx(x为任意氨基酸)，位于两端的1-3个氨基酸可被缺失；(iii)或SEQ ID NO:49的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸被替换、插入或缺失所得到的氨基酸序列。
上述的线性表位肽具有多方面的突出优势：其可以用较低成本的进行合成制备，通过分析该表位肽结合的能力来判定ITPRIPL1特异性抗体的功能，具有操作简便和检测结果稳定可靠的优势；线性表位肽可以直接作为免疫原注射动物或进行筛选，从而比使用全长蛋白能够获得更多的有效功能抗体，显著提高相关药物的发现效率。
本申请还提供了一种用于发现和鉴定ITPRIPL1功能调节剂的方法，其特征在于，检测受试分子的以下一种或多种性质：特异性结合细胞表面表达的ITPRIPL1的能力；对ITPRIPL1与CD3ε结合的影响；对ITPRIPL1与NRP2结合的影响；对ITPRIPL1与SEMA3G结合的影响；对ITPRIPL1与EBI2结合的影响；对免疫细胞或肿瘤细胞功能的影响。
本申请创造性地开发了可以结合ITPRIPL1靶向性抗体，能够以高亲和力结合上述靶蛋白并且中和其功能，抑制其与一个或多个配体的结合，从而达到解除肿瘤细胞免疫逃逸功能的作用，促进免疫细胞在体内外对肿瘤细胞的杀伤；本申请提供的抗体可作为有效成分制备用于治疗肿瘤的药物，为肿瘤的治疗提够了新的有效方案。同时本发明还提供了具有优良中和功能的抗体对应的线性表位、施用抗体的生物标志物。
以下将结合附图对本申请的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本申请的目的、特征和效果。
相对于现有技术，本申请具有以下有益效果：
本申请公开了一种调节免疫反应和抑制肿瘤的方法，通过调控ITPRIPL1基因的表达或功能实现上述目的。本申请基于新的科学发现，即ITPRIPL1结合CD3ε等蛋白从而调节不同免疫细胞的功能，进而参与免疫反应的调节和肿瘤的免疫逃逸过程。本申请证实ITPRIPL1的调节剂可用于制备药物或药物组合物，在抑制肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反应、过敏和感染等疾病方面具有应用前景。
附图说明
图1为实施例1的质粒构建结果；
图2为实施例1的免疫共沉淀实验结果；
图3为实施例1的外源表达的ITPRIPL1与CD3E在细胞内共定位的结果图；
图4为实施例2的表达ITPRIPL1胞外区受体结合结构域的表达载体构建结果；
图5为实施例2的免疫共沉淀实验结果；
图6示出实施例2的免疫荧光及共定位分析ITPRIPL1胞外区和CD3胞外区具有反式结合的实验结果；
图7为实施例3的ITPRIPL1-RBD重组蛋白(IT1-RBD蛋白)凝胶电泳后考马斯亮蓝染色结果(注：ITPRIPL1＝IT1，下同)；
图8为实施例4的ELISA实验结果；
图9和图10为实施例5中流式细胞术证明ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段结合高表达CD3的Jurkat细胞的结果图，其中，图9的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定，图9的(b)反映Jurkat细胞与不同浓度的ITPRIPL1胞外区纯化蛋白片段的结合情况。图10则为图9的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况；
图11和图12为实施例5中流式细胞术证明ITPRIPL1蛋白以更高的效率结合过表达CD3的细胞的结果图，其中，图11的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定，图11的(b)反映CD3ε表达情况不同的细胞与不同浓度ITPRIPL1重组蛋白的结合情况。图12则为图11的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况；
图13和图14为实施例5中流式细胞术证明CD3以更高效率结合过表达ITPRIPL1的细胞的结果图，其中，图13的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定，图13的(b)反映ITPRIPL1表达情况不同的细胞与CD3ε蛋白的结合情况。图14则分别为图13的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况；
图15为实施例5中50微克每毫升ConA激活的条件下，随ITPRIPL1蛋白浓度变化的NFKB信号变化的结果图；
图16为实施例5中50微克每毫升ConA激活的条件下，随微球包被ITPRIPL1蛋白浓度变化的NFKB信号变化的结果图；
图17为免疫印迹法中GAPDH内参调齐后的不同类型的肿瘤细胞的ITPRIPL1的表达情况；
图18示出ITPRIPL1在正常组织、肿瘤组织中的mRNA表达水平；
图19为实施例6中酶联免疫吸附剂测定证明多克隆抗体能与表达ITPRIPL1的细胞结合的结果图；
图20为实施例6中酶联免疫吸附剂测定证明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与CD3E结合的结果图；
图21和图22为实施例6中流式细胞术证明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与过表达CD3ε的细胞的结合的结果图，其中，图21的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图21的(b)反映多克隆抗体浓度变化时ITPRIPL1与CD3ε结合情况变化。图22则为图21的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况；
图23为实施例7中萤光素报告实验证明过表达ITPRIPL1的HCT116细胞能更多地降低Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号的结果图；
图24为实施例7中萤光素报告实验证明CD3E蛋白可以阻断ITPRIPL1蛋白对Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号的抑制的结果图；
图25和图26为实施例8中流式细胞术证明ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤的结果图，其中，图25的(a)和(b)表示依据CD45来划分293E细胞。图25的(c)为不同ITPRIPL1蛋白浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图26为图25的(c)中各条件下具体凋亡染色情况；
图27和图28为实施例9中流式细胞术证明ITPRIPL1过表达能降低PBMC对于肿瘤细胞的杀伤而敲除ITPRIPL1能促进PBMC对于肿瘤细胞的杀伤的结果图，其中，图27的(a)和(b)表示依据CD45来划分HCT116细胞。图27的(c)为不同多克隆抗体浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图28为图27的(c)中各条件下具体凋亡染色情况；
图29和图30为实施例10中流式细胞术证明ITPRIPL1多克隆抗体能促进PBMC对于肿瘤细胞的杀伤的结果图。图29的(a)和(b)表示依据CD45来划分HCT116细胞。图29的(c)为不同多克隆抗体浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图30为图29的(c)中各条件下具体凋亡染色情况；
图31为实施例11的免疫共沉淀实验结果；
图32为实施例12的酶联免疫吸附实验结果图；
图33和图34为实施例12的流式细胞术证明NRP2以更高效率结合过表达ITPRIPL1的细胞的实验结果。其中，图33的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图33的(b)反映ITPRIPL1表达情况不同的细胞与NRP2蛋白的结合情况，图34则分别为图33的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况；
图35为实施例13的萤光素报告实验结果；
图36为实施例14的萤光素报告实验结果；
图37和图38为实施例14中的流式细胞术证明纯化得到的IT1-RBD1-Fc重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤的结果图，其中，图37的(a)表示依据CD45来划分293E细胞。图37的(b)为不同ITPRIPL1表达与不同蛋白条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性，图38为图37的(b)中各条件下具体凋亡染色情况；
图39为实施例14的免疫印迹法实验结果；
图40为实施例5中OCTET分子互作证明ITPRIPL1蛋白能直接与CD3E蛋白相结合；
图41为实施例14中CD3ε蛋白阻断ITPRIPL1-RBD-Fc重组蛋白对磷酸化通路影响的免疫印迹法实验结果；
图42为实施例15中Jurkat的CD3突变体对磷酸化通路影响的免疫印迹法实验结果；
图43为实施例15中ITPRIPL1-RBD-Fc重组蛋白对Jurkat细胞内钙离子流的免疫荧光实验结果；
图44为实施例15中Jurkat的CD3突变体对ITPRIPL1-RBD-Fc重组蛋白细胞内钙离子影响不同应答的免疫荧光实验结果；
图45为实施例16中ITPRIPL1-RBD-Fc重组蛋白增加CD3与Nck结合的免疫印迹法实验结果；
图46为实施例16中ITPRIPL1-RBD-Fc重组蛋白增加CD3与Nck结合的邻近连接实验结果；
图47为实施例17中人源化CD3ε小鼠MC38皮下移植瘤模型的肿瘤体积的监测与肿瘤重量测量的实验结果；
图48为实施例17中人源化CD3ε小鼠MC38皮下移植瘤模型处死取材后取PBMC进行T细胞相关免疫调控点分析的流式细胞术实验结果；
图49为实施例17中人源化CD3ε小鼠MC38皮下移植瘤模型的肿瘤组织的免疫组化结果；
图50为实施例17中ITPRIPL1敲除与野生型小鼠的PBMC进行T细胞相关免疫调控点分析的流式细胞术实验结果；
图51为实施例17中ITPRIPL1敲除与野生型小鼠的PBMC中分泌型细胞因子进行ELISA分析实验结果；
图52为实施例17中ITPRIPL1敲除与野生型小鼠的睾丸组织T细胞免疫组化染色结果，以及精子形态和活力分析结果；
图53为实施例18中ITPRIPL1在肿瘤和正常组织中表达的分析结果；
图54显示了实施例14中所述的ITPRIPL1序列和功能注释，条形图为不同种属的结合情况；
图55为ITPRIPL1抗体对肿瘤组织和正常组织的标记与区分作用；
图56为ITPRIPL1抗体对发生了远处转移的肿瘤细胞的特异性标记和区分作用；
图57显示的是本申请中鼠杂交瘤抗体与ITPRIPL1结合的结果图，其中，图57A为1微克每毫升的100株杂交瘤抗体与1微克每毫升ITPRIPL1反应的ELISA结果图，图57B为1微克每毫升的挑选出的9株杂交瘤抗体与1微克每毫升ITPRIPL1反应的ELISA结果图。图57C为13B7抗体与ITPRIPL1的结合曲线图；
图58显示的是本申请中流式细胞分析技术检测各鼠杂交瘤抗体与内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞结合情况的结果图，其中，图58A为Jurkat细胞圈门设定，图58B为各杂交瘤抗体结合率统计结果，图58C-58L为不同的杂交瘤抗体2E7、5E5、13B7、13F7、15C9、16E1、18B12、18G5、19B11及20E3与Jurkat细胞结合的流式细胞分析结果；
图59显示的是本申请中流式细胞分析技术检测鼠杂交瘤13B7抗体与表达ITPRIPL1的多种肿瘤细胞的结合结果图，其中，图59A为HCT116未加入抗体对照，图59B为HCT116加入抗体组，图59C为A549未加入抗体对照，图59D为A549加入抗体组，图59E为MC38未加入抗体对照，图59F为MC38加入抗体组，图59G为MC38-ITPRIPL1稳转株未加入抗体对照，图59H为MC38-ITPRIPL1稳转株加入抗体组，图59I为Jurkat未加入抗体对照，图59J为Jurkat加入抗体组，图59K为Raji未加入抗体对照，图59L为Raji加入抗体组，图59M为13B7抗体与表达ITPRIPL1的不同肿瘤细胞结合率的统计结果图；
图60显示的是本申请中流式细胞分析技术检测不同浓度的鼠杂交瘤13B7抗体与内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞的结合结果图，其中，图60A为圈门设定，图60B为阴性对照，图60C-图60H分别为0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的13B7抗体结合时的结合率，图60I为各组结合率的数据统计结果；
图61显示的是本申请中免疫蛋白印迹法分析13B7抗体与ITPRIPL1的结合结果图，其中，用内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞、内源性表达ITPRIPL1的HCT116细胞与不表达ITPRIPL1的MC38细胞进行Western Blot实验，用13B7抗体进行孵育；
图62显示的是本申请中不同鼠杂交瘤抗体阻断ITPRIPL1与不同蛋白结合的结果图，其中，图62A显示的不同鼠杂交瘤抗体阻断ITPRIPL1与CD3E结合的结果图，图62B显示的不同鼠杂交瘤抗体阻断ITPRIPL1与SEMA3G结合的结果图；
图63显示的是本申请中鼠杂交瘤单克隆抗体与ITPRIPL1结合的ELISA结果图；
图64显示的是本申请中流式细胞分析技术检测不同鼠杂交瘤单克隆抗体与内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞结合的结果图；
图65显示的是本申请中不同鼠杂交瘤单克隆抗体阻断ITPRIPL1与不同蛋白结合的统计结果图以及两种抗体的序列比较，其中，图65A显示的是不同鼠杂交瘤单克隆抗体阻断ITPRIPL1与CD3E结合的结果图，图65B显示的是不同鼠杂交瘤抗体阻断ITPRIPL1与SEMA3G结合的统计图，图65C显示了两种抗体序列的比较分析；
图66显示的是本申请中ITPRIPL1抗原结合区域鉴定结果图。其中，图66A-66M依次为抗体18B12、18B12D1A6、13B7、13B7A6H3、16E1、18G5、20E3、16E1D8H1、5E5、2E7、19B7、13F7、18G5F3F4与来自ITPRIPL1蛋白的不同肽段结合的统计结果图；
图67显示的是本申请中不同鼠杂交瘤单克隆抗体促进PBMC对内源性高表达ITPRIPL1的Raji细胞杀伤的细胞流式分析检测结果图，其中，图67A-B为圈门设定，图67C为Raji细胞自身凋亡对照，图67D为加入PBMC与阴性血清的杀伤情况，图67E-图67N分别为加入PBMC时加入0.5微克每毫升的13B7A6H3单克隆抗体、2微克每毫升的13B7A6H3单克隆抗体、0.5微克每毫升的16E1D8C4单克隆抗体、2微克每毫升的16E1D8C4单克隆抗体、0.5微克每毫升的18G5F3E5单克隆抗体、2微克每毫升的18G5F3E5单克隆抗体、0.5微克每毫升的18B12D1单克隆抗体、2微克每毫升的18B12D1单克隆抗体、0.5微克每毫升的18B12D1A6单克隆抗体、2微克每毫升的18B12D1A6单克隆抗体的检测结果；
图68显示的是本申请中不同鼠杂交瘤单克隆抗体促进PBMC对内源性高表达ITPRIPL1的Raji细胞杀伤的细胞流式分析检测结果统计图；
图69显示的是本申请中P8多肽段进行不同的点突变后与13B7A6H3单克隆抗体进行结合的ELISA实验结果；
图70显示的是本申请中利用表位作图法的实验结果与对应抗体分群分析；
图71显示的是小鼠MC38-ITPRIPL1过表达皮下移植瘤模型使用结合ITPRIPL1-RBD的单克隆抗体进行治疗的肿瘤体积与质量改变的实验结果；
图72显示的是小鼠MC38-ITPRIPL1过表达皮下移植瘤模型使用结合ITPRIPL1-RBD的单克隆抗体进行治疗的外周血PBMC进行流式分析的实验结果；
图73显示的是小鼠MC38-ITPRIPL1过表达皮下移植瘤模型使用结合ITPRIPL1-RBD的单克隆抗体进行治疗的肿瘤组织免疫组化染色结果；
图74显示的是人源化抗体与P8多肽结合的ELISA实验结果；
图75显示的是食蟹猴ITPRIPL1-P8对应多肽与13B7A6H3单克隆抗体结合的ELISA实验结果。
具体实施方式
虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方式。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方式。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非特别说明，否则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方式。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方式，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方式组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方式能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，如在本文中的短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
术语“例如”和“即”仅作为实例使用，而无意于限制，并且不应当诠释为仅涉及在说明书中明确列举的那些项目。
术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如“至少一种”应当理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。
相反地，术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、 76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应当理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。
术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
术语“衍生”、“突变”指核酸或氨基酸序列经过替换、删除、插入等变化形成新的序列，新序列所组成的组中的氨基酸序列或与组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性；
如文本所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，本发明涉及的部分术语进行解释：
术语“免疫反应”是指机体对于异己成分或者变异的自体成分做出的防御反应；
术语“肿瘤”是指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变；
术语“基因编辑系统”是指对目标基因进行编辑，具体通过对特定DNA片段的敲除、插入、突变等手段得到的基因序列。
术语“sgRNA”是向导RNA，在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体中，属于一种小型非编码RNA；
术语“抗体恒定区”是指抗体分子C端氨基酸相对稳定的区域，具有许多重要的生物学功能；
术语“凝血因子”是指参与血液凝固过程的各种蛋白质组分；
术语“抗原递呈细胞”是机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，诱发T、B细胞发生免疫应答作用的细胞，主要包括巨噬细胞、树突状细胞以及B细胞等；
术语“自身免疫疾病”是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害的疾病；
术语“移植排斥反应”是指受者进行同种异体组织或器官移植后，外来的组织或器官等移植物作为一种“异己成分”被受者免疫系统识别，后者发起针对移植物的攻击、破坏和清除的免疫学反应；
术语“过敏反应”是指已产生免疫的机体在再次接受相同抗原刺激时所发生的组织损伤或功能紊乱的反应；
术语“感染”是指细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应；
术语“中和抗体”是当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体。病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞；
术语“阻断性抗体”与细胞表面分子作用位点结合，主要起到阻断受体和配体结合的作用；
术语“酶联免疫吸附试验”是利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析；
术语“流式细胞术”用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析；
术语“信号通路”是指当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根据这种信息来做出反应的现象；
术语“免疫逃逸”是指免疫抑制病原体通过其结构和非结构产物，拮抗、阻断和抑制机体的免疫应答。
术语“修饰”是指通过化学链接的方法，对多肽或蛋白质进行链接其它化合物或功能基团，例如抗体恒定区(Fc)、聚乙二醇修饰、糖基化修饰、多聚唾液酸修饰、脂肪酸修饰、KLH修饰、生物素修饰等。
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的或者人工合成的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)包括但不限于，特异性结合抗原的糖蛋白免疫球蛋白。通常，抗体可以包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合分子。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域，CL。VH和VL区域可以进一步细分为高变的区域，称为互补决定区(CDR)，散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。Ab的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
轻链可变区和重链可变区分别包含间插有三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)的“构架”区。“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)，是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”) 的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。
然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。例如，对使用Kabat和Chothia编号的CDR区域在不同指派系统定义下的残基范围如下表A所示。
表A.不同指派系统定义下的CDR残基范围
因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
本发明抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
抗体可以包括例如，单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、工程化抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、抗体融合物(本文有时称为“抗体缀合物”)、异缀合抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼源化抗体、亲和体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，抗-抗Id抗体)、微抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有 时称为“抗体模拟物”)和以上任何的抗原结合片段。
术语“人源化抗体”意图指将源自另一哺乳动物物种，诸如小鼠种系的CDR序列嫁接到人框架序列上获得的抗体。可以在人框架序列中进行别的框架区修饰。
如本文所用，“抗原结合分子”、“抗原结合片段”或“抗体片段”是指包含从该分子所源于的抗体的抗原结合片段(例如，CDR)的任何分子。抗原结合分子可以包括抗原互补决定区(CDR)。抗体片段的实例包括但不限于，从抗原结合分子形成的Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、dAb、线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。在一些实施方式中，抗原结合分子结合ITPRIPL1蛋白，在一些实施方式中，抗原结合分子具有中和活性，能够抑制ITPRIPL1与受体CD3E或EBI2结合。
术语“嵌合抗原受体”即Chimeric Antigen Receptor(CAR),包含胞外结构域、跨膜结构域和可能的胞内结构域，胞外结构域由识别并结合特定抗原的蛋白结构域构成。嵌合抗原受体可表达在免疫细胞并调节其与靶细胞相互作用的能力。
术语“免疫耦联物”可包括抗体免疫耦联物(即抗体药物偶联物，antibody-drug conjugate，ADC)，是通过化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到抗体上；类似地，免疫耦联物还包括蛋白药物耦联物、核酸药物耦连物。
如本文所用，术语“抗原”是指引发免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可以牵涉抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或这两者。本领域技术人员将容易理解任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)均可以充当抗原。抗原可以内源性表达，即由基因组DNA表达或可以重组表达。抗原可以对某些组织，例如癌细胞具有特异性或者其可以广泛地表达。此外，较大分子的片段可以起抗原作用。在一些实施方式中，抗原为ITPRIPL1蛋白抗原。
如本文所用，在一些实施方式中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段直接阻断配体上的结合位点或者通过间接方式(如配体的结构或能量改变)改变配体的结合能力。在一些实施方式中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段防止与其结合的蛋白质行使生物学功能。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用并且是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽含有至少两个氨基酸并且可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中也通常称为例如肽、寡肽和寡聚体)和较长的链(其在本领域中通常称为蛋白质，其具有许多类型)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然的肽、重组的肽、合成的肽或其组合。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合至”是指两个分子之间例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。
如本文所用，“抑制结合”、“阻断结合”或“竞争相同表位”的能力是指抗体抑制两个分子的结合至任何可检测的程度的能力。在一些实施方式中，阻断两个分子之间结合的抗体将两个分子之间的结合相互作用抑制至少50％。在一些实施方式中，该抑制可以大于20％，30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％或大于90％。
如本文所用，术语“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”或“KD值”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域良好建立的方法来确定。
如本文所用，术语“高亲和力”的抗体是指针对靶抗原具有1×10 -7M或更低，更优选5×10 -8M或更低，甚至更优选1×10 -8M或更低，甚至更优选5×10 -9M或更低，和甚至更优选1×10 -9M或更低的KD值的抗体。
如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性表位”或“构象表位”。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用位点跨越蛋白质中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如CLDN18.2)的抗体。在国际专利申请WO 03/048731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，其基于它们的交叉竞争。
本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。
本文所使用的术语“互补”涉及核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对，以使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。
如本文所用，术语“癌症”是指一大组各种疾病，其特征为体内异常细胞不受控制的生长。不受调节的细胞分裂和生长导致形成入侵相邻组织且也可以通过淋巴系统或血流转移到身体远程部分的恶性肿瘤。“癌症”或“癌症组织”可以包括肿瘤。比如：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃肠、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物/肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴(spinal axis)肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)、及所述癌症的组合。
如本文所用，术语“与ITPRIPL1相关的癌症”是指由ITPRIPL1的增加或减少的表达或活性引起、加重或以其它方式与其相关的任何癌症，在一些实施方式中，本文公开的方法可以用于选自结直肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、头颈癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫内膜癌、乳腺癌、和卵巢癌。
如本文所用，“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一治疗剂组合使用时保护受试者免于疾病发作或者促进疾病消退的任何量，所述疾病消退的证据为疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续期间增加或防止由于疾病折磨导致的损伤或残疾。可以使用熟练从业人员已知的各种方法评估治疗剂促进疾病消退的能力，例如在临床试验期间在人受试者中评估、在用于预测在人体中的效力的动物模型系统中评估或通过在体外测定法中测定试剂的活性评估。
如本文所用，“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方式中，个体或受试者是人。“受试者”可以是“患者”–患者是需要治疗的人类受试者，可以是患有ITPRIPL1相关癌症如乳腺癌的个体，处于发生ITPRIPL1相关癌症如结乳腺癌的风险的受试者。
如本文所用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。特别地，体外细胞可以包括T细胞。
如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文所用，术语“调控”、“调节”总体上包含了上调或下调两个不同方向的意思，在某些情况下可以理解了抑制或增强，在某些情况下可以理解为降低或提高，在某些情况下可以理解为减少或增多等，具体解释不做限制，根据实际应用语境理解和解释。示例性的，在一些实施方式中，“调控”肿瘤细胞生长可以理解为抑制或增强肿瘤细胞生长。
如本文所用，术语“减少”和“降低”可互换使用并且表示小于原来的任何变化。“减少”和“降低”是相对的术语，需要在测量前和测量后间进行比较。“减少”和“降低”包括完全消耗；同理术语“增多”和“提高”是相反解释。
受试者的“治疗”或“处理”是指在受试者上进行任何类型的干预或过程，或对该受试者施用活性剂，以达到逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症或状况或与疾病相关的生化指标的发作、进展、发展、严重或复发的目的。在一些实施方式中，“治疗”或“处理”包括部分缓解。在另一个实施方式中，“治疗”或“处理”包括完全缓解。
术语“ITPRIPL1在个体内表达”指ITPRIPL1的蛋白或mRNA在正常人和患者体内的表达水平，包括在患病组织例如肿瘤组织或自身免疫性疾病的组织、血液样本、尿液、分辨等生物样本中的含量。 这种表达量可作为疾病的诊断生物标志物，或者作为相关药物的伴随诊断标志物。
以下结合附图和实施例对本申请的技术方案做进一步的说明。
本申请首次揭示，ITPRIPL1的胞外区结合CD3ε胞外区和NRP2胞外区，并公开了ITPRIPL1结合CD3ε和NRP2后分别对T细胞和抗原递呈细胞产生的调节作用。基于新的科学发现，本申请公开了一种通过靶向ITPRIPL1调节免疫反应和抑制肿瘤的方法，并揭示ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途。具体地，本申请提供了对ITPRIPL1基因编辑的方法，以及将遗传物质导入细胞以调节ITPRIPL1表达的方法。本申请进一步公开了ITPRIPL1的受体结合域(RBD)并提供了制备ITPRIPL1-RBD分离蛋白的方案，演示了用ITPRIPL1-RBD结合CD3ε和NRP2从而调节免疫细胞功能的方法。再进一步地，本申请示例了制备ITPRIPL1抗体的方法，并证明上述抗体可以增强免疫细胞的抗肿瘤作用。本申请公开的通过靶向ITPRIPL1以调节免疫反应和抑制肿瘤的方法，显示了ITPRIPL1在治疗肿瘤、自身免疫疾病、移植排斥反应、过敏反应、感染等疾病中的靶点价值。
既往未见报到关于ITPRIPL1基因功能的报道，本申请公开了ITPRIPL1作为CD3ε新鉴定的配体(实施例1)，阐明ITPRIPL1胞外区受体结合域(RBD)为第25-103氨基酸(实施例2)，在此基础上制备了具有调节CD3ε和T细胞功能的分离重组蛋白(实施例3)。本申请还公开了上述分离蛋白的制备、用途和施用方法。
进一步地，本申请公开了分离的ITPRIPL1-RBD蛋白结合CD3ε的能力(实施例4)，分别利用酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术等实验方法证明了ITPRIPL1-RBD分离蛋白能够结合CD3ε胞外区。
由于ITPRIPL1-RBD(序列见SEQ ID NO:1)是结合CD3ε的关键区域，通过重组表达的方式可制备分离的ITPRIPL1-RBD蛋白，可用于结合细胞表面的CD3ε蛋白，并向T细胞内传递抑制性信号(实施例5)，因此该分离的ITPRIPL1-RBD蛋白可用于调节T细胞的功能。虽然本申请提供了序列为SEQ ID NO:1的分离蛋白在结合CD3ε、调节T细胞和和制备中和抗体方面的作用，通过本领域技术人员容易实施的、非创造性的衍生(如截短、插入、突变或融合等)方法而得到的其他具有类似功能的蛋白序列，亦在本申请主张的权利范围内。
本申请公开了分离的ITPRIPL1-RBD作为免疫原制备中和性抗体的应用(实施例6)。在ITPRIPL1作为CD3ε的配体未被揭示的情况下，本领域的技术人员无法有目的地制备用于阻断ITPRIPL1和CD3结合的抗体。本申请揭示了CD3ε和ITPRIPL1这对受体配体的存在，定义了ITPRIPL1结合CD3的关键结构，并提供了ITPRIPL1-RBD分离蛋白的制备方法，这使得制备用于阻断ITPRIPL1和CD3结合的抗体成为本领域人员通过常规技术(例如杂交瘤、噬菌体展示等技术)容易实现的目标。因此，以ITPRIPL1胞外区片段作为免疫原制备得到的阻断性抗体，亦在本申请专利的权利要求范围内。
本申请还揭示，通过调节ITPRIPL1-RBD和CD3胞外区的结合来调节T细胞来源的细胞株的增殖信号通路激活(实施例7)。
本申请揭示，ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤(实施例8)，据此提出靶向ITPRIPL1在抑制自身免疫方面的应用，以及在制备治疗自身 免疫、移植排斥反应、过敏、感染等疾病的药物组合物的应用价值。
本申请揭示，降低肿瘤细胞表达的ITPRIPL1可显著增加人外周血单核细胞对肿瘤细胞的杀伤(实施例9)，支持ITPRIPL1在肿瘤的免疫逃逸中扮演的角色，据此提出了ITPRIPL1作为肿瘤免疫治疗靶点的重要价值。
本申请还揭示，以ITPRIPL1-RBD蛋白作为免疫原制备的抗体，有效地促进了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤(实施例10)。这验证了ITPRIPL1作为肿瘤免疫治疗靶点的重要价值，并建立了以抗体阻断ITPRIPL1和CD3结合的方法。所述抗体代表一类具有全新功能的抗体，即具有识别ITPRIPL1并阻断其与CD3ε的结合，从而调节T细胞功能的抗体。
进一步地，本申请比较了不同长度的ITPRIPL1胞外区片段，证明ITPRIPL1-RBD2序列具有与CD3ε结合的能力但稍有降低，而ITPRIPL1-RBD3结合CD3的能力显著降低，因此揭示了ITPRIPL1胞外区的长度和CD3ε结合能力的正向相关性，表征了具备功能的ITPRIPL1胞外区序列的基本特性(实施例11)。本申请揭示了ITPRIPL1-RBD蛋白具有结合NRP2的能力(实施例12)。且分离的ITPRIPL1-RBD蛋白具有向表达NRP2蛋白的分化THP1巨噬细胞传递抑制信号的能力(实施例13)。
在药物研发过程中经常采用修饰的方法来改善药代动力学等属性，可对多肽或蛋白质进行链接其它化合物或功能基团，例如抗体恒定区(Fc)、聚乙二醇修饰、糖基化修饰、多聚唾液酸修饰、脂肪酸修饰、KLH修饰、生物素修饰等。本申请通过Fc修饰的方式，示例修饰对ITPRIPL1的重组蛋白功能的影响。经过纯化得到的ITPRIPL1-RBD-Fc修饰蛋白具有抑制T细胞通路信号与杀伤的功能(实施例14)。进一步地，该ITPRIPL1-RBD-Fc蛋白能够抑制T细胞的磷酸化通路，并能够被CD3ε阻断(实施例14)。
本申请制备了Jurkat CD3突变体并进一步揭示了对磷酸化通路影响的相关机制(实施例15)。同时，通过检测细胞内钙离子流探究ITPRIPL1-Fc对不同CD3表达的Jurkat的细胞影响(实施例15)，并发现ITPRIPL1-Fc通过增加CD3与Nck的结合以调控通路(实施例16)。
进一步地，将本申请运用到体内动物模型上，于人源化CD3ε小鼠体内构建MC38皮下移植瘤模型，检测肿瘤生长情况、PBMC中T细胞的功能、以及肿瘤细胞中T细胞浸润情况(实施例17)。同时，建立ITPRIPL1敲除小鼠模型，并检测PBMC中T细胞的功能、细胞因子变化、以及睾丸T细胞浸润情况，验证该申请可以应用至体内(实施例17)。
本申请揭示了常见多器官癌的ITPRIPL1表达情况并与对应癌旁组织相比较，证实ITPRIPL1于癌变时增多(实施例18)。
实施例1：ITPRIPL1作为CD3ε新鉴定的配体
1.构建表达质粒
基于已公开序列(NCBI参考序列NM_001008949.3)通过合成全长人类ITPRIPL1的cDNA，以pcDNA3.1为载体，其中C末端融合至Flag标签，从而产生含有Flag标签的ITPRIPL1质粒。质粒构建结果如图1所示。图1的(a)是载体克隆结构示意图，图1的(b)是基因表达载体质粒被EcoRI/XhoI酶切后DNA凝胶电泳图，所得片段大小符合预期，图1的(c)为载体测序验证结果的部分截取。
2.免疫共沉淀及免疫印迹法分析结果表明ITPRIPL1与CD3结合。
将含有Flag标签的ITPRIPL1(或空载)，以及HA标签的CD3ε的pcDNA3.1质粒共转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)中，置于六孔板(康宁，NY，美国)培养48-72小时至蛋白充分表达后，用1：100免疫沉淀裂解液(赛默飞，MA，美国)与蛋白酶、磷酸酶、PMSF三联(康臣，上海，中国)混合裂解液裂解并刮取细胞，一部分细胞样本经离心、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得输入量蛋白样本；剩余细胞样本用Flag标签特异性鼠抗体(CST，MA，美国)进行免疫沉淀，经PBS清洗、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得免疫沉淀蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置12.5％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以ITPRIPL1-Flag和CD3ε-HA蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用Flag标签特异性兔抗体(Abcam，MA，美国)和HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)分别孵育ITPRIPL1-Flag与CD3ε-HA相应条带，4℃过夜。次日经TBST清洗后，用溶于TBS的5％脱脂牛奶(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
如图2示出了免疫共沉淀实验结果。图2的(a)和(b)分别显示用于免疫共沉淀的输入蛋白中ITPRIPL1和CD3ε的含量即输入量，图2的(c)显示直接沉淀的ITPRIPL1，图2的(d)显示间接被沉淀的、与ITPRIPL1结合的CD3ε。免疫共沉淀实验结果表明ITPRIPL1与CD3结合。
3.免疫荧光及共定位分析表明ITPRIPL1与CD3具有显著共定位。
将含有Flag标签的ITPRIPL1(或空载)和HA标签的CD3ε的pcDNA3.1质粒共转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)中，置于八孔载玻片(赛默飞，MA，美国)培养30小时至蛋白充分表达后弃去培养液，PBS清洗后4％多聚甲醛固定二十分钟，PBS再次清洗后透膜封闭液封闭一小时，然后加入透膜封闭液稀释的Flag标签特异性鼠抗体(CST，MA，美国)与HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)4℃孵育过夜。PBS清洗过夜后的八孔载玻片，加入PBS稀释的Alexa Fluor 488荧光特异性抗鼠抗体(Invitrogen，CA，美国)与Alexa Fluor 594荧光特异性抗兔抗体(Invitrogen，CA，美国)室温孵育二十分钟，PBS清洗后DAPI封片，待封片剂干燥后置于荧光显微镜下观察。
图3示出了外源表达的ITPRIPL1与CD3ε在细胞内的显著共定位。图3的(a)是ITPRIPL1的定位模式；(b)是CD3ε蛋白的定位模式；(c)是两种颜色的蛋白定位模式相叠加，其中白色的直线路径上ITPRIPL1和CD3ε的荧光强度在图3的(d)显示。由以上结果可以观察到两种蛋白的定位具有显著的相关性，支持两种蛋白的相互结合。
实施例2：ITPRIPL1胞外区受体结合域(RBD)及其衍生序列的功能
1.构建表达质粒
基于已公开序列(NCBI参考序列NM_001008949.3)，分别选中其中胞外区(25-103氨基酸)、胞外区和跨膜区(25-124氨基酸)、跨膜区和胞内区(104-555氨基酸)为三段不同的目标序列，合成全长人类 ITPRIPL1，以pcDNA3.1为载体，其中胞外区、胞外区和跨膜区C末端融合至Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)，跨膜区和胞内区N末端融合至Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)，从而产生含有Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)的ITPRIPL1胞外区、胞外区和跨膜区、跨膜区和胞内区质粒。其中，ITPRIPL1(25-103)即CD3结合结构域的表达载体构建结果如图4所示。图4的(a)是载体质粒构建图谱，将编码ITPRIPL1(25-103)氨基酸片段的cDNA在所及末端链接编码Flag标签的cDNA，插入pEGFP-C1(上海捷瑞公司)，该载体表达产物带有GFP荧光标记，但其主要功能产物是ITPRIPL1(25-103)即CD3结合片段。图4的(b)是基因表达载体质粒被EcoRI/XhoI酶切后DNA凝胶电泳图，所得片段大小符合预期，图4的(c)为测序结果峰图的截图。
2.免疫共沉淀实验结果表明ITPRIPL1的胞外区(而非胞内区或跨膜区)与CD3ε结合。
将含有Flag标签的ITPRIPL1胞外区、胞外区和跨膜区、胞内区和跨膜区与HA标签的CD3ε的pcDNA3.1质粒分别共转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)中，置于六孔板(康宁，NY，美国)培养48-72小时至蛋白充分表达后，用1：100免疫沉淀裂解液(赛默飞，MA，美国)与蛋白酶、磷酸酶、PMSF三联(康臣，上海，中国)混合裂解液裂解并刮取细胞，一部分细胞样本经离心、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得输入量蛋白样本；剩余细胞样本用Flag标签特异性鼠抗体(CST，MA，美国)进行免疫沉淀，经PBS清洗、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得免疫沉淀蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置12.5％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以ITPRIPL1胞外区、胞外区和跨膜区、胞内区和跨膜区-Flag与CD3ε-HA蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用Flag标签特异性兔抗体(Abcam，MA，美国)和HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)分别孵育ITPRIPL1-Flag与CD3ε-HA相应条带，4℃过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
图5为免疫共沉淀实验结果。如图5所示，图5的(a)显示了Flag抗体检测到的输入量蛋白中ITPRIPL1的含量，而图5的(b)显示了输入蛋白量中CD3ε的含量。图5的(c)显示了直接沉淀的ITPRIPL1不同的突变体，而图5的(d)显示了相应被间接沉淀(因与ITPRIPL1突变体结合)的CD3ε。上述结果表明，ITPRIPL1的胞外区(而不是胞内区或跨膜区)存在的情况下，CD3ε和ITPRIPL1保持结合状态。因此ITPRIPL1的胞外区结合了CD3ε，符合CD3ε的配体ITPRIPL1其胞外区受体结合域(RBD)为第25-103氨基酸的结论。
3.免疫荧光及共定位分析表明ITPRIPL1胞外区和CD3胞外区具有反式结合。
将HA标签的CD3ε转染HCT116细胞；另外单独将Flag标签的ITPRIPL1(分别以为人、小鼠、大猩猩、绿猴、金色塌鼻子猴、亚马逊松鼠猴的ITPRIPL1胞外区与人ITPRIPL1跨膜区)-绿色荧光蛋白的pcDNA3.1质粒转染另一批HCT116；最后将两次分别转染的细胞共同培养，以免疫荧光双染 色法确定两种蛋白的定位模式。其中大鼠、小鼠、大猩猩、绿猴、金色塌鼻子猴、黑色塌鼻子猴、亚马逊松鼠猴的ITPRIPL1胞外区序列见图54。
具体步骤如下：将含有HA标签的CD3ε的pcDNA3.1质粒转染一批HCT116细胞(ATCC，VA，美国)；另外单独将含有Flag标签的ITPRIPL1(胞外区与跨膜区)-绿色荧光蛋白的pcDNA3.1质粒转染另一批HCT116细胞(ATCC，VA，美国)；转染20小时后用胰酶将细胞各自消化，混合并充分重悬混匀，铺板至八孔载玻片(赛默飞，MA，美国)，继续培养10小时。弃去培养液，PBS清洗后4％多聚甲醛固定二十分钟，PBS再次清洗后透膜封闭液封闭一小时，然后加入透膜封闭液稀释的HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)4℃孵育过夜。PBS清洗过夜后的八孔载玻片，加入PBS稀释的Alexa Fluor594荧光特异性抗兔抗体(Invitrogen，CA，美国)室温孵育二十分钟，PBS清洗后DAPI封片，待封片剂干燥后置于荧光显微镜下观察。以免疫荧光双染色法确定两种蛋白的定位模式。
如图6所示，图6的(a)显示ITPRIPL1和CD3ε染色重叠的图像，图6的(b)和(c)分别显示了ITPRIPL1受体结合区域(ITPRIPL1-RBD)以及CD3ε的染色结果。图6的(d)是通过ImageJ软件包的共定位分析模块进行分析，得到的两种蛋白共定位的区域。其中白色的直线路径上ITPRIPL1和CD3ε的荧光强度在图6的(e)显示。可见在两个细胞交界处，ITP-RBD(绿色荧光)和CD3ε(红色荧光)的信号都有明显的集中和强化，这支持两种蛋白的胞外区在细胞表面反式结合。实验结果还表明，小鼠、大猩猩、绿猴、金色塌鼻子猴、亚马逊松鼠猴的ITPRIPL1胞外区与人CD3E胞外区发生结合。
实施例3：具有调节CD3ε和T细胞功能的ITPRIPL1-RBD分离重组蛋白的制备
基于已公开序列(NCBI参考序列NP_001008949.1)通过Cusabio(武汉，中国)合成人类ITPRIPL1胞外区(25-103氨基酸)重组蛋白，通过酵母表达并提纯蛋白，其中C末端融合至6x-His与Myc标签，从而产生含有6x-His与Myc标签的ITPRIPL1-RBD重组蛋白。
如图7所示，为ITPRIPL1-RBD重组蛋白凝胶电泳后考马斯亮蓝染色结果，提示其分子量和纯度符合预期。
实施例4：刀豆蛋白A(ConA)与分离的ITPRIPL1-RBD蛋白分别具有结合CD3ε的能力
酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证实刀豆蛋白A(ConA)与分离的ITPRIPL1胞外区片段分别与CD3ε胞外区存在浓度依赖的直接结合。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用0.5/1/2/4微克每毫升的ConA或0.03125/0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的ITPRIPL1-RBD重组蛋白各溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，再以用1微克每毫升CD3ε胞外区蛋白质片段(义翘神州，北京，中国)进行孵育结合，该CD3ε(Met1-Asp126)蛋白带有hFc标签，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗人Fc段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(生工，上海，中国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图8为ELISA实验结果。实验表明，刀豆蛋白A(ConA)和分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白 (IT1-RBD)分别与CD3胞外区纯化蛋白存在浓度依赖的直接结合，且IT1-RBD的结合强度大于ConA。上述结果证明刀豆蛋白A(ConA)与分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白(IT1-RBD)分别与CD3ε胞外区纯化蛋白直接结合，且IT1-RBD的结合强度大于ConA。
实施例5：分离的ITPRIPL1-RBD蛋白可用于结合细胞表面的CD3ε蛋白，并向T细胞内传递抑制性信号
1.构建HCT116-ITPRIPL1与HCT116-CD3ε稳转株细胞
将构建的全长ITPRIPL1-Flag质粒与CD3ε-HA质粒以及空载pcDNA3.1质粒分别转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)，置于培养箱中培养24-48小时后，加入1000微克每毫升的遗传霉素(Geneticin，G418)(Gibco，CA，美国)进行筛选，10-14天后至空载pcDNA3.1质粒转染组细胞全部死亡后，即得HCT116-ITPRIPL1与HCT116-CD3ε稳转株细胞。
2.流式细胞术证明ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段结合高表达CD3的Jurkat细胞。
将培养的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，调整细胞数为2x10 5每毫升，分别加入200微升至6支1.5ml EP管(Axygen，CA,美国)中。向其中4支EP管中分别加入0.1微克、0.2微克、0.4微克、0.8微克ITPRIPL1-RBD-6x-His重组蛋白(IT1-6x-His蛋白)使其浓度为0.5微克每毫升、1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升。将所有EP管置于细胞培养箱中，静置30分钟，而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释6x-His-FITC抗体(Abcam，MA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图9的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图9的(b)反映Jurkat细胞与不同浓度的ITPRIPL1胞外区纯化蛋白片段的结合情况。图10则为图9的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明ITPRIPL1胞外区纯化蛋白片段可与高表达CD3的Jurkat细胞结合。
3.流式细胞术证明ITPRIPL1蛋白以更高的效率结合过表达CD3的细胞。
将培养的HCT116野生型细胞(ATCC，VA，美国)与HCT116-CD3ε稳转株细胞消化后计数，分别调整细胞数为2x10 5每毫升，加入200微升分别至5支与3支1.5ml EP管(Axygen，CA,美国)。向HCT116野生细胞中3支EP管和HCT116-CD3ε稳转株细胞的3支EP管中各自分别加入0.2微克、0.4微克、0.8微克ITPRIPL1-RBD-6x-His重组蛋白使其浓度为1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升。将所有EP管置于细胞培养箱中，静置30分钟，而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释6x-His-FITC抗体(Abcam，MA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY，美国) 中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图11的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图11的(b)反映CD3ε表达情况不同的细胞与不同浓度ITPRIPL1重组蛋白的结合情况。图12则为图11的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明ITPRIPL1胞外区纯化蛋白片段可与过表达CD3的HCT116细胞结合而不与不表达CD3的HCT116细胞结合。
4.流式细胞术证明CD3以更高效率结合过表达ITPRIPL1的细胞。
将培养的HCT116野生型细胞(ATCC，VA，美国)与HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞消化后计数，分别调整细胞数为2x10 5每毫升，加入200微升分别至3支与1支1.5ml EP管(Axygen，CA,美国)。向HCT116野生细胞中1支EP管和HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞的EP管中加入0.4微克CD3E-人Fc蛋白(义翘神州，北京，中国)使其浓度为2微克每毫升。将所有EP管置于细胞培养箱中，静置30分钟，而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:1000稀释抗人IgG Alexa Fluor 647抗体(Invitrogen，CA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图13的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图13的(b)反映ITPRIPL1表达情况不同的细胞与CD3ε蛋白的结合情况。图14则分别为图13的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明CD3ε能与表达ITPRIPL1的HCT116结合，并能更强地结合过表达ITPRIPL1的HCT116细胞。
5.萤光素报告实验证明ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段抑制ConA激活的Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号。
将培养的Jurkat-dual细胞(Invivogen，CA，美国)计数，1000rpm x5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基(Gibco，CA，美国)重悬调整细胞数为2x10 6每毫升，透明96孔板(赛默飞，MA，美国)中每孔加入200微升细胞。各孔分别加入0.2微克、0.4微克、0.8微克ITPRIPL1-6x-His重组蛋白使其浓度为1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升。置于细胞培养箱中反应两小时后，各孔加入10微克每毫升刀豆蛋白A(ConA)(阿拉丁，上海，中国)，置于细胞培养箱中反应18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板(costar，ME，美国)，各孔加入50微升Quanti-luc试剂(Invivogen，CA，美国)与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪(赛默飞，MA，美国)立即检测信号。
如图15所示，在10微克每毫升ConA激活的条件下，随ITPRIPL1蛋白浓度变化的NFKB信号变化。上述结果表明ITPRIPL1-RBD的纯化重组蛋白能抑制ConA激活的Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号，并呈浓度依赖性。
6.萤光素报告实验证明固定在微球表面的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段抑制ConA激活的Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号。
将蛋白G磁性微球(赛默飞，MA，美国)与His抗体(Abcam，MA，美国)置于4支EP管(Axygen， CA,美国)中，放入DNA混合仪(新芝，宁波，中国)最低速室温旋转1小时。向其中3支EP管加入0.2微克、0.4微克、0.8微克ITPRIPL1-6x-His重组蛋白，再次最低速室温旋转1小时。培养的Jurkat-dual细胞(Invivogen，CA，美国)计数，1000rpm x5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基(Gibco，CA，美国)重悬调整细胞数为2x10 6每毫升，透明96孔板(赛默飞，MA，美国)中每孔加入200微升细胞。各孔分别加入各EP管内容物使包被蛋白浓度为1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升。置于细胞培养箱中反应两小时后，各孔加入50微克每毫升刀豆蛋白A(ConA)(阿拉丁，上海，中国)，置于细胞培养箱中反应18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板(costar，ME，美国)，各孔加入50微升Quanti-luc试剂(Invivogen，CA，美国)与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪(赛默飞，MA，美国)立即检测信号。
如图16所示，在50微克每毫升ConA激活的条件下，随微球包被ITPRIPL1蛋白浓度变化的NFKB信号变化。上述结果表明固定于微球表面的ITPRIPL1-RBD纯化重组蛋白能抑制ConA激活的Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号，并呈浓度依赖性。
7.检测ITPRIPL1在不同类型的肿瘤细胞中表达的水平
由于ITPRIPL1的胞外区具有抑制免疫细胞(例如T细胞)的功能，因此肿瘤细胞可能表达ITPRIPL1以逃避免疫系统的监视和杀伤。如果多种肿瘤细胞异常表达ITPRIPL1，则提示ITPRIPL1可能对于肿瘤的发生和发展(包括免疫逃逸)起到促进作用。本发明揭示ITPRIPL1在来自不同类型肿瘤的细胞系中，ITPRIPL1存在异常的表达。具体实验步骤为：将培养的各细胞系计数，取2x10 6个细胞至15ml离心管，800rpm x4分钟离心后弃去上清，PBS重悬清洗，800rpm x4分钟离心，重复PBS重悬清洗。离心完成后弃去上清，按1:100配置RIPA裂解液与蛋白酶、磷酸酶、PMSF三联，每管细胞加入120微升混合裂解液，并转移至EP管中。各EP管于液氮-冰上进行三冻三融，最后一次融化后12000rpm 4摄氏度条件下离心15分钟。离心完成后取上清，离心后上清:5x上样缓冲液按4:1配置成各细胞样品，置于100摄氏度金属浴中10分钟变性。变性完成后，通过凝胶电泳和免疫印迹分析，以GAPDH作为内参，确定各肿瘤细胞系中ITPRIPL1的内源性表达。
图17为免疫印迹法中GAPDH内参调齐后的ITPRIPL1的表达情况。如图17所示，免疫印迹实验检测肿瘤细胞系表达ITPRIPL1蛋白的水平，其中包括LoVo结直肠癌、Raji淋巴瘤、RL淋巴瘤、MDA-MB-231乳腺癌、HCT116结直肠癌、A549肺癌、HL60、Jurkat淋巴瘤、H1299肺癌、A375黑色素瘤细胞中都存在较高水平的表达。发明人虽然并没有检测所有类型的肿瘤细胞中ITPRIPL1的表达，但是从已经检测过的肿瘤细胞中表达ITPRIPL1的比例来看(10/11，超过90％)，ITPRIPL1在恶性肿瘤中可能存在多种类型的、相当广泛的表达。
相应地，Protein Atlas数据库基于高通量mRNA表达谱分析提取的结果提示，ITPRIPL1可能在多种肿瘤中都存在表达显著升高的病例。过去没有见到过关于ITPRIPL1功能的任何报道。因此在本发明的内容公开之前，本领域的技术人员无法预知ITPRIPL1在肿瘤发生发展和免疫逃逸中扮演的任何功能。本发明公开了ITPRIPL1肿瘤细胞蛋白质水平的异常表达升高、ITPRIPL1胞外区结合CD3ε并造成T细胞抑制等实验数据，这首次揭示了ITPRIPL1在肿瘤免疫治疗靶标的重要价值。
如图18所示，根据Protein Atlas网站收集的mRNA表达谱数据，ITPRIPL1在正常组织或细胞中 可能主要表达在睾丸、T细胞中。值得说明的是，mRNA的表达并不能直接代表蛋白质水平的表达，而且通常意义上，表达谱数据的再分析还需要低通量的生物学实验进行验证(例如蛋白凝胶电泳免疫印迹分析)才能得到可靠结论。
8.OCTET分子互作实验证明ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段能直接与CD3ε蛋白结合。
启动OCTET仪器。将100微克CD3E-Fc蛋白(义翘神州，北京，中国)通过Fc探针吸附至饱，再将50微克ITPRIPL1胞外区重组蛋白以800nM/1600nM/3200nM浓度进行相应的结合，绘制结合曲线并计算解离常数。
如图40所示，该图显示了整个吸附-解离的过程并计算了相关常数。上述结果表明ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白片段能直接与CD3E蛋白相结合。
实施例6：分离的ITPRIPL1-RBD作为免疫原制备抗体用于抑制肿瘤在体内生长
1.ITPRIPL1-RBD作为免疫原制备小鼠多克隆抗体和多克隆抗体
将人类ITPRIPL1-RBD重组蛋白作为免疫原，经过上述实施例中验证了该样本的纯度和生物学活性后，对C57BL/6小鼠进行免疫，进行多次免疫以增强效果：(1)初次免疫，抗原50μg/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，间隔3周；(2)第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周；(3)第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射间隔3周；(4)加强免疫，剂量50μg，腹腔注射。最后一次注射3天后采血测其效价。检测免疫效果达到要求后，再进行多次累积方式取血、分离多克隆抗体，并进行多克隆抗体纯化，具体实验步骤包括：(1)准备蛋白G sepharose CL-4B亲和柱。准备10mL蛋白G sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空15分钟以除去填料中的气泡。将蛋白G sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1mL/分-2mL/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。(2)制备多克隆抗体。将多克隆抗体放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37℃预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05％，4℃，15,000×g离心5分钟，移出澄清的多克隆抗体再经过滤器过滤除去多余的脂。(3)亲和层析。将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5mL的速度将多克隆抗体上到柱上，为保证多克隆抗体与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加Ph 2.7洗脱缓冲溶液，以0.5mL/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100μL中和缓冲溶液的1.5mL EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。在柱中加入10mL，pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至Aλ280nm<0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。
2.酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证明ITPRIPL1-RBD作为免疫原的多克隆抗体能与表达ITPRIPL1的细胞结合
使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先将不表达ITPRIPL1的B16细胞(ATCC，VA，美国)、中等程度表达ITPRIPL1的LoVo细胞(ATCC，VA，美国)与HCT116-ITPRIPL1的稳转株细胞胰酶消化并计数，调整细胞数量为2x106每毫升，每孔100微升细胞铺板，4℃包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后， 再将总IgG浓度为10毫克每毫升的多克隆抗体以1:1000/1:500/1:250/1:125进行梯度稀释，与铺板细胞孵育结合，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(生工，上海，中国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图19的(a)为B16细胞与不同浓度多克隆抗体的结合率变化。图19的(b)为LoVo细胞与不同浓度多克隆抗体的结合率变化。图19的(c)为HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞与不同浓度多克隆抗体的结合率变化。该实验表明，随多克隆抗体中IgG浓度增加，B16细胞与多克隆抗体结合率无明显变化趋势，LoVo细胞与多克隆抗体的结合率呈一定程度的浓度依赖的增长，HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞与多克隆抗体的结合率呈明显的浓度依赖的增长。上述结果证明多克隆抗体能与表达ITPRIPL1的细胞结合。
3.酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与CD3ε结合。
使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用0.1微克CD3ε蛋白片段(义翘神州，北京，中国)溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，该CD3ε(Met 1-Asp117)蛋白带有hFc标签，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。4℃包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，再以2微克每毫升的ITPRIPL1-RBD-6x-His蛋白分别与1:1000/1:500/1:250/1:125的总IgG浓度为10毫克每毫升的多克隆抗体混合后进行共孵育结合，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗6x-His标签辣根过氧化物酶抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(生工，上海，中国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
如图20所示，该实验表明，随多克隆抗体中IgG浓度增加，CD3ε与ITPRIPL1-RBD蛋白的结合率逐渐降低。上述结果证明多克隆抗体可以阻断ITPRIPL1与CD3ε之间的结合。
4.流式细胞术证明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与过表达CD3ε的细胞的结合。
将HCT116-CD3ε稳转株细胞消化后计数，分别调整细胞数为2x10 5每毫升，加入200微升分别至8支1.5ml EP管(Axygen，CA,美国)。向EP管中各加入0.8微克IT1-RBD蛋白使其浓度为4微克每毫升。向其中五支EP管分别加入1:1000/1:500/1:250/1:125/1:67.5稀释的总IgG浓度为10毫克每毫升的多克隆抗体，静置细胞培养箱中30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释6x-His FITC抗体(Abcam，MA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图21的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图21的(b)反映多克隆抗体浓度变化时ITPRIPL1与 CD3ε结合情况变化。图22则为图21的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明多克隆抗体能阻断ITPRIPL1与过表达CD3ε的细胞的结合。
5.在多克隆抗体的基础上制备单克隆抗体，并进一步验证抗体抑制肿瘤生长的作用。
由于ITRPRIPL1在多种肿瘤中表达上调，因此特异性结合ITPRIPL1的抗体能够识别体内的肿瘤细胞，并通过抗体的恒定区Fc段发挥ADCC、ADCP和CDC作用从而杀伤肿瘤细胞。ADCC即抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)，是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等)表面的FcR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞，是抗肿瘤的治疗性抗体药物发生作用的一种作用重要机制。ADCP即抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis)，也是用于识别和介导治疗性抗体作用于肿瘤细胞的一种重要机制。CDC即补体依赖的细胞毒性，指的是补体参与的细胞毒作用，即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。本实施例将证实特异性识别ITPRIPL1保外区的抗体对肿瘤在体内生长的抑制作用。具体实施步骤如下：
a)将融合得到的杂交瘤细胞稀释至96孔板(估计密度为每孔0.5个细胞)，并进一步培养至克隆形成。取来源于单克隆的杂交瘤的培养基上清进行ELISA试验，测定与0.2微克每毫升ITPRIPL1(RBD1蛋白)包板的抗原结合程度，按照OD450吸收值排序，并取结合最强的抗体对应的单克隆杂交瘤细胞，扩大培养，并制备腹水抗体(下称：RBD1结合抗体)，用于动物体内功能研究。
b)将构建的全长ITPRIPL1-Flag质粒以及空载pcDNA3.1质粒分别转染至MC38细胞(Kerafast，MA，美国)，置于培养箱中培养24-48小时后，加入200微克每毫升的遗传霉素(Geneticin，G418)(Gibco，CA，美国)进行筛选，10-14天后至空载pcDNA3.1质粒转染组细胞全部死亡后，即得MC38-ITPRIPL1稳转株细胞。选取6-8周龄的人源化CD3ε小鼠(南方模式，上海，中国)，依据体重随机分组，每组6只小鼠。取MC38野生型及MC38-ITPRIPL1稳转株细胞计数，并用PBS重悬至1.5x10 7每毫升细胞密度。将小鼠剃毛，于右侧腋下皮下接种1.5x10 6ITPRIPL1过表达MC38细胞，即为人源化CD3ε小鼠MC38ITPRIPL1过表达皮下移植瘤体内模型的构建。自接种肿瘤第五天起，每三天对各组MC38ITPRIPL1过表达移植瘤小鼠进行腹腔注射100微克RBD1结合抗体或等量PBS，之后每间隔三天注射一次，共计治疗四次。使用游标卡尺进行肿瘤大小的测量，每次测量肿瘤长径与短径，用1/2*A*a*a的公式计算肿瘤体积，每三天测量一次，对肿瘤体积进行记录。于接种后第23天对小鼠进行统一处死，剥离肿瘤后，称量肿瘤重量并统计。如图71所示，肿瘤体积及肿瘤重量均显示使用RBD1结合抗体治疗后肿瘤生长显著受到抑制，证实ITPRIPL1单克隆抗体具有体内功能。
c)流式细胞术表明ITPRIPL1单克隆抗体能显著增加ITPRIPL1过表达肿瘤的T细胞活性。利用心脏采血的方式，从小鼠体内取得至少1ml外周血。利用小鼠外周血PBMC分离试剂盒(Solarbio，北京，中国)，按照试剂盒相应说明书进行操作，得到小鼠PBMC细胞。将小鼠PBMC置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释鼠CD8-APC抗体(Biolegend，CA，美国)，鼠CD69-APC抗体(Biolegend，CA，美国)，鼠CD137-APC抗体(Biolegend，CA，美国)各EP管加入 200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用500微升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入200微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。如图72所示，根据细胞荧光阳性率，RBD1结合抗体能显著增加CD8、CD25、CD139的表达。该实验结果表明RBD1结合抗体能解除ITPRIPL1对小鼠体内T细胞活性的抑制。
d)免疫组织化学染色表明RBD1结合抗体能显著增加ITPRIPL1过表达肿瘤的免疫细胞浸润。将MC38-ITPRIPL1过表达肿瘤组织剥离后进行切片以及石蜡包埋处理(百奥斯，武汉，中国)。将所得石蜡切片进行脱蜡、水化、抗原修复等处理后，予以鼠CD8抗体(CST，MA，美国)湿盒孵育过夜。次日复温后按试剂说明书进行二抗孵育，DAB染色(Solarbio，北京，中国)以及苏木紫染色(Solarbio，北京，中国)后，逆酒精浓度梯度风干并封片。封片完成后，置于荧光显微镜下使用自然光观察并拍照。如图73所示，RBD1结合抗体使用后能显著增加CD8于肿瘤组织中的阳性率。该实验结果表明RBD1结合抗体能增加MC38ITPRIPL1过表达的肿瘤组织中免疫细胞的浸润。
上述结果表明，特异性识别ITPRIPL1胞外区即RBD1的抗体，能够显著抑制肿瘤细胞在体内的生长。由于ITPRIPL1同时表达在原发癌、淋巴转移癌、远处转移癌，这使得抗体药物可以作用在不同部位和发展阶段的肿瘤，通过ADCC、ADCP、CDC等作用发挥更为持续和广泛的抗肿瘤效果，并激活肿瘤局部的免疫反应。同时由于ITPRIPL1在上述肿瘤的对照正常组织中表达很低，因此这种针对ITPRIPL1的抗体对正常组织和细胞可能产生的毒副作用更为有限。上述特性突出了ITPRIPL1特异性抗体作为一种新的抗癌疗法具有的突出优势和应用前景。实施例7：通过调节ITPRIPL1-RBD和CD3胞外区的结合来调节T细胞来源的细胞株的增殖信号通路激活
由于既往研究表明，CD3ε的结合可能造成T细胞增殖和功能的改变，而由于T细胞是原代细胞不利于进行干预和检测，进行此类研究最广泛采用的模型是Jurkat细胞即来源于T细胞的细胞株，而NF-KB的信号转导是广泛采用的体现Jurkat或T细胞激活程度的检测指标。因此，我们构建了Jurkat-NFKB报告细胞株(将NF-KB启动子下游的萤火虫荧光酶通过慢病毒转导入Jurkat细胞，经检测可以用刀豆蛋白A激活)，用于检测ITPRIPL1在肿瘤细胞表达的情况下，对共培养的T细胞功能状态的影响。
首先，萤光素报告实验证明过表达ITPRIPL1的HCT116细胞能更多地降低Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号，如图23所示。将培养的Jurkat-dual细胞计数，1000rpm x5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基重悬调整细胞数为2x10 6每毫升，透明96孔板中每孔加入200微升细胞。将HCT116细胞与HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞胰酶消化并计数，调整细胞数为2x10 6每毫升，各加入20微升与相应的Jurkat-dual细胞混合。置于细胞培养箱中共培养18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板，各孔加入50微升Quanti-luc试剂与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪立即检测信号。上图反映表达ITPRIPL1的HCT116细胞能抑制Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号，而过表达ITPRIPL1的HCT116细胞能进一步降低NFKB增殖信号。上述结果表明过表达ITPRIPL1的HCT116细胞能更多地降低Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号。
进一步地，萤光素报告实验证明CD3ε蛋白可以阻断ITPRIPL1蛋白对Jurkat-dual细胞NFKB增 殖信号的抑制，如图24所示。培养的Jurkat-dual细胞计数，1000rpm x5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基重悬调整细胞数为2x10 6每毫升，透明96孔板中每孔加入200微升细胞。各孔分别加入2微克每毫升的ITPRIPL1蛋白与0微克每毫升、1微克每毫升、2微克每毫升、4微克每毫升的CD3ε蛋白混合物。置于细胞培养箱中反应两小时后，各孔加入50微克每毫升刀豆蛋白A(ConA)，置于细胞培养箱中反应18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板，各孔加入50微升Quanti-luc试剂与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪立即检测信号。上图反映在50微克每毫升ConA激活的条件下，加入2微克每毫升ITPRIPL1蛋白与不同浓度的CD3ε蛋白的条件下Jurkat-dual细胞的NFKB信号变化。上述结果表明ITPRIPL1蛋白对ConA激活的Jurkat-dual细胞的NFKB增殖信号的抑制能被CD3ε蛋白阻断，并呈浓度依赖性，从而说明ITPRIPL1的抑制作用通过CD3ε产生。
实施例8：ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤
使用流式细胞术证明ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤。将CD3与CD28抗体(Invitrogen，CA，美国)与PBMC(ATCC，VA，美国)混合稀释使得其终浓度为1微克每毫升以激活T细胞，培养过夜。次日将PBMC与293E(ATCC，VA，美国)细胞计数，分别调整细胞数为1x10 6每毫升，对照组加入100微升293E细胞与100微升培养液，实验组两种细胞各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，实验组中再有4组各自加入1、2、4、8微克每毫升的ITPRIPL1-RBD重组蛋白，置于培养箱中孵育6小时。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(美仑，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置不加PBMC不染组、不加PBMC双染组、加入PBMC不染组、加入PBMC单染Annexin V-FITC组、加入PBMC单染PI组、加入PBMC双染组与各加入ITPRIPL1蛋白的双染组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(美仑，上海，中国)与10微升PI(美仑，上海，中国)，室温慢摇孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
图25的(a)和(b)表示依据CD45来划分293E细胞。图25的(c)为不同ITPRIPL1蛋白浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图26为图25的(c)中各条件下具体凋亡染色情况。上述结果表明ITPRIPL1-RBD重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤。
实施例9：通过基因编辑敲除肿瘤细胞表达的ITPRIPL1可显著增加人外周血单核细胞对肿瘤细胞的杀伤
1.构建CRISPR/Cas9基因编辑系统，即含有嘌呤霉素抗性的特定切割ITPRIPL1的sgRNA的慢病毒。
实验总体流程：首先合成gRNA序列的单链DNA oligo，然后退火配对产生双链DNA oligo，再 通过其两端所含酶切位点将其直接连入酶切后的CRISPR/Cas9载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的CRISPR/Cas9载体。针对目的基因靶基因序列，利用公用网站中提供的gRNA序列设计原则，设计多个靶位点序列，如SEQ ID NOs:11-13所示。根据基因序列分别设计并合成3对gRNA寡聚单链DNA，oligo序列如SEQ ID NOs:14-19所示，其中SEQ ID NO:14,15为靶序列SEQ ID NO:11对应的gRNA寡聚单链DNA序列；SEQ ID NO:16,17为靶序列SEQ ID NO:12对应的gRNA寡聚单链DNA序列；SEQ ID NO:18,19为靶序列SEQ ID NO:13对应的gRNA寡聚单链DNA序列。将寡聚单链DNA退火成双链，将双链的gRNA oligo分别插入到CRISPR/Cas9载体中，构建CRISPR/Cas9重组质粒，并转化至感受态细胞Stbl3。载体的构建包括以下具体步骤：
1)gRNA的退火：用无菌的TE buffer稀释引物使终浓度为100μMol。分别吸取10μl的上下游引物混合并吹打均匀放入PCR管内进行退火，结束后置于冰上放置几分钟可直接连接或于-20℃冷冻保存。
2)CRISPR/Cas9载体的酶切及回收：酶切体系如下：CRISPR/Cas9vector 5μg；10*Buffer5μl；BsmBI4μl；ddH2O补足50μl。于37℃酶切约30min。在此期间，可配置0.8％的琼脂糖凝胶，待酶切结束后进行核酸电泳。电泳结束后切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg约为100μl来计算凝胶的体积，并加入3倍胶体积的QG buffer置于50℃水浴内将凝胶彻底融化，期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s。弃掉管内液体，向柱子内加入750μl的PE buffer，离心1min。弃掉管内液体，再次空离1min。换一个新的1.5ml的EP管，向柱子内加入50μl的EB buffer，离心1min，离心管中即为回收的载体。
3)CRISPR/Cas9载体与引物的连接。连接体系如下：回收载体3μl(50ng)；Oligo引物1μl(0.5μM)；T4DNA ligase buffer1.5μl；T4DNA连接酶1μl；ddH2O补足15μl。于25℃水浴中孵育30min。
4)转化：将感受态细胞置于冰上待其自然解冻后，把连接产物全部加入感受态细胞中，于冰上放置20min，后于42℃水浴中热击90S。然后迅速置于冰上放置2-3min。加入1000μl不含抗生素的LB培养基于37℃，150rpm振荡培养45min。3000rpm离心2min，弃掉约850μl的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有相应抗性的培养皿中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。
5)重组质粒的制备：挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。
6)测序鉴定阳性克隆，经过比对，重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致，因此载体构建成功。
2.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑并构建HCT116-ITPRIPL1敲除细胞系。
将HCT116细胞(ATCC，VA，美国)以合适的密度(第二日生长至密度约30-40％左右)铺置于24孔板(康宁，NY，美国)中，次日消化计数，先以GFP对照慢病毒(吉满，上海，中国)数量梯度以感染细胞，48小时后换液，72小时后镜下观察GFP荧光以确定最佳病毒细胞感染比，以探索MOI值。确 定MOI值后，重新铺板，以含有杀稻瘟菌素抗性的Cas9系统慢病毒(吉满，上海，中国)以MOI值感染HCT116细胞，48小时后换液，72小时后加入浓度梯度的杀稻瘟菌素(Invivogen，CA，美国)以筛选10-14天，最终筛选所得的细胞系即含有Cas9系统的HCT116细胞。再将含有Cas9系统的HCT116细胞于24孔板中铺板计数，以含有嘌呤霉素抗性的特定切割ITPRIPL1的sgRNA的慢病毒以MOI值进行感染，48小时后换液，72小时后进入浓度梯度的嘌呤霉素(Invivogen，CA，美国)进行筛选10-14天，即得HCT116-ITPRIPL1敲除细胞系。
3.流式细胞术证明敲降肿瘤细胞表达的ITPRIPL1可显著增加人外周血单核细胞对肿瘤细胞的杀伤。
将CD3与CD28抗体(Invitrogen，CA，美国)与PBMC(ATCC，VA，美国)混合稀释使得其终浓度为1微克每毫升以激活T细胞，培养过夜。次日将PBMC与HCT116野生型(ATCC，VA，美国)/ITPRIPL1过表达/ITPRIPL1敲除细胞计数，分别调整细胞数为1x10 6每毫升，对照组加入100微升肿瘤细胞与100微升培养液，实验组肿瘤细胞与PBMC各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，置于培养箱中孵育6小时。取出96孔板，PBS(美仑，大连，中国)润洗后用不含EDTA的胰酶(碧云天，上海，中国)将细胞消化，置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(美仑，大连，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置不加PBMC不染组、不加PBMC双染组、加入PBMC不染组、加入PBMC单染Annexin V-FITC组、加入PBMC单染PI组、加入PBMC双染组与各加入IT1蛋白的双染组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(美仑，大连，中国)与10微升PI(美仑，大连，中国)，室温慢摇孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
图27的(a)和(b)表示依据CD45来划分肿瘤细胞。图27的(c)为不同ITPRIPL1表达条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图28为图27的(c)中各条件下具体凋亡染色情况。上述结果表明ITPRIPL1过表达能降低PBMC对于肿瘤细胞的杀伤而敲除ITPRIPL1能促进PBMC对于肿瘤细胞的杀伤。
实施例10：以ITPRIPL1-RBD蛋白作为免疫原制备的抗体能有效促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤
将CD3与CD28抗体(Invitrogen，CA，美国)与PBMC(ATCC，VA，美国)混合稀释使得其终浓度为1微克每毫升以激活T细胞，培养过夜。次日将PBMC与HCT116细胞(ATCC，VA，美国)计数，分别调整细胞数为1x10 6每毫升，对照组加入100微升HCT116细胞与100微升培养液，实验组两种细胞各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，实验组中再有4组各自加入1：500/250/125/62.5的ITPRIPL1多克隆抗体，置于培养箱中孵育6小时。取出96孔板，PBS(美仑，上海，中国)润洗后用不含EDTA的胰酶(碧云天，上海，中国)将细胞消化，置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与 洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(美仑，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置不加PBMC不染组、不加PBMC双染组、加入PBMC不染组、加入PBMC单染Annexin V-FITC组、加入PBMC单染PI组、加入PBMC双染组与各加入ITPRIPL1蛋白的双染组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(美仑，上海，中国)与10微升PI(美仑，上海，中国)，室温慢摇孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
图29的(a)和(b)表示依据CD45来划分HCT116细胞。图29的(c)为不同多克隆抗体浓度条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图30为图29的(c)中各条件下具体凋亡染色情况。上述结果表明ITPRIPL1多克隆抗体能促进PBMC对于肿瘤细胞的杀伤。
实施例11：ITPRIPL1-RBD2序列突变体与CD3E结合能力有一定程度的降低，ITPRIPL1-RBD3与CD3ε结合能力显著下降
1.构建HCT116-RBD2与RBD3序列突变体
基于已公开序列(NCBI参考序列NM_001008949.3)，分别选中胞外区(25-103氨基酸)中的DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAENFWTGDTSSDQ(ITPRIPL1-RBD2，即SEQ ID NO:2)、MDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAEN(ITPRIPL1-RBD3，即SEQ ID NO:3)为两段不同的目标序列，合成特定ITPRIPL1序列突变体，以pcDNA3.1为载体，其中胞外区、胞外区和跨膜区C末端融合至Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)，从而产生含有Flag标签与绿色荧光蛋白(GFP)的ITPRIPL1胞外区、ITPRIPL1-RBD2、ITPRIPL1-RBD3质粒。
2.免疫共沉淀实验分析ITPRIPL1-RBD2为与CD3E结合的最短序列。
将含有Flag标签的ITPRIPL1胞外区、ITPRIPL1-RBD2、ITPRIPL1-RBD3与HA标签的CD3E的pcDNA3.1质粒分别共转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)中，置于六孔板(康宁，NY，美国)培养48-72小时至蛋白充分表达后，用1：100免疫沉淀裂解液(赛默飞，MA，美国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)混合裂解液裂解并刮取细胞，一部分细胞样本经离心、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得输入量蛋白样本；剩余细胞样本用HA标签特异性鼠抗体(Biolegend，CA，美国)或Flag标签特异性鼠抗体(CST，MA，美国)进行免疫沉淀，经PBS清洗、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得免疫沉淀蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置12.5％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以ITPRIPL1胞外区、ITPRIPL1-RBD2、ITPRIPL1-RBD3与CD3E-HA蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用Flag标签特异性兔抗体(Abcam，MA，美国)和HA标签特异性兔抗体(CST，MA，美国)分别孵育ITPRIPL1胞外区、ITPRIPL1-RBD2、ITPRIPL1-RBD3与CD3E-HA相应条带，四度过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣， 上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
图31的(a)显示了输入量蛋白中不同ITPRIPL1序列突变体与CD3ε的含量，图31的(b)显示了间接沉淀(因与CD3ε结合)的ITPRIPL1不同序列的突变体，与直接沉淀的CD3ε。图31的(c)显示了输入量蛋白中不同ITPRIPL1序列突变体与CD3ε的含量，图31的(d)显示了间接沉淀(因与ITPRIPL1不同序列的突变体结合)的CD3E，与直接沉淀的ITPRIPL1不同序列的突变体。上述结果表明，在ITPRIPL1的胞外区和RBD2序列突变体存在的情况下，CD3E和ITPRIPL1保持结合状态；而RBD3序列则不能检测到明显的结合。由上可得ITPRIPL1胞外区的长度或完整程度与CD3E结合的能力存在正向相关性。
实施例12：分离的ITPRIPL1-RBD蛋白具有结合NRP2的能力
1.酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证实分离的ITPRIPL1(IT1)胞外区片段与NRP2胞外区存在浓度依赖的直接结合。
使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用0.03125/0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的ITPRIPL1-RBD重组蛋白各溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，再以用1微克每毫升的NRP2胞外区蛋白质片段(义翘神州，北京，中国)进行孵育结合，该NRP2蛋白带有hFc标签(N2-Fc)，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗人Fc段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，用显色液(生工，上海，中国)进行显色，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
如图32所示，该实验表明，分离的ITPRIPL1胞外区片段与NRP2胞外区存在浓度依赖的直接结合。上述结果证明分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白(IT1-RBD)与NRP2胞外区纯化蛋白直接结合，且呈浓度依赖性。
2.流式细胞术证明NRP2以更高效率结合过表达ITPRIPL1的细胞。
经检测，HEK293细胞内源表达一定水平的ITPRIPL1，稳转表达后表达水平进一步升高。将培养的293E野生型细胞(ATCC，VA，美国)与293E-ITPRIPL1稳转株细胞消化后计数，分别调整细胞数为2x10 6每毫升，加入200微升分别至96孔板(costar，ME，美国)各孔中。向各实验组孔中分别加入0/0.5/1/2/4微克每毫升的NRP2蛋白(义翘神州，北京，中国)。将96孔板置于细胞培养箱中，静置30分钟，而后取出，转移至EP管(Axygen，CA，美国)中400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。用细胞染色缓冲液按1:1000稀释抗人IgG Alexa Fluor 647抗体(Invitrogen，CA，美国)，除阴性对照外，每支EP管中加入200微升抗体稀释液，室温下摇床上40rpm孵育30分钟。而后取出EP管，400rcf离心5分钟后弃去上清。用1000微升细胞染色缓冲液重悬洗涤细胞，400rcf离心5分钟后再次弃去上清并重复洗涤。洗涤完成后，各EP管加入300微升细胞染色缓冲液重悬，转移至流式管(Falcon，NY， 美国)中，进行上机分析(美天旎，科隆，德国)。
图33的(a)为不划入死亡细胞的阈值设定。图33的(b)反映ITPRIPL1表达情况不同的细胞与NRP2蛋白的结合情况。图34则分别为图33的(b)中各条件下具体染色及蛋白结合情况。上述结果表明NRP2能与有一定ITPRIPL1表达量的293E结合，并能更强地结合过表达ITPRIPL1的293E细胞。
实施例13：分离的ITPRIPL1-RBD蛋白具有向表达NRP2蛋白的分化THP1巨噬细胞传递抑制信号的能力
萤光素报告实验证明游离的分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白(IT1-RBD)能抑制不激活条件下的PMA诱导分化完成的THP1-dual细胞IFN增殖信号。
将培养的THP1-dual细胞(Invivogen，CA，美国)计数，1000rpmx5分钟离心后用不含抗生素的RPMI-1640培养基(Gibco，CA，美国)重悬调整细胞数为2x10 6每毫升，透明96孔板(赛默飞，MA，美国)中每孔加入200微升细胞与20纳克每毫升的PMA试剂(Invivogen，CA，美国)诱导，培养箱培养3小时后PBS清洗并更换培养基。72小时后再次更换培养基并分别加入0/1/2/4/8微克每毫升的游离的分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白，置于细胞培养箱中培养18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板，各孔加入50微升Quanti-luc试剂(Invivogen，CA，美国)与10微升细胞混合液，加入混匀后用多功能酶标仪立即检测信号。
如图35所示，上述结果表明游离的分离的ITPRIPL1的胞外区纯化蛋白(IT1-RBD)能抑制不激活条件下的PMA诱导分化完成的THP1-dual细胞IFN增殖信号。由上可得分离的ITPRIPL1-RBD蛋白具有向表达NRP2蛋白的分化THP1巨噬细胞传递抑制信号的能力。
实施例14：纯化得到的IT1-RBD-Fc蛋白具有抑制T细胞信号与杀伤的功能
1.分离纯化IT1-RBD-Fc蛋白。
基于已公开序列(NCBI参考序列NM_001008949.3)，选中胞外区(HPLMVSDRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAENFWTGDTSSDQLVLGKKDMGWPFQADGQEG)作为IT1-RBD1，即胞外区除去信号肽的所有部分；其中的DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAENFWTGDTSSDQ作为IT1-RBD2，即在RBD1的基础上去除了N端的多个保守序列氨基酸，以及C端的多个保守与非保守序列氨基酸(用于验证哺乳动物保守的氨基酸位点对于功能的重要性)；
MDLDTLARSRQLEKRMSEEMRLLEMEFEERKRAAEQRQKAEN作为IT1-RBD3(仅保留了预测为Alpha螺旋二级结构的序列，验证该二级结构是否为功能所需的最小序列)，其后串联不含CH1区的Fc序列
(PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)，以pcDNA3.1为载体，构建相应质粒。上述的几个ITPRIPL1胞外区的突变衍生序列见图54所示。
通过该实施例，对ITPRIPL1的胞外区发挥功能的序列进行表征。利用ITPRIPL1胞外区功能片段 的AlphaFold预测结构与CD3E的x线衍射晶体结构(1XIW.pdb)进行蛋白-蛋白对接，分析得出图54所示的人类、小鼠、大鼠、绿猴、金丝猴、黑金丝猴、玻利维亚松鼠猴、马氏夜猴、黑猩猩等多个种属的ITPRIPL1都能够结合CD3E，这与实施例2中免疫荧光及共定位分析的结果一致。
因此根据不同种属的差异位点，获得具备结合CD3E功能的RBD1衍生序列：
DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRxLEMEFEERxxxAExxQKxENxWxGxTSxDQ(其中x代表可替换的氨基酸)。
本实施例针对RBD1,RBD2,RBD3进行了功能检测分析。
获取质粒后，通过PEI试剂(李记，上海，中国)转染至293E细胞(ATCC，VA，美国)，120小时后，用RIPA裂解液(碧云天，上海，中国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)冰上裂解细胞10分钟，12000rpm离心15分钟后吸取上清，用1：100的蛋白A磁珠(天地人和，常州，中国)室温130rpm摇动2小时，将混合液吸入预先用平衡液(20mM磷酸氢二钠，0.15M氯化钠，pH7.0)平衡的过滤柱(密理博，MA，美国)，平衡液清洗两次后，用洗脱液(0.1M甘氨酸，pH3.0)：中和液(1M Tris-HCl，pH8.5)＝16:1进行洗脱，洗脱所得即为纯化的IT1-RBD-Fc蛋白。用Nanodrop分光光度计测定蛋白浓度，置于-20℃保存。
2.萤光素报告实验证明纯化得到的IT1-RBD1-Fc蛋白能抑制ConA激活与不激活条件下的Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号。
培养的Jurkat-dual细胞(Invivogen，CA，美国)计数，1000rpmx5分钟离心后用不含抗生素的IMDM培养基(Gibco，CA，美国)重悬调整细胞数为2x10 6每毫升，透明96孔板中每孔加入200微升细胞。各孔分别加入0/4微克每毫升提纯的IT1-RBD1/RBD2/RBD3的Fc蛋白。置于细胞培养箱中反应两小时后，各孔加入50微克每毫升刀豆蛋白A(ConA)(阿拉丁，上海，中国)作为激活组或等体积去内毒素水作为不激活组，置于细胞培养箱中反应18-24小时。反应完成后，取不透明96孔板(costar，ME，美国)，各孔加入50微升Quanti-luc试剂(Invivogen，CA，美国)与20微升反应混合液，加入混匀后用多功能酶标仪立即检测信号。
如图36所示，在50微克每毫升ConA激活与不激活的条件下，加入4微克每毫升不同IT1-RBD段的Fc蛋白条件下Jurkat-dual细胞的NFKB信号变化。上述结果表明纯化得到的IT1-RBD1-Fc蛋白能抑制ConA激活与不激活条件下的Jurkat-dual细胞NFKB增殖信号，且随着序列逐渐缩短，抑制效果逐渐减弱。
3.流式细胞术证明纯化得到的IT1-RBD1-Fc重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤。
HEK293细胞被广泛用于创建自身免疫疾病模型，进行肾脏自身免疫疾病、神经系统自身免疫疾病、系统性红斑狼疮(SLE)等，进行疾病进展情况、分子细胞生物学机制以及药理学研究(Stepanenko AA,Gene.2015Sep 15；569(2):182-90、Hira S.J Physiol Sci.2019Sep；69(5):723-732.、Keskitalo S,,Front Immunol.2019Dec 5；10:2770.)。此外，HEK293细胞还被用于构建移植后排斥疾病模型(Yi Gao.Int J Clin Exp Med.2014；7(11):4572–4583、Lorber,Marc I，Transplantation:1999–67(6)-p 897-903、Pabois A,Biochem Pharmacol.2016Mar 15；104:95-107)、抗病毒感染免疫反应(Ismail Cem Yilmaz, Allergy.2021Sep 14.doi:10.1111/all.15091、Elizabeth A Reap,Vaccine.2007Oct 16；25(42):7441-9)、肿瘤免疫反应等(A A Stepanenko,Gene.2015Sep 15；569(2):182-90)。
此外，来源于自身免疫疾病或正常人的外周血单个核细胞(PBMC)也在诸多研究中用于构建自身免疫疾病模型(Yoshikawa N.Horm Metab Res.1994Sep；26(9):419-23.)、移植后排斥(Transplant Proc.2016Oct；48(8):2840-2844.)、抗感染免疫反应(Har-Noy M,J Transl Med.2020May 12；18(1):196、Nakamura-Hoshi M,Sci Rep.2020Jul 9；10(1):11394.)、抗肿瘤免疫反应等(Zhuang X,Cancer Immunol Res.2019Jun；7(6):939-951)，其中涉及到的靶细胞亦包括HEK293细胞。实际上基于PBMC人源化的NSG小鼠模型，其作用效果与体外的PBMC与靶细胞的作用高度相关，因此基于PBMC与靶细胞的体外模型对于疾病过程和药效的体现具有不容忽视的作用。
本实施例采用HEK293细胞作为自身免疫、移植排斥、过敏反应、抗肿瘤反应的靶细胞，将人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞，通过具有代表性的疾病模型，示范基于ITPRIPL1的调节剂对抗原递呈细胞与T细胞相互作用的影响，以及对上述不同疾病的干预作用。
其实施过程详述如下：将CD3与CD28抗体(Invitrogen，CA，美国)与PBMC(ATCC，VA，美国)混合稀释使得其终浓度为1微克每毫升以激活T细胞，培养过夜。次日将PBMC与293E野生型(ATCC，VA，美国)/ITPRIPL1过表达细胞计数，分别调整细胞数为1x10 6每毫升，对照组加入100微升293E野生型/ITPRIPL1过表达细胞与100微升培养液，实验组将PBMC与另一种细胞各加入100微升至96孔板(costar，ME，美国)中，实验组中再有3组野生型293E细胞分别加入2微克每毫升的IT1-RBD1/RBD2/RBD3-Fc蛋白，置于培养箱中孵育6小时。取出96孔板，吸收细胞，置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(碧云天，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置不加PBMC不染组、不加PBMC双染组、加入PBMC不染组、加入PBMC单染Annexin V-FITC组、加入PBMC单染PI组、加入PBMC双染组与各加入IT1蛋白的双染组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(碧云天，上海，中国)与10微升PI(碧云天，上海，中国)，室温慢摇孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
图37的(a)表示依据CD45来划分293E细胞。图37的(b)为不同ITPRIPL1表达与不同蛋白条件下依据各组凋亡数据所计算出的PBMC相对杀伤活性。图38为图37的(b)中各条件下具体凋亡染色情况。上述结果表明纯化得到的IT1-RBD1-Fc重组蛋白可降低人外周血单核细胞(PBMC)对肾脏来源的H3K293细胞的杀伤，且随着序列逐渐缩短，降低效果逐渐减弱。
4.免疫印迹法实验表明ITPRIPL1-RBD重组蛋白与纯化得到的IT1-RBD1-Fc重组蛋白具有抑制CD3E下游的ZAP70与Akt通路的功能。
将培养的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，取4x10 6个细胞至15ml离心管(康宁，NY，美国)，800rpmx4分钟离心后弃去上清，用不含血清的RPMI1640培养基(美仑，大连，中国)重悬，置于培养箱中饥饿培养3小时，800rpmx4分钟离心，4毫升完全培养基(美仑，大连，中国)重悬，各取1毫升 于12孔板(康宁，NY，美国)各孔中，各孔分别加入：不处理；4微克每毫升IT1-RBD蛋白；4微克每毫升RBD1-Fc蛋白；4微克每毫升RBD2-Fc蛋白。充分混匀后置于培养箱中培养10min后取出，将细胞转移至1.5mlEP管(Axygen，CA,美国)中，800rpmx4分钟离心，PBS重悬清洗并离心，重复清洗。离心完成后弃去上清，按1:100配置RIPA裂解液(碧云天，上海，中国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)，每管细胞加入80微升混合裂解液。各EP管于液氮-冰上进行三冻三融，最后一次融化后12000rpm 4摄氏度条件下离心15分钟。离心完成后取上清，离心后上清:5x上样缓冲液(碧云天，上海，中国)按4:1配置成各细胞样品，置于100摄氏度金属浴中10分钟变性以制得蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置10％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以Akt、ZAP70与GAPDH蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用pAkt特异性兔抗体(CST，MA，美国)、Akt特异性兔抗体(CST，MA，美国)、pZAP70特异性兔抗体(CST，MA，美国)、GAPDH抗体(康臣，上海，中国)分别孵育相应条带，四度过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
图39的(a)和(b)分别为免疫印迹法中GAPDH内参调齐后的磷酸化Akt与磷酸化ZAP70的表达情况，其中Akt磷酸化与ZAP70磷酸化经ITPRIPL1-RBD重组蛋白与纯化得到的IT1-RBD-Fc蛋白处理后均有一定程度的降低，而IT1-RBD1-Fc重组蛋白的磷酸化降低较IT1-RBD2-Fc蛋白更为明显。实验结果表明ITPRIPL1-RBD重组蛋白与纯化得到的IT1-RBD1-Fc蛋白具有降低CD3E下游的Akt与ZAP70磷酸化的作用，从而说明其具有抑制相应T细胞通路的功能。
5.免疫印迹法实验表明CD3E蛋白具有阻断ITPRIPL1-RBD1-Fc重组蛋白对磷酸化ZAP70与Akt通路影响的功能。
将培养的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，取4x10 6个细胞至15ml离心管(康宁，NY，美国)，800rpmx4分钟离心后弃去上清，用不含血清的RPMI1640培养基(美仑，大连，中国)重悬，置于培养箱中饥饿培养3小时，800rpmx4分钟离心，4毫升完全培养基(美仑，大连，中国)重悬，各取1毫升于12孔板(康宁，NY，美国)各孔中，各孔分别加入：不处理；4微克每毫升RBD1-Fc蛋白；4微克每毫升RBD1-Fc蛋白+4微克每毫升CD3E蛋白。充分混匀后置于培养箱中培养10min后取出，将细胞转移至1.5mlEP管(Axygen，CA,美国)中，800rpmx4分钟离心，PBS重悬清洗并离心，重复清洗。离心完成后弃去上清，按1:100配置RIPA裂解液(碧云天，上海，中国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)，每管细胞加入80微升混合裂解液。各EP管于液氮-冰上进行三冻三融，最后一次融化后12000rpm 4摄氏度条件下离心15分钟。离心完成后取上清，离心后上清:5x上样缓冲液(碧云天，上海，中国)按4:1配置成各细胞样品，置于100摄氏度金属浴中10分钟变性以制得蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置10％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑 完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以Akt、ZAP70、ERK与GAPDH蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用pAkt特异性兔抗体(CST，MA，美国)、Akt特异性兔抗体(CST，MA，美国)、pZAP70特异性兔抗体(CST，MA，美国)、ZAP70特异性图抗体(CST，MA，美国)，pERK特异性兔抗体(CST，MA，美国)，ERK特异性兔抗体(CST，MA，美国)，GAPDH抗体(康臣，上海，中国)分别孵育相应条带，四度过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
图41为对应磷酸化通路改变的免疫印迹法实验结果。如图所示，Akt、ZAP70、ERK的磷酸化均于ITPRIPL1-RBD1-Fc加入后出现明显降低，以ZAP70为最明显；加入CD3E蛋白后，该磷酸化的下降趋势被抵消。实验结果表明CD3E可以阻断ITPRIPL1-RBD1-Fc蛋白对磷酸化通路的调控作用，ITPRIPL1-RBD-Fc通过CD3对T细胞磷酸化通路进行调控。
实施例15：ITPRIPL1调控T细胞功能需要CD3的正确构象改变与PRS段
1.构建CD3突变体Jurkat细胞
将培养的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，取2x10 5个细胞至24孔板(康宁，NY，美国)各孔中，铺板过夜。将500微升完全培养基(美仑，大连，中国)与以MOI值100计算的针对CD3的敲除慢病毒(吉玛，上海，中国)混合，进行病毒感染。48小时后换液。继续培养24小时后，加入1微克每毫升的嘌呤霉素进行为期一周的筛选。筛选结束后即得CD3敲除的Jurkat细胞株。
将CD3敲除的Jurkat细胞计数，取2x10 5个细胞至24孔板各孔中，铺板过夜。将500微升完全培养基与以MOI值100计算的CD3-K76T(无法进行正确的构象改变)与CD3-ΔPRS(PRS段改变)过表达病毒混合，进行病毒感染。48小时后换液。继续培养24小时后，加入600微克每毫升的遗传霉素(Geneticin，G418)(Gibco，CA，美国)进行为期一周的筛选。筛选结束后即得CD3突变的Jurkat细胞株。
2.免疫印迹法实验表明ITPRIPL1对T细胞的磷酸化通路调控需要CD3的构象改变与PRS段
将野生型Jurkat细胞、CD3敲除Jurkat细胞、CD3-K76T Jurkat细胞、CD3-ΔPRS细胞计数，取1x10 6个细胞至12孔板(康宁，NY，美国)各孔中，加入10微克每毫升OKT3激活后，各分别不处理或加入4微克每毫升ITPRIPL1-RBD1-Fc处理，培养10分钟后收取细胞。将细胞转移至1.5mlEP管(Axygen，CA,美国)中，800rpmx4分钟离心，PBS重悬清洗并离心，重复清洗。离心完成后弃去上清，按1:100配置RIPA裂解液(碧云天，上海，中国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)，每管细胞加入80微升混合裂解液。各EP管于液氮-冰上进行三冻三融，最后一次融化后12000rpm 4摄氏度条件下离心15分钟。离心完成后取上清，离心后上清:5x上样缓冲液(碧云天，上海，中国)按4:1配置成各细胞样品，置于100摄氏度金属浴中10分钟变性以制得蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置10％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120 伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以Akt、ZAP70、ERK与GAPDH蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用pAkt特异性兔抗体(CST，MA，美国)、Akt特异性兔抗体(CST，MA，美国)、pZAP70特异性兔抗体(CST，MA，美国)、ZAP70特异性图抗体(CST，MA，美国)，pERK特异性兔抗体(CST，MA，美国)，ERK特异性兔抗体(CST，MA，美国)，GAPDH抗体(康臣，上海，中国)分别孵育相应条带，四度过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
图42为各CD3突变体Jurkat细胞在ITPRIPL1-RBD1-Fc蛋白作用下的免疫印迹法所显示的磷酸化通路变化。结果表明，野生型Jurkat细胞中ITPRIPL1所导致的下降的磷酸化，于CD3敲除/K76T突变/ΔPRS突变Jurkat细胞中并未观测到，表明ITPRIPL1对T细胞的磷酸化通路调控需要CD3的构象改变与PRS段。
3.细胞内钙离子流荧光染色实验表明ITPRIPL1具有降低T细胞活性的作用
将培养的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，取5x10 5个细胞至12孔板(康宁，NY，美国)各孔中，予以PBS或2微克每毫升ITPRIPL1-RBD蛋白进行处理24小时。处理完毕后，予以4微摩尔Fluo-8AM(Abcam，MA，美国)细胞内钙离子指示剂进行染色，于培养箱中避光孵育1小时。HHBS缓冲液(Solarbio，北京，中国)清洗2次后，置于荧光显微镜下观察。
图43为荧光显微镜下所观察到的细胞内钙离子流信号强度。实验结果表明，ITPRIPL1具有显著降低Jurkat细胞内钙离子流的功能，表明ITPRIPL1具有降低T细胞活性的作用。
4.细胞内钙离子流荧光染色实验表明ITPRIPL1具有降低T细胞活性的作用依赖于CD3的构象改变与PRS段
将野生型Jurkat细胞、CD3敲除Jurkat细胞、CD3-K76T Jurkat细胞、CD3-ΔPRS细胞计数，取5x10 5个细胞至12孔板(康宁，NY，美国)各孔中，分别予以PBS或4微克每毫升ITPRIPL1-RBD1-Fc蛋白进行处理24小时。处理完毕后，予以4微摩尔Fluo-8AM(Abcam，MA，美国)细胞内钙离子指示剂进行染色，于培养箱中避光孵育1小时。HHBS缓冲液(Solarbio，北京，中国)清洗2次后，置于荧光显微镜下观察。
图44为荧光显微镜下所观察到的各细胞内钙离子流信号强度。实验结果表明，于CD3敲除/K76T突变/ΔPRS突变Jurkat细胞中并未观测到ITPRIPL1对野生型Jurkat细胞内钙离子流的显著影响，说明ITPRIPL1对T细胞的信号调控需要CD3的构象改变与PRS段。
实施例16：ITPRIPL1通过调控CD3-Nck结合调控T细胞信号与功能
1.免疫印迹法实验证明ITPRIPL1-RBD1-Fc蛋白能够浓度依赖地增加CD3与Nck的结合信号。
将培养的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，取5x10 6个细胞至15ml离心管(康宁，NY，美国)，800rpmx4分钟离心后弃去上清，用不含血清的RPMI1640培养基(美仑，大连，中国)重悬，置于培养箱中饥饿培养3小时，800rpmx4分钟离心，5毫升完全培养基(美仑，大连，中国)重悬，各取1毫升于12孔板(康宁，NY，美国)各孔中，先加入10微克每毫升OKT3进行激活处理，并同时各孔分别加 入：不处理；0.5/1/2/4微克每毫升RBD1-Fc蛋白。充分混匀后置于培养箱中培养5min后取出，将细胞转移至1.5mlEP管(Axygen，CA,美国)中，800rpmx4分钟离心，PBS重悬清洗并离心，重复清洗。离心完成后弃去上清，按1：100免疫沉淀裂解液(赛默飞，MA，美国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)，每管细胞加入200微升混合裂解液。一部分细胞样本经离心、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得输入量蛋白样本；剩余细胞样本用CD3E特异性鼠抗体(Santa cruz biotechnology，CA，美国)进行免疫沉淀，经PBS清洗、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得免疫沉淀蛋白样品。离心后上清:5x上样缓冲液(碧云天，上海，中国)按4:1配置成各细胞样品，置于100摄氏度金属浴中10分钟变性以制得蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置10％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以CD3E、Nck蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用CD3E特异性兔抗体(CST，MA，美国)、Nck特异性兔抗体(CST，MA，美国)分别孵育相应条带，四度过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
如图45所示，上述结果表明ITPRIPL1-RBD1-Fc蛋白能上调CD3与Nck的结合，并呈现出浓度依赖性。由上可得ITPRIPL1能够浓度依赖地增加CD3与Nck的结合信号。
2.邻近连接实验证明ITPRIPL1-RBD1-Fc蛋白能够增加CD3与Nck的结合信号。
将培养的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，取2x10 6个细胞至15ml离心管(康宁，NY，美国)，800rpmx4分钟离心后弃去上清，用不含血清的RPMI1640培养基(美仑，大连，中国)重悬，置于培养箱中饥饿培养3小时，800rpmx4分钟离心，2毫升完全培养基(美仑，大连，中国)重悬，各取1毫升于12孔板(康宁，NY，美国)各孔中，先加入10微克每毫升OKT3进行激活处理，并同时各孔分别加入：不处理；4微克每毫升RBD1-Fc蛋白。置于培养箱5分钟后取出Jurkat细胞，并按照邻近链接实验试剂盒附赠的说明书(默克，NJ，美国)使用试剂盒内试剂以及CD3E特异性鼠抗体(Santa cruz biotechnology，CA，美国)与、Nck特异性兔抗体(CST，MA，美国)进行相关操作。封片完成后，置于荧光显微镜下观察。
如图46所示，邻近连接实验表明ITPRIPL1-RBD1-Fc蛋白能显著增加CD3与Nck的结合，从而调控T细胞信号与功能。
实施例17：ITPRIPL1具有体内调控免疫与T细胞功能的作用，促进肿瘤的免疫逃逸
1.构建人源化CD3ε小鼠MC38皮下移植瘤体内模型
将构建的全长ITPRIPL1-Flag质粒以及空载pcDNA3.1质粒分别转染至MC38细胞(Kerafast，MA，美国)，置于培养箱中培养24-48小时后，加入200微克每毫升的遗传霉素(Geneticin，G418)(Gibco，CA，美国)进行筛选，10-14天后至空载pcDNA3.1质粒转染组细胞全部死亡后，即得MC38-ITPRIPL1稳转株细胞。
选取6-8周龄的人源化CD3ε小鼠(南方模式，上海，中国)，依据体重随机分组，每组6只小鼠。取MC38野生型及MC38-ITPRIPL1稳转株细胞计数，并用PBS重悬至1.5x10 7每毫升细胞密度。将小鼠剃毛，于右侧腋下皮下接种1.5x10 6野生型或ITPRIPL1过表达MC38细胞，即为人源化CD3ε小鼠MC38皮下移植瘤体内模型的构建。
2.ITPRIPL1过表达显著增加小鼠体内肿瘤生长
人源化CD3ε小鼠MC38皮下移植瘤体内模型构建完成后，于接种后第五天起使用游标卡尺进行肿瘤大小的测量，每次测量肿瘤长径与短径，用1/2*A*a*a的公式计算肿瘤体积，每三天测量一次，对肿瘤体积进行记录。于接种后第23天对小鼠进行统一处死，剥离肿瘤后，称量肿瘤重量并统计。
如图47所示，肿瘤体积及肿瘤重量均显示ITPRIPL1过表达能显著增加肿瘤生长，具有体内功能。由于ITPRIPL1在人类肿瘤中广泛表达上调(见本申请的其他实施例)，本实施例的结果表明，ITPRIPL1在人类肿瘤中发挥促进免疫逃逸的作用。因此，针对ITPRIPL1的抑制剂具有抑制肿瘤生长的作用，ITPRIPL1的调节剂在肿瘤治疗药物的制备中具有应用价值。
3.流式细胞术表明ITPRIPL1过表达抑制小鼠体内T细胞活性
利用心脏采血的方式，从小鼠体内取得至少1ml外周血。利用小鼠外周血PBMC分离试剂盒(Solarbio，北京，中国)，按照试剂盒相应说明书进行操作，得到小鼠PBMC细胞。
将小鼠PBMC置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释鼠CD8-APC抗体(Biolegend，CA，美国)，鼠CD69-APC抗体(Biolegend，CA，美国)，鼠CD137-APC抗体(Biolegend，CA，美国)各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用500微升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入200微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
如图48所示，根据平均荧光强度，ITPRIPL1过表达能显著降低CD8、CD25、CD139的表达。该实验结果表明ITPRIPL1过表达能抑制小鼠体内T细胞活性。
4.免疫组织化学染色表明ITPRIPL1过表达减少肿瘤内T细胞浸润
将MC38肿瘤组织剥离后进行切片以及石蜡包埋处理(百奥斯，武汉，中国)。将所得石蜡切片进行脱蜡、水化、抗原修复等处理后，予以鼠CD8抗体(CST，MA，美国)湿盒孵育过夜。次日复温后按试剂说明书进行二抗孵育，DAB染色(Solarbio，北京，中国)以及苏木紫染色(Solarbio，北京，中国)后，逆酒精浓度梯度风干并封片。封片完成后，置于荧光显微镜下使用自然光观察并拍照。
如图49所示，ITPRIPL1过表达能显著降低CD8于肿瘤组织中的阳性率。该实验结果表明ITPRIPL1过表达能降低MC38肿瘤组织中T细胞的浸润。
5.构建ITPRIPL1杂合/纯合敲除小鼠体内模型
采用CRISPR/Cas9技术，利用非同源重组修复引入突变的方式，造成Itpripl1基因蛋白读码框移码，功能缺失。简要过程如下：通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；将Cas9 mRNA和gRNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得6只阳性F1代小鼠。即得杂合敲除及纯合敲除ITPRIPL1的小鼠。
6.流式细胞术表明ITPRIPL1敲除增强T细胞活性
从小鼠模型中取血、分离PBMC。对细胞悬液进行细胞计数。细胞计数后用PBS溶液稀释，调整待检测细胞浓度为10 6个/mL。取200ul细胞悬液，1000rpm离心5min(4℃)。将细胞重悬于100ul PBS；设置检测管如下：
阴性对照管：100ul细胞悬液；
CD39检测管：100ul细胞悬液加入PD1的抗体2ul，轻轻混匀；
CD73检测管：100ul细胞悬液加入PD-L1的抗体2ul，轻轻混匀；
抗体均为(赛默飞，MA，美国)。
4℃避光孵育30分钟。孵育结束后，使用流式细胞仪进行检测。
如图50所示，ITPRIPL1敲除后抑制性表面分子CD39、CD73均显著降低，提示ITPRIPL1敲除能增强体内T细胞活性，验证ITPRIPL1本身对于T细胞的负向调控作用。
7.ELISA检测表明ITPRIPL1敲除增加免疫激活细胞因子分泌
将小鼠PBMC按细胞因子颗粒酶A、颗粒酶B、IL-2、TNF-alpha、IL-21的ELISA试剂盒说明书(Abnova，CA，美国)进行操作与处理，得到相对应的实验结果。
如图51所示，ITPRIPL1敲除增加颗粒酶A、颗粒酶B、IL-2、TNF-alpha、IL-21等细胞因子的分泌量，说明ITPRIPL1敲除后体内免疫激活因子分泌增加，提示ITPRIPL1本身的免疫抑制作用。
8.免疫组织化学染色表明ITPRIPL1敲除增加睾丸组织中T细胞浸润
将小鼠睾丸组织剥离并进行染色与切片(基尔顿，上海，中国)，并置于荧光显微镜下观察相应结果。
如图52所示，免疫组织化学染色表明ITPRIPL1敲除后，睾丸中CD3、CD4、CD8的阳性率增加，提示T细胞浸润增加。相应地，杂合和纯合敲除的小鼠精子形态异常，运动方式异常，活力显著降低，与睾丸发生的显著炎症浸润相符合，作为睾丸组织自身免疫紊乱的有力支持证据。上述结果说明ITPRIPL1在睾丸中生理条件下负向调控T细胞活性，ITPRIPL在维持睾丸的免疫豁免状态方面发挥关键作用。因此，ITPRIPL1的表达可能用于预测睾丸自身免疫疾病和自身免疫性不孕不育的发生，调节ITPRIPL1的活性可用于自身免疫性不孕不育的干预和治疗。
实施例18：ITPRIPL1作为生物标志物用于指示肿瘤细胞在体内的存在、预测肿瘤的进展和分期、区分肿瘤和正常组织的边界。
本申请创新性地揭示ITPRIPL1在肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用，ITPRIPL1表达升高的肿瘤适合使用ITPRIPL1的抑制剂以抑制肿瘤的生长。因此，检测ITPRIPL1的表达十分重要。本申请示范了应用ITPRIPL1的特异性抗体检测其表达的方法，并且揭示了ITPRIPL1的高表达能够用于指示肿瘤细胞在体内的存在，并且能够准确标记肿瘤组织和正常组织的边界。此外，ITPRIPL1还与肿瘤的进展分期显著相关。具体如下：
产生ITPRIPL1多克隆抗体的过程如前所述。进一步通过杂交瘤筛选和分离培养，制备ITPRIPL1的单克隆抗体。利用ITPRIPL1的抗体对多种肿瘤组织的芯片(上海芯超)进行免疫组化染色，扫描图片并统计ITPRIPL1表达水平和分布。如图53所示，ITPRIPL1于多类常见癌种蛋白水平显著表达 增加，并明显强于癌旁组织。同时ITPRIPL1与肿瘤的进展和分期显著相关。例如，在进展期的乳腺癌(3C、4期)表达显著高于早期(1期)；在进展期肺癌(4期)表达显著高于早期(1A期)；在结直肠癌和甲状腺癌中ITPRIPL1存在上述的进展期癌中高于早期癌的特点。该结果显示，ITPRIPL1生物标志物可用于指示肿瘤细胞在体内的存在，并且能够预测肿瘤的进展和分期。
ITPRIPL1在肿瘤组织中的染色呈现非常突出的一致性，首先，在上述多种肿瘤中ITPRIPL1存在普遍的显著上调，只有很少数的肿瘤存在例外现象。其次，ITPRIPL1在肿瘤组织中的表达存在很强的均一性，即在原发灶不同部位和转移灶的不同细胞中表达较为一致。这种特点在图56中可以观察到。ITPRIPL1在转移至淋巴结中肿瘤细胞中存在显著表达，可用于区分癌细胞组织和正常淋巴结组织；ITPRIPL1还在远处转移的肿瘤细胞中显著高表达，因此可以用于区分转移灶和正常组织。ITPRIPL1的上述特点，使其适合用于区分肿瘤和正常细胞和组织，以及准确标定肿瘤和正常细胞与组织的边界。这种标志物适合用于治疗前后肿瘤大小和浸润程度的分析。因此，ITPRIPL1的表达是一种ITPRIPL1调节剂药物的重要伴随诊断标志物。同时，较低的异质性使得ITPRIPL1作为一种非常有潜力的肿瘤诊断生物标志物。
实施例19：鼠杂交瘤抗体能特异性地结合ITPRIPL1
1.制备ITPRIPL1小鼠杂交瘤抗体
(1)将人类ITPRIPL1-Fc重组蛋白(如SEQ ID NO:21所示)作为免疫原，对C57BL/6小鼠进行免疫，进行多次免疫以增强效果：
1)初次免疫，抗原50μg/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，间隔3周；
2)第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周；
3)第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射间隔3周；
4)加强免疫，剂量50μg，腹腔注射。最后一次注射3天后采血测其效价。
(2)检测免疫效果达到要求后，再进行多次累积方式取血、分离多克隆抗体，并进行多克隆抗体纯化，具体实验步骤包括：
1)准备蛋白G sepharose CL-4B亲和柱。准备10mL蛋白G sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空15分钟以除去填料中的气泡。将蛋白G sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1mL/分-2mL/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子；
2)制备多克隆抗体。将多克隆抗体放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05％，4℃，15,000×g离心5分钟，移出澄清的多克隆抗体再经过滤器过滤除去多余的脂；
3)亲和层析。将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5mL的速度将多克隆抗体上到柱上，为保证多克隆抗体与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加Ph 2.7洗脱缓冲溶液，以0.5mL/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100μL中和缓冲溶液的1.5mL EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，pH低于7时利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。 在柱中加入10mL、pH1.9的洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至Aλ280nm<0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。
2.酶联免疫吸附剂测定(ELISA)对各杂交瘤抗体与ITPRIPL1的结合验证
为验证各杂交瘤抗体对ITPRIPL1的结合力，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证实各抗体与ITPRIPL1蛋白的直接结合。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用100微升(1微克每毫升)的ITPRIPL1重组蛋白(cusabio，武汉，中国)ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含TPRIPL1重组蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37℃封闭90分钟。PBST清洗后，温箱37℃结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图57为该ELISA实验结果。左上图为所有100株所得的抗体与ITPRIPL1蛋白结合的ELISA结果，右上图为从左上图结果挑选9株结合较好的抗体的单独重复实验结果。下图为13B7抗体的浓度依赖的结合曲线。实验表明，各抗体与ITPRIPL1结合力的强弱各不相同，表明抗体之间的异质性，而13B7为结合力最强的抗体。上述结果证明各杂交瘤能与ITPRIPL1有结合力各不相同的结合。
2.流式细胞术(FACS)对各杂交瘤抗体与ITPRIPL1的结合验证
为进一步验证各杂交瘤抗体对ITPRIPL1的结合力，采取流式细胞术(FACS)证实各抗体与ITPRIPL1蛋白的直接结合。将内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，调整细胞数为1x10 6/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，向每孔中分别加入终浓度为1微克每毫升的杂交瘤抗体或对照血清，培养箱孵育30分钟。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释抗鼠Fc段-Alexa Fluor 488抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入300微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试。
图58为该FACS实验结果，该实验显示各抗体与ITPRIPL1结合力的强弱各不相同，表现了抗体之间的异质性，其中13B7为结合力最强的抗体。
实施例20：13B7抗体能够以高亲和力特异性地结合ITPRIPL1
1.流式细胞术(FACS)验证13B7抗体对ITPRIPL1表达量不同的细胞结合
为进一步验证13B7对ITPRIPL1的结合力，采取流式细胞术(FACS)证实13B7抗体与ITPRIPL1表达量不同的各类细胞直接结合。将内源性ITPRIPL1表达量不同的细胞，即HCT116(ATCC，VA，美国)、A549(ATCC，VA，美国)、MC38(Kerafast，MA，美国)、Jurkat(ATCC，VA，美国)、Raji细胞(ATCC，VA，美国)以及MC38-ITPRIPL1稳转株细胞计数，调整细胞数为1x10 6/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，向每孔中分别加入终浓度为1微克每毫升的13B7抗体，培养箱 孵育30分钟。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释抗鼠Fc段-Alexa Fluor 488抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入300微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试。
图59为该FACS实验结果，该实验结果显示各细胞系与13B7抗体的结合力强弱与各细胞系表达ITPRIPL1蛋白的情况基本一致，表明13B7抗体能与表达ITPRIPL1的细胞系上的ITPRIPL1特异地结合。
2.流式细胞术(FACS)验证13B7抗体能浓度依赖地结合Jurkat细胞
为验证13B7对ITPRIPL1的结合力，采取流式细胞术(FACS)验证13B7抗体存在与Jurkat细胞的浓度依赖的结合。将内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞计数，调整细胞数为1x10 6/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，向每孔中分别加入终浓度为0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的13B7抗体，培养箱孵育30分钟。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释抗鼠Fc段-Alexa Fluor 488抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入300微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试。
图60为该FACS实验结果，该结果显示Jurkat细胞能与13B7抗体呈浓度依赖性的高亲和力的结合。
3.蛋白质免疫印迹法验证13B7抗体能特异性地结合ITPRIPL1表达量不同细胞的ITPRIPL1蛋白
将含有内源性表达ITPRIPL1情况各不相同的Jurkat、HCT116、MC38细胞计数，各取出1x10 6个细胞，PBS清洗并离心后，用60微升RIPA裂解液(碧云天，上海，中国)与1：100蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)混合裂解液冰上裂解15分钟，取液氮三冻三融，经离心、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得输入量蛋白样本。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置12.5％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以ITPRIPL1蛋白及内参GAPDH蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用13B7抗体以终浓度1微克每毫升稀释和GAPDH-HRP抗体(康臣，上海，中国)分别孵育ITPRIPL1与GAPDH相应条带，4℃过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗鼠二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
图61为该Western Blot实验结果。如图所示，根据GAPDH内参的提示，13B7抗体能特异性地与ITPRIPL1蛋白分子量所在位置显示出条带，并与各细胞内源性表达ITPRIPL1情况相符，说明13B7抗体能特异性地与ITPRIPL1蛋白进行结合。
实施例21：各杂交瘤抗体对ITPRIPL1与CD3E/SEMA3G结合的阻断效果测定
为了验证各杂交瘤抗体对ITPRIPL1与CD3E或SEMA3G的结合是否存在阻断效果，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)对各抗体的阻断效果进行验证。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用1微克每毫升的ITPRIPL1-Fc标签重组蛋白(Abclonal，武汉，中国)或1微克每毫升的CD3E-Fc标签蛋白(Acro，北京，中国)溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，包被ITPRIPL1-Fc蛋白的孔加入终浓度为1微克每毫升的SEMA3G-His标签蛋白(cusabio，武汉，中国)，同时加入终浓度为1/2微克每毫升的杂交瘤抗体；包被CD3E-Fc蛋白的孔加入终浓度为1微克每毫升的ITPRIPL1-His标签蛋白(cusabio，武汉，中国)，同时加入终浓度为1/2微克每毫升的杂交瘤抗体；温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗His段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图62为该ELISA实验结果。上图为ITPRIPL1-CD3E结合时各杂交瘤抗体的阻断情况，下图为ITPRIPL1-SEMA3G结合时各杂交瘤抗体的阻断情况。实验结果表明各杂交瘤抗体能不同程度地阻断ITPRIPL1与CD3E或SEMA3G的结合，显示了各抗体之间的异质性，其中以18B12以及13B7抗体的结合效果最好。
实施例22：单克隆抗体能以更高的亲和力结合ITPRIPL1
1.免疫吸附剂测定(ELISA)验证各单克隆抗体对ITPRIPL1的结合力
在对各杂交瘤抗体进行单克隆纯化后，得到16株生长情况较好的单克隆抗体。为验证各单克隆抗体对ITPRIPL1的结合力，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)验证各抗体与ITPRIPL1蛋白的直接结合。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用100微升1微克每毫升的ITPRIPL1重组蛋白(cusabio，武汉，中国)ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，加入终浓度为1微克每毫升的不同的单克隆抗体，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图63为该ELISA实验结果。实验结果表明各单克隆抗体之间对ITPRIPL1的结合力存在一定的差距，而整体对ITPRIPL1的结合力明显强于单克隆纯化之前的结合力，表明单克隆抗体能以更高的亲和力结合ITPRIPL1。
2.流式细胞术(FACS)验证各单克隆抗体与ITPRIPL1的结合
为进一步验证各单克隆抗体对ITPRIPL1的结合力，采取流式细胞术(FACS)证实各抗体与ITPRIPL1蛋白的直接结合。将内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞计数，调整细胞数为1x10 6/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，向每孔中分别加入终浓度为1微克每毫升的单克隆抗体或对照血清，培养箱孵育30分钟。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释抗鼠Fc段-Alexa Fluor 488抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入300微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试。
结果如图64所示，各单克隆抗体与ITPRIPL1结合力的强弱各不相同，表现了抗体之间的异质性，而整体结合力强于单克隆纯化之前。上述结果证明各杂交瘤能与ITPRIPL1蛋白有结合力各不相同的结合，且单克隆纯化后对ITPRIPL1结合力更强。
实施例23：各单克隆抗体对ITPRIPL1与CD3E/SEMA3G结合的阻断效果测定
为了验证所得的单克隆抗体对ITPRIPL1与CD3E或SEMA3G的结合是否存在阻断效果，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)对各抗体的阻断效果进行验证。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用终浓度为1微克每毫升的ITPRIPL1-Fc标签重组蛋白(Abclonal，武汉，中国)或终浓度为1微克每毫升的CD3E-Fc标签蛋白(Acro，北京，中国)溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。4℃包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，包被ITPRIPL1-Fc蛋白的孔加入终浓度为1微克每毫升的SEMA3G-His标签蛋白(cusabio，武汉，中国)，同时加入终浓度为1微克每毫升的单克隆抗体；包被CD3E-Fc蛋白的孔加入终浓度为1微克每毫升的ITPRIPL1-His标签蛋白(cusabio，武汉，中国)，同时加入终浓度为1/2微克每毫升的单克隆抗体；温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗His段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图65为该ELISA实验结果。实验结果表明，各单克隆抗体对于ITPRIPL1于CD3E/SEMA3G的阻断效果仍各自存在一定差异，其中13B7A6H3/18B12D1A6/18B12D1F7的阻断效果较好，与单克隆纯化之前的结论相符。
实施例24：杂交瘤抗体与单克隆抗体与多肽段结合测定
以ITPRIPL1胞外段蛋白序列为基础，设计1/3重合序列的多肽段，共计17段(金斯瑞，南京，中国)。其序列如SEQ ID NO:42-58所示。将所得的多肽段以400微克每毫升的终浓度溶于DMSO中，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)验证各杂交瘤抗体并挑选4株单克隆抗体进行多肽段结合的验证。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用终浓度为1微克每毫升的多肽段以100微升ELISA包 被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，加入终浓度为1微克每毫升的不同的杂交瘤抗体或单克隆抗体，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图66为该ELISA实验结果。与某一特定多肽段结合高于背景及其他多肽段三倍以上读数，即认为结合特定肽段。实验结果表明，具有较好阻断效果的13B7/18B12产生的单克隆抗体均结合P8，而无阻断效果或阻断效果较差的杂交瘤抗体及单克隆抗体无特定结合肽段，说明P8为优势结合位点。
实施例25：测定ITPRIPL1单克隆抗体对PBMC细胞杀伤肿瘤细胞的促进作用
流式细胞术证明具有阻断ITPRIPL1与CD3E/SEMA3G结合效果的单克隆抗体可以促进PBMC对肿瘤细胞的杀伤。
提前24小时用1ug/mL的Anti-CD3/CD28(Invitrogen，CA，美国)将复苏的PBMC细胞激活。将PBMC细胞与Raji细胞计数，分别调整细胞数为4x10 6/毫升或1x10 6/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，同时加入两个浓度的不同的单克隆抗体或对照血清，混合后置于培养箱中共孵育6小时。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(碧云天，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置各实验和对照组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(碧云天，上海，中国)与10微升PI(碧云天，上海，中国)，室温孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试，结果如图67和68所示，该结果表明，与对照相比，抗体中具有阻断ITPRIPL1与CD3E/SEMA3G结合效果、能够结合P8(SEQ ID NO:49)的单克隆抗体13B7A6H3/18B12D1A6显著增加了PBMC对Raji细胞的杀伤。
经测序得知，单克隆抗体13B7A6H3的重链序列如SEQ ID NO:22所示，轻链序列如SEQ ID NO:23所示，重链可变区VH序列如SEQ ID NO:24所示，轻链可变区VL如SEQ ID NO:25所示，重链互补决定区HCDR1的序列如SEQ ID NO:26所示，重链互补决定区HCDR2的序列如SEQ ID NO:27所示，重链互补决定区HCDR3的序列如SEQ ID NO:28所示，轻链互补决定区LCDR1的序列如SEQ ID NO:29所示，轻链互补决定区LCDR2的序列为KV，轻链互补决定区LCDR3的序列如SEQ ID NO:31所示；单克隆抗体18B12D1A6的重链序列如SEQ ID NO:32所示，轻链序列如SEQ ID NO:33所示，重链可变区VH序列如SEQ ID NO:34所示，轻链可变区VL如SEQ ID NO:35所示，重链互补决定区HCDR1的序列如SEQ ID NO:36所示，重链互补决定区HCDR2的序列如SEQ ID NO:37所示，重链互补决定区HCDR3的序列如SEQ ID NO:38所示，轻链互补决定区LCDR1的序列如SEQ ID NO:39所示，轻链互补决定区LCDR2的序列为KV，轻链互补决定区LCDR3的序列如SEQ ID NO:41所示。
分析以上抗体序列的相似性(图65C)，可见轻链CDR1的序列为xSLxNSKGNTH(x代表任意氨基酸)且与13B7A6H3轻链CDR1相似度为81.8％，轻链CDR3的序列为SQSTHxPYT且与13B7A6H3 轻链CDR1相似度为87.5％。其它CDR序列相同。因此可以预测，轻链CDR1和CDR3与13B7A6H3的相似性高于80％，且其它CDR序列与13B7A6H3相同的情况下，抗体仍可具备结合ITPRIPL1的活性。如以所有CDR序列的整体相似性进行比较，可知与13B7A6H3的重链CDR1、CDR2、CDR3和轻链CDR1、CDR2、CDR3总体达到94％相似度的序列可具备结合ITPRIPL1的活性。
实施例26：多肽段点突变对单克隆抗体结合影响测定
免疫吸附剂测定(ELISA)验证多肽段点突变对单克隆抗体的影响。
将此前所得的多肽段P8具体的氨基酸序列逐个分别进行丙氨酸(A)突变，原先为丙氨酸的位点不进行突变，所得序列如SEQ ID NO:59-71所示。将所得的多肽段以及无突变多肽段以400微克每毫升的终浓度溶于DMSO中，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)验证与13B7A6H3单克隆抗体的结合。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用终浓度为1微克每毫升的多肽段以100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，加入终浓度为1微克每毫升的13B7A6H3单克隆抗体，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图69为该ELISA实验结果。实验结果表明，P8中的位点3(L)、7(F)、10(R)突变后13B7A6H3抗体不再与多肽段结合，而其他位点突变则不影响结合，说明3(L)、7(F)、10(R)为13B7A6H3单克隆抗体与ITPRIPL1蛋白结合的关键位点。
实施例27：表位作图法竞争性分析ITPRIPL1单克隆抗体分群
表位作图法(Epitope mapping)对ITPRIPL1单克隆抗体的分群分析。
将所得的ITPRIPL1单克隆抗体通过表位作图法分析目前所得ITPRIPL1单克隆抗体之间的竞争性关系并进行分群。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用终浓度为0.5微克每毫升的ITPRIPL1蛋白以100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，加入0.5微克每毫升的各个ITPRIPL1单克隆抗体，并同时交叉加入终浓度为0.5微克每毫升的各个ITPRIPL1单克隆抗体，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图70为表位作图法ELISA实验结果。实验结果表明，13B7、18B12之间存在竞争关系，13H10、15C9、16E1之间存在竞争关系，其他抗体之间互相不存在竞争关系。提示目前的ITPRIPL1单克隆抗体可分为四群：(1)13B7、18B12；(2)13H10、15C9、16E1；(3)13E8；(4)18G5
实施例28：人源化ITPRIPL1抗体构建与结合位点测定
1.人源化ITPRIPL1抗体的构建
依据之前抗体测序的结果，将13B7A6H3单克隆抗体对应的成对序列SEQ ID NO:73-82.利用人源化基因表达优化并重新编码，得到对应的人源化序列，并利用该序列插入人Fc段对应序列载体，得到人源化ITPRIPL1抗体序列质粒。将人源化ITPRIPL1抗体序列质粒转染至HEK293细胞并进行培养。72小时后收取上清，与平衡后的蛋白A磁珠室温混匀2小时，于层析柱内进行流穿、平衡/洗杂、洗脱，进行中和后所得产物即人源化ITPRIPL1抗体。
2.人源化ITPRIPL1抗体的结合活性及位点测定
使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用终浓度为1微克每毫升的ITPRIPL1 P8多肽以100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板，阳性对照采用人ITPRIPL1 P8多肽包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，加入终浓度为0.5微克每毫升的嵌合及人源化13B7A6H3单克隆抗体，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗人Fc段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图74人源化抗体与ITPRIPL1 P8多肽段结合的ELISA实验结果。实验结果表明所得人源化抗体均具有活性并能特异性地结合13B7A6H3所结合ITPRIPL1多肽段位点，表明抗体构建的成功。
实施例29：单克隆ITPRIPL1抗体与食蟹猴ITPRIPL1蛋白的结合测定
免疫吸附剂测定(ELISA)验证13B7A6H3单克隆抗体能与食蟹猴ITPRIPL1对应多肽段结合。
根据NCBI蛋白数据库，得知食蟹猴ITPRIPL1蛋白的序列为SEQ ID NO:72；其中人ITPRIPL1 P8于食蟹猴对应多肽段序列为SEQ ID NO:。根据食蟹猴对应多肽段构建相应多肽。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用终浓度为1微克每毫升的食蟹猴ITPRIPL1多肽以100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板，阳性对照采用人ITPRIPL1 P8多肽包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，加入终浓度为0.5微克每毫升的13B7A6H3单克隆抗体，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
图75为食蟹猴ITPRIPL1多肽与ITPRIPL1单克隆抗体结合ELISA实验结果。实验结果表明，食蟹猴ITPRIPL1多肽与人ITPRIPL1 P8多肽对13B7A6H3单克隆抗体结合无明显差异，提示13B7A6H3单克隆抗体可与食蟹猴ITPRIPL1蛋白结合。。
综上所述，本申请公开了一种新鉴定的结合CD3ε胞外区的天然膜蛋白ITPRIPL1，并揭示了ITPRIPL1结合CD3ε后产生的、控制T细胞活化的信号转导改变。这提示，过去曾被发现的结合CD3ε的抗体可能在一定程度上模拟或影响了ITPRIPL1所具有的天然配体功能。CD3ε和ITPRIPL1这对免 疫检查点受体配体的发现，为深入理解机体免疫稳态的维持和肿瘤细胞的免疫逃逸机制带来新的视角。
尽管本申请的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本申请的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本申请的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本申请的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (47)

  1. ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中，所述的调节剂用于提高或降低机体的ITPRIPL1基因或蛋白的表达或功能。
  2. 根据权利要求1所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中，所述的调节剂包含以下任意一种：
    (1)使细胞内ITPRIPL1基因被敲除或突变的基因编辑系统；
    (2)降低ITPRIPL1基因表达水平的RNA分子；
    (3)用于导入细胞内的核酸分子，所述核酸分子编码ITPRIPL1并提高ITPRIPL1的表达量；
    (4)分离的ITPRIPL1重组蛋白；
    (5)识别并结合ITPRIPL1的抗体。
  3. 根据权利要求2所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中：
    所述的基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统；用于所述CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶序列选自SEQ ID NO:11-13所示的任意一条序列，用于编码sgRNA的寡聚DNA序列选自SEQ ID NO:14-19；
    所述的核酸分子包含：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的序列；
    所述的ITPRIPL1重组蛋白包含：ITPRIPL1蛋白胞外区中能够结合CD3ε或NRP2蛋白的功能片段；
    所述的识别并结合ITPRIPL1的抗体为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗原结合结构域、双特异性抗体、多特异性抗体，或嵌合抗原受体中的抗原结合部。
  4. 根据权利要求3所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中，所述的功能片段的序列选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中任意一条，或为其衍生序列，所述衍生序列包括DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRxLEMEFEERxxxAExxQKxENxWxGxTSxDQ(”x”为任意氨基酸)，所述的衍生方法包括：将1-10个氨基酸进行替换、删除或插入但并未改变序列的功能；衍生序列优选为DRMDLDTLARSRQLEKRMSEEMRxLEMEFEERxxxAExxQKxENxWxGxTSxDQ(”x”为任意氨基酸)。
  5. 根据权利要求3或4所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中，所述的ITPRIPL1重组蛋白与抗体恒定区形成融合蛋白或与凝血因子形成融合蛋白；或者，对所述的ITPRIPL1重组蛋白进行修饰，修饰的方式包括：聚乙二醇修饰、糖基化修饰、多聚唾液酸修饰、脂肪酸修饰、KLH修饰、生物素修饰。
  6. 根据权利要求3所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中，通过药物传递系统将所述的核酸分子导入细胞内，所述的药物传递系统 包括：重组表达载体、病毒、脂质体或纳米材料。
  7. 根据权利要求1所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中，所述的调节免疫反应包括：在自身免疫反应、抑制移植排斥免疫反应、过敏反应、抗感染免疫反应、抗肿瘤免疫反应的过程中，抗原递呈细胞和T淋巴细胞的功能的调节。
  8. 根据权利要求7所述的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中，所述的免疫反应包括：I型糖尿病、免疫性不孕不育、器官移植后排斥反应、过敏反应、全身炎症或细胞因子风暴、感染。
  9. 根据权利要求1的ITPRIPL1的调节剂在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中，所述的肿瘤为ITPRIPL1相关的实体瘤或血液系统肿瘤；所述的实体瘤包括：胶质瘤、肺癌、头颈部癌、胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、食管癌、尿路上皮癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌，黑色素瘤、胰腺癌或肝癌；所述的血液系统肿瘤包括：白血病或淋巴瘤。
  10. 一种药物组合物，其中，包含权利要求1至9中任意一项所述的用途中采用的调节剂，以及药学上可接受的载体。
  11. 一种分离的ITPRIPL1重组蛋白，其中，所述的重组蛋白为ITPRIPL1蛋白胞外区中能够结合CD3ε或NRP2蛋白的功能片段。
  12. 一种识别并结合ITPRIPL1的抗体，在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物中的用途，其中，所述的抗体识别并结合ITPRIPL1蛋白的胞外区。
  13. 特异性识别ITPRIPL1的抗体在标记原发灶内癌症组织和癌旁组织的边界、转移至淋巴结的癌细胞与正常淋巴组织的边界、发生远处转移的癌细胞与转移器官的正常组织的边界，以及在其它生物样本中标记癌症组织活细胞的应用。
  14. 根据权利要求13所述的应用，其中，所述癌症包括甲状腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、食管癌、肾癌以及其它ITPRIPL1相关肿瘤。
  15. 分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其能够与抗原ITPRIPL1中如SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列结合。
  16. 根据权利要求15所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，该结合蛋白包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:34中任一项所示的重链可变区VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:35中任一项所示的轻链可变区VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  17. 根据权利要求16所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其中所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。
  18. 根据权利要求16所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其中所述HCDR1的氨 基酸序列如SEQ ID NO:36所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。
  19. 根据权利要求16所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其中所述LCDR1的氨基酸序列与SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的相似性超过80％，所述LCDR2的氨基酸序列为KV，所述LCDR3的氨基酸序列与SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的相似性超过80％。
  20. 根据权利要求16所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其中所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:39中的任一项所示，所述LCDR2的氨基酸序列为KV，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:41中的任一项所示。
  21. 根据权利要求16所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其中，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述LCDR2的氨基酸序列为KV，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；或者所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述LCDR2的氨基酸序列为KV，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。
  22. 根据权利要求16所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:35中的任一项所示。
  23. 根据权利要求15-22任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区源自人IgG重链恒定区。
  24. 根据权利要求15-22任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区。
  25. 根据权利要求15-22任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其包含抗体重链HC，且所述HC包含SEQ ID NO:22或32中任一项所示的氨基酸序列。
  26. 根据权利要求15-22任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其包含抗体轻链LC，且所述LC包含SEQ ID NO:23或33中任一项所示的氨基酸序列。
  27. 根据权利要求15-22任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv和/或di-scFv。
  28. 根据权利要求15-22任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，所述ITPRIPL1蛋白包含人和食蟹猴ITPRIPL1蛋白。
  29. 嵌合抗原受体，其包含权利要求15-28中任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白。
  30. 免疫耦联物，其包含权利要求15-28中任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白。
  31. 分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求15-28中任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白或权利要求29所述的嵌合抗原受体，或编码权利要求4、11中任一项所述的多肽或蛋白片段。
  32. 载体，其包含权利要求31所述的核酸分子。
  33. 细胞，其包含权利要求31所述的核酸分子或权利要求32所述的载体。
  34. 药物组合物，其包含权利要求15-28中任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白、权利要求29所述的嵌合抗原受体、权利要求30所述的免疫耦联物，以及任选地药学上可接受的佐剂。
  35. 权利要求15-28中任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白表达的条件下，培养权利要求33所述的细胞。
  36. 权利要求15-28中任一项所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白、权利要求29所述的嵌合抗原受体、权利要求30所述的免疫耦联物、和/或权利要求34所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。
  37. 根据权利要求36所述的用途，其中，所述肿瘤包括ITPRIPL1相关的肿瘤。
  38. 一种筛选和鉴别ITPRIPL1相关肿瘤的方法，通过检测ITPRIPL1在取自受试者的生物样本中的表达并与预设值相比较的方式进行判定，所述的检测包括以抗体、核酸探针或包含特定引物的PCR反应等检测方式，所述的生物样本包括组织、血液、尿液、脑脊液、腹水、胸水、组织渗出液、粪便等样本。
  39. 权利要求38所述的方法，在制备肿瘤筛查或诊断的试剂盒中的应用，以及在制备用于筛选适用ITPRIPL1调节剂的患者的伴随诊断试剂盒中的应用。
  40. 一种ITPRIPL1的线性表位多肽，所述线性表位肽的序列包含：
    (ⅰ)氨基酸序列为SEQ ID NO:49，即RLLEMEFEERKRAAE；
    (ⅱ)或氨基酸序列为或xxLxxxFxxRxxx(x为任意氨基酸)，位于两端的1-3个氨基酸可被缺失；
    (iii)或SEQ ID NO:49的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸被替换、插入或缺失所得到的氨基酸序列；
  41. 一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求40中所述肽的核酸序列或其互补序列。
  42. 一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求41中所述的核酸分子。
  43. 一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞中含有权利要求42中所述的载体。
  44. 一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求40所述的肽、权利要求42所述的载体或权利要求43所述的细胞。
  45. 权利要求40-44所述的表位肽及相应的编码核酸、载体、宿主细胞、药物组合物及其在筛选和制备ITPRIPL1调节剂中的用途。
  46. 一种用于发现和鉴定权利要求1-36所述ITPRIPL1功能调节剂的方法，其特征在于，检测受试分子的以下一种或多种性质：特异性结合细胞表面表达的ITPRIPL1的能力；对ITPRIPL1与CD3ε结合的影响；对ITPRIPL1与NRP2结合的影响；对ITPRIPL1与 SEMA3G结合的影响；对ITPRIPL1与EBI2结合的影响；对免疫细胞或肿瘤细胞功能的直接或间接影响，所述的影响可为体外的或体内的可检测的影响。
  47. 一种分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白在制备调节免疫反应或抗肿瘤的药物以及检测ITPRIPL1在个体内表达中的用途，其中所述分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白能够与抗原ITPRIPL1中如SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列结合。
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